Нейротрофический фактор роста человека (эновин), кодирующая его выделенная молекула нуклеиновой кислоты, вектор (варианты), фармацевтическая композиция (варианты), антитело, способ обнаружения фактора роста, набор, способ идентификации агониста или антагониста (варианты)

Нейротрофический фактор роста человека (эновин), кодирующая его выделенная молекула нуклеиновой кислоты, вектор (варианты), фармацевтическая композиция (варианты), антитело, способ обнаружения фактора роста, набор, способ идентификации агониста или антагониста (варианты)

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения нейротрофического фактора роста человека (эновин). Выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую эновин, встраивают в экспрессирующий вектор. Вектор или фактор роста (эновин) используют для получения фармацевтической композиции для лечения и профилактики нарушений нервной системы. Фактор роста обнаруживают в образце с помощью антитела, способного связываться с фактором роста. Идентификацию агониста или антагониста нейротрофического фактора роста проводят путем взаимодействия биологического материала, экспрессирующего рецептор фактора роста, с испытуемым соединением в присутствии указанного фактора роста. Изобретение позволяет разрабатывать лекарственные средства для профилактики и лечения нейродегенеративных заболеваний. 11 н. и 15 з.п. ф-лы, 27 ил., 4 табл.

Настоящее изобретение относится к нейротрофическому фактору, в частности к клонированию и экспрессии нового члена семейства нейротрофических факторов GDNF, получившего название "эновин" (EVN).

Предпосылки изобретения

Нейротрофические факторы участвуют в дифференцировке, развитии и обеспечении жизнеспособности нейронов. Эти белки предотвращают дегенерацию и стимулируют выживание разных типов нервных клеток, благодаря чему они являются потенциальными лекарственными средствами для лечения нейродегенеративных заболеваний. Нейротрофический фактор, выделенный из линии глиальных клеток (GDNF), был первым членом постоянно увеличивающегося подсемейства нейротрофических факторов, отличающихся в структурном отношении от нейротрофинов. GDNF является трансформирующим фактором роста (TGF-), входящим в суперсемейство факторов роста, характеризующихся специфической структурой семи высококонсервативных остатков цистеина в аминокислотной последовательности (Kingsley, 1994). GDNF был первоначально выделен при помощи метода на основе способности этого фактора сохранять жизнеспособность и функциональность допаминергических нейронов желудочка среднего мозга эмбриона in vitro (Lin et al., 1993). Другие типы нервных клеток в центральной (CNS) или периферической (PNS) нервной системе также реагируют на действие GDNF, направленное на сохранение их жизнеспособности (Henderson et al., 1994, Buj-Bello et al., 1995, Mount et al., 1995, Oppenheim et al., 1995). Клетки продуцируют GDNF в неактивной проформе, которая специфически расщепляется на сайте узнавания фурина RXXR с образованием активного (зрелого) GDNF (Lin et al., 1993). Экзогенное введение GDNF оказывает сильное нейрозащитное действие в животных моделях болезни Паркинсона, общего нейродегенеративного нарушения, характеризующегося утратой до 70% допаминергических клеток в черном веществе головного мозга (Beck et al., 1995, Tomac et al., 1995, Gash et al., 1996, Choi-Lundberg et al., 1997, Bilang-Bleuel et al., 1997).

Недавно были обнаружены новые нейротрофические факторы семейства GDNF. Нейротурин (NTN) выделен из кондиционированной среды, содержащей клетки яичника китайского хомячка (СНО), при помощи метода на основе способности этого фактора стимулировать жизнеспособность симпатических нейронов в культуре (Kotzbauer et al., 1996). Белок зрелого NTN на 57% гомологичен зрелому GDNF. Персефин (PSP) обнаружен в результате клонирования с использованием вырожденной затравки для полимеразной реакции синтеза цепи (PCR) с геномной ДНК в качестве матрицы. Зрелый PSP подобно зрелому GDNF способствует выживанию допаминергических нейронов желудочка среднего мозга и двигательных нейронов в культуре (Milbrandt et al., 1998). Гомология белка зрелого PSP со зрелым GDNF и NTN составляет приблизительно 50%. Артемин (ARTN) был обнаружен в результате скрининга базы данных ДНК и является фактором выживания сенсорных и симпатических нейронов в культуре (Baloh et al., 1998b).

