Белок, специфически связывающийся с ингибирующим остеокластогенез фактором (ocif) (варианты), днк его кодирующая (варианты), днк в качестве зонда (варианты), способ получения белка (варианты), способ скрининга вещества (варианты), антитело (варианты), способ получения поликлонального антитела, гибридома (варианты), способ получения моноклонального антитела, способ измерения ocif- связывающего белка, фармацевтическая композиция (варианты) и лекарственное средство (варианты)

Белок, специфически связывающийся с ингибирующим остеокластогенез фактором (ocif) (варианты), днк его кодирующая (варианты), днк в качестве зонда (варианты), способ получения белка (варианты), способ скрининга вещества (варианты), антитело (варианты), способ получения поликлонального антитела, гибридома (варианты), способ получения моноклонального антитела, способ измерения ocif- связывающего белка, фармацевтическая композиция (варианты) и лекарственное средство (варианты)

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генной инженерии и медицине, и может быть использовано для получения белка, специфически связывающегося с ингибирующим остеокластогенез фактором (OCIF). OCIF-связывающий белок специфически связывается с ингибирующим остеокластогенез фактором и проявляет высокую аффинность в отношении OCIF (константа диссоциации на клеточной мембране Kd=10^-9 М или менее), имеет молекулярную массу приблизительно 30000-40000 при измерении при помощи электрофореза в SDS-полиакриламиде при невосстанавливающих условиях, проявляет активность поддержания или усиления дифференцировки и созревания остеокластов. Рекомбинантный OCIF-связывающий белок получают путем культивирования клеток, трансформированных вектором, содержащим ДНК, кодирующую OCIF – связывающий белок. Антитело, распознающее OCIF-связывающий белок, получают путем иммунизации животного или путем культивирования гибридомы ВР-6264 или ВР-6265, или ВР-6266. Антитело используют для получения фармацевтической композиции для профилактики или лечения нарушения или патологии костного метаболизма. Изобретение позволяет разрабатывать средства для предотвращения или лечения заболеваний, связанных с нарушением костного метаболизма. 29 н. и 21 з.п. ф-лы, 33 ил., 4 табл.

Область технологии

Данное изобретение относится к новому белку (молекуле OCIF-связывающего белка, далее этот белок может называться ОВМ), который связывается с ингибирующим остеокластогенез фактором (который далее может называться OCIF) и способу получения этого белка.

Данное изобретение относится также к ДНК, кодирующей этот белок, белкам, содержащим аминокислотную последовательность, кодируемую этой ДНК, способу получения этого белка с применением способов генной инженерии и фармацевтическим композициям, содержащим этот белок.

Данное изобретение относится, далее, к способам скрининга, с использованием этого белка и этой ДНК, веществ для регуляции экспрессии этого белка, веществ, ингибирующих или регулирующих биологическую активность этого белка, или рецепторов, переносящих сигнал этого белка посредством взаимодействия с этим белком, к веществам, получаемым при помощи этого скрининга, и к фармацевтическим композициям, которые содержат полученные вещества.

Данное изобретение относится также к антителам против этого белка, способам получения этих антител и фармацевтическим композициям, содержащим эти антитела.

Предшествующий уровень техники Костный метаболизм зависит от общей активности остеобластов, которые регулируют остеогенез (костеобразование), и остеокластов, которые регулируют резорбцию костей (рассасывание). Считается, что нарушение костного метаболизма вызывается нарушением баланса остеогенеза и резорбции костей. Остеопороз, гиперкальциемия, болезнь Педжета (деформируюшая остеодистрофия), почечная остеодистрофия, хронический ревмакардит, остеоартрит и т.п. известны как заболевания, сопутствующие нарушению костного метаболизма. Остеопороз является типичным заболеванием, вызываемым таким нарушением костного метаболизма. Это заболевание возникает, когда резорбция костей остеокластами преобладает над остеогенезом, совершаемым остеобластами. Это заболевание характеризуется уменьшением как подвергнутого кальцинозу костного материала, так и костного матрикса. Хотя механизм этого заболевания не выяснен полностью, заболевание вызывает боли в костях, делает их хрупкими и может приводить к переломам. Это заболевание становится социальной проблемой, поскольку оно увеличивает количество прикованных к постели лиц по мере увеличения популяции пожилых людей. Получение терапевтического средства для этого заболевания крайне желательно. Ожидается, что заболевание, вызываемое уменьшением костной массы, должно излечиваться супрессией костной резорбции, ускорением костеобразования (остеогенеза) или улучшением баланса между резорбцией и костеобразованием.

Ожидается, что остеогенез усиливается ускорением пролиферации, дифференцировки или активации остеобластов, которые образуют костную ткань, или супрессией пролиферации, дифференцировки или активации остеокластов, которые рассасывают костную ткань. В последние годы большой интерес вызывали гормоны, низкомолекулярные вещества или физиологически активные белки, проявляющие такие активности, и эти вещества являются объектом интенсивных фундаментальных исследований и разработок, осуществляемых в настоящее время.

Лекарственные средства, такие как кальцитониновые агенты, агенты активных форм витамина D₃, гормональные агенты, содержащие эстрадиол, иприфлавон, витамин К₂ и бифосфонатные соединения, уже известны в качестве лекарственных средств для лечения и сокращения периода лечения заболеваний, связанных с костями. Разрабатываются клинические тесты для производных активных форм витамина D₃, производных эстрадиола и бисфосфонатных соединений второго и третьего поколения для разработки терапевтических агентов с превосходной эффективностью и минимальными побочными эффектами.

Однако способы терапии с использованием этих агентов не всегда были удовлетворительными по эффективности и терапевтическим результатам. Настоятельно необходима разработка новых терапевтических агентов, которые являются более безопасными и более эффективными. Некоторые агенты, используемые для лечения заболеваний, связанных с костным метаболизмом, применяют лишь ограниченно из-за их побочных действий. Кроме того, способы лечения с использованием двух или нескольких агентов в сочетании являются в настоящее время основным направлением в лечении заболеваний, связанных с костным метаболизмом, таких как остеопороз. С этой точки зрения желательна разработка лекарственных средств, имеющих механизм действия, отличающийся от общепринятых лекарственных средств, и проявляющих более высокую эффективность и минимальные побочные эффекты.

Как упоминалось выше, клетками, контролирующими костный метаболизм, являются остеобласты и остеокласты. Известно, что эти клетки имеют тесные взаимодействия, называемые "сопряжением". В частности, известно, что цитокины, такие как Интерлейкины 1 (IL-1), 3 (IL-3), 6 (IL-6) и 11 (IL-11), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF), интерферон- (IFN-), фактор некроза опухолей (TNF-) и трансформирующий фактор роста (TGF-), секретируемые остеобластными стромальными клетками, усиливают или ингибируют дифференцировку или созревание остеокластов (Raisz: Disorders of Bone and Mineral Metabolism, 287-311, 1992; Suda et al.: Principles of Bone Biology, 87-102, 1996; Suda et al.: Endocrine Reviews, 4, 266-270, 1995, Lacey et al.: Endocrinology, 186, 2369-2376, 1995). Сообщалось, что остеобластные стромальные клетки играют важную роль в дифференцировке и созревании остеокластов, а также в таких функциях остеокластов, как резорбция костей зрелыми остеокластами посредством клетка-клеточных контактов с незрелыми предшественниками остеокластов или со зрелыми остеокластами.

Считали, что фактор, называемый фактором дифференцировки остеокластов (ODF, Suda et al: Endocrine Rev., 13, 66-80, 1992; Suda et al.: Bone, 17, 87S-91S, 1995), экспрессируется на мембране остеобластных стромальных клеток и участвует в образовании остеокластов посредством контакта клетка-клетка. Согласно этой гипотезе на клетках-предшественниках остеокластов присутствует рецептор ODF. Однако до сих пор не были очищены или идентифицированы ни ODF, ни его рецептор. Не было также сообщений, касающихся их свойств, механизма действия или структуры. Таким образом, механизм, участвующий в дифференцировке и созревании остеокластов, пока еще не выяснен в достаточной степени. Выяснение этого механизма явится большим вкладом не только в фундаментальную медицину, но также в разработку новых лекарственных средств для лечения заболеваний, связанных с нарушением костного метаболизма.

Авторы данного изобретения провели интенсивные исследования в связи с этой ситуацией и обнаружили ингибирующий остеокластогенез фактор (OCIF) в культуральном бульоне фибробластов легких эмбриона человека, IMR-90 (ATCC Deposition No. CCL186) (WO 96/26217).

Авторам данного изобретения удалось клонировать ДНК, кодирующую OCIF, получить рекомбинантный OCIF в клетках животных и подтвердить in vivo фармацевтические эффекты (улучшающее действие на костный метаболизм и т.д.) рекомбинантного OCIF. Ожидается, что OCIF можно будет использовать в качестве агента для предотвращения или лечения заболеваний, связанных с нарушением костного метаболизма, с большей эффективностью, чем эффективность общепринятых лекарственных средств, и с меньшими побочными действиями.

Описание изобретения

Авторы данного изобретения провели поиск белка, который связывается с ингибирующим остеокластогенез фактором (OCIF), и обнаружили, что OCIF-связывающий белок экспрессируется на остеобластных стромальных клетках, культивируемых в присутствии фактора резорбции костей, такого как активная форма витамина D₃ и паратиреоидный гомон (РТН). Кроме того, авторы данного изобретения исследовали характеристики и физиологические функции OCIF-связывающего белка и нашли, что этот белок проявляет биологическую активность фактора, поддерживающего или усиливающего дифференцировку и созревание остеокластов из незрелых предшественников остеокластов. Эти открытия составили данное изобретение. Дальнейшее исследование белка данного изобретения доказало, что он представляет собой важный белок, регулирующий дифференцировку и созревание остеокластов из незрелых предшественников остеокластов в системе сокультивирования остеобластных стромальных клеток и клеток селезенки. Успех в идентификации и выделении белка, действующего в качестве фактора, поддерживающего или усиливающего дифференцировку и созревание остеокластов, в данном изобретении сделал возможным скрининг нового лекарственного средства, применимого для лечения патологии костного метаболизма, на основе механизма костного метаболизма, использующего белок данного изобретения.

В соответствии с этим целью данного изобретения является получение нового белка (OCIF-связывающей молекулы или ОВМ), который связывается с ингибирующим остеокластогенез фактором (OCIF), и способа получения этого белка.

Другой целью данного изобретения является получение ДНК, кодирующей этот белок, белков, содержащих аминокислотную последовательность, кодируемую этой ДНК, и способа получения этого белка с применением способов генной инженерии и фармацевтических композиций, содержащих этот белок.

Следующей целью данного изобретения является разработка способов скрининга веществ, контролирующих экспрессию этого белка, с применением этих белка и ДНК, веществ, ингибирующих или регулирующих биологическую активность этого белка, рецепторов, трансдуцирующих действие этого белка путем связывания с этим белком, веществ, получаемых этим скринингом, и фармацевтических композиций, содержащих эти вещества.

Еще одной целью данного изобретения является получение антител против этого белка, способов получения этих антител и фармацевтических композиций, содержащих эти антитела.

Белок данного изобретения имеет следующие физико-химические свойства и биологическую активность:

(а) аффинность: специфически связывается с ингибирующим остеокластогенез фактором (OCIF) и проявляет высокую аффинность в отношении OCIF (константа диссоциации на клеточной мембране Kd=10^-9 М или менее);

(b) молекулярная масса: имеет молекулярную массу приблизительно 30000-40000 при определении электрофорезом в SDS-полиакриламидном геле (SDS-ПААГ-электрофорезом) при невосстанавливающих условиях и среднюю молекулярную массу приблизительно 90000-110000 при сшивании с мономерной формой OCIF и

(c) биологическая активность: проявляет активность поддержания или усиления дифференцировки и созревания в системе сокультивирования мышиных остеобластных стромальных клеток и мышиных клеток селезенки в присутствии факторов костной резорбции, таких как активная форма витамина D₃ и паратиреоидный гормон (РТН).

Система сокультуры ST2, мышиной остеобластной стромальной клеточной линии и мышиных клеток селезенки в присутствии активной формы витамина D₃ или РТН хорошо известна в качестве типичной системы in vitro культуры для образования остеокластов. Клетки, экспрессирующие белок данного изобретения, могут быть определены тестированием связывания OCIF с мышиными остеобластными стромальными клетками или мышиными клетками селезенки в присутствии или в отсутствие активной формы витамина D₃. Белок данного изобретения характеризуется как белок, который специфически индуцируется на остеобластных стромальных клетках, культивируемых в присутствии остеотропного фактора, такого как активная форма витамина D₃ или РТН. Кроме того, белок данного изобретения может быть охарактеризован как белок, проявляющий биологическую активность, поддерживающую или усиливающую дифференцировку и созревание остеокластов, на основании следующих результатов. А именно, образование остеокластов ингибируется зависимым от дозы образом путем добавления 1-40 нг/мл OCIF к вышеупомянутой системе сокультуры в присутствии активной формы витамина D₃, временной ход экспрессии белка данного изобретения на клетках ST2 в присутствии активной формы витамина D₃ хорошо коррелирует с временным ходом образования остеокластов в этой сокультуре. Кроме того, количество белка данного изобретения, экспрессируемого на клетках ST2, коррелирует со способностью этих клеток к поддержанию образования остеокластов и связывание OCIF с белком данного изобретения на клетках ST2 полностью подавляет образование остеокластов.

Аффинность белка данного изобретения в отношении OCIF может быть оценена мечением OCIF и испытанием связывания меченого OCIF с поверхностью мембраны клеток животного. OCIF может быть помечен по общепринятому способу мечения, такому как мечение радиоактивным изотопом или флуоресцентное мечение. Мечение остатков тирозина ¹²⁵I может быть приведено в качестве характерного примера мечения OCIF радиоактивным изотопом. Могут быть использованы такие способы мечения, как способ с Иодогеном, способ с хлорамином Т и ферментативный способ. Связывание меченого OCIF с поверхностной мембраной клеток животного может тестироваться общепринятым способом. Добавление немеченого OCIF к среде, используемой для теста связывания, в концентрации, в 100-400 раз превышающей концентрацию меченого OCIF, обеспечивает измерение неспецифического связывания. Величина специфического связывания OCIF может быть рассчитана вычитанием величины неспецифического связывания из общей величины связывания меченого OCIF. Аффинность белка данного изобретения, экспрессируемого на клеточной мембране, в отношении OCIF может оцениваться изменением величины меченого OCIF и анализом специфического связывания при помощи кривой Скетчарда.

Определенная аффинность белка данного изобретения в отношении OCIF равна приблизительно 100-500 пМ. Белок данного изобретения характеризуется высокой аффинностью (константа диссоциации на клеточной мембране Кd=10^-9 M или менее) в отношении ингибирующего остеокластогенез фактора (OCIF). Молекулярная масса ОВМ может быть оценена гель-фильтрацией, электрофорезом в SDS-ПААГ или т.п. Для точного определения молекулярной массы предпочтительным является электрофорез в SDS-ПААГ. ОВМ является белком, имеющим молекулярную массу приблизительно 40000 (40000±4000) в восстанавливающих условиях.

Белок данного изобретения может быть получен из мышиной остеобластной стромальной клеточной линии ST2, мышиной клеточной линии преадипоцитов РА6, остеобластных клеточных линий человека или других остеобластных клеток, выбранных из клеток млекопитающих, таких как человек, мыши или крысы. В качестве веществ, индуцирующих экспрессию белка данного изобретения, могут быть приведены остеотропные факторы, такие как активная форма витамина D₃ (кальцитриол), паратиреоидный гормон (РТН), интерлейкин (IL-1, IL-6, IL-11), Онкостатин М и ингибирующий лейкоз фактор (LIF). Эти вещества могут быть добавлены в концентрации 10^-8 М (активная форма витамина D₃ и РТН), 10 нг/мл (IL-11) или 1 нг/мл (Онкостатин М). IL-6 предпочтительно используют в концентрации 20 нг/мл с 500 нг/мл растворимого рецептора IL-6. Предпочтительно могут быть использованы конфлюентные клетки мышиной остеобластной стромальной клеточной линии ST2, культивируемые в среде -МЕМ, к которой добавлены 10^-8 М активная форма витамина D₃, 10^-7 М дексаметазон и 10% фетальная телячья сыворотка. Культивируемые клетки могут быть собраны выскребанием "скребком" для клеток. Собранные клетки могут храниться при -80С до использования.

Белок данного изобретения может быть эффективно очищен из мембранных фракций собранных клеток. Мембранные фракции могут быть получены общепринятым способом, который используют для получения внутриклеточных органелл. Различные типы ингибиторов протеаз могут быть добавлены к буферному раствору, используемому для получения мембранной фракции. Примеры ингибиторов протеаз включают ингибиторы сериновой протеазы, ингибиторы тиоловых протеаз и ингибиторы метапротеазы. В качестве специфических примеров приводятся PMSF, APMSF, ЭДТА, о-фенантролин, лейпептин, пепстатин А, апротинин, соевый ингибитор трипсина. Гомогенизатор Даунса, политронный гомогенизатор или ультразвуковой процессор могут быть использованы для гомогенизации клеток. Гомогенат клеток суспендируют в буферном растворе, содержащем 0,5 М сахарозу, и центрифугируют в течение 10 минут при 600 g для отделения ядер и неразрушенных клеток в виде осадка. Супернатант центрифугируют в течение 90 минут при 150000 х g для получения мембранных фракций в виде осадка. Полученную мембранную фракцию обрабатывают различными типами детергентов для эффективной солюбилизации и экстракции белка данного изобретения из клеточной мембраны. Могут быть использованы детергенты, которые обычно используют для солюбилизации белков клеточных мембран, такие как CHAPS (3-[(3-холамидопропил)диметиламонио]-1-пропансульфонат), Тритон Х-100, Nikkol и н-октилгликозид. Предпочтительно к мембранной фракции добавляют 0,5% CHAPS и смесь перемешивают в течение 2 часов при 4С для солюбилизации белка данного изобретения. Полученную таким образом пробу центрифугируют при 150000 g в течение 60 минут для получения фракции солюбилизированных мембран в виде супернатанта.

Белок данного изобретения может быть очищен из фракции солюбилизированных мембран с использованием колонки, геля или смолы, связанных с OCIF. Иммобилизованный OCIF может быть OCIF, выделенным из культурального бульона фибробластов легких эмбриона человека IMR-90, описанным в WO 96/26217, или rOCIF, полученным при помощи способов генной инженерии. rOCIF может быть получен введением кДНК человека, кДНК мыши или кДНК крысы в экспрессирующий вектор в соответствии с общепринятым способом, перенесением сконструированного вектора в клетки животного, такие как клетки СНО, клетки ВНК или клетки Namalwa, или в клетки насекомого для получения rOCIF и очисткой rOCIF. Полученный OCIF имеет молекулярную массу приблизительно 60 кДа (мономерная форма) или 120 кДа (димерная форма). OCIF димерной формы является предпочтительным для иммобилизации. Примерами гелей и смол, с которыми иммобилизуют OCIF, являются ECH-Sepharose 4B, EAH-Sepharose 4B, Thiopropyl Sepharose 6В, CNBr-активированная Sepharose 4B, активированная СН Sepharose 4B, эпокси-активированная Sepharose 6B, активированная тиолом Sepharose 4B (изготавливаемые Pharmacia Co.), TSKgel AF-Epoxy Toyopal 650, TSKgel AF-Amino Toyopal 650, TSKgel AF-Formyl Toyopal 650, TSKgel AF-Carboxy Toyopal 650, TSKgel AF-Tresyl Toyopal 650 (изготовляемые Tosoh Corporation), Amino-Cellulofine, Carboxy-Cellulofine, FMP активированный Cellulofine, Formyl-Cellulofine (изготовляемые Seikagaku Kogyo Co.), Affigel 10, Affigel 15 и Affiprep 10 (изготовляемые BioRad Co.). В качестве колонок, на которых может быть иммобилизован OCIF, могут быть приведены HiTrap NHS-активированная колонка (Pharmacia Co.), TSKgel AF-Tresyl 5PW (Tosoh Corporation) и т.д. В качестве характерного примера способа иммобилизации OCIF с HiTrap NHS-активированной колонкой (1 мл, Pharmacia Co.) может быть приведен следующий способ. В частности, 1 мл 0,2 М раствора NаНСО₃/0,5 М NaCl (рН 8,3), содержащего 13,0 мг OCIF, инъецируют в эту колонку для проведения реакции связывания при комнатной температуре в течение 30 минут. На колонку наносят последовательно 0,5 М этаноламин/0,5 М NaCl (pH 8,3) и 0,1 М уксусную кислоту, 0,5 М NaCl (pH 4,0). Затем колонку опять промывают 0,5 М этаноламином/0,5 М NaCl (pH 8,3) и колонке дают стоять в течение 1 часа при комнатной температуре для блокирования избыточных активных групп. Колонку последовательно промывают дважды 0,5 М этаноламином/0,5 М NaCl (pH 8,3) и 0,1 М уксусной кислотой/0,5 М NaCl (pH 4,0) и затем промывают раствором 50 мМ Трис/1 М NaCl/0,l% CHAPS (pH 7,5), получая колонку с иммобилизованным OCIF. Белок данного изобретения может быть эффективно очищен колонкой с иммобилизованным OCIF, приготовленной таким образом, или гелем или смолой с иммобилизованным OCIF.

Для ингибирования деградации белка данного изобретения желательно добавлять различные вышеупомянутые ингибиторы протеаз к буферным растворам, используемым для очистки этого белка. Белок данного изобретения может быть очищен нанесением вышеупомянутой фракции солюбилизированных мембран на колонку с иммобилизованным OCIF или смешиванием с гелем или смолой с иммобилизованным OCIF и элюцией белка из этой колонки, геля или смолы кислотой, различными денатурирующими белок агентами, какодилатным буфером или т.п. Желательно использовать для элюции кислоту и нейтрализовать сразу после элюции для снижения денатурации белка данного изобретения. В качестве кислотного раствора, используемого для элюции, может быть приведен раствор 0,1 М глицина-соляной кислоты (pH 3,0), раствор 0,1 М глицина-соляной кислоты (pH 2,0), раствор 0,1 М цитрата натрия (рН 2,0) и т.п.

Белок данного изобретения может быть дополнительно очищен общепринятыми способами очистки, используемыми для очистки различных белков из биологических материалов, и различными способами очистки, использующими физико-химические свойства этого белка. Для концентрации растворов, содержащих белок данного изобретения, могут быть использованы общепринятые способы, используемые в процессе очистки для белков, такие как ультрафильтрация, лиофилизация и высаливание. Предпочтительно используют, например, ультрафильтрацию с применением Centricon-10 (BioRad Co.). В качестве способов очистки используют в сочетании различные способы, обычно применяемые для очистки белков, такие как ионообменная хроматография, гель-фильтрационная хроматография, гидрофобная хроматография, хроматография с обращенной фазой (обращенно-фазовая хроматография) и препаративный электрофорез. Более конкретно, можно очищать белок данного изобретения комбинированием гель-фильтрации на колонке Superose 12 (Pharmacia Co.) и обращенно-фазовой хроматографии. Для детектирования белка данного изобретения определяют активность связывания белка данного изобретения с иммобилизованным OCIF или материал, связавшийся с иммобилизованным OCIF, иммунопреципитируют антителами против OCIF и анализируют при помощи электрофореза в SDS-полиакриламидном геле (электрофореза в SDS-ПААГ).

Полученный белок данного изобретения применим в качестве средства для лечения заболеваний, вызываемых нарушением костного метаблизма, таких как врожденный системный остеопетроз (болезнь Альберс-Шенберга), или в качестве реагента для исследований или диагностики таких заболеваний.

Данное изобретение обеспечивает также ДНК, кодирующую новый белок (OCIF-связывающую молекулу или ОВМ), который связывается с ингибирующим остеокластогенез фактором, белки, содержащие аминокислотную последовательность, кодируемую этой ДНК, способ получения этого белка способами генной инженерии и фармацевтические композиции, содержащие такой белок. Кроме того, данное изобретение обеспечивает способы скрининга веществ для регуляции экспрессии ОВМ, способ скрининга веществ, ингибирующих или модифицирующих биологическую активность ОВМ, или способ скрининга рецепторов, передающих действие ОВМ путем связывания с ОВМ, и фармацевтические композиции, содержащие вещества, полученные в результате этого скрининга.

Новый белок ОВМ, кодируемый ДНК данного изобретения, имеет следующие физико-химические свойства и биологическую активность:

(a) связывается специфически с ингибирующим остеокластогенез фактором (OCIF),

(b) имеет молекулярную массу приблизительно 40000 (±4000) при определении при помощи электрофореза в SDS-ПААГ при восстанавливающих условиях и среднюю молекулярную массу 90000-110000 при сшивании с мономерной формой OCIF и

(c) проявляет активность поддержания или усиления дифференцировки и созревании остеокластов.

Ингибирующий остеокластогенез фактор (OCIF) человека, который используют в качестве зонда для идентификации ДНК, кодирующей ОВМ, OCIF-связывающей молекулы данного изобретения, и для оценки свойств ОВМ, может быть выделен из культурального бульона фибробластной клеточной линии легких эмбриона человека IMR-90 согласно WO 96/26217. Рекомбинантный OCIF человека, рекомбинантный OCIF мыши, рекомбинантный OCIF крысы и т.п. могут быть также использованы для выделения и идентификации ДНК, кодирующей ОВМ. Эти рекомбинантные белки OCIF могут быть получены встраиванием ДНК-фрагментов, кодирующих эти белки, в экспрессирующие векторы в соответствии с общепринятыми способами, экспрессией в клетках животных, таких как клетки СНО, клетки ВНК или клетки Namalwa, или в клетках насекомых, и их очисткой.

В качестве способа выделения кДНК, кодирующей белок-мишень, (клонирования кДНК), может быть использован способ, предусматривающий определение частичной аминокислотной последовательности этого белка и выделение кДНК-мишени при помощи гибридизации с использованием нуклеотидной последовательности, соответствующей этой аминокислотной последовательности. Другой доступный способ, даже в случае, когда аминокислотная последовательность белка неизвестна, предусматривает конструирование библиотеки кДНК в экспрессирующем векторе, введение этой кДНК в клетки и скрининг на экспрессию белка-мишени для выделения целевой кДНК (способ экспрессионного клонирования, D'Andrea et al.: Cell, 57, 277-285, 1989; FuKunaga et al.: Cell, 61, 341-350, 1990). В способе экспрессионного клонирования подходящие клетки-хозяева, такие как бактерии, дрожжи, клетки животных и т.п., выбирают в зависимости от цели. Во многих случаях выбирают клетки животных в качестве клеток-хозяев для клонирования кДНК, кодирующей белок, такой как белок данного изобретения, который предположительно присутствует на мембранной поверхности клеток животных. Обычно отбирают клетки-хозяева, проявляющие высокую эффективность трансфекции ДНК и достигающие высоких уровней экспрессии введенной ДНК. Одним из примеров таких клеток животного являются клетки почек обезьяны COS-7, используемые в данном изобретении. Поскольку большой Т-антиген SV40 экспрессируется в клетке COS-7, плазмида, которая имеет репликатор SV40, может присутствовать в виде эписомы из множественных копий в этой клетке, так что ожидается высокий уровень экспрессии. Кроме того, поскольку экспрессия белка-мишени клетками COS-7 достигает максимума в пределах нескольких дней после введения ДНК, эта клетка пригодна для быстрого скрининга. Сочетание этой клетки-хозяина с плазмидой, способной к высокой экспрессии, обеспечивает экспрессию гена чрезвычайно высокого уровня. Фактором, оказывающим наибольшее влияние на экспрессию гена, находящегося на плазмиде, является промотор. В качестве промоторов, обеспечивающих высокую экспрессию, используют такие промоторы, как промотор SR и полученные из цитомегаловируса промоторы. Для скрининга кДНК, кодирующих мембранный белок, согласно стратегии экспрессионного клонирования используют процедуры скрининга, такие как способ связывания, способ пэннинга или film emulsion способ.

Данное изобретение относится к ДНК, кодирующей белок (ОВМ), который специфически связывается с OCIF, выделенной сочетанием стратегии экспрессионного клонирования и скрининга при помощи способа связывания с экспрессируемым белком, и к скринингу физиологически активных веществ с использованием этой ДНК или экспрессируемого белка. ОВМ, кодируемый ДНК данного изобретения, может быть детектирован мечением OCIF и тестированием связывания меченого OCIF с поверхностной мембраной клетки животного. OCIF может быть помечен общепринятым способом мечения, таким как способ мечения радиоактивным изотопом или способ флуоресцентного мечения, который используют для мечения обычных белков. В качестве характерного примера мечения OCIF радиоактивным изотопом может быть приведено мечение остатков тирозина ¹²⁵I. Могут быть использованы такие способы мечения, как способ с Иодогеном, способ с хлорамином Т и ферментативный способ. Связывание меченого OCIF с поверхностной мембраной клеток животного может тестироваться общепринятыми способами. Добавление немеченого OCIF к среде, используемой для теста связывания, в концентрации, в 100-400 раз превышающей концентрацию меченого OCIF, обеспечивает измерение неспецифического связывания. Величина специфического связывания OCIF может быть рассчитана вычитанием величины неспецифического связывания из общей величины связывания меченого OCIF.

Авторы данного изобретения предположили, что существует взаимодействие между фактором, участвующим в дифференцировке остеокластов, и OCIF. На основании этого предположения авторы изобретения для выделения белка, с которым связывается OCIF, подвергли скринингу экспрессионную библиотеку, полученную из мРНК мышиной остеобластной стромальной клеточной линии ST2 в соответствии со следующим способом. В частности, ДНК, синтезированную с использованием мРНК ST2, встраивали в экспрессирующий вектор клеток животных и вектор с этой вставкой вводили в клетки почек обезьян COS-7. Целевой белок, экспрессируемый на клетках COS-7, подвергали скринингу с использованием OCIF, меченного ¹²⁵I, в качестве зонда. В результате была выделена ДНК, кодирующая белок, который специфически связывается с OCIF. Затем определяли нуклеотидную последовательность ДНК, кодирующей эту OCIF-связывающую молекулу (ОС IF-связывающую молекулу; ОВМ). Кроме того, было обнаружено, что ОВМ, кодируемый этой ДНК, связывается специфически и сильно с OCIF на клеточной мембране.

Сравнительно мягкими условиями для гибридизации ДНК данного изобретения являются, например, условия, когда ДНК переносят на нейлоновую мембрану и иммобилизуют на ней в соответствии с общепринятыми способами и гибридизуют в буферном растворе для гибридизации с зондом ДНК, меченным изотопом, при температуре 40-70С в течение от приблизительно 2 часов до ночи с последующим промыванием в 0,5 SSC (0,075 М хлорид натрия и 0,0075 М цитрат натрия) при 45С в течение 10 минут.

В частности, в качестве нейлоновой мембраны для перенесения на нее и иммобилизации на ней ДНК используют Highbond N (Аmersham Co.). Затем ДНК гибридизуют с зондом ДНК, меченным ³²P, в буфере для быстрой гибридизации (Amersham, Co) при 65С в течение 2 часов с последующим промыванием 0,5 SSC (0,075 М хлорид натрия и 0,0075 М цитрат натрия) при 45С в течение 10 минут.

Система сокультуры мышиных остеобластных стромальных клеток и мышиных клеток селезенки в присутствии активной формы витамина D₃ или РТН хорошо известна в качестве типичной системы культуры in vitro для образования остеокластов. Белок данного изобретения характеризуется как белок, который индуцируется специфически на остеобластных стромальных клетках, культивируемых в присутствии агента, который усиливает резорбцию костей, такого как активная форма витамина D₃ или РТН. Кроме того, вследствие того факта, что образование остеокластов стимулируется добавлением белка, кодируемого ДНК данного изобретения, к мышиным клеткам селезенки, культивируемым даже в отсутствие активной формы витамина D₃ или РТН, считают, что ОВМ, который кодируется ДНК данного изобретения, участвует в дифференцировке и созревании остеокластов.

Рекомбинантный ОВМ может быть получен встраиванием ДНК данного изобретения в экспрессирующий вектор для конструирования плазмиды и введением этой плазмиды в различные клетки или микроорганизмы для экспрессии рекомбинантного ОВМ. В качестве хозяина, в котором может экспрессироваться рекомбинантный OBM, могут быть использованы клетки млекопитающих, такие как COS-7, CHO, Namalwa, или бактерии, такие как Escherichia coli. OBM может экспресироваться в виде мембраносвязанной формы белка с использованием полноразмерной ДНК и в виде секретируемой формы или растворимой формы белка путем удаления части, кодирующей трансмембранный домен. Продуцируемый рекомбинантный OBM может быть эффективно очищен с применением подходящего сочетания общепринятых способов очистки, используемых для обычных белков, таких как аффинная хроматография с использованием колонок с иммобилизованным OCIF, ионообменная хроматография и гель-фильтрационная хроматография. Полученный белок данного изобретения применим в качестве агента для лечения заболеваний, вызываемых нарушением костного метаболизма, таких как врожденный системный остеопетроз, или в качестве реагента для исследования и диагностики таких заболеваний.

С использованием белка OBM, кодируемого ДНК данного изобретения, могут проводиться следующие операции скрининга:

(1) скрининг веществ, которые регулируют экспрессию OBM,

(2) скрининг веществ, которые специфически связываются с OBM и ингибируют биологическую активность OBM, и

(3) скрининг белков, которые присутствуют в клетках-предшественниках остеокластов и передают (трансдуцируют) биологическую активность OBM (рецептор OBM). Можно также создавать антагонисты и агонисты с использованием этого рецептора OBM. В комбинаторной химии с применением вышеупомянутых OBM или рецептора ОВМ пептидная библиотека, используемая для скрининга антагонистов или агонистов, может быть получена следующим способом. В частности, одним из таких способов является способ расщепления (Lam et al.: Nature, 354, 82-84, 1991). Согласно этому способу синтетические носители (гранулы), каждая из которых содержит специфическую аминокислоту (единицу), связанную с ней, готовят отдельно для всех единиц. Синтезированные носители смешивают вместе и делят на порции, равные числу этих единиц. Затем связывают следующие единицы. Эту процедуру повторяют n раз с получением библиотеки, содержащей носители, с которыми связаны n единиц. Согласно этому способу синтеза каждый пул носителей имеет один тип последовательности. Таким образом, можно идентифицировать пептид, специфически связывающийся с белком данного изобретения путем отбора пула, который дает сигнал, позитивный в этом способе скрининга, с использованием белка данного изобретения, и путем определения аминокислотной последовательности пептида, связанного на этом пуле. Другим способом является способ фаговой индикации, который использует фаг, несущий синтетическую ДНК, которая кодирует пептиды со случайными аминокислотными последовательностями. Этот способ имеет преимущество, заключающееся в увеличении числа молекул в библиотеке в сравнении с вышеупомянутым способом библиотеки синтетических пептидов, но имеет недостаток, заключающийся в том, что он дает меньшее разнообразие для данного числа молекул, поскольку могут быть конкретные последовательности, которые отсутствуют в этой библиотеке, если фаги неспособны экспрессировать эти последовательности. В способе фаговой индикации система скрининга с использованием белка данного изобретения также может быть применена для определения нуклеотидной последовательности, кодирующей этот пептид, т.е. фаг, специфически связывающийся с белком данного изобретения, концентрируют пэннингом, отобранный фаг амплифицируют в Escherichia coil и определяют нуклеотидную последовательность, к