Белок, способный ингибировать остеокластогенез (ocif) (варианты), кднк, способ получения белка, способ лечения остеопороза, способ лечения и/или улучшения востановления массы кости, способ лечения нарушения, связанного с костным метаболизмом, трансформированный штамм escherichia coli pbk/01f10 и фармацевтическая композиция

Белок, способный ингибировать остеокластогенез (ocif) (варианты), кднк, способ получения белка, способ лечения остеопороза, способ лечения и/или улучшения востановления массы кости, способ лечения нарушения, связанного с костным метаболизмом, трансформированный штамм escherichia coli pbk/01f10 и фармацевтическая композиция

Реферат

 

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению белка/фактора ингибирования остеокластогенеза (OCIF), и может быть использовано для лечения и иммунологической диагностики заболеваний, сопровождающихся резорбцией костей. Белок OCIF с молекулярной массой приблизительно 60 кД в условиях восстановления, с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 1, 2 и 3, получают путем трансформации клетки-хозяина вектором, содержащим кДНК, кодирующую этот белок. Белок OCIF в составе фармацевтической композиции используют в способах лечения остеопороза, лечения/улучшения восстановления массы кости, а также в способе лечения нарушения, связанного с костным метаболизмом. Изобретение позволяет получить новый белок, который эффективно ингибирует образование остеокластов. 9 н. и 3 з.п. ф-лы, 15 ил., 16 табл.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к новому белку - фактору ингибирования остеокластогенеза (OCIF) и к способам получения такого белка.

Предпосылки создания изобретения

Человеческие кости постоянно преобразовываются за счет повторяющихся процессов резорбции и воссоздания. Полагают, что при этих процессах остеобласты и остеокласты являются клетками, ответственными, в основном, за костеобразование и резорбцию костей соответственно. Типичным примером заболевания, вызванного развитием аномального костного метаболизма, является остеопороз. Известно, что это заболевание провоцируется состоянием, при котором резорбция костей остеокластами превышает костеобразование остеобластами, но механизм остеопороза пока полностью невыяснен. Остеопороз вызывает боль в костях и делает кости хрупкими, что приводит к переломам. Так как остеопороз увеличивает число лежачих пациентов пожилого возраста, он становится социальной проблемой при возрастании числа пожилых людей. Поэтому ожидается, что будут разрабатываться эффективные лекарственные средства для лечения этого заболевания. Снижение костной массы, вызванное аномальным костным метаболизмом, как считается, можно предупредить посредством ингибирования резорбции костей, улучшения костеобразования или улучшения уравновешенного метаболизма.

Предполагается, что костеобразование промотируется путем стимулирования роста, дифференцировки или активации остеобластов. Сообщается, что многие цитокины стимулируют рост или дифференцировку остеобластов, т.е. фактор роста фибробластов (FGF) (Rodan S.B. et al.. Endocrinology, vol.121, р.1917, 1987), инсулиноподобный фактор роста I (IGF-I) (Hock J.M. et al., Endocrinolory, vol.122, p.254, 1988), инсулиноподобный фактор роста II (IGF-II) (McCarthy Т. et al., Endocrinology, vol.124, p.301, 1989), активин A (Centrella M. et al., Mol. Cell. Biol., vol.11, p.250, 1991), васкулотропин (Varonique M. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., vol.199, p.380, 1994) и морфогенетический костный белок (BMP) (Yamaguchi A. et al., J. Cell Biol., vol.113, p.682, 1991, Sampath Т.К. et al., J. Biol. Chem., vol.267, p.20532, 1992, и Knutsen R. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 194, p.1352, 1993).

С другой стороны, уделялось внимание и интенсивно изучались цитокины, которые ингибируют дифференцировку и/или созревание остеокластов. Обнаружено, что трансформирующий -фактор роста (Chenu С. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.85, p.5683, 1988) и интерлейкин-4 (Kasano К. et al., Bone-Miner., vol.21, p.179, 1993) ингибируют дифференцировку остеокластов. Обнаружено, что кальцитонин (Bone-Miner., vol.17, р.347, 1992), макрофагальный колониестимулирующий фактор (Hattersley G. et al.,. J. Cell. Physiol., vol.137, p.199, 1988), интерлейкин-4 (Watanabe, К. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., vol.172, p.1035, 1990) и -интерферон (Cowen M. et al., J. Bone-Miner. Res., vol.1, p.469, 1986) ингибируют резорбцию костей остеокластами.

Предполагается, что эти цитокины являются эффективными лекарственными средствами для улучшения восстановления костной массы путем стимуляции костеобразования и/или путем ингибирования резорбции костей. Цитокины, такие как инсулиноподобный фактор роста I и костные морфогенетические белки, в настоящее время прошли клинические испытания на их действие при лечении пациентов с костными заболеваниями. Кальцитонин уже применяют в качестве лекарственного средства для лечения остеопороза и для уменьшения боли при остеопорозе.