GDNF, NTN, PSP и ARTN требуют наличия гетеродимерного рецепторного комплекса для осуществления внутриклеточной трансдукции сигнала в нижней области. GDNF связывается с субъединицей альфа 1 семейства рецепторов GDNF (GFR-1; GFR; Комитет по номенклатуре, 1997), мембранным белком, связанным гликозилфосфатидилинозитолом (гликозил-PtdIns) (Jing et al., 1996, Treanor et al., 1996, Sanicola et al., 1997). Комплекс GDNF/GFR-1 затем связывается и активирует протоонкоген cRET, мембраносвязанную тирозинкиназу (Durbec et al., 1996, Trupp et al., 1996), что вызывает фосфорилирование остатков тирозина в cRET и последующую активацию путей трансдукции сигнала в нижней области (Worby et al., 1996). Были исследованы несколько других членов семейства GFR лигандсвязывающих рецепторов (Baloh et al., 1997, Sanicola et al., 1997, Klein et al., 1997, Buj-Bello et al., 1997, Suvanto et al., 1997). GFR-2 и GFR-3 (Jing et al., 1997, Masure et al., 1998, Woby et al., 1998, Naveilham et al., 1998, Baloh et al., 1998a) были идентифицированы целым рядом научно-исследовательских групп. GFR-1 и GFR-2 широко экспрессированы почти во всех тканях, и их экспрессию можно регулировать (Sanicola et al., 1997, Widenfalk et al., 1997).

GFR-3 отсутствует в развивающейся или зрелой центральной нервной системе, но широко экспрессирован в нескольких развивающихся и зрелых сенсорных и симпатических ганглиях периферической нервной системы (Widenfalk et al., 1998, Naveilhan et al., 1998, Baloh et al., 1998a). Четвертый член этого семейства, GFR-4, был клонирован из кДНК цыплят (Thompson et al., 1998). GFRa-l является предпочтительным рецептором для GDNF, в то время как GFR-2 предпочтительно связывает NTN (Jing et al., 1996, Treanor et al., 1996, Klein et al., 1997). GFR-4 цыплят образует функциональный рецепторный комплекс для PSP в сочетании с cRET (Enokido et al., 1998). Установлено, что клетки, экспрессирующие как GFR-3, так и cRET, не реагируют на GDNF, NTN или PSP (Worby et al., 1998, Baloh et al., 1998a). Недавно установлено, что ART передает сигнал при помощи cRET, используя GFR-3 в качестве предпочтительного лигандсвязывающего рецептора (Baloh et al., 1998b). Сообщение между нейротрофическими факторами и рецепторами GFR возможно in vitro, так как GDNF может связываться с GFR-2 или GFR-3 в присутствии cRET (Sanicola et al., 1997, Trupp et al., 1998) и NTN может связываться с GFR-1 с низкой степенью сродства (Klein et al., 1997). Коротко говоря, GDNF, NTN, PSP и ART являются частью нейротрофической сигнальной системы, при помощи которой разные лигандсвязывающие субъединицы (GFR-1 - GFR-4) могут взаимодействовать с субъединицей тирозинкиназы (cRET). Физиологическая значимость этих открытий, сделанных in vitro, недавно была продемонстрирована в сенсационных исследованиях, выполненных на генетическом уровне (Rosenthal, 1999), которые совершенно четко показывают, что GDNF взаимодействует с GFR-1 in vivo, в то время как NTN является предпочтительным лигандом для GFR-2.

Авторы настоящего изобретения идентифицировали, клонировали, экспрессировали, локализовали в хромосоме и исследовали эновин (EVN), четвертый член семейства GDNF. Представление о белке зрелого EVN было значительно расширено благодаря открытию разных функциональных и нефункциональных сплайсированных вариантов мРНК. Кроме того, авторы этого изобретения получили данные об экспрессии, связывании EVN с GFR-3, влиянии in vitro EVN на рост аксонов и защите от вызываемой таксолом нейротоксичности в дифференцированных стауроспорином культурах клеток нейробластомы человека SH-SY5Y.

Сущность изобретения

Объектами настоящего изобретения являются молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая новый нейротрофический фактор роста человека "эновин", экспрессирующий вектор, содержащий указанную молекулу нуклеиновой кислоты, клетка-хозяин, трансформированная указанным вектором, нейротрофический фактор роста, кодированный указанной молекулой нуклеиновой кислоты, выделенный эновин, соединения, являющиеся агонистами или антагонистами эновина, и фармацевтические композиции, содержащие эту нуклеиновую кислоту или белок эновина либо их агонисты или антагонисты.

Подробное описание изобретения

Первым объектом настоящего изобретения является молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая нейротрофический фактор роста человека, именуемый здесь эновином, который имеет аминокислотную последовательность, показанную на фиг.21, или кодирующая функциональный эквивалент, производное или биологический предшественник указанного фактора роста. Указанная молекула нуклеиновой кислоты предпочтительно является ДНК и еще более предпочтительно молекулой кДНК.

Нуклеиновая кислота по этому изобретению предпочтительно имеет последовательность, соответствующую положениям 81-419 в последовательности, показанной на фиг.1, более предпочтительно положениям 81-422 и еще более предпочтительно непроцессированную последовательность, показанную на фиг.1.

Считается, что молекула нуклеиновой кислоты, соответствующая положениям 81-419, кодирует последовательность белка зрелого эновина после процессирования проформы этого белка на сайте процессинга RXXR, имеющемся в устойчивой проформе указанного белка эновина.

Это изобретение относится также к антисмысловой молекуле, способной гибридизовать с любыми последовательностями нуклеиновых кислот по этому изобретению в очень строгих условиях, которые должны быть хорошо известны специалистам в этой области.

Строгие условия гибридизации в используемом здесь значении означают условия, в которых полинуклеиновые кислоты являются устойчивыми. Стабильность гибридов выражается в температуре плавления (Tm) гибридов. Tm можно приблизительно представить формулой

81,5С-16,6(log10[Na⁺]+0,41(%G&C)-600/l

где l означает длину гибридов в нуклеотидах. Tm понижается примерно на 1-1,5С с каждым 1% уменьшения гомологии последовательностей.

Молекулу нуклеиновой кислоты по этому изобретению можно успешно использовать для экспрессии нейротрофического фактора роста человека по этому изобретению в клетке-хозяине или подобном микроорганизме с использованием приемлемого экспрессирующего вектора.

Экспрессирующий вектор по этому изобретению представляет собой вектор, способный экспрессировать ДНК, оперативно связанную с регуляторными последовательностями, такими как промоторные области, которые способны экспрессировать такие фрагменты ДНК.

Необходимыми для экспрессии регуляторными элементами являются промоторные последовательности, которые связывают полимеразу РНК и последовательности, инициирующие транскрипцию, предназначенные для связывания рибосом. Например, бактериальный экспрессирующий вектор может содержать такой промотор, как lac-промотор, последовательность Shine-Dalgarno для инициации транскрипции и инициирующий кодон AUG. Аналогичным образом, эукариотический экспрессирующий вектор может содержать гетерологичный или гомологичный промотор для полимеразы II РНК, сигнал полиаденилирования в нижней области, инициирующий кодон AUG и терминирующий кодон для отделения рибосомы. Такие векторы можно приобрести коммерческим путем или собрать из последовательностей при помощи методов, хорошо известных в этой области.

Таким образом, экспрессирующий вектор является рекомбинантной векторной ДНК или РНК, такой как плазмида, фаг, рекомбинантный вирус или другой вектор, который при введении в приемлемую клетку-хозяина вызывает экспрессию фрагментов ДНК или РНК. Приемлемые экспрессирующие векторы хорошо известны специалистам в этой области и включают векторы, реплицирующиеся в эукариотических и/или прокариотических клетках, векторы, которые остаются эписомными, или векторы, которые внедряются в геном клетки-хозяина.

Антисмысловую молекулу, способную гибридизовать с нуклеиновой кислотой по этому изобретению, можно использовать в качестве зонда, лекарственного средства или в фармацевтической композиции.

Молекулы нуклеиновой кислоты по этому изобретению можно ввести в векторы, имеющие антисмысловую ориентацию, для продуцирования антисмысловой РНК. Антисмысловую РНК или другие антисмысловые нуклеиновые кислоты можно продуцировать синтетическими средствами.

Другим объектом этого изобретения является клетка-хозяин, трансформированная, трансфицированная или инфицированная экспрессирующим вектором по этому изобретению, которая предпочтительно является эукариотической клеткой и более предпочтительно клеткой млекопитающего.

Введение клонированной ДНК в приемлемый экспрессирующий вектор с целью последующей трансформации указанной клетки и отбора трансформированных клеток хорошо известно в этой области и описано в справочнике Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press.

Другим объектом настоящего изобретения является молекула нуклеиновой кислоты, имеющая по крайней мере 15 нуклеотидов, предпочтительно от 15 до 50 нуклеотидов.

Эти последовательности можно успешно использовать в качестве зондов или затравок для инициации репликации или тому подобного. Такие молекулы нуклеиновой кислоты можно получить методами, хорошо известными в этой области, такими как метод рекомбинантных ДНК или метод синтеза. Их можно также использовать в диагностических наборах, устройствах или тому подобных приспособлениях для обнаружения нуклеиновой кислоты по этому изобретению. Эти испытания обычно включают контактирование зонда с образцом в условиях гибридизации и обнаружение любого дуплекса, образующегося между зондом и любой нуклеиновой кислотой в образце.

В соответствии с настоящим изобретением эти зонды могут быть связаны с твердым носителем. Они предпочтительно находятся на матрице, поэтому несколько зондов можно одновременно гибридизовать с одним биологическим образцом. Эти зонды можно наносить на матрицу или синтезировать in situ на самой матрице. (См. Lockhart et al., Nature Biotechnology, vol. 14, December 1996 "Expression monitoring by hybridisation into high density oligonucleotide arrays". Одна матрица может содержать более 100, 500 и даже 1000 разных зондов в разных местах.

Молекулы нуклеиновой кислоты по этому изобретению можно также продуцировать при помощи методов рекомбинантных ДНК или методов синтеза, таких как, например, механизмы клонирования при помощи полимеразной реакции синтеза цепи (PCR), которые обычно включают получение двух затравок, содержащих примерно 10-50 нуклеотидов в области гена, предназначенного для клонирования, контактирование этих затравок с мРНК, кДНК или геномной ДНК из клетки человека, выполнение полимеразной реакции синтеза цепи в условиях, обеспечивающих амплификацию целевой области, выделение амплифицированной области или фрагмента и получение амплифицированной ДНК. Такие методы хорошо известны в этой области и описаны в справочнике Sambrook et al. (Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 1989).

Нуклеиновые кислоты или олигонуклеотиды по этому изобретению могут иметь метку, облегчающую их обнаружение. Приемлемыми метками являются радиоизотопы, такие как ³²Р или ³⁵S, ферментативные метки или другие белковые метки, в частности биотиновые или флуоресцентные маркеры. Такие метки можно вводить в нуклеиновые кислоты или олигонуклеотиды по этому изобретению и детектировать при помощи известных методов.

Аллельные варианты или полиморфизмы молекулы ДНК человека по этому изобретению можно успешно идентифицировать, например, путем зондирования библиотеки кДНК или геномной библиотеки, созданной с привлечением целого ряда субъектов, например разных популяций. Кроме того, нуклеиновые кислоты и зонды по этому изобретению можно использовать для секвенирования геномной ДНК у пациентов методами, хорошо известными в этой области, такими как метод терминации дидезоксицепи Сангера, при помощи которого можно успешно выявить любую предрасположенность пациента к конкретным нарушениям, обусловленным фактором роста по этому изобретению.

Другим объектом настоящего изобретения является трансгенная клетка, ткань или организм, содержащие трансген, способный экспрессировать нейротрофический фактор человека "эновин" по этому изобретению.

Термин "трансген, способный экспрессировать" в используемом здесь значении означает любую приемлемую последовательность нуклеиновых кислот, которая вызывает экспрессию нейротрофического фактора, выполняющего ту же функцию и/или обладающего той же активностью, что и нейротрофический фактор по этому изобретению. Этот трансген может содержать, например, геномную нуклеиновую кислоту, выделенную из клеток человека, или синтетическую нуклеиновую кислоту, включая кДНК, интегрированную в хромосому или внехромосомное пространство.

Трансген предпочтительно имеет вектор по этому изобретению, который содержит молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую указанный нейротрофический фактор, или функциональный фрагмент указанной молекулы нуклеиновой кислоты. "Функциональный фрагмент" указанной нуклеиновой кислоты означает фрагмент гена или кДНК, кодирующий указанный нейротрофический фактор или его функциональный эквивалент, который может быть экспрессирован с целью продуцирования функционального нейротрофического фактора роста по этому изобретению. Таким образом, фрагменты нейротрофического фактора роста по этому изобретению, которые соответствуют специфическим аминокислотным остаткам, взаимодействующим с соответствующим рецептором, также являются объектом настоящего изобретения и могут служить в качестве агонистов, активирующих соответствующий рецептор фактора роста по этому изобретению, что позволяет выявить его постоянное влияние на рост и жизнеспособность клеток. Объектом этого изобретения являются также дифференциально сплайсированные изоформы и сайты инициации транскрипции нуклеиновых кислот по этому изобретению.

В соответствии с настоящим изобретением указанная нуклеиновая кислота включает не только идентичную нуклеиновую кислоту, но и нуклеиновую кислоту с любыми незначительными изменениями оснований, включающими, в частности, замену оснований, ведущую к образованию тождественного кодона (другого кодона, определяющего тот же аминокислотный остаток), благодаря вырожденному коду в заменяемых консервативных аминокислотах. Термин молекула нуклеиновой кислоты означает также комплементарную последовательность к любой одноцепочечной последовательности, полученную в результате замены оснований.

Другим объектом этого изобретения является выделенный нейротрофический фактор роста человека, кодированный вышеуказанной молекулой нуклеиновой кислоты. Этот фактор роста предпочтительно содержит аминокислотную последовательность, соответствующую положениям 27-139, аминокислотной последовательности, показанной на фиг.1, ее функциональный эквивалент, производное или биологический предшественник.

Термин "функциональный эквивалент" в используемом здесь значении означает фактор роста, который обладает всеми свойствами и функциональными признаками, характериными для фактора роста, именуемого эновином. "Производное" эновина в используемом здесь значении означает полипептид, в котором некоторые аминокислоты изменены, удалены или заменены другими аминокислотами, при этом указанный полипептид сохраняет биологическую активность эновина и/или может взаимодействовать с антителами, полученными с использованием эновина по этому изобретению в качестве стимулирующего антигена.

В объем настоящего изобретения входят гибридные и модифицированные формы эновина, в том числе слитые белки и их фрагменты. Гибридные и модифицированные формы получают, модифицируя или заменяя некоторые аминокислоты, например, при помощи точковой мутации, причем указанные модификации все же позволяют получить белок, который сохраняет биологическую активность эновина по этому изобретению. Специфические последовательности нуклеиновых кислот можно изменить с получением фактора роста, обладающего такими же или практически такими же свойствами, что и эновин.

Как известно в этой области, многие белки продуцируются in vivo при помощи (пре)сигнальной последовательности у N-конца белка. Кроме того, такие белки могут содержать еще одну пропоследовательность, которая является устойчивым предшественником зрелого белка. Такие пре- и пропоследовательности обычно не нужны для достижения биологической активности. Молекула эновина по этому изобретению содержит не только непроцессированную последовательность, показанную на фиг.21, но и последовательность, занимающую положение 27-139, которая соответствует протеолитическому сайту процессинга RXXR, имеющемуся в факторах роста этого типа, и представляет собой зрелую последовательность эновина.

К указанным белковым, полипептидным или аминокислотным последовательностям по этому изобретению относятся не только идентичные аминокислотные последовательности, но и их изомеры, а также последовательности с незначительным изменением аминокислот, полученные из природной аминокислотной последовательности, допускающей замену консервативных аминокислот (замена аминокислотой, родственной ее боковым цепям). В объем этого изобретения входят также аминокислотные последовательности, которые отличаются от природной аминокислоты, но позволяют получить полипептид, который в иммунологическом отношении идентичен или подобен полипептиду, кодированному природной последовательностью.

Белки или полипептиды по этому изобретению далее включают варианты таких последовательностей, в том числе природные аллельные варианты, которые по существу гомологичны указанным белкам или полипептидам. В этом описании изобретения термин "существенная гомология" относится к последовательности, которая обладает по крайней мере 70%, предпочтительно 80%, 90% или 95% гомологией аминокислот с белками или полипептидами, кодированными молекулами нуклеиновых кислот по этому изобретению.

Нейротрофические факторы роста, экспрессированные клетками-хозяевами по этому изобретению, также входят в объем настоящего изобретения.

Настоящее изобретение далее относится к ингибированию нейротрофического фактора роста по этому изобретению in vivo методом антисмысловых молекул. Метод антисмысловых молекул можно использовать для контроля экспрессии генов путем создания тройной спирали или антисмысловой ДНК или РНК, причем оба эти метода основаны на связывании полинуклеотида с ДНК или РНК. Например, часть последовательности ДНК, кодирующей зрелый белок по настоящему изобретению, используют для конструирования олигонуклеотида антисмысловой РНК длиной от 10 до 50 пар оснований. Олигонуклеотид ДНК конструируют так, чтобы он был комплементарен области гена, участвующего в транскрипции (тройная спираль - см. Lee et al. Nucl. Acids. Res., 6:3073 (1979); Cooney et al., Science, 241:456 (1988); and Dervan et al., Science, 251:1360 (1991), что позволяет предотвратить транскрипцию и продуцирование эновина. Олигонуклеотид антисмысловой РНК гибридизует с мРНК in vivo и блокирует трансляцию молекулы мРНК с образованием эновина.

Благодаря сходству последовательностей у описанного фактора роста и ранее идентифицированных факторов роста семейства GDNF, считается, что эновин также способен стимулировать жизнеспособность и рост клеток и устранять нарушения, возникающие вследствие дефектов функционирования или экспрессии указанного нейротрофического фактора.

Поэтому молекулы нуклеиновых кислот или нейротрофический фактор по этому изобретению можно использовать для лечения или профилактики нарушений нервной системы у нуждающегося субъекта путем введения указанному субъекту молекулы нуклеиновой кислоты или фактора роста по этому изобретению в достаточной концентрации для ослабления симптомов указанного нарушения. Таким образом, молекулы нуклеиновых кислот по этому изобретению можно использовать для сохранения и улучшения жизнеспособности нервных клеток, а также для лечения заболеваний нервной системы или нейродегенеративных нарушений, включая болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, периферическую невропатию, боковой амиотрофический склероз, травму периферической и центральной нервной системы или поражение нейротоксинами.

Нейротрофический фактор роста по этому изобретению оказывает нейротрофическое или нейрозащитное действие на нервные клетки или популяции клеток, в частности на нервные клетки или популяции клеток, подвержденные апоптозу. Нуклеиновая кислота или фактор роста, именуемый эновином, по этому изобретению можно дополнительно использовать для лечения нейродегенеративных нарушений, таких как инсульт, болезнь Хантингтона, периферическая невропатия, острое поражение мозга, опухоли нервной системы, рассеянный склероз, боковой амиотрофический склероз, травма периферической нервной системы, поражение нейротоксинами, множественная неоплазия эндокринной системы, врожденная болезнь Гиршспрунга, прионассоциированные болезни, болезнь Крейтцфельда-Якоба, путем введения нуждающемуся субъекту указанной нуклеиновой кислоты или эновина в достаточной концентрации для ослабления или профилактики симптомов описанных здесь заболеваний нервной системы.

Кроме того, как подробно описано в нижеследующем примере, эновин ускоряет восполнение дефицита сенсорных нейронов, что предполагает возможность его использования для лечения или облегчения болевых синдромов, обусловленных нейрогенными нарушениями периферической или центральной нервной системы, ревматических/воспалительных заболеваний, а также нарушений проводимости путем введения эновина нуждающемуся субъекту в достаточной концентрации для ослабления или профилактики симптомов этих нарушений.

Альтернативный метод лечения вышеописанных нарушений нервной системы включает имплантацию в клетки субъекта, экспрессирующие нейротрофический фактор роста человека по этому изобретению, такие как описанные здесь трансгенные клетки.

Молекулы нуклеиновых кислот и нейротрофический фактор роста по этому изобретению могут также входить в состав фармацевтической композиции вместе с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или наполнителем.

Антитела к нейротрофическому фактору по настоящему изобретению можно получить методами, хорошо известными в этой области. Например, поликлональные антитела можно получить, инокулируя животное-хозяина, такое как мышь, фактором роста или его эпитопом, что дает иммунную сыворотку. Моноклональные антитела можно получить известными методами, в частности такими, которые описаны Kohler R. and Milstein С., Nature (1975) 256, 495-497.

Антитела по этому изобретению можно успешно использовать при осуществлении метода обнаружения фактора роста по этому изобретению, который включает взаимодействие антитела с образцом и идентификацию белка, связанного с указанным антителом. В объем этого изобретения входит набор для выполнения указанного метода, который включает антитело по этому изобретению и устройство для осуществления взаимодействия антитела с указанным образцом.

В объем настоящего изобретения входит также набор или устройство для обнаружения в образце нейротрофического фактора роста по этому изобретению, который включает вышеописанное антитело и приспособление для осуществления взаимодействия указанного антитела с указанным образцом.

Белки, взаимодействующие с нейротрофическим фактором по этому изобретению, например соответствующий клеточный рецептор, можно идентифицировать путем исследования белок-белкового взаимодействия, используя систему с двумя гибридными векторами, которая хорошо известна специалистам в области молекулярной биологии (Fields & Song, Nature 340:245, 1989). В основе этого метода лежит функциональное восстановление in vivo фактора транскрипции, активирующего репортерный ген. В частности, этот метод включает получение соответствующей клетки-хозяина с векторной ДНК, содержащей репортерный ген, под контролем промотора, регулируемого фактором транскрипции, имеющим ДНК-связывающий домен и активирующий домен, экспрессирующий в клетке-хозяине последовательность первой гибридной ДНК, кодирующей первое слияние фрагмента или всей последовательности нуклеиновой кислоты по этому изобретению, и указанный ДНК-связывающий домен или активирующий домен фактора транскрипции, экспрессирующий в клетке-хозяине по крайней мере одну последовательность второй гидрибной ДНК, имеющуюся в библиотеке или подобном хранилище, кодирующую предполагаемые исследуемые связывающие белки вместе с ДНК-связывающим или активирующим доменом фактора транскрипции, который не был включен в первое слияние; обнаружение связывания исследуемых белков с белком по этому изобретению путем выявления продукта репортерного гена в клетке-хозяине; необязательное выделение последовательностей второй гидрибной ДНК, кодирующей связывающий белок.

Примером осуществления такого метода является использование белка GAL4 в дрожжах. GAL4 является транскрипционным активатором галактозного обмена в дрожжах и имеет отдельный домен для связывания с активаторами вверху от генов, регулирующих галактозный обмен, а также связывающий белок домен. Можно сконструировать нуклеотидные векторы, один из которых содержит нуклеотидные остатки, кодирующие ДНК-связывающий домен GAL4. Эти остатки связывающего домена могут быть слиты с образованием известной кодирующей белок последовательности, такой как, например, нуклеиновые кислоты по этому изобретению. Другой вектор содержит остатки, кодирующие связывающий белок домен GAL4. В результате слияния этих остатков получают остатки, кодирующие испытуемый белок, предпочтительно на пути трансдукции сигнала рассматриваемого позвоночного животного. Любое взаимодействие между нейротрофическим фактором, кодированным нуклеиновой кислотой по этому изобретению, и испытуемым белком активирует транскрипцию ре-портерной молекулы в дрожжевой клетке GAL-4 с транскрипционной недостаточностью, в которой векторы были трансформированы. Репортерную молекулу, такую как -галактозидаза, предпочтительно активируют путем восстановления транскрипции генов галактозного обмена в дрожжах.

Авторы настоящего изобретения установили, что рецептором эновина является GFR3. Поэтому можно выполнять анализы, позволяющие выявить агонистов или антагонистов эновина. Этот анализ применим также к другим нейротрофическим факторам роста и соответствующим им рецепторам. Идентифицированные соединения можно использовать для лечения или профилактики таких заболеваний, как болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, нейродегенеративные нарушения, обусловленные увеличением последовательностей полиглутамина, такие как болезнь Хантингтона, периферическая невропатия, острое поражение головного мозга, опухоли нервной системы, рассеянный склероз, боковой амиотрофический склероз, травма периферической нервной системы, поражение нейротоксинами, множественная неоплазия эндокринной системы, врожденная болезнь Гиршспрунга, прионассоциированные болезни, болезнь Крейтцфельда-Якоба, инсульт, болевые синдромы с выраженными нейрогенными нарушениями периферической или центральной нервной системы, ревматические/воспалительные заболевания, а также нарушения проводимости, путем введения нуждающемуся субъекту указанного агониста или антагониста в достаточной концентрации для профилактики или лечения указанных заболеваний нервной системы. Такие соединения могут также входить в состав фармацевтических композиций вместе с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или наполнителем.

Агонисты или антагонисты фактора роста (такого как, например, эновин) можно идентифицировать в соответствии с одним вариантом осуществления изобретения, осуществляя контактирование клеточной ткани или организма, экспрессирующего приемлемый рецептор и cRET, с испытуемым соединением в присутствии данного фактора роста, и сравнивая степени активизации RET в указанной клетке, ткани или организме с контрольным образцом, который не подвергали контактированию с указанным испытуемым соединением.

Альтернативный способ осуществления этого изобретения относится к способу идентификации агонистов или антагонистов нейротрофического фактора роста, который включает контактирование клеточной ткани или организма, экспрессирующего соответствующий вектор указанного фактора роста и cRET, с испытуемым соединением в присутствии указанного фактора роста, измерение степени активации сигнальной киназы на пути трансдукции сигнала, составляющим элементом которого является указанный рецептор, после добавления антитела, специфичного к указанной сигнальной киназе, конъюгированной с репортерной молекулой, и сравнение с клеточной тканью или организмом, который не подвергали контактированию с указанным соединением.

Другим объектом этого изобретения является использование соединения, которое, как установлено, является антагонистом по этому изобретению, для изготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта или нарушений, обусловленных повышенной перистальтикой кишечника.

Соединения, идентифицированные при выполнении анализов по настоящему изобретению, можно успешно использовать для усиления моторики желудочно-кишечного тракта, поэтому они могут быть полезны для лечения заболеваний, обусловленных затрудненным или нарушенным прохождением содержимого по желудочно-кишечному тракту.

Кроме того, такие соединения можно эффективно использовать для лечения теплокровных животных, включая человека, страдающих затрудненным или нарушенным опорожнением желудка и в более широком смысле затрудненным или нарушенным прохождением содержимого по желудочно-кишечному тракту. Таким образом, настоящее изобретение относится к способу лечения таких заболеваний, как гастроэзофагальный рефлюкс, диспепсия, гастропарез, послеоперационная непроходимость кишечника и псевдонепроходимость кишечника.

Диспепсия означает нарушение функции пищеварения, которое может сопровождаться симптомом первичной дисфункции желудочно-кишечного тракта, в частности дисфункции желудочно-кишечного тракта, обусловленной повышенным мышечным тонусом, или осложнением, вызванным другими нарушениями, такими как аппендицит, заболевания желчного пузыря или неправильное питание. Симптомами диспепсии являются, например, отсутствие аппетита, ощущение тяжести, быстрое насыщение, тошнота, рвота и вздутие живота.

Гастропарез может возникнуть в результате неправильного функционирования желудка или в виде осложения вследствие таких заболеваний, как сахарный диабет, прогрессирующий системный склероз, анорексия, повышенная нервная возбудимость и миотоническая дистрофия.

Послеоперационная непроходимость кишечника означает закупорку или кинетическую недостаточность перистальтики кишечника вследствие нарушения мышечного тонуса после хирургического вмешательства.

Псевдонепроходимость кишечника означает состояние, характеризующееся запором, коликами и рвотой при отсутствии физической непроходимости.

Соединения по настоящему изобретению можно использовать для устранения фактической причины заболевания или ослабления его симптомов.

Кроме того, некоторые соединения, являющиеся стимуляторами кинетической активности толстого кишечника, можно использовать для нормализации или улучшения прохождения содержимого через кишечник у субъектов с симптомами нарушения перистальтики, например уменьшения перистальтики только тонкого и толстого кишечника или в сочетании с медленным опорожнением желудка.

С учетом способности соединений по настоящему изобретению усиливать кинетическую активность толстого кишечника объектом этого изобретения является способ лечения теплокровных животных, включая человека, страдающих нарушениями перистальтики кишечника, такими как запоры, псевдонепроходимость, атония кишечника, послеоперационная атония кишечника, синдром раздраженной толстой кишки (IBS) и вызванное лекарственными сре