Изолированная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид tag 7, изолированный полипептид tag 7, способ ингибирования развития опухолей у млекопитающих (варианты) и способ лечения рака у животного(варианты)

Патент 2238976

Авторы

Классы МПК

Реферат

Изобретение относится к биотехнологии и медицине и может быть использовано для получения tag7 полипептида и ингибирования развития опухоли. Полипептид tag7 или изолированную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид tag7, используют для ингибирования развития опухолей у млекопитающего и лечения рака путем воздействия на клетку. Воздействие нуклеиновой кислотой, в частности, осуществляют с помощью вектора или вириона. Изобретение позволяет разрабатывать лекарственные средства для лечения карциномы, меланомы, саркомы, лейкемии. 6 н. и 29 з.п. ф-лы, 36 ил., 5 табл.

Область изобретения

Изобретение относится к области молекулярной биологии, биологии рака и терапевтической медицины. Изобретение главным образом направлено на идентификацию генов, которые ингибируют развитие клеток рака и вызывают в них апоптоз, и на полипептиды, кодируемые такими генами. В частности, изобретение касается нуклеотидной последовательности одного из таких ингибирующих опухоли генов, tag7, аминокислотной последовательности полипептида, кодируемого tag7, антител, которые специфически связывают генный продукт tag7 и способов ингибирования развития раковых клеток и терапии рака с применением гена tag7 и генного продукта.

Уровень техники

Метастазирование опухоли

Метастазирование опухолевых клеток представляет собой комплексный процесс, включающий сложный каскад процессов. Среди этих процессов пролиферация опухолевых клеток и блокирование механизма апоптоза (см. статью Harrington Е.А. и др. в журнале Embo J. 73:3286-3295 (1994)), распространение опухолевых клеток в окружающих тканях, проникновение опухолевых клеток в циркуляционные контуры крови и лимфы и закрепление и размножение опухолевых клеток на новом месте (см. статьи Schirmacher А.Е. в журнале Adv.Cancer Res. 43: и Liotta L.A. и др. в журнале Lab.Invest.49:636-649 (1983)). Пока молекулярные механизмы индуцирования фенотипа метастазов остаются слабо исследованными; вероятно, что когда опухоль становится метастазирующей, происходит активация и/или инактивакция различных регуляторных и структурных генов. Описаны несколько генов, чья экспрессия коррелируется с потенциальной способностью опухолей к метастазированию (см. статьи Yasushi Т. и др. в журнале J.Biol.Chem. 269(37): 22958-22963 (1994); Ebralidze А.К. и др. в журнале Genetika (USSR),25(5): 932-936 (1989); Wolf С. и др. в журнале Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90:1843-1847 (1993); Bernbard E.J. и др. в журнале Proc.Natl.Acad.Sci. USA 91;61-65; Sato Н. и др. в журнале Nature 370:61-65 (1994)).

Предполагалось, что популяция клеток в пределах определенной опухоли может быть гетерогенной в отношении их потенциальной способности к метастазированию (см. статью Fidler I.J. и Hart I.R. в журнале Science 217: 998-1001(1982). Это предположение указывало на возможность получения родственных опухолей, которые по потенциальной способности к метастазированию заметно отличаются от одной родительской опухоли. Например, получили опухоли, которые можно трансплантировать мыши и которые имеют переменную повторяемость и специфичность метастазирования по отношению к органу, как результат выбора характера метастазирования (см. статью Senin V.M. в журнале Vestn.Akad.Med.Nauk.SSSR 0(5): 85-91 (1984)).