Примерами лекарственных средств, в настоящее время используемых клинически для лечения костных заболеваний и для сокращения периода лечения, являются дигидроксивитамин ₃, витамин К₂, кальцитонин и его производные, гормоны, такие как эстрадиол, иприфлавон, и препараты кальция. Однако эти лекарственные средства не обеспечивают удовлетворительного терапевтического действия, и, как и ожидалось, разрабатываются новые лекарственные средства. Как уже упоминалось, костный метаболизм регулируется балансом между резорбцией костей и костеобразованием. Поэтому предполагается, что в качестве лекарственных средств для лечения костных заболеваний, таких как остеопороз, будут разрабатываться цитокины, которые ингибируют дифференцировку и/или созревание остеокластов.

Изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение предпринято с учетом описанных выше соображений. Целью настоящего изобретения является как новый фактор, названный фактором ингибирования остеокластогенеза (OCIF), так и эффективный способ получения указанного фактора.

Авторы настоящего изобретения провели интенсивные поиски факторов ингибирования остеокластогенеза в кондиционированной человеческими эмбриональными фибробластами IMR-90 (АТСС CCL186) среде и обнаружили новый фактор ингибирования остеокластогенеза (OCIF), который ингибирует дифференцировку и/или созревание остеокластов.

Авторы настоящего изобретения создали способ накопления белка до высокой концентрации путем культивирования клеток IMR-90 с использованием кусков глиноземистой керамики в качестве основы для прилипания клеток.

Авторы настоящего изобретения также создали эффективный способ выделения белка OCIF из кондиционированной IMR-90 среды с использованием последовательного ряда колоночной хроматографии - ионообменной, гепарин-аффинной, аффинной к цибарону синему и обращенно-фазовой.

Авторы настоящего изобретения, основываясь на аминокислотной последовательности очищенного природного OCIF, успешно клонировали кДНК, кодирующую этот белок. Авторы настоящего изобретения создали также процедуру получения этого белка, который ингибирует дифференцировку остеокластов. Настоящее изобретение относится к белку, который получают с помощью клеток фибробластов легких человека, имеет молекулярную массу при определении методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) 60 кД в условиях восстановления и 120 кД при невосстанавливающих условиях, обладает аффинностью как к катионообменным смолам, так и к гепарину, снижает свою активность ингибирования дифференцировки и созревания остеокластов при обработке в течение 10 минут при 70С или в течение 30 минут при 56С и теряет свою активность ингибирования дифференцировки и созревания остеокластов при обработке в течение 10 минут при 90С. По аминокислотной последовательности белок OCIF, который описан в настоящем изобретении, ясно отличается от любых известных факторов, ингибирующих образование остеокластов.

Настоящее изобретение включает способ очистки белка OCIF, включающий (1) выращивание человеческих фибробластов, (2) внесение кондиционированной среды в колонку с гепарином для получения адсорбированной фракции, (3) очистку белка OCIF с использованием катионообменной колонки, (4) очистку белка OCIF с использованием гепарин-аффинной колонки, (5) очистку белка OCIF с использованием аффинной колонки с цибакроном синим, (6) выделение белка OCIF с использованием колонки для обращенно-фазовой хроматографии. Цибакрон синий, соединенный с носителем, изготовленным из синтетических гидрофильных полимеров, является примером материала, применяемого для получения колонок с цибакроном синим. Эти колонки обычно называют "синими колонками".

Настоящее изобретение включает способ накопления белка OCIF до высоких концентраций путем культивирования человеческих фибробластов с использованием кусков глиноземистой керамики в качестве основы для прилипания клеток.

Кроме того, авторы настоящего изобретения определили аминокислотные последовательности пептидов, производных от OCIF, сконструировали затравки на основе этих аминокислотных последовательностей и получили фрагменты кДНК, кодирующие OCIF, из кДНК-библиотеки клеток IMR-90.

Подробное описание изобретения

Белок OCIF настоящего изобретения можно выделить из кондиционированной среды человеческих фибробластов с высоким выходом. Процедура выделения OCIF основана на обычных технических приемах очистки белков от биоматериалов, в соответствии с физическими и химическими свойствами белка OCIF. Например, способ концентрации включает обычные биохимические способы, такие как ультрафильтрация, лиофилизация и диализ. Метод очистки включает сочетания нескольких приемов хроматографии для очистки белков, таких как ионообменная колоночная хроматография, аффинная колоночная хроматография, колоночная гель-фильтрация, гидрофобная колоночная хроматография, колоночная хроматография с обращенной фазой и препапаративный гель-электрофорез. Человеческие фибробласты, используемые для получения белка OCIF, представляют собой предпочтительно IMR-90. Способ получения кондиционированной IMR-90 среды представляет собой предпочтительно способ, включающий прилипание человеческих эмбриональных клеток IMR-90 к кусочкам глиноземистой керамики в роллер-флаконах, применение модифицированной по способу Дульбекко среды Игла (DMEM) с добавлением 5% сыворотки новорожденного теленка для культивирования клеток и культивирование клеток в роллер-флаконах в течение 7-10 суток методом стендовой культивации. К буферу в качестве детергента на стадиях очистки белка OCIF добавляют предпочтительно ХАПС (3-[(3-холамидопропил)диметиламмоний]-1-пропансульфонат).

Белок OCIF настоящего изобретения можно сначала получить в виде гепаринсвязывающей основной фракции OCIF путем внесения культуральной среды в колонку с гепарином (гепарин-сефароза CL-6B, Pharmacia), элюирования 10 мМ буфером трис-НСl, рН 7,5, содержащим 2 М NaCl, и последующего внесения фракции OCIF в Q. анионнообменную колонку (HiLoad-Q/FF, Pharmacia) и сбора неадсорбированной фракции. Белок OCIF можно очистить, подвергая полученную фракцию OCIF очистке на S. катионообменной колонке (HiLoad-S/FF, Pharmacia), колонке с гепарином (гепарин-5РW, TOSOH), колонке с цибакроном синим (Blue-5PW, TOSOH) и на колонке для обращенно-фазовой хроматографии (BU-300 C4, Perkin Elmer), и вещество определяют по описанным ранее свойствам.

Настоящее изобретение относится к способу клонирования кДНК, кодирующей белок OCIF, на основании аминокислотной последовательности природного OCIF, и к способу получения рекомбинантного белка OCIF, который ингибирует дифференцировку и/или созревание остеокластов. Белок OCIF очищают по способу, описанному в настоящем изобретении, и обрабатывают эндопептидазой (например, лизилэндопептидазой). Определяют аминокислотные последовательности пептидов, полученных при гидролизе, и синтезируют смесь олигонуклеотидов, которые могут кодировать каждую внутреннюю аминокислотную последовательность. Фрагмент кДНК OCIF получают ПЦР (предпочтительно, RT-ПЦР-ПЦР с обратной транскриптазой), используя в качестве затравок описанные выше олигонуклеотидные смеси. кДНК OCIF полной длины, кодирующую белок OCIF, клонируют из кДНК-библиотеки, используя в качестве зонда полученный фрагмент ДНК OCIF. кДНК OCIF, содержащую полную кодирующую область, вставляют в экспрессионный вектор. Рекомбинантный OCIF можно получить путем экспрессии в клетках млекопитающих или в бактериях кДНК OCIF, содержащей полную кодирующую область.

Настоящее изобретение относится к новым белкам OCIF2, OCIF3, OCIF4 и OCIF5, которые являются вариантами OCIF и обладают описанной выше активностью. Эти варианты OCIF получают из кДНК-библиотеки, созданной с IMR-90 поли(А)+РНК путем гибридизации с использованием в качестве зонда фрагмента кДНК OCIF. Каждую из кДНК вариантов OCIF, содержащую полную кодирующую область, вставляют в экспрессионный вектор. Каждый вариант рекомбинантного OCIF можно получить путем экспрессии каждой из кДНК вариантов OCIF, кодирующей полную кодирующую область, в обычных хозяевах. Каждый вариант рекомбинантного OCIF можно очистить по способу, описанному в настоящем изобретении. Каждый вариант рекомбинантного OCIF обладает способностью ингибировать остеокластогенез.

Настоящее изобретение включает также мутанты OCIF. Существуют мутанты замещения, в которых один цистеиновый остаток, вероятно, участвующий в образовании димера, замещен на остаток серина, и различные делеционные мутанты OCIF. Замещения или делеции вводят в кДНК OCIF с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) или путем переваривания рестрикционными ферментами. Каждую из этих мутированных кДНК OCIF вставляют в вектор, содержащий соответствующий промотор для генной экспрессии. Полученный в результате экспрессионный вектор для каждого из мутантов OCIF трансфектируют в эукариотные клетки, такие как клетки млекопитающего. Каждый из мутантов OCIF можно получить и очистить от кондиционированной среды трансфектированных клеток.

Настоящее изобретение относится к поликлональным антителам и к способу количественного определения концентрации OCIF с использованием этих поликлональных антител.

В качестве антигенов (иммуногенов) можно использовать природный OCIF, полученный из кондиционированной IMR-90 среды, рекомбинантный OCIF, продуцированный такими хозяевами, как микроорганизмы и эукариоты с использованием кДНК OCIF, синтетические пептиды на основе аминокислотной последовательности OCIF или пептиды, полученные из OCIF путем частичного переваривания. Поликлональные антитела против OCIF получают путем иммунизации соответствующих млекопитающих антигенами в сочетании с адъювантами для иммунизации, при необходимости, и очистки от сыворотки обычными способами очистки. Поликлональные антитела против OCIF, которые метят радиоизотопами или ферментами, можно использовать в системах радиоиммунного анализа (РИА) или в системах иммунного анализа (ИФА). С помощью этих систем анализа можно легко определить концентрации QCIF в биологических материалах, таких как кровь и асциты, и в среде для культивирования клеток.

Антитела в настоящем изобретении можно использовать при радиоиммуноанализе (РИА) или при иммуноферментном анализе (ИФА). Используя эти системы анализа можно легко определить концентрацию OCIF в биологических материалах, таких как кровь и асциты.

Настоящее изобретение относится к новым моноклональным антителам и к способу количественного определения концентрации OCIF с использованием этих моноклональных антител.

Моноклональные антитела против OCIF можно получить с помощью обычного метода с использованием OCIF в качестве антигена. В качестве антигенов можно использовать нативный OCIF, полученный из культуральной среды клеток IMR-90, и рекомбинантный OCIF, продуцированный такими хозяевами, как микроорганизмы и эукариоты с использованием кДНК OCIF. С другой стороны, в качестве антигенов можно также использовать синтезированные пептиды, созданные на основе аминокислотной последовательности OCIF, и пептиды, полученные из OCIF путем частичного переваривания. Иммунизированные лимфоциты, полученные путем иммунизации млекопитающих антигеном методом иммунизации in vitro, сливают с миеломой млекопитающих, и получают гибридому. Из гибридом, полученных при слиянии клеток, отбирают гибридомные клоны, секретирующие антитело, которое узнает OCIF. Нужные антитела можно получить путем выращивания клеток отобранных гибридомных клонов. При получении гибридомы особенно полезны для иммунизации мелкие животные, такие как мыши или крысы. Для иммунизации OCIF разводят до необходимой степени физиологическим раствором (0,15 М NaCl) и вводят с адъювантом животным 2-5 раз каждые 2-20 дней внутривенно или интраперитонеально. Иммунизированное животное убивают через три дня после последней иммунизации, извлекают селезенку, и используют спленоциты как иммунизированные В-лимфоциты.

Клеточные линии мышиной миеломы для слияния клеток с иммунизированными В-лимфоцитами включают, например, р3/63-Аg8, p3-U1, NS-1, МРС-11, SP-2/0, F0, р363 Аg8.653 и S194. Можно также использовать крысиную клеточную линию R-210. Человеческие В-лимфоциты иммунизируют методом иммунизации in vitro и сливают с клеточной линией человеческой миеломы или человеческими В-лимфоцитами, трансформированными ЕВ-вирусом, которые используют в качестве родительской клеточной линии для слияния клеток, и продуцируют антитело человеческого типа.

Слияние клеток иммунизированных В-лимфоцитов и миеломной клеточной линии осуществляют, в основном, обычными способами. Например, используют, как правило, метод Koehler G. с сотр. (Nature, 256, 495-497, 1975), а также для слияния клеток можно применить метод электрического импульса. Иммунизированные В-лимфоциты и трансформированные В-клетки смешивают в обычных соотношениях, и для слияния клеток используют, как правило, культуральную среду без сыворотки плода коровы (FBS), содержащую полиэтиленгликоль. Слитые с миеломной клеточной линией В-лимфоциты для отбора гибридомы выращивают в селекционной среде ГАТ, содержащей FBS.

Для отбора гибридомы, продуцирующей антитело против OCIF, можно использовать, главным образом, ИФА, анализ бляш-кообразования, Ouchterlony или реакцию агглютинации. Среди этих методов простым и легким для осуществления с достаточной точностью является ИФА, и его-то главным образом и используют. С помощью ИФА с использованием очищенного OCIF можно легко и точно отобрать нужное антитело. Полученную таким образом гибридому можно культивировать посредством обычного метода выращивания клеток и заморозить, чтобы иметь в наличии при необходимости. Антитело можно получить путем культивирования гибридомы с использованием обычного метода выращивания клеток или путем интраперитонеальной трансплантации гибридомы животным. Антитело можно очистить обычными методами очистки, такими как осаждение солью, гель-фильтрация и аффинная хроматография. Полученное антитело специфически реагирует с OCIF и может использоваться для определения концентрации OCIF и очистки OCIF. Антитела настоящего изобретения узнают эпитопы OCIF и обладают высокой аффинностью к OCIF. Следовательно, их можно использовать для создания ИФА. С помощью (использования) этой системы анализа можно легко определить концентрацию OCIF в биологических материалах, таких как кровь и асциты.

Настоящее изобретение относится к средствам, применяемым для лечения костных заболеваний, которые в качестве действующего ингредиента содержат OCIF. Крыс подвергают денервации левой передней конечности. Испытываемые соединения вводят ежесуточно после операции в течение 14 дней. После 2-недельной обработки животных умерщвляют и рассекают их передние конечности. После этого испытывают кости на механическую прочность методом изгибания в трех точках. OCIF улучшает механическую прочность кости в зависимости от дозы.

Белок OCIF настоящего изобретения пригоден как фармацевтический ингредиент для лечения или снижения потерь костной массы при остеопорозе, костных заболеваниях, таких как ревматизм, остеоартрит, и аномального костного метаболизма при множественной миеломе. Белок OCIF также полезен в качестве антигена для установления иммунологического диагноза заболевания. Составлены фармацевтические препараты, содержащие белок OCIF в качестве активного ингредиента, и их можно вводить перорально или парентерально. Препараты содержат белок OCIF настоящего изобретения в качестве действующего ингредиента и безопасны при введении человеку или животным. Примерами фармацевтических препаратов являются композиции для инъекций или капельного внутривенного вливания, суппозитории, назальные препараты, подъязычные препараты и пластыри для чрескожного поглощения. Фармацевтические препараты для инъекции можно получить путем смешивания фармакологически эффективного количества белка OCIF и фармацевтически приемлемых носителей. Носителями являются наполнители и/или активаторы, т.е. аминокислоты, сахариды, производные целлюлозы и другие органические и неорганические соединения, которые, как правило, добавляются к активным ингредиентам. Когда белок OCIF смешивают с наполнителями и/или активаторами для получения инъекций, могут быть добавлены, при необходимости, регуляторы рН, буферы, стабилизаторы, солюбилизаторы и т.п.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 приводится картина элюирования сырого белка OCIF (фракция проходит через Hiload-Q/FF; образец 3) из колонки с Hilaod-S/HP.

На фиг.2 приводится картина элюирования сырого белка OCIF (фракция гепарин-SPW; образец 5) из колонки с синим-5PW.

На фиг.3 приводится картина элюирования сырого белка OCIF (фракции 49-50, синий-SPW) из колонки для обращенно-фазовой хроматографии.

На фиг.4 приводятся данные SDS-PAGE выделенных белков OCIF в условиях восстановления и в невосстанавливающих условиях.

Описание полос:

полосы 1, 4 - маркерные белки молекулярной массы;

полосы 2, 5 - белок OCIF пика 6 на фиг.3;

полосы 3, 6 - белок OCIF пика 7 на фиг.3.

Фиг.5 дает картину элюирования пептидов, полученных путем переваривания пиридилэтилированного белка OCIF лизилэн-донуклеазой, на колонке для хроматографии с обращенной фазой.

На фиг.6 приводятся данные SDS-PAGE изолированного природного (n) OCIF-белка и рекомбинантного (r) белка OCIF в невосстанавливающих условиях. rOCIF(E) и rOCIF(C) продуцируются в клетках 293/EBNA и в СНО-клетках соответственно.

Описание полос:

полоса 1 - маркерные белки молекулярной массы;

полоса 2 - белок nOCIF мономерного типа;

полоса 3 - белок nOCIF димерного типа;

полоса 4 - белок rOCIF(E) мономерного типа;

полоса 5 - белок rOCIF(E) димерного типа;

полоса 6 - белок rOCIF(С) мономерного типа;

полоса 7 - белок rOCIF(С) димерного типа.

На фиг.7 приводятся данные SDS-PAGE изолированного природного (n) OCIF-белка и рекомбинантного (r) белка OCIF в восстанавливающих условиях. rOCIF(E) и rOCIF(С) продуцируются в клетках 293/EBNA и в СНО-клетках соответственно.

Описание полос:

полоса 8 - маркерные белки молекулярной массы;

полоса 9 - белок nOCIF мономерного типа;

полоса 10 - белок-nOCIF димерного типа;

полоса 11 - белок rOCIF(E) мономерного типа;

полоса 12 - белок rOCIF(E) димерного типа;

полоса 13 - белок rOCIF(С) мономерного типа;

полоса 14 - белок rOCIF(С) димерного типа.

На фиг.8 приводятся данные SDS-PAGE изолированного природного (n) OCIF-белка и рекомбинантного (r) белка OCIF, из которых в условиях восстановления удалены N-связанные цепи сахаров. rOCIF(E) и rOCIF(С) являются белком rOCIF, продуцированным в клетках 293/EBNA и в СНО-клетках соответственно.

Описание полос:

полоса 15 - маркерные белки молекулярной массы;

полоса 16 - белок nOCIF мономерного типа;

полоса 17 - белок nOCIF димерного типа;

полоса 18 - белок rOCIF(E) мономерного типа;

полоса 19 - белок rOCIF (E) димерного типа;

полоса 20 - белок rOCIF(С) мономерного типа;

полоса 21 - белок rOCIF (С) димерного типа.

На фиг.9 сравниваются аминокислотные последовательности OCIF и OCIF2.

Фиг.10 показывает сравнение аминокислотных последовательностей OCIF и OCIF3.

Фиг.11 показывает сравнение аминокислотных последовательностей OCIF и OCIF4.

Фиг.12 показывает сравнение аминокислотных последовательностей OCIF и OCIF5.

На фиг.13 приводится стандартная кривая для определения концентрации белка OCIF с помощью ИФА с использованием поликлональных антител против OCIF.

На фиг.14 приводится стандартная кривая для определения концентрации белка OCIF с помощью ИФА с использованием моноклональных антител против OCIF.

На фиг.15 показывается действие белка OCIF при остеопорозе.

Наилучший способ осуществления изобретения

Настоящее изобретение в дальнейшем будет поясняться с помощью приведенных ниже примеров, однако объем изобретения не ограничивается указанными примерами.

ПРИМЕР 1

Получение кондиционированной среды человеческих фиброластов IMR-90

Человеческие эмбриональные легочные фибробластные клетки IMR-90 (ATCC-CCL186) выращивают на кусках глиноземистой керамики (80 г) (99,5% диоксида алюминия, изготовитель Toshiba Ceramic К.К.) в среде DMEM (изготовитель Gibco BRL Со.) с добавлением 5% CS (телячьей сыворотки) и 10 мМ буфера HEPES (500 мл на роллер-флакон) при 37С в присутствии 5% СО₂ в течение 7-10 суток, с использованием 60 роллер-флаконов (490 см², 110171 мм, изготовитель Coning Co.) в стационарной культуре. Кондиционированную среду собирают, и в роллер-флаконы добавляют свежую среду. Получают около 30 л кондиционированной IMR-90 культуры на загрузку культуры. Кондиционированную среду обозначают как образец 1.

ПРИМЕР 2

Метод анализа на активность ингибирования развития остеокластов

Активность ингибирования развития остеокластов анализируют путем измерения активности тартрат-резистентной кислой фосфатазы (TRAP) по методам М. Kumegava с сотр. (Protein. Nucleic Acid. Enzyme, vol.34, p.999, 1989) и N. Takahashi с сотр. (Endocrynology, vol.122, p.1373, 1988) с некоторыми изменениями. Коротко, клетки костного мозга, полученные от мыши в возрасте 17 дней, суспендируют в -МЕМ (минимальная поддерживающая среда) (изготовитель GIBCO BRL Co.), содержащей 10% FBS, 210^-8 М активированного витамина D₃ и каждый испытываемый образец, и инокулируют в каждую лунку 96-луночного планшета при плотности клеток 310⁵ клеток/0,2 мл/лунку. Планшеты инкубируют в течение 7 суток при 37С в увлажненной атмосфере с 5% СО₂. Культуры продолжают выращивать далее, заменяя 0,16 мл старой среды тем же объемом свежей среды на 3 и 5 сутки после начала культивирования. На 7 сутки, после промывания планшетов забуференным фосфатом физиологическим раствором, клетки фиксируют этанолом с ацетоном (1:1) в течение 1 мин при комнатной температуре, а затем проверяют развитие остеокластов путем определения активности фосфатазы с использованием набора (кислая фосфатаза, лейкоциты, № по каталогу 387-А, производство Sigma Co.). Снижение числа позитивных к TRAP клеток принимают за показатель активности OCIF.

ПРИМЕР 3

Очистка OCIF

I) Колоночная хроматография на гепарин-сефарозе CL-6B

Кондиционированную IMR-90 среду (90 л, образец 1) фильтруют через 0,22-мкм мембранный фильтр (гидрофильный милли-диск, 2000 см², Millipore Co.), и разделяют фильтрат на три части. Каждую часть (30 л) вносят в колонку с гепарин-сефарозой CL-6B (54,1 см, Pharmacia Co.), уравновешенную 10 мМ трис-HCl, содержащим 0,3 М NaCl, pH 7,5. После промывания колонки 10 мМ трис-HCl, pH 7,5, при скорости потока 500 мл/ч белковую фракцию, адсорбированную на гепарин-сефарозе CL-6B, элюируют 10 мМ трис-HCl, pH 7,5, содержащим 2 М NaCl. Фракцию обозначают как образец 2.

II) Колоночная хроматография на HiLoad-Q/FF

Фракцию с гепарин-сефарозного адсорбента (образец 2) диализуют против 10 мМ трис-HCl, pH 7,5, с добавлением ХАПС до конечной концентрации 0,1%, инкубируют при 4С в течение ночи и разделяют на две части. Затем каждую часть вносят в анионообменную колонку (HiLaod-Q/FF, 2,610 см, Pharmacia Co.), которую уравновешивают 50 мМ трис-HCl, 0,1% ХАПС, рН 7,5, и получают неадсорбированную фракцию (1000 мл). Эту фракцию обозначают как образец 3.

III) Колоночная хроматография на HiLoad-S/HP

Неадсорбированную на HiLoad-Q фракцию (образец 3) загружают в катионообменную колонку (HiLoad-S/HP, 2,610 см, Pharmacia Co.), которую уравновешивают 50 мМ трис-HCl, 0,1% ХАПС, рН 7,5. После промывания колонки 50 мМ трис-HCl, 0,1% ХАПС, рН 7,5, адсорбированный белок элюируют с линейным градиентом от 0 до 1 М NaCl при скорости потока 8 мл/мин в течение 100 мин, и собирают фракции (12 мл). Каждые 10 фракций номеров с 1 по 40 объединяют для образования одной порции. По 100 мкл каждой из четырех порций испытывают на активность OCIF. Активность OCIF наблюдают во фракциях с 11 по 30 (как показано на фиг.1). Фракции с 21 по 30, которые обладают более высокой специфической активностью, собирают и обозначают как образец 4.

IV) Аффинная колоночная хроматография с гепарином 5PW

Разводят 120 мл фракции с HiLoad с 21 по 30 (образец 4) 240 мл 50 мМ трис-HCl, 0,1% ХАПС, рН 7,5, и вносят в колонку для аффинной хроматографии с гепарином 5PW (0,87,5 см, Tosoh Co.), которую уравновешивают 50 мМ трис-HCl, 0,1% ХАПС, рН 7,5. После промывания колонки 50 мМ трис-HCl, 0,1% ХАПС, рН 7,5, адсорбированный белок элюируют с линейным градиентом от 0 до 2 М NаСl при скорости потока 0,5 мл/мин в течение 60 мин, и собирают фракции (0,5 мл). Из каждой фракции отбирают по 50 мкл для испытания на активность OCIF. Активные фракции, элюированные 0,7-1,3 М NaCl, объединяют и обозначают как образец 5.

V) Аффинная колоночная хроматография на синем 5PW

Образец 5 (10 мл) разбавляют 190 мл 50 мМ трис-HCl, 0,1% ХАПС, рН 7,5, и вносят в колонку с синим 5PW для аффинной хроматографии (0,55 см, Tosoh Co.), которую уравновешивают 50 мМ трис-HCl, 0,1% ХАПС, рН 7,5. После промывания колонки 50 мМ трис-HCl, 0,1% ХАПС, рН 7,5, адсорбированный белок элюируют 30 мл с линейным градиентом от 0 до 2 М NaCl при скорости потока 0,5 мл/мин, и собирают фракции (0,5 мл). Используя 25 мкл каждой фракции, оценивают активность OCIF. Фракции с номерами от 49 по 70, элюированные 0,1-1,6 М NaCl, обладают активностью OCIF.

VI) Колоночная хроматография с обращенной фазой

Фракцию с синего 5PW, полученную при сборе фракций 49-50, подкисляют 10 мкл 25% ТФК (трифторуксусная кислота) и вносят в колонку С4 для хроматографии с обращенной фазой (BU-300, 2,1220 мм, производство Perkin-Elmer), которую уравновешивают 0,1% ТФК и 25% ацетонитрила. Адсорбированный белок элюируют с градиентом ацетонитрила от 25 до 55% при скорости потока 0,2 мл/мин в течение 60 мин, и пик каждого белка собирают (фиг.3). Фракцию каждого пика (100 мкл) испытывают на активность OCIF, и активностью OCIF обладают пик 6 и пик 7. Результаты приводятся в табл.1.

ПРИМЕР 4

Молекулярная масса белка OCIF

Два белковых пика (6 и 7) с активностью OCIF подвергают электрофорезу в полиакриламидном геле в присутствии ДСН в условиях восстановления и в невосстанавливающих условиях. Коротко, 20 мкл фракции каждого пика концентрируют в вакууме и растворяют в 1,5 мкл 10 мМ трис-HCl, рН 8, 1 мМ ЭДТК, 2,5% ДСН, 0,01% бромофенолового синего, и инкубируют при 37°С в течение ночи в невосстанавливающих условиях или в условиях восстановления (с 5% 2-меркаптоэтанола). Затем по 1,0 мкл каждого образца анализируют методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии ДСН с градиентом геля 10-15% акриламида (Pharmacia Co.) и приспособлением для электрофореза (Fast System, Pharmacia Co.). Для вычисления молекулярной массы используют следующие маркерные белки молекулярной массы: фосфорилазу b (94 кД), бычий сывороточный альбумин (67 кД), овальбумин (43 кД), карбоангидразу (30 кД), триприновый ингибитор (20,0 кД) и лактальбумин (14,4 кД). После электрофореза белковые полосы визуализируют серебряным красителем, используя набор Phast с серебряным красителем. Результаты приводятся на фиг.4.

Полоса белка явно в 60 кД детектируется в белке пика 6 как в условиях восстановления, так и в невосстанавливающих условиях. В белке пика 7 полоса белка с явными 60 кД детектируется в условиях восстановления, и полоса белка с явными 120 кД детектируется в невосстанавливающих условиях. Поэтому белок пика 7 рассматривают как гомодимер белка пика 6.

ПРИМЕР 5

Термоустойчивость OCIF

Образцы в 20 мкл фракций 51 и 52 из синего 5PW разбавляют до 30 мкл 10 мМ забуференного фосфатом физиологического раствора, рН 7,2, и инкубируют в течение 10 мин при 70С или 90С, или в течение 30 мин при 56С. После термообработки образцы проверяют на активность OCIF. Результаты приводятся в табл.2.

ПРИМЕР 6

Внутренняя аминокислотная последовательность белка OCIF

Каждые 2 фракции (1 мл) №№51-70 из фракции из синего 5PW подкисляют 10 мкл 25% ТФК и вносят в колонку С4 для хроматографии с обращенной фазой (BU-300, 2,1220 мм, производство Perkin-Elmerr-Co.), уравновешенную 25% ацетонитрила, содержащего 0,1% ТФК. Адсорбированный белок элюируют 12 мл раствора с линейным градиентом ацетонитрила от 25 до 55% при скорости потока 0,2 мл-мин, и собирают белковые фракции, соответствующие пику 6 и пику 7 соответственно. Белок каждого пика вносят в белковый секвенатор (PROCISE 494, Perkin-Elmer Co.). Однако N-концевую последовательность белка каждого пика нельзя проанализировать. Поэтому N-конец белка каждого пика считается блокированным. Таким образом, анализируются внутренние аминокислотные последовательности этих белков.

Белок пика 6 или пика 7, очищенный С4-ВЭЖХ, концентрируют центрифугированием и пиридилэтилируют в условиях восстановления. Коротко, 50 мкл 0,5 М трис-HCl, рН 8,5, содержащего 100 мкг дитиотрейтола, 10 мМ ЭДТК, 7 М гидрохлорида гуанидина и 1% ХАПС, добавляют к каждому образцу, и смеси инкубируют в течение ночи в темноте при комнатной температуре. Каждую смесь подкисляют 25% ТФК (конечная концентрация 0,1%) и вносят в колонку С4 для хроматографии с обращенной фазой (BU-300, 2,130 мм, Perkin-Elmer Co.), уравновешенную 20% ацетонитрила, содержащего 0,1% ТФК. Пиридилэтилированный OCIF элюируют 9 мл раствора с линейным градиентом ацетонитрила от 20 до 50% при скорости потока 0,3 мл/мин, и собирают белок каждого пика. Пиридилэтилированный OCIF концентрируют в вакууме и растворяют в 25 мкл 0,1 М трис-HCl, рН 9, содержащего 8 М мочевины и 0,1% твина 80. Добавляют в пробирку 73 мкл 0,1 М трис-HCl, рН 9, и 0,02 мкг лизилэндопептидазы (Wako Pure Chemical, Япония) и инкубируют при 37С в течение 15 часов. Каждый гидролизат подкисляют 1 мкл 25% ТФК и вносят в колонку С8 для хроматографии с обращенной фазой (RP-300, 2,1220 мм, Perkin-Elmer Co.), уравновешенную 0,1% ТФК.

Пептидные фрагменты элюируют из колонки с линейным градиентом ацетонитрила от 0 до 50% при скорости потока 0,2 мл/мин в течение 70 мин, и собирают пептид каждого пика. Каждый пептидный фрагмент (Р1-Р3) вносят в белковый секвенатор. Последовательности пептидов показаны в последовательностях под номерами 1-3 соответственно.

ПРИМЕР 7

Определение нуклеотидной последовательности кДНК OCIF

I) Выделение поли(А)+РНК из клеток IMR-90

Из 110⁸ клеток IMR-90 выделяют около 10 мкг поли(А)+ +РНК, используя набор для выделения мРНК Fast Track (Invitrogen), в соответствии с рекомендациями изготовителя.

II) Получение смешанных затравок

Две показанные ниже смешанные затравки синтезируют на основе аминокислотных последовательностей двух пептидов (пептид Р2 и пептид Р3, последовательности №№2 и 3 соответственно). Все олигонуклеотиды в смешанных затравках №2F могут кодировать аминокислотную последовательность в пептиде 2 с шестого остатка - глутамина (Gln) до двенадцатого остатка - лейцина (Leu). Все олигонуклеотиды в смешанных затравках №3R могут кодировать аминокислотную последовательность в пептиде 3 с шестого остатка - гистидина (His) до двенадцатого остатка - лизина (Lys). Последовательности смешанных затравок В №№2F и 3R приведены в табл.3.

III) Амплификация фрагмента кДНК OCIF методом ПЦР (полимеразной цепной реакции)

Первую нить кДНК генерируют с использованием набора для синтеза кДНК Superscript II (Gibco BRL) и 1 мкг поли(А)+РНК, полученной в примере 7-I, в соответствии с рекомендациями изготовителя. Фрагмент ДНК, кодирующий OCIF, получают с помощью ПЦР с использованием кДНК-матрицы и затравок, описанных в примере 7-II.

ПЦР осуществляют при следующих условиях:

10Х буфера Ex Taq (Takara Shuzo) 5 мкл

2,5 мМ раствор dNTP* 4 мкл

раствор кДНК 1 мкл

Ex Taq (Takara Shuzo) 0,25 мкл

стерильная дистиллированная вода 29,75 мкл

40 мкМ раствор затравок №2F 5 мкл

40 мкМ раствор затравок №3R 5 мкл

* dNTP=дезоксинуклеозид-5’-трифосфат.

Компоненты реакции смешивают в микроцентрифужной пробирке. За начальной стадией денатурации при 95С в течение 3 мин следуют 30 циклов денатурации при 95С в течение 30 с и отжига при 50С в течение 30 с и удлинения при 70С в течение 2 мин. После амплификации конечную стадию удлинения осуществляют при 70С в течение 5 мин. Размер продуктов ПЦР определяют при электрофорезе в 1,5% агарозном геле. Получают фр