Производные гемина и их фармацевтически приемлемые соли, способ получения, применение и фармацевтическая композиция

Производные гемина и их фармацевтически приемлемые соли, способ получения, применение и фармацевтическая композиция

Реферат

 

Изобретение относится к производным гемина или их фармацевтически приемлемым солям - ингибиторам протеолитических ферментов и представляющим собой соединения общей формулы (I)

где R₁ и R₂ - заместители, которые могут представлять собой аминокислоты, производные аминокислот, пептиды, состоящие из 1-15 аминокислотных остатков, производные пептидов, состоящих из 1-15 аминокислотных остатков, а -карбоксильная группа аминокислот или пептидов и боковые группы аминокислот или пептидов могут быть модифицированы, причем возможно, что R₁=R₂ или R₁ R₂=OH; карбоксильная группа порфирина может быть модифицирована метиловым или другим C₂-C₈-эфиром или физиологически приемлемой солью; Y^- представляет собой Cl^-, СН₃СОО^-; Me представляет собой Fe, за исключением соединений, где

Ме=Fe³⁺, Y^-=Cl^-,

R₁=-LeuLeuValPheOMe, R₂=-OH; R₁=-ValPheOMe, R₂=-OH; R₁=-LeuHisOMe,

R₂=-OH; R₁=-LeuHisAlaOMe, R₂=-OH; R₁=-LeuHisNHC₁₀H₂₀COOMe, R₂=-ОН;

R₁=-LeuHisNHC₁₀H₂₀COOH, R₂=-OH; R₁=-LeuHisNHC₁₀H₂₀COOMe,

R₂=-LeuHisNHC₁₀H₂₀COOMe; R₁=-Lys(Tfa)AlaAlaOMe, R₂=-OH;

R₁=-ValPheOMe, R₂=-LeuHisOMe; R₁=-LeuLeuValPheOMe, R₂=-LeuHisOMe;

R₁=-LeuLys(Tfa)LeuOMe, R₂=-OH; R₁=-LeuLys(Tfa)LeuOMe, R₂=-LeuHisOMe;

R₁=-Lys(Tfa)AlaAlaOMe, R₂=-AlaHisLys(Cbz)LeuOMe; R₁=-GlyOBzl,

R₂=-GlyOBzl; R₁=-HisOMe, R₂=-HisOMe; R₁=-LeuHisOMe, R₂=-LeuHisOMe;

R₁=-LeuHisLeuGlyCys(Bzl)OBzl, R₂=-LeuHisLeuGlyCys(Bzl)OBzl;

R₁=-LeuHisOMe, R₂=-OEt; R₁=-LeuHisLeuGlyCys(Bzl)OBzl, R₂=-OEt; R₁=-OBzl,

R₂=-OBzl; R₁=-OBzl, R₂=-OH; R₁=-AlaOMe, R₂=-OBzl; R₁=-HisOMe, R₂=-OBzl;

R₁=-LeuHisOMe, R₂=-OBzl; R₁=-LeuHisLeuGlyCys(Bzl)OBzl, R₂=-OBzl;

R₁=-LeuHisAlaLys(Cbz)GlyCys(Bzl)OBzl, R₂=-OBzl; R₁=-LeuHisLys(Cbz)OMe,

R₂=-OH; R₁=-LeuHis(Bzl)Lys(Cbz)OMe, R₂=-OH; R₁=-LeuHisOMe, R₂=-OMe;

R₁=-LeuHis(Bzl)Lys(Cbz)OMe, R₂=-OMe; R₁=-AlaLeuAlaPheAlaCys(Bzl)OMe,

R₂=-LeuHis(Bzl)Lys(Cbz)OMe; R₁=-AlaLeuAlaPheAlaCys(Bzl)OBzl,

R₂=-LeuHis(Bzl)Lys(Cbz)OMe; R₁=-LeuHisAlaLys(Cbz)Cys(Bzl)OBzl,

R₂=-LeuHis(Bzl)Lys(Cbz)OMe; R₁=-LeuHisOMe, R₂=-OMe;

R₁=-GlyProArgGlyGlyOMe, R₂=-OH;

R₁=-ArgProProGlyPheSer(Bzl)PheArgGlyGlyOMe, R₂=-OH,

двум способам получения производных гемина общей формулы I, фармацевтической композиции, обладающей способностью ингибировать протеолитические ферменты и применению производных гемина формулы I, ранее известных, обозначенных выше, в качестве ингибиторов протеолитических ферментов: протеиназы ВИЧ, пепсина, трипсина, химотрипсина. 5 н. и 9 з.п. ф-лы, 2 табл., 2 ил.

Изобретение относится к химии и медицине, а именно к новым ингибиторам протеолитических ферментов, в частности ВИЧ-протеиназы, пепсина и химотрипсина, а также способу их получения.

Известно применение в медицине ингибиторов протеолитических ферментов, например, для лечения острых панкреатитов, а также ВИЧ-инфекции. В последнем случае лечебный эффект достигается путем использования ингибиторов протеиназы ВИЧ псевдопептидной природы (ифавиренц, криксиван). Кроме того, известно применение ингибиторов протеолитических ферментов в фармацевтике в составе лекарственных форм препаратов пептидно-белковой природы для предотвращения их деградации в желудочно-кишечном тракте.

Так как известные синтетические неприродные ингибиторы протеолитических ферментов обладают рядом отрицательных побочных эффектов при их терапевтическом применении, то задачей настоящего изобретения явилось создание новых ингибиторов ферментов, представляющих собой конъюгаты природных соединений.

Было найдено, что поставленная задача решается хотя бы одним из производных гемина общей формулы (I)

где R₁ и R₂ - заместители, которые могут представлять собой аминокислоты, производные аминокислот, пептиды, состоящие из 1-15 аминокислотных остатков, производные пептидов, состоящих из 1-15 аминокислотных остатков, а -карбоксильная группа аминокислот или пептидов и боковые группы аминокислот или пептидов могут быть модифицированы, причем возможно, что R₁=R₂ или R₁ R₂=OH, или R₁=R₂=OH, в частности

R₁=-ValPheOMe, R₂=-OH (V); R₁=-ValPheOMe,

R₂=-ValPheOMe (VI); R₁=-LeuValPheOMe, R₂=-OH (VII);

R₁=-LeuLeuValPheOMe, R₂=-OH (VIII); R₁=-LeuLeuValPheOMe,

R₂=-LeuLeuValPheOMe (IX); R₁=-GlyProArgOMe, R₂=-OH (X); R₁=-ArgOMe,

R₂=-OH (XI); R₁=-ArgOMe, R₂=-ArgOMe (XII); R₁=-LeuValPheOH, R₂=-OH (XIII); R₁=-ValSerGlnAsnLeuOH, R₂=-OH (XIV);

R₁=-ArgArgTrpHisArgLeuLysGlu(OMe)OH, R₂=-OH (XV); R₁-лизиновый кор,

R₂=-OH (XVI); R₁=-GluAspLeuOH, R₂=-OH (XVII);

карбоксильная группа порфирина может быть модифицирована метиловым или другим С₂-С₈-эфиром или физиологически приемлемой солью; Y^- представляет собой Сl^-, СН₃СОО^-; Me представляет собой Fe, или их фармацевтически приемлемых солей, обладающих способностью ингибировать протеолитические ферменты (протеиназы ВИЧ, пепсина, трипсина, химотрипсина), а также интерферониндуцирующей и противовирусной активностью.

Еще одним объектом данного изобретения является способ получения новых и известных псевдопептидов общей формулы (I).

Известные производные гемина, соответствующие формулам (V-IX), содержащие пептиды с этерифицированными карбоксильными группами, ранее получали различными методами классического пептидного синтеза в растворе. [Радюхин В.А., Филиппович Е.И., Евстигнеева Р.П. //Журн. общ. химии. 1980. Т. 50. С. 673-678; Радюхин В.А., Казакова Н.А., Филиппович Е.И., Евстигнеева Р.П. //Журн. общ. химии. 1982. Т. 52. №2 С. 432-440.]. В данной заявке пептиды в производных гемина (V, VI, VIII) получают методом смешанных ангидридов [Гершкович А.В., Кибирев В.К. Химический синтез пептидов. //АН Украины. Ин-т биоорган, химии и нефтехимии. - Киев: Наукова думка. 1992. 359 С.], что позволяет упростить процедуру их синтеза, увеличить выход и улучшить качество продукта. Промежуточные трет-бутилоксикарбонильные защиты -аминогруппы аминокислот при синтезе пептидов удаляют воздействием трифторуксусной кислоты с последующей нейтрализацией триэтиламином. Остаток гемина вводят в молекулу путем взаимодействия предварительно деблокированного пептида с соответствующим 6(7)-моно- или 6,7-бис-N-оксисукцинимидным эфиром протогемина IX.

Получение пептидных производных гемина, особенно содержащих длинные пептиды и/или с карбоксильными и другими функциональными группами сопровождается рядом сложностей при их синтезе в растворе. Это определяется неполным протеканием реакции образования амидных связей между гемином и пептидом, плохой растворимостью незащищенных и длинных пептидов в органических растворителях, отсутствием селективности при получении моно- и бис-производных гемина, что приводит к трудностям при выделении целевого продукта - геминпептида.

Твердофазный метод синтеза пептидных производных гемина имеет ряд преимуществ перед классическим в растворе, а именно позволяет повысить выход и облегчает выделение целевого продукта (имеются в виду известные преимущества твердофазного синтеза вообще перед синтезом в растворе). Кроме того, синтез на твердой фазе позволяет селективно получать 6(7)-монопроизводные гемина. Данный подход в общем заключается в синтезе пептида на полимере с последующим ацилированием аминогруппы пептида на полимере активированным производным гемина с последующим отщеплением продукта от полимера.

Известно применение полимеров Меррифилда (хлорметилированный сополимер стирола и дивинилбензола) и Trilar (полиамидный носитель с щелочелабильной якорной группой) для синтеза геминпептидов [Евстигнеева Р.П., Лубсандоржиева Л.К., Желтухина Г.А.// Биоорган, химия. 1993. Т. 19. №6. С. 664-669; Евстигнеева Р.П., Желтухина Г.А., Халиль В., Ефимова Е.И.// Биоорган, химия. 1999. Т. 25. №8. С. 572-580]. Однако синтез на полимере Меррифилда не обеспечивал удовлетворительного выхода продукта при отщеплении его омылением или переэтерификацией. При таком способе синтеза стадия отщепления продукта является лимитирующей и проходит с низким выходом, хотя и позволяет получать производные гемина, содержащие остатки аспарагиновой и глутаминовой аминокислот, незащищенные как по С-концу, так и по боковым карбоксильным группировкам. Проведение отщепления производного гемина от полимера Меррифилда в жестких кислых условиях нецелесообразно вследствие деструкции целевого соединения, главным образом металлопорфиринового остатка.

Синтез на полимере Trilar имеет ограничения при выборе стратегии и предусматривает применение только кислотолабильных N -защитных групп, преимущественно Вос-защит. При этом защита боковых радикалов аминокислот осуществляется, главным образом, с помощью групп, удаляемых гидрогенолизом, что нежелательно вследствие возможности затрагивания винильных групп порфирина.

Новые производные гемина, в частности соединение (XVII), получают твердофазным методом с применением полимера Меррифилда и трет-бутилоксикарбонильной промежуточной защиты -аминогруппы аминокислот. При этом для защиты боковых радикалов аспарагиновой и глутаминовой аминокислот используют бензильную защиту. Для образования пептидных связей на полимере используют пентафторфениловые эфиры аминокислот. Удаление Вос-группы проводят действием раствора 50% трифторуксусной кислоты в дихлорметане с последующей нейтрализацией раствором триэтиламина в DMFA. Присоединение остатка гемина проводят с использованием моно-N-оксисукцинимидного эфира протогемина IX [Радюхин В.А., Филиппович Е.И., Евстигнеева Р.П.// Журн. общ. химии. 1980. Т. 50. С. 673-678]. Отщепление производного гемина (XVII) с одновременным снятием сложноэфирных защитных группировок проводят действием 0.5 н. раствора NaOH в диоксане (1:1).

Задачей, стоявшей перед авторами при создании настоящего изобретения, являлась разработка более эффективного метода получения новых производных гемина, в частности соединений (XIII-XVI). Данная задача была решена путем применения новой модификации твердофазного метода синтеза порфиринопептидов с использованием полимера с 2-хлортритилхлоридной якорной группой [Barlos К., Chatzi О., Gamos D., Stavropouls G.// Int. J. Peptide Protein. Res. 1991. V. 37. P. 513-520], причем целевой продукт в конце синтеза отщепляется одновременно с деблокированием боковых защитных групп пептида в мягких кислых условиях, которые являются более предпочтительными по сравнению со щелочными и позволяют получать производные гемина, не защищенные по боковым функциональным группам и по С-концу. Для этого в качестве промежуточной защиты -аминогруппы используют 9-флуоренилметилоксикарбонильную (Fmoc) группу [Гершкович А.В., Кибирев В.К. Химический синтез пептидов.// АН Украины. Ин-т биоорган. химии и нефтехимии. - Киев: Наукова думка. 1992. 359 с.]. Для защиты боковых радикалов серина, гистидина, лизина используют трифенилметильную группу [Barlos К., Mamos P., Papaioannou D., Patrianakou S., Sanida С., Schafer W.// Liebigs Ann. Chem. 1987. S. 1025-1030]. Для реакции образования пептидной связи на полимере используют эквивалентные количества N,N’-дициклогексилкарбодиимида (DCC) и 1-гидроксибензотриазола. Удаление Fmoc-защиты проводят в мягких условиях - 20%-ным раствором пиперидина в DMFA. Присоединение остатка гемина осуществляют действием моно-N-оксисукцинимидного эфира протогемина IX, полученного без выделения.

Отщепление производных гемина от полимера и деблокирование боковых защитных групп проводят смесью уксусной кислоты, трифторэтанола и дихлорметана в соотношении 1:1:8.

Предложенный способ твердофазного синтеза производных порфиринов может быть использован не только для синтеза геминпептидов, но и для синтеза производных любых карбоксилсодержащих порфиринов и металлопорфиринов, в том числе с использованием альтернативных способов активации карбоксильной группы порфирина (металлопорфирина).

Синтез производных гемина отражен в примерах 1-16.

Предлагаемые производные гемина получены с высокими выходами и высокой степенью чистоты и охарактеризованы УФ-, ИК-спектроскопией, масс-спектрометрией, ТСХ.

Индивидуальность полученных соединений проверяют методом ТСХ на пластинах Silufol UV-254 (Чехия) в системе растворителей хлороформ-метанол 9:1 (1), на пластинах Alufol (нейтр., "Merck", Германия) в системе хлороформ-метанол 9:1 (2), на пластинах Kieselgel ("Merck", Германия) в системах: хлороформ-метанол 9:1 (3), пиридин-вода-хлороформ-гексан 10:10:10:1 (4), н-бутанол-вода-уксусная кислота 4:5:1 (5), хлороформ-метанол-уксусная кислота 9:1:0.1 (6), хлороформ-метанол-уксусная кислота 7:3:1 (7), на бумаге в системе н-бутанол-вода-уксусная кислота 4:5:1 (8).

Хроматограммы проявляют нингидрином, хлор-толидиновым реактивом и по свечению в УФ-свете.

Выходы продуктов твердофазного синтеза рассчитывают по отношению к содержанию исходной аминокислоты в полимере. Пептидилполимеры для количественного аминокислотного анализа гидролизуют смесью 12 н. соляная кислота-пропионовая кислота (1:1) в течение двух часов при 140 С.

Количественный аминокислотный анализ гидролизатов проводят на автоматическом аминокислотном анализаторе Biotronic IC5001 (Германия).

Масс-спектры высокого разрешения получают на времяпролетном масс-спектрометре с лазерной десорбционной ионизацией (TOF MALDI) Vision 2000 (Thermo Bioanalysis, Англия) и магнитно-секторном приборе с прямой конфигурацией и электроспрей-ионизацией Finnigan MAT 900S (США).

Электронные спектры снимают на приборе Jasco model UV/VS 7800 Spectrophotometer (Япония).

ПМР-спектры регистрируют на приборе Bruker MSL 200 (200 МГц) (Германия) в CDCl₃, CD₃OD D₂O.

ИК-спектры снимают на приборах Perkin ELMER FT-IR Spectrometer 1725X (Щвейцария) и Hitachi 250-70 IR Spectrometer (Япония).

Температуру плавления определяют на термоплавильном столике фирмы Boetius (Германия).

В качестве полимерных носителей в синтезе производных гемина используют сополимер стирола с 1% дивинилбензола с 2-хлортритилхлоридной якорной группой с содержанием Сl^- 1.58 ммоль/г (фирма "Bachem", Германия), а также хлорметилированный сополимер стирола и 1% дивинилбензола, содержащий 1.05 ммоль/г Сl^- (фирма "Sigma", Германия). Твердофазный синтез осуществляют в соответствии с Fmoc- и Воc-стратегиями соответственно. Нагрузку стартовой аминокислоты на носителе определяют спектрофотометрическим методом [Dryland A., Sheppard R.C.// J. Chem. Soc. Perkin Trans. I. 1986. №1. P. 125-137] и с применением пикриновой кислоты [Gisin B.E.// Anal. Chem. Acta. 1972. V. 58. Р. 248-249], а также по данным количественного аминокислотного анализа. Блокирование остаточных аминогрупп в полимере проводят действием 5-кратных избытков п-нитрофенилацетата [Желтухина Г.А., Сидорова М.В., Филиппович Е.И., Евстигнеева Р.П.// Журн. орг. химии. 1978. Т. 48. №5. C. 1171-1172]. Деблокирование Fmoc-пептидилполимеров проводят по следующей схеме: 1) промывка DMF 3 мин 2; 2) обработка 20% раствором пиперидина в DMF 3 мин 1, 11 мин 1; промывка DMF 1 мин 5. Деблокирование Вос-пептидилполимеров осуществляют по схеме: 1) промывка хлористым метиленом 2 мин 2; 2) обработка 50% раствором TFA в хлористом метилене 15 мин 2; 3) промывка хлористым метиленом 2 мин 2; 4) промывка DMF 2 мин 2; 5) нейтрализация 10% раствором Et₃N в DMF 10 мин 2; 6) промывка DMF 2 мин 2. Полноту протекания реакций конденсации на полимере проверяют с помощью полуколичественного нингидринового теста [Kaiser E., Colescott R.L., Rossinger G.D., Cook P.J.// Anal. Biochem. 1970. V. 34. №2. P. 595-598].

Пример 1. N -Boc-Val-Phe-OMe (II) [Гершкович А.В., Кибирев В.К. Химический синтез пептидов.// АН Украины. Ин-т биоорган. химии и нефтехимии. - Киев: Наукова думка. 1992. 359 с.]

К раствору 0.79 мл (5.46 ммоль) Et₃N и 4.0 мл DMFA прибавляют 1.19 г (5.46 ммоль) HCl H-Phe-OMe, оставляют на 15 мин при 0 С. Осадок отделяют. К охлажденному до -15 С раствору 1.34 г (6.17 ммоль) Boc-Val-OH в 4.0 мл DMFA при перемешивании прибавляют 0.59 мл (5.83 ммоль) N-метилморфолина и 0.47 мл (5.83 ммоль) этилхлорформиата, перемешивают в течение 15 мин при -15 С. Контроль за образованием смешанного ангидрида проводят методом ТСХ. К реакционной смеси добавляют раствор H-Phe-OMe и перемешивают при -15 С 2 ч. Насыщенным раствором поташа доводят рН реакционной смеси до 8.5, перемешивают при 0 С 20 мин, разбавляют 40 мл насыщенного раствора хлористого натрия, доводят рН до 8.5 и экстрагируют этилацетатом (5 15 мл). Этилацетатный экстракт промывают 5% раствором бикарбоната натрия (3 10 мл), водой (2 10 мл), 3% раствором НСl (2 15 мл), водой (2 15 мл), насыщенным раствором NaCl (2 15 мл), водой (2 15 мл). Сушат над безводным сульфатом натрия. Растворитель удаляют в вакууме. Остаток сушат над Р₂O₅. Выход 1.80 г (87.0%), R_f 0.82 (1). Т. пл. 106-108 С. Лит. т. пл. 101-102 С [Евстигнеева Р.П., Лубсандоржиева Л.К., Желтухина Г.А.// ДАН. 1992. Т. 326. С. 452-455]. Масс-спектр, m/z: [М]⁺ 378.9.

Пример 2. N -Boc-Leu-Val-Phe-OMe (III).

Раствор 1.10 г (2.91 ммоль) Boc-Val-Phe-OMe в TFA оставляют на 25 мин при 20 С, после чего растворитель удаляют в вакууме. Остаток растирают с эфиром, растворитель удаляют в вакууме, сушат над безводным NaOH. К раствору CF₃COOH H-Val-Phe-OMe в 4.0 мл DMFA при перемешивании добавляют 0.42 мл (2.91 ммоль) Еt₃N. Оставляют на 15 мин при 0 С. Реакцию конденсации с Boc-Leu-ОН проводят в условиях, аналогичных описанным для соединения (II). Выход 1.05 г (73.4%), R_f 0.74 (1). Т. пл. 134-136 С. Найдено %: С 63.29, Н 8.2, N 8.75. С₂₆Н₄₁N₃О₆. Вычислено %: С 63.50, Н 8.34, N 8.55. Масс-спектр, m/z: [M+2H₂O]⁺ 527.0.

Пример 3. N -Boc-Leu-Leu-Val-Phe-OMe (IV).

Синтез, выделение и очистку пептида (IV) осуществляют в соответствии с методикой, описанной для пептида (III), исходя из 0.25 г (0.51 ммоль) Вос-Leu-Val-Phe-OMe. Выход 0.19 г (61.6%), R_f 0.60 (1). ИК-спектр, , см^-1, вазелиновое масло: 3260 (NH-), 1745 (СО сл. эф.), 1632 (амид I), 1515 (амид II). Спектр ¹Н-ЯМР (CDCl₃), , м. д.: 1.4 (с, 9Н, трет. Вu), 1.6 (с, 6Н, изо-Pr.), 2.05 (к, 1Н, -СН-СОО), 3.1 (д, 2Н, -CH₂-), 3.7 (с, 3Н, -O-СН₃), 4.0 (т, 4Н, N-CH-CON), 4.9 (д, 4Н, 4NH), 6.6 (д, 6Н, (СН₃)₂-СН-), 7.1-7.3 (м, 5Н, Ph). Масс-спектр, m/z: [M]⁺ 605.6.

Пример 4. N -[6(7)-(Протогемин IX)-ил]-Val-Phe-OMe (V).

Раствор 0.10 г (0.26 ммоль) Boc-Val-Phe-OMe в TFA оставляют на 25 мин при 20 С, растворитель удаляют в вакууме. Остаток растирают с эфиром, растворитель удаляют в вакууме, сушат над безводным NaOH. К раствору СF₃СООН Н-Val-Рhе-ОМе в 0.5 мл DMFA при перемешивании прибавляют 0.04 мл (0.26 ммоль) Et₃N и оставляют на 15 мин при 0 С. Добавляют 6(7)-моно-N-оксисукцинимидный эфир протогемина IX, полученный из 0.21 г (0.33 ммоль) гемина, в 3 мл DMFA по типичной методике [Радюхин В.А., Филиппович Е.И., Евстигнеева Р.П.// Журн. общ. химии. 1980. Т. 50. С. 673-678]. Оставляют на 48 ч при 20 С. Растворитель из реакционной смеси удаляют в вакууме, остаток растирают с эфиром, растворитель удаляют в вакууме. Сырой продукт очищают препаративной хроматографией на пластинах PSC-Fertigplatten Kieselgel 60 F₂₅₄ (200 200 1 мм) (Merck) в системе растворителей хлороформ-метанол (9:1). Целевое вещество элюируют с сорбента смесью хлороформ-метанол (1:1). Для введения противоиона раствор геминпептида (V) в 10 мл хлороформа обрабатывают 0.5 н. раствором соляной (уксусной) кислоты, промывают водой до нейтральной реакции. Органический слой сушат над безводным Na₂SO₄, растворитель удаляют в вакууме, остаток сушат над безводным СаСl₂ в вакууме. Выход 0.14 г (59.0%), R_f 0.41 (3), R_f 0.05 (2). Электронный спектр, _max, нм, СНСl₃, ( 10^-3): 389.2 (78.5), 511.0 (8.8), 540.2 (6.9), 642.4 (5.0); ИК-спектр, , см^-1, СНСl₃: 3316 (NH-), 1745 (СО сл. эф.), 1619 (СОО^-), 1667 (амид I), 1506 (амид II). Масс-спектр, m/z: [M+H]⁺ 877.1. Количественный аминокислотный анализ: Val 0.99(1), Phe 1.01(1).

Пример 5. N -[6,7-(Протогемин IX)-ил]-Val-Рhе-ОМе (VI).

Соединение (VI) получают по методике, описанной для соединения (V) из 0.10 г (0.26 ммоль) Boc-Val-Phe-OMe и 6,7-бис-N-оксисукцинимидного эфира протогемина IX в 2 мл DMF, синтезированного из 0.09 г (0.14 ммоль) гемина, 0.03 г (0.28 ммоль) N-гидроксисукцинимида и 0.06 г (0.28 ммоль) DCC. Продукт очищают на колонке (170 20 мм) с силикагелем UA 02750 32-63 Active (США), элюируя целевое вещество смесью хлороформ-метанол (9:1). Для введения противоиона геминпептид (VI) обрабатывают по методике, описанной для соединения (V). Выход 0.11 г (74.2%), R_f 0.6 (3), R_f 0.9 (2). Электронный спектр, _max, нм, СНСl₃, ( 10^-3): 389.0 (75.7), 509.6 (8.3), 543.6 (6.4), 641.6 (4.8); ИК-спектр, , см^-1, СНСl₃: 3316 (NH-), 1743 (СО сл. эф.), 1653 (амид I), 1516 (амид II). Масс-спектр, m/z: [М]⁺ 1137.41. Количественный аминокислотный анализ: Val 0.94(1), Phe 1.07(1).

Пример 6. N -[6(7)-(Протогемин IX)-ил]-Leu-Val-Phe-OMe (VII).

Соединение (VII) получают аналогично соединению (V) из 0.10 г (0.20 ммоль) Boc-Leu-Val-Phe-OMe и 6(7)-моно-N-оксисукцинимидного эфира протогемина IX в 2 мл DMF, синтезированного из 0.18 г (0.29 ммоль) гемина. Сырой продукт очищают препаративной хроматографией аналогично соединению (V). Для введения противоиона геминпептид (VII) обрабатывают в соответствии с методикой, описанной для соединения (V). Выход 0.02 г (12.4%), R_f 0.41 (3). Масс-спектр, m/z: [М+3Н]⁺ 992.26.

Пример 7. N -[6(7)-(Протогемин IX)-ил]-Leu-Leu-Val-Phe-OMe (VIII).

Соединение (VIII) получают аналогично соединению (V) из 0.12 г (0.20 ммоль) Boc-Leu-Leu-Val-Phe-OMe и 6(7)-моно-N-оксисукцинимидного эфира протогемина IX в 2.5 мл DMF, синтезированного из 0.18 г (0.29 ммоль) гемина. Сырой продукт очищают препаративной хроматографией аналогично соединению (V). Для введения противоиона геминпептид (VIII) обрабатывают в соответствии с методикой, описанной для соединения (V). Выход 0.09 г (41.0%), R_f 0.5 (3), R_f 0.05 (2). Электронный спектр, _max, нм, СНСl₃, ( 10^-3): 387.0 (46.0), 512.0 (6.9), 543.0 (6.0); ИК-спектр, , см^-1, СНСl₃: 3250 (NH-), 1730 (СО сл. эф.), 1617 (COO^-), 1640 (амид I), 1540 (амид II). Масс-спектр, m/z: [М]⁺ 1104.7. Количественный аминокислотный анализ: Leu 1.80 (2), Val 1.09 (1), Phe 1.01 (1).

Пример 8. N -[6,7-(Протогемин IX)-ил]-Leu-Leu-Val-Phe-OMe (IX).

Соединение (IX) получают аналогично соединению (VI) из 0.10 г (0.20 ммоль) Boc-Leu-Leu-Val-Phe-OMe и 6,7-бис-N-оксисукцинимидного эфира протогемина IX в 2 мл DMF, синтезированного из 0.07 г (0.11 ммоль) гемина. Сырой продукт очищают препаративной хроматографией аналогично соединению (V). Для введения противоиона геминпептид (IX) обрабатывают в соответствии с методикой, описанной для соединения (V). Выход 0.09 г (32.0%), R_f 0.7 (3), R_f 0.9 (2). Электронный спектр, _max, нм, СНСl₃, ( 10^-3): 390.6 (53.9), 509.0 (5.9), 540.0 (5.5), 640.8 (2.5); ИК-спектр, , см^-1, СНСl₃: 3316 (NH-), 1745 (СО сл. эф.), 1650 (амид I), 1514 (амид II). Масс-спектр, m/z: [М]⁺ 1104.7. Количественный аминокислотный анализ: Leu 2.00 (2), Val 0.96 (1), Phe 1.07 (1).

Пример 9. N -[6(7)-(Протогемин IX)-ил]-Gly-Pro-Arg-OMe (X).

Деблокирование аминокомпонента и синтез геминпептида (X) осуществляют в соответствии с условиями, описанными для соединения (V), исходя из 0.04 г (0.09 ммоль) Boc-Gly-Pro-Arg-OMe и 6(7)-моно-N-оксисукцинимидного эфира протогемина IX в 2 мл DMF, синтезированного из 0.09 г (0.13 ммоль) гемина. Целевое вещество выделяют на колонке (300 30 мм) с силикагелем L40/100 (Чехия), элюируя смесью растворителей хлороформ-метанол-уксусная кислота 9:1:0.1. Фракции, содержащие вещество с R_f 0.42 (6) собирают. Растворители удаляют в вакууме. Остаток очищают препаративной хроматографией на пластинах PSC-Fertigplatten Kieselgel 60 F₂₅₄ (200 200 1 мм) (Merck) в системе растворителей (6). Для введения противоиона раствор геминпептида (X) в 5 мл н-бутанола обрабатывают 0.5н раствором соляной (уксусной) кислоты, промывают водой до нейтральной реакции. Органический слой сушат над безводным Na₂SO₄, растворитель удаляют в вакууме, остаток сушат над безводным CaCl₂. Выход 0.03 г (28%), R_f 0.45 (6). Электронный спектр, _max, нм, МеОН, ( 10^-3): 399.4 (72.6), 481.6 (5.6), 597.0 (3.9). ИК-спектр, , см^-1, вазелиновое масло: 1637 (амид I), 1562 (амид II). Масс-спектр, m/z: [M⁺] 940.53.

Пример 10. N -[6(7)-(Протогемин IX)-ил]-Arg-OMe (XI).

К раствору 0.12 мл (0.80 ммоль) Еt₃N и 1 мл DMF прибавляют 0.10 г (0.40 ммоль) HCl H-Arg-OMe, оставляют на 15 мин при 20 С. К раствору полученного аминокомпонента добавляют раствор 6(7)-моно-N-оксисукцинимидного эфира протогемина IX в 5 мл DMF, синтезированного из 0.38 г (0.58 ммоль) гемина. Реакционную смесь перемешивают в течение 5 ч, оставляют на 72 ч при 20 С. Растворитель из реакционной смеси удаляют в вакууме. Вещество очищают на колонке (300 15 мм) с Kieselgel 60, целевой продукт элюируют смесью метанол-вода-уксусная кислота (3:1:1). Фракции, содержащие вещество с R_f 0.26 (6), собирают. Растворители удаляют в вакууме. Остаток очищают препаративной хроматографией на пластинах PSC-Fertigplatten Kieselgel 60 F₂₅₄ (Merck) в системе растворителей хлороформ-метанол-уксусная кислота (7:3:0.5). Растворители удаляют в вакууме. Для введения противоиона геминпептид (XI) обрабатывают в соответствии с методикой, описанной для соединения (X). Выход 0.056 г (17%). R_f 0.26 (6). Электронный спектр, _max, нм, МеОН, ( 10^-3): 398.4 (53.9), 482.2 (5.9), 597.8 (3.0); ИК-спектр, , см^-1, вазелиновое масло: 1745 (СО сл. эф.), 1635 (амид I), 1560 (амид II). Масс-спектр, m/z: [M]⁺ 786.41.

Пример 11. N -[6,7-(Протогемин IX)-ил]-Arg-OMe (XII).

Соединение (XII) получают аналогично соединению (XI) из 0.10 г (0.40 ммоль) HCl H-Arg-OMe и 6,7-бис-N-оксисукцинимидного эфира протогемина IX в 2 мл DMF, синтезированного из 0.14 г (0.22 ммоль) гемина. Реакционную смесь перемешивают в течение 6 ч, оставляют на 72 ч при 20 С. Растворитель из реакционной смеси удаляют в вакууме. Вещество очищают на колонке (300 15 мм) с Kieselgel 60, целевой продукт элюируют смесью хлороформ-метанол-уксусная кислота (7:3:1). Растворители удаляют в вакууме. Для введения противоиона геминпептид (XII) обрабатывают в соответствии с методикой, описанной для соединения (X). Выход 0.030 г (12%). R_f 0.4 (7). Электронный спектр, _max, нм, МеОН, ( 10^-3): 398.8 (50.9), 481.8 (5.4), 596.8 (4.8); ИК-спектр, , см^-1, вазелиновое масло: 1745 (СО сл. эф.), 1632 (амид I), 1558 (амид II). Масс-спектр, m/z: [М]⁺ 956.52.

Пример 12. N -[6(7)-(Протогемин IX)-ил]-Leu-Val-Phe-OH (XIII).

Присоединение стартовой аминокислоты к полимерной матрице осуществляют в соответствии с методикой [Barlos К., Chatzi О., Gamos D., Stavropouls G.// Int. J. Peptide Protein. Res. 1991. V. 37. P. 513-520]. К 0.3 г (0.47 ммоль Сl^-) полимера, предварительно набухшего в 3 мл DCE, прибавляют свежеприготовленный раствор 0.12 г (0.30 ммоль) Fmoc-Phe-OH и 0.11 мл (0.75 ммоль) Et₃N в 4.5 мл DCE. Смесь перемешивают 25 мин при 20 С. Реакцию останавливают прибавлением 6 мл смеси МеОН-Еt₃N (9:1), перемешивают 1 мин. Пептидилполимер отфильтровывают и промывают DCE (2 мин 3), DMF (2 мин 2), изопропанол (2 мин 2), DMF (2 мин 2), изопропанол (2 мин 2), метанол (2 мин 1), эфир (2 мин 2). Объем одной промывки 3 мл. Сушат в вакууме над Р₂О₅. Содержание стартовой аминокислоты в полимере, определенное спектрофотометрическим методом по содержанию Fmoc-группы в полимере [Dryland A., Sheppard R.C.// J. Chem. Soc. Perkin Trans. I. 1986. №1. Р. 125-137], 0.43 ммоль/г. К раствору 0.13 г (0.39 ммоль) Fmoc-Val-OH в 3 мл DMF при охлаждении и перемешивании добавляют 0.06 г (0.39 ммоль) 1-НОВТ и 0.08 г (0.39 ммоль) DCC. Смесь перемешивают в течение 20 мин, прибавляют к деблокированному пептидилполимеру и перемешивают в течение 30 мин. Оставляют на 24 ч при 20 С. Дипептидилполимер отфильтровывают, промывают DMF (1 мин 5). Нингидриновый тест отрицательный. Реакцию пептидообразования повторяют с использованием 0.14 г (0.39 ммоль) Fmoc-Leu-ОН, трипептидилполимер отфильтровывают, промывают аналогично предыдущему. Нингидриновый тест положительный. Реакцию повторяют с 1 эквивалентом карбоксильного компонента. Оставляют на 2 ч. Нингидриновый тест отрицательный. Раствор 6(7)-моно-N-оксисукцинимидного эфира протогемина IX, полученного по типичной методике из 0.36 г (0.56 ммоль) гемина, в 10.5 мл DMF прибавляют к 0.3 г деблокированного трипептидилполимера и перемешивают в течение 30 мин. Оставляют на 24 ч при 20 С. Геминпептидилполимер отделяют, промывают DMF (1 мин 7). Нингидриновый тест отрицательный. К 0.3 г геминпептидилполимера прибавляют 3 мл смеси AcOH-TFE-DCM (1:1:8), перемешивают в течение 1 ч. Полимер отделяют, промывают смесью AcOH-TFE-DCM (1:1:8) (1 мин 4). Растворители из фильтрата удаляют в вакууме, остаток сушат в вакууме над NaOH. Для введения противоиона раствор геминпептида в 10 мл н-бутанола обрабатывают 0.5 н раствором соляной (уксусной) кислоты, промывают водой до нейтральной реакции. Органический слой сушат над безводным Na₂SO₄, растворитель удаляют в вакууме, остаток сушат над безводным СаСl₂ вакууме. Продукт очищают на колонке с сефадексом LH-20 25/100 (Швеция), элюируя целевое вещество смесью хлороформ-метанол (1:1). Выход 0.08 г (72.0%), R_f 0.63 (4). Электронный спектр, _max, нм, СНСl₃-МеОН (1:1), ( 10^-3): 395.2 (60.3), 500.2 (6.4), 536.0 (5.7), 624.6 (4.8); ИК-спектр, , см^-1, в пленке: 3291 (NH-), 1716 (-СООН), 1643 (амид I), 1546 (амид II). Масс-спектр, m/z: [M]⁺ 975.5. Количественный аминокислотный анализ: Leu 0.97 (1), Val 1.00 (1), Phe 1.04 (1).

Пример 13. N -[6(7)-(Протогемин IX)-ил]-Val-Ser-Gln-Asn-Leu-OH (XIV).

Присоединение стартовой аминокислоты Leu к 0.33 г (0.52 ммоль Сl^-) полимера с 2-хлортритилхлоридной якорной группой осуществляют по методике, описанной для соединения (XIII), с использованием 0.12 г (0.33 ммоль) Fmoc-Leu-OH и 0.12 мл (0.83 ммоль) Et₃N. Содержание стартовой аминокислоты в полимере 0.28 ммоль/г. К раствору 0.10 г (0.27 ммоль) Fmoc-Asn-OH в 3 мл DMF при охлаждении и перемешивании добавляют 0.04 г (0.27 ммоль) 1-НОВТ и 0.06 г (0.27 ммоль) DCC. Смесь перемешивают в течение 20 мин, прибавляют к деблокированному пептидилполимеру и перемешивают в течение 30 мин. Оставляют на 24 ч при 20 С. Дипептидилполимер отфильтровывают, промывают DMF (1 мин 5). Нингидриновый тест положительный. Аминоацилполимер промывают DMF (1 мин 2), добавляют раствор 0.08 г (0.45 ммоль) п-нитрофенилацетата в 3 мл DMF, оставляют на 2 ч, дипептидилполимер отфильтровывают, промывают DMF (1 мин 5). Нингидриновый тест отрицательный. К деблокированному дипептидилполимеру прибавляют раствор 0.14 г (0.27 ммоль) Fmoc-Gln-OPfp в 3 мл DMF, перемешивают 30 мин, оставляют на 24 ч при 20 С. Трипептидилполимер отфильтровывают, промывают DMF (1 мин 5). Нингидриновый тест отрицательный. К раствору 0.15 г (0.27 ммоль) Fmoc-Ser(Trt)-OH в 3 мл DMF при охлаждении и перемешивании добавляют 0.04 г (0.27 ммоль) 1-НОВТ и 0.06 г (0.27 ммоль) DCC. Смесь перемешивают в течение 20 мин, прибавляют к деблокированному трипептидилполимеру и перемешивают в течение 30 мин. Оставляют на 24 ч при 20 С. Тетрапептидилполимер отфильтровывают, промывают DMF (1 мин 5). Нингидриновый тест отрицательный. Реакцию пептидообразования повторяют с использованием 0.09 г (0.27 ммоль) Fmoc-Val-OH. Пентапептидилполимер отфильтровывают, промывают DMF (1 мин 5). Нингидриновый тест отрицательный. Раствор 6(7)-моно-N-оксисукцинимидного эфира протогемина IX, полученного по типичной методике из 0.36 г (0.56 ммоль) гемина, в 10.5 мл DMF прибавляют к 0.3 г деблокированного пентапептидилполимера и перемешивают в течение 30 мин. Оставляют на 24 ч при 20 С. Геминпептидилполимер отделяют, промывают DMF (1 мин 7). Нингидриновый тест отрицательный. К 0.3 г геминпептидилполимера прибавляют 3 мл смеси AcOH-TFE-DCM (1:1:8), перемешивают в течение 1.5 ч. Полимер отделяют, промывают смесью AcOH-TFE-DCM (1:1:8) (1 мин 4). Растворители из фильтрата удаляют в вакууме, остаток сушат в вакууме над NaOH. Сырой продукт растворяют в DMF и переосаждают эфиром. Осадок отделяют и промывают МеОН. Для введения противоиона геминпептид (XIV) обрабатывают в соответствии с методикой, описанной для соединения (XIII). Выход 0.10 г (92.0%), R_f 0.35 (5). Электронный спектр, _max, нм, DMSO, ( 10^-3): 404.0 (60.3), 499.4 (6.4), 537.6 (5.7), 622.2 (4.8); ИК-спектр, , см^-1, DMSO: 3308 (NH-), 1725 (-COOH), 1671 (амид I), 1538 (амид II). Масс-спектр, m/z: [M]⁺ 1158.4. Количественный аминокислотный анализ: Leu 1.00 (1), Asp 1.10 (1), Glu 1.20 (1), Ser 0.80 (1), Val 0.90 (1).

Пример 14. N -[6(7)-(Протогемин IX)-ил]-Arg-Arg-Trp-His-Arg-Leu-Lys-Glu(OMe)-OH (XV).

Присоединение стартовой аминокислоты Glu к 0.6 г (0.95 ммоль Сl^-) полимера с 2-хлортритилхлоридной якорной группой осуществляют по методике, описанной для соединения (XIII), с использованием 0.36 г (0.95 ммоль) Fmoc-Glu(OMe)-OH и 0.33 мл (2.38 ммоль) Et₃N. Содержание глутаминовой кислоты в полимере 0.22 ммоль/г. Твердофазный синтез октапептидилполимера осуществляют аналогично описанному выше синтезу трипептидилполимера при получении геминпептида (XIII). Реакции образования пептидной связи на полимере проводят с использованием трехкратных избытков (по отношению к содержанию стартовой глутаминовой кислоты в полимере) Fmoc-производных аминокислот, в том числе Fmoc-Lys(methoxy-Trt)-OH и Fmoc-His(Trt)-OH, в присутствии эквивалентных количеств DCC 1-HOBT (по 0.40 ммоль) в среде DMF в течение 24 ч. Присоединение остатка гемина осуществляют в соответствии с методикой, описанной в примере синтеза соединения (XIII). Отщепление целевого геминпептида с одновременным деблокированием боковых функциональных групп проводят действием на пептидилполимер смеси AcOH-TFE-DCM (2:1:7) в течение 3 ч при перемешивании. Далее