Полипептиды, ингибирующие опухоли

Ряд полипептидов, естественньм путем продуцируемых клетками млекопитающих, проявляют антиопухолевую активность (то есть индуцируют задержку роста, апоптоз и/или дифференциацию раковых клеток). Например, сообщается, что комбинации определенных цитокинов, таких как интерлейкины и колониестимулирующие факторы, индуцируют конечную дифференциацию и сопутствующую задержку роста некоторых типов опухолевых клеток и клеточных линий (см. обзор, данный Pimental E. в Handbook of Growth Factors, Vol.1, Roca Raton, Florida: CRC Press, c.28-34 (1994)). К тому же, трансформирующий (-фактор роста (TGF-) и интерфероны известны в качестве потенциальных ингибиторов развития опухолевых клеток при определенных условиях in vivo и in vitro (см. статью Keski-Oja J. и Moses H.L. в журнале Med-Biol. 66:13-20 (1987); статью Ohta M. и др. в журнале Nature 329:539-541 (1987)). Другие естественные полипептиды млекопитающих проявляют разнообразную противоопухолевую активность, например индуцируют апоптоз в некоторых опухолевых клетках, содержат факторы некроза опухолей (TNFs) (см. обзор, данный Pimental E. в Handbook of Growth Factors, Vol.3, Roca Raton, Florida: CRC Press, c.241-278 (1994)).

Недавно было идентифицировано семейство TNF-цитокинов и их рецепторов, чьи структурные свойства до некоторой степени являются обычными. Это семейство включает системы рецептор-лиганд из TNF, LT-, LT-, Fas, CD27, CD40, ОХ-40 и фактора роста нерва (NGF) (см. статьи Smith С. и др. в журнале Cell 76:959-962(1994); Armitage R.J. в журнале Curr.Opin.Immunol. 6:407-413 (1994)). За исключением NGF, все эти TNF-цитокины, как предполагается, вовлечены в регуляцию иммунной системы. TNF и лимфотоксин-альфа (LT- или TNF-) представляют собой цитокины, вовлеченные во многие регуляторные процессы (см. статьи Vassalli P. в журнале Ann. Rev. Immunol. 10: 411-452 (1992); Paul N. и Ruddle N. в журнале Ann.Rev.Immunol. 6:407-438 (1988)), но их роль в иммунной системе, хотя и является, без сомнения, решающей, остается загадочной (см. статью Kossodo S. и др. в журнале Exp.Med. 176:1259-1264 (1994)). TNF синтезируется разными типами клеток как ответ на различные неблагоприятные воздействия; это обычно является одним из первичных явлений в каскаде воспалительных процессов, включающем сильный противоопухолевый эффект у мыши (см. статью Blankenstein Т. и др. в журнале J.Exp.Med.173:1047-1052 (1991)). Активированные макрофаги являются основным источником мембраносвязанного TNF, хотя он также продуцируется активированньми лимфоцитами и несколькими клетками других типов. Наоборот, LT- продуцируется только лимфоцитами и существует в мембраносвязанной форме только через гримерный комплекс с LT- (см. статью Browning J. и др. в журнале Cell 72:847-855 (1993)). LT- обнаруживает спектр действия, аналогичный спектру действия TNF в системах in vitro, но слабее (см. статью Browning J. и Ribolini А. в журнале J.Immunol. 743:1859-1867 (1989)). И TNF, и LT- индуцируют апоптоз в различных системах (см. статьи Cohen J.J. и др. в журнале Ann. Rev.Immunol. 10:267-293 (1992); Golstein Р. и др. в журнале Immunol.Rev.121:29-65 (1991); Sarin А. и др. в журнале J.Immunol. l55:3716-3718 (1995)). Недавно появилось сообщение об ингибировании роста опухолей, опосредованном LT- (см. статью Qin Z. и Blankenstein Т. в журнале Cancer Res. 55-A747-4751 (1995)).

TNF и LT- также вырабатываются некоторыми опухолевыми клетками различного происхождения, такими как фибросаркомы мыши, линии эпителиальных клеток человека, а также клетки и клеточные линии лейкемии Т-клеток (см. статьи Rubin B.Y. и др. в журнале J.Exp.Med.164:1350-1255 (1986); Spriggs D.R. и др. в журнале J.Clin.Invest. 81:455-460 (1988); Ishibashi К. и др. в журнале Blood77: 2451-2455 (1991)). Гены, кодирующие TNF, LT- и LT-P, лежат на близком расстоянии один от другого внутри области класса III основного комплекса гистосовместимости (МНС) (см. статьи Spies и др. в журнале Proc.Natl.Acad. USA 53:8699-8702 (1986); Nedospasov S.A. и др. в журнале Nucl.Acids Res. 14:7713-7725 (1986); Gardner S.М.и др. в журнале J.Immunol. 139:476-483 (1987)). Представляется, что эти гены являются эволюционно родственными и формируют локус за счет тандемных дупликаций гена, хотя противоположная ориентация транскрипции LT- означает, что могут иметь место более сложные эволюционные процессы. В последнее время был клонирован и определен в качестве индуцирующего апоптоз TNF-лиганда (TRAIL), еще один новый член семейства TNF (см. статью Wiley S.R. и др. в журнале Immunity 3: 673-682 (1995)).

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение преимущественно относится к генам и полипептидам, ингибирующим развитие опухолей, и способам лечения рака с использованием таких генов и полипептидов. Конкретно, изобретение предлагает выделенные молекулы нуклеиновой кислоты tag7, содержащие нуклеотидную последовательность по меньшей мере на 65% (более предпочтительно по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 99%) идентичную используемой в качестве ссылки последовательности, выбранной из группы, включающей:

(a) нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:1;

(b) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид tag7 имеющий полноразмерную аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:2;

(c) нуклеотидную последовательность, кодирующую зрелый полипептид tag7, имеющий аминокислотную последовательность в положениях 20-182 в SEQ ID NO:2;

(d) нуклеотидную последовательность полинуклеотида, который гибридизуется при жестких условиях с полинуклеотид, имеющим нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:1;

(e) нуклеотидную последовательность полинуклеотида, который гибридизуется при определенных условиях с полинуклеотидом, имеющим нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:1;

(f) нуклеотидную последовательность, комплементарную к любой из последовательностей по (а), (b), (с), (d) или (е), или их фрагмент.

Изобретение также относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей полинуклеотид, который гибридизуется при жестких условиях с полинуклеотидом, имеющим нуклеотидную последовательность, идентичную той, которая содержится в выделенных молекулах нуклеиновой кислоты, описанных выше, и которая может или не может кодировать полипептид с tag7-активностью.

Изобретение также относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей полинуклеотид, который гибридизуется при определенных условиях с полинуклеотидом, имеющим нуклеотидную последовательность, идентичную той, которая содержится в выделенных молекулах нуклеиновой кислоты, описанных выше, и которая может или не может кодировать полипептид с tag7-активностью.

В предпочтительном воплощении изобретение относится к выделенным молекулам нуклеиновой кислоты tag7 содержащим полинуклеотид, имеющий:

(a) нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:3;

(b) нуклеотидную последовательность, кодирующую человеческий полипептид tag7, имеющий полноразмерную аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:4;

(c) нуклеотидную последовательность полинуклеотида, который гибридизуется при жестких условиях гибридизации с полинуклеотидом, имеющим нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:3;

(d) нуклеотидную последовательность полинуклеотида, который гибридизуется при определенных условиях гибридизации с полинуклеотидом, имеющим нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:3;

(e) нуклеотидную последовательность, комплементарную к любой из последовательностей по (а), (b), (с), или (d), или их фрагмент.

Изобретение также относится к векторам, в частности векторам экспрессии, содержащим такие выделенные молекулы нуклеиновой кислоты, и клеткам-хозяевам, которые содержат эти выделенные молекулы или векторы. Предпочтительные клетки-хозяева согласно изобретению включают, не ограничиваясь этим, бактериальные клетки, дрожжевые клетки, клетки животных (в особенности клетки млекопитающих или насекомых) и клетки растений.

Изобретение также касается способов продуцирования выделенного полипептида tag7, предусматривающих культивирование вышеописанных клеток-хозяев при условиях, обеспечивающих экспрессию полипептида tag7 и выделение его. Изобретение направлено также на выделенные полипептиды tag7, продуцированные согласно этим способам.

Изобретение относится также к выделенным полипептидам tag7, имеющим аминокислотную последовательность по меньшей мере на 65% (более предпочтительно на по меньшей мере 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 99%), идентичную используемой в качестве ссылки последовательности, выбранной из группы, включающей:

(a) аминокислотную последовательность, кодируемую выделенной молекулой нуклеиновой кислоты, имеющей нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:1;

(b) полноразмерную аминокислотную последовательность полипептида tag7, представленную в SEQ ID NO:2;

(c) аминокислотную последовательность полипептида tag7, кодируемую полинуклеотидом, который гибридизуется при жестких условиях гибридизации с полинуклеотидом, имеющим нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:1;

(d) аминокислотную последовательность полипептида tag7, кодируемую полинуклеотидом, который гибридизуется при определенных условиях гибридизации с полинуклеотидом, имеющим нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:1; или их фрагмент.

В предпочтительном воплощении изобретение относится к человеческому полипептиду tag7, имеющему:

(a) аминокислотную последовательность, кодируемую выделенной молекулой нуклеиновой кислоты, имеющей нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:3;

(b) аминокислотную последовательность полипептида tag7, представленную в SEQ ID NO:4; или их фрагмент.

Изобретение относится также к фармацевтическим композициям, содержащим один или более из вышеописанных выделенных полипептидов tag7, или их фрагментов и фармацевтически приемлемый носитель, или среду для них.

Изобретение касается также способов продуцирования выделенного tag7-специфичного антитела, предусматривающих иммунизацию животного вышеописанными выделенными полипептидами tag7 и выделение из животного tag7-специфичного антитела. Изобретение направлено также на tac7-специфичные антитела, продуцируемые этими способами. Антитела согласно настоящему изобретению могут быть моноклональными или поликлональными и могут быть мечены для их обнаружения или иммобилизованы на твердой опоре.

Изобретение касается также способов ингибирования развития опухолей у млекопитающих, таких как опухоли у человека. В одном из предпочтительных воплощений, такие способы согласно изобретению могут предусматривать воздействие на клетку млекопитающего композиции, содержащей один или более выделенных полипептидов tag7, причем выделенный полипептид tag7 имеет аминокислотную последовательность по меньшей мере на 65% (более предпочтительно по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 99%) идентичную используемой в качестве ссылки последовательности, выбранной из группы, включающей:

(b) полноразмерную аминокислотную последовательность полипептида tag7, представленную в SEQ ID NO:2;

(c) аминокислотную последовательность зрелого полипептида tag7, имеющего аминокислотную последовательность, представленную в положениях 20-182 в SEQ ID NO:2;

(d) аминокислотную последовательность, кодируемую полинуклеотидом, который гибридизуется при жестких условиях гибридизации с полинуклеотидом, имеющим нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:1;

(e) аминокислотную последовательность, кодируемую полинуклеотидом, который гибридизуется при определенных условиях гибридизации с полинуклеотидом, имеющим нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:1, при этом воздействие на клетку млекопитающего полипептидом tag7 ингибирует рост клетки.

В предпочтительном варианте осуществления этого способа опухолью млекопитающего является опухоль человека, и на человеческие клетки воздействуют композицией, содержащей человеческий полипептид tag7, имеющий аминокислоту, кодируемую выделенной молекулой нуклеиновой кислоты, который имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:3, или ее фрагмент.

В другом предпочтительном варианте осуществления данное изобретение относится к способам ингибирования развития опухоли у млекопитающего, предусматривающим введение в клетку млекопитающего молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей полинуклеотид, имеющий полинуклеотидную последовательность, по меньшей мере на 65% (более предпочтительно, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 99%), идентичную используемой в качестве ссылки последовательности, выбранной из группы, включающей:

(a) нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:l;

(b) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид tag 7, имеющий полноразмерную аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:2;

(d) нуклеотидную последовательность молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид tag7, содержащий полинуклеотид, который гибридизуется при жестких условиях гибридизации с полинуклеотидом, имеющим нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:l;

(е) нуклеотидную последовательность молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид tag7, содержащий полинуклеотид, который гибридизуется при определенных условиях гибридизации с полинуклеотидом, имеющим нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:1, при этом введение выделенной молекулы нуклеиновой кислоты в клетку млекопитающего ингибирует развитие опухоли.

В предпочтительном варианте осуществления данное изобретение относится к способам ингибирования развития опухоли человека, предусматривающим введение в клетку человека молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей человеческий полинуклеотид tag7, имеющий нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:3, или его фрагмент.

В соответствии с данным изобретением в результате осуществления настоящих способов можно индуцировать в вышеописанных опухолях апоптоз. Опухоли млекопитающих, развитие которых ингибируется способами по изобретению, преимущественно включают опухолевые клетки человека, в частности клетки карциномы (включая, но не ограничиваясь этим, клетки карциномы печени, клетки карциномы яичника, клетки карциномы груди, клетки карциномы затылочной части шеи, клетки карциномы легкого, клетки карциномы простаты, клетки карциномы желудка, клетки карциномы мочевого пузыря, клетки карциномы яичка, клетки карциномы прямой кишки, клетки кардиномы поджелудочной железы, клетки карциномы полости рта, клетки карциномы чешуйчатых клеток, клетки карциномы головы и шеи и клетки тератокарциномы), клетки саркомы (включая, но не ограничиваясь этим, клетки саркомы Kaposi, клетки фибросаркомы и клетки остеосаркомы), клетки меланомы и клетки лейкемии.

Изобретение также относится к способам лечения рака у страдающего им животного (в частности, млекопитающего, такого как человек). В одном из предпочтительных воплощений такие способы могут предусматривать воздействие на указанное животное композиции, содержащей один или более выделенных полипептидов tag7, причем указанный выделенный полипептид tag7 имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 65% (более предпочтительно по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 99%) идентичную используемой в качестве ссылки последовательности, выбранной из группы, включающей:

(b) полноразмерную аминокислотную последовательность полипептида tag 7, представленную в SEQ ID NO:2;

(c) аминокислотную последовательность зрелого полипептида tag 7, имеющего аминокислотную последовательность, представленную в положениях от 20 до 182 в SEQ ID NO:2;

(d) аминокислотную последовательность, кодируемую молекулой выделенной нуклеиновой кислоты, содержащей полинуклеотид, который гибридизуется при жестких условиях гибридизации с полинуклеотидом, имеющим нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:1;

(е) аминокислотную последовательность, кодируемую молекулой выделенной нуклеиновой кислоты, содержащей полинуклеотид, который гибридизуется при определенных условиях гибридизации с полинуклеотидом, имеющим нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID: 1, причем указанное лечение ингибирует развитие рака или индуцирует ремиссию рака.

В другом предпочтительном варианте осуществления данного изобретения такие способы согласно настоящему изобретению могут предусматривать введение в организм животного молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность по меньшей мере на 65% (более предпочтительно по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 99%), идентичную используемой в качестве ссылки последовательности, выбранной из группы, включающей:

(a) нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:1;

(c) нуклеотидную последовательность, кодирующую зрелый полипептид tag7 имеющий аминокислотную последовательность в положениях от 20 до 182 в SEQ ID NO:2;

(d) нуклеотидную последовательность полинуклеотида, который гибридизуется, при жестких условиях гибридизации с полинуклеотидом, имеющим нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:1;

(е) нуклеотидную последовательность полинуклеотида, который гибридизуется при определенных условиях гибридизации с полинуклеотидом, имеющим нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:1, причем указанное лечение ингибирует развитие рака или индуцирует ремиссию.

В предпочтительном варианте осуществления такие способы могут предусматривать введение человеку композиции, содержащей выделенный человеческий полинуклеотид tag7, имеющий полинуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:3, или по меньшей мере один из фрагментов.

В другом предпочтительном варианте осуществления данное изобретение относится к способам лечения рака у страдающего им животного, предусматривающих введение животному по меньшей мере одной вышеописанной композиции, содержащей один или несколько из выделенных полипептидов tag7 по настоящему изобретению.

В соответствии с изобретением выделенные полипептиды tag7, используемые в вышеописанных способах, преимущественно имеют аминокислотную последовательность по меньшей мере на 95% идентичную вышеописанным последовательностям. Композиции, содержащие tag7 и используемые в вышеописанных способах, могут далее содержать фармацевтически приемлемые носитель или среду для выделенного полипептида tag7.

Также в соответствии с настоящим изобретением полинуклеотиды, используемые в вышеописанных способах, имеют последовательности нуклеиновых кислот по меньшей мере на 65% (более предпочтительно по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 99%), идентичные вышеописанным последовательностям, и могут содержаться в векторе или вирионе, которые можно произвести из аденовируса или аденоассоциированного вируса.

Животным, страдающим от рака и подвергаемьм лечению способами согласно настоящему изобретению, может быть млекопитающее, например человек. Рак, излечиваемый этими способами, может включать, не ограничиваясь этим, карциному (такую как карцинома печени, карцинома яичника, карцинома груди, карцинома затылочной части шеи, карцинома легкого, карцинома простаты, карцинома желудка, карцинома мочевого пузыря, карцинома яичка, карцинома прямой кишки, карцинома поджелудочной железы, карцинома полости рта, карцинома чешуйчатых клеток, карцинома головы и шеи или тератокарцинома), саркому (например, саркому Kaposi, фибросаркому и остеосаркому), меланому или лейкемию.

Другие предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения будут ясны обычному специалисту с учетом прилагаемых чертежей и описания изобретения, а также формулы изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1 изображает нуклеотидную последовательность кодирующего сегмента клонированной к ДНК из tag7 (SEQ ID NO:1) и аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 2) полипептида tag7, кодируемого этой кодирующей последовательностью.

Фиг.2 представляет сложный график различных структурных характеристик полипептида tag7, показывающий (на основе первичной аминокислотной структуры полипептида): вероятные участки альфа-спирали, бета-складчатой структуры, бета-изгиба и альфа-закрученной структуры; вероятные альфа- и бета-амфипатические участки; гидрофильность полипептида; показатель антигенности полипептида; возможную локализацию полипептида на клеточной поверхности.

Фиг.3 представляет радиоавтографию, сравнивающую результаты анализа, выявляющего различия в мРНК у неметастазирующих опухолевых клеток VMR-0 (линии 1, 3) и опухолевых клеток VMR-L, дающих метастазы в печени (линии 2, 4), кДНК были получены из 0,2 мг РНК путем обратной транскрипции с помощью обратной транскриптазы вируса лейкемии из мыши Moloney (M-MuLV) в присутствии праймера Т12АС (5'-ТТТТТТТТТТТТАС-3') (SEQ ID NO: 5) и двух различных 10-основных олигонуклеотидных праймеров: 5'-AATCGGGCTG-3' (SEQ ID NO:6; линии 1, 2) и 5'AGT-CAGCCAC-3' (SEQ ID NO:7; линии 3, 4). Различия в популяциях мРНК между двумя разными типами клеток показаны стрелками.

Фиг.4 представляет радиоавтографию Нозерн-блоттинг гибридизации реамплифицированных кДНК проб tag7 с помощью тотальной РНК, полученной из опухолевых клеток VMR-0 (линия 1) и опухолевых клеток VMR-L (линия 2). Относительное количество материала в каждой линии определяется по интенсивности сигнала гибридизации от кДНК гена глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH).

Фиг.5 представляет радиоавтографию Нозерн-блоттинг гибридизации тотальной РНК, выделенной из различных органов здоровой мыши, с обработкой пробой, представляющей собой ³²Р-меченную ДНК клона tag7. Линия 1: клетки VMR-0; линия 2: клетки VMR-L; линия 3: исходная печень; линия 4: исходная зобная железа; линия 5: исходный яичник; линия 6: исходное сердце; линия 7: исходный головной мозг; линия 8: исходная почка; линия 9: исходная селезенка; линия 10: исходное легкое; линия 11: исходная кожа. GAPDH является меченной пробой, используемой в качестве стандарта, как на фиг.2.

Фиг.6 представляет радиоавтографию Нозерн-блоттинг-гибридизации тотальной РНК, выделенной из различных клеточных линий мыши, с обработкой пробой, представляющей собой ³²Р-меченную ДНК из клона tag7. Линия 1: клетки CSML-0; линия 1:клетки CSML-100; линия 3: клетки VMR-0; линия 4: клетки VMR-L; линия 5: клетки VMR-Ov.

Фиг.7 представляет радиоавтографию Нозерн-блоттинг-гибридизации тотальной РНК, выделенной из различных первичных опухолей мыши и соответствующих опухолевых клеточных линий мыши, с обработкой пробой, представляющей собой ³²Р-меченную ДНК из клона tag7.

Фиг.8 представляет набор фотографий, отображающих распределение транскриптов tag7 в тканях мыши.

(А): Радиоавтография Нозерн-блоттинга тотальной РНК, выделенной из указанных тканей здоровой мыши.

(В-Е): Гибридизация in situ участков ткани взрослой мыши с помощью проб ³⁵S-меченной ДНК из клона tag 7; (В): гиппокампус и зубчатая извилина головного мозга; (С): мозжечок; (D): кишки; (Е): кишки, расщепленные РНК-азой перед гибридизацией.

Фиг.9 представляет радиоавтографию Нозерн-блоттинга транскрипции tag7 в лимфоидных и кроветворных клетках мыши, культивированных в средах без добавок или в средах, содержащих липополисахарид (LPS).

Фиг.10 представляет фотографию Вестерн-блоттинга растворимых и связанных с клеткой форм tag7 в различных мышиных клетках.

(A): tag7 связанный с клеткой. Общие клеточные лизаты и кондиционированные среды ("supe") LPS-индуцированных и неиндуцированных опухолевых мышиных клеток VMR-L и VMR-0 были иммуноосаждены с антителами анти-tag7 и проанализированы методом Вестерн-блоттинга с использованием в качестве контроля рекомбинантного tag7 (rtagT).

(B): Растворимый tag7. Спленоциты мыши были стимулированы липополисахаридом в течение различных отрезков времени, и лизаты или супернатанты были иммуноосаждены и проанализированы методом блоттинга с антителами анти-tag7, как описано выше. Величины маркеров молекулярной массы указаны стрелкой.

Фиг.11 представляет в сочетании линейный график (А) и фотографию геля агарозы, окрашенного бромидом этидия (В), показывающие, что растворимый белок tag7 индуцирует гибель и фрагментацию ДНК в клетках L929.

(А): Клетки L929 были культивированы в присутствии tag7 (среды, кондиционированные клетками VMR-L, стимулированными с помощью LPS) или фактора некроза опухоли (TNF), с антителами анти-tag7 или без них и тестированы на гибель клеток путем окрашивания трипановым синим (кондиционированная среда и TNF) или расщепления лактатдегидрогеназой (TNF). Результаты показаны как среднее от пяти отдельных опытов, а ошибки представляют собой средние квадратические отклонения.

(В): Фотография электрофореза в 1.8% геле агарозы, окрашенном бромидом этидия, ДНК из клеток L929, которые были обработаны только TNF ("контроль") или супернатантами клеток VMR-L, стимулированных с помощью LPS ("Tag7 supe"). Маркеры калибрования положения ДНК представлены слева.

Фиг.12 относится к ингибированию развития опухолевых клеток "in vivo" с помощью генетически модифицированных клеток VMR-0.

(A): Нозерн-блоттинг гибридизация тотальной РНК, выделенной из трансфецированных и родительских клеток с помощью проб ³²Р-меченной ДНК из tag7.

(B): График темпа развития опухоли, показывающий рост клеток (незакрашенные квадратики - родительские опухолевые клетки VMR-0, закрашенные треугольники - псевдо-трансфецированные VMR-0, незакрашенные кружочки - подавление роста 4SX путем инъекции поликлонального антитела анти tag7 в место расположения клеток, закрашенные квадратики - наблюдаемый эффект совместной инъекции родительских (VMR-0) и tag7 - модифицированных опухолевых клеток (4SX), незакрашенные треугольники - скорость роста клона 12SX, закрашенные кружочки - скорость роста клона 4SX.C - родительских и модифицированных (клон 4SX) опухолей, полученных путем рассечения из сингенных животных).

(C): Фотографии, показывающие размер опухолей, образованных родительскими клетками и tag7модифицированными опухолевыми клетками.

(D): Определение белка tag7 с помощью Вестерн-блоттинга (верхняя полоса) и цитотоксичности культуральной среды для клеток (нижняя полоса).

Фиг.13 показывает анализ трансформированных опухолевых клеток, анализируемых в голой мыши (недостаток Т-клеток) и SCID -мыши (недостаток Т- и В-клеток). Размер опухоли контролировали в течение 40 дней.

Фиг.14 представляет фотографию голой мыши, которой вводили клетки, экспрессирующие tag7 (4SX, верхняя полоса) и родительские клетки VMR-0 (нижняя полоса).

Фиг.15: Гистологический анализ и электронная микроскопия

(A) показывает гистологический срез опухоли, образуемой родительскими клетками (клетками VMR-0), окрашенный эозин/гематоксилином.

(B) показывает изображения, полученные электронной микроскопией митотических клеток в опухоли, образуемой родительскими клетками (клетками VMR-0).

(C) показывает изображения, полученные электронной микроскопией апоптических клеток в опухоли, образуемой клетками, модифицированными tag7 (клетки 4SX).

Фиг.16: Иммуногистохимический анализ. Распознавание эффекторных клеток.

(A) Опухоли, продуцирующие tag7 (4SX).

(B) Родительские опухоли (VMR-0).

Фиг.17: Индуцирование защитного иммунитета путем временной экспрессии tag7 в М3-клетках меланомы мыши. Выживаемость DBA/2 мыши.

Фиг.18 представляет радиоавтографию Нозерн-блоттинг-гибридизации тотальной РНК, выделенной из различных человеческих органов с помощью проб ³²P-меченной ДНК из мышиного клона tag 7, демонстрирующий экспрессию гомологии tag7 в различных человеческих тканях.

Фиг.19 показывает определение tag7, экспрессируемого как фьюжн-белок GST-tag7.

Фиг.20 показывает иммунногистохимический анализ аденокарциномы легкого с помощью антител анти- tac7.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Обзор

Для распознавания генов, обнаруживающих разный уровень экспрессии в опухолях на различных стадиях развития, согласно настоящему изобретению использовали две опухолевых линии аденокарциномы грудной железы мыши (VMR-0, имеющих низкую способность к метастазированию, и VMR-L, метастазирующих в печень с высокой частотой). С использованием технологии "выявления различий в РНК" (см. статью Liang Р. и Pardee A.B. в журнале Science 257:967-971(1992)) был получен ранее не описанный ген, экспрессированный в опухолевой линии VMR-L, который был назван tag7 и структурно охарактеризован. Хотя ген tag7 первоначально был выделен из мышиных тканей, настоящее изобретение относится также к человеческому гомологу tag7, который экспрессируется в человеческих клетках и тканях. Поэтому обычному специалисту в данной области будет понятно, что термин "tag7", как он здесь применяется, означает выделенные tac7-молекулы нуклеиновой кислоты, полинуклеотиды, полипептиды и антитела, которые могут быть мышиного или человеческого происхождения, и настоящее изобретение таким образом охватывает tog-7-молекулы нуклеиновой кислоты, полинуклеотиды, полипептиды и антитела мышиного и человеческого происхождения.

Молекулы нуклеиновой кислоты

Все нуклеотидные последовательности, кроме особо оговоренных случаев, определяемые здесь путем секвенирования молекулы ДНК, определяются секвенированием вручную, например, дидезокси-секвенированием, в соответствии с методами, которые являются обычными для специалиста в данной области (см. статьи Sanger F. и Coulson A.R. в журнале J.Mol.Biol. 94:444-448 (1975); Sanger F. и др. в журнале Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74:5463-5467 (1977)), или автоматическим секвенированием, например с использованием с Автоматического Секвенатора для биосистем (Applied Biosystems Automated Sequenator), в соответствии с инструкциями изготовителя. Все аминокислотные последовательности полипептидов, кодированные определенными здесь молекулами ДНК, были предсказаны путем умозрительной трансляции ДНК-последовательности, определенной выше. Поэтому, как известно в данной области знаний в отношении любой ДНК-последовательности, определяемой в соответствии с такими подходами, всякая ДНК-последовательность, определяемая здесь, может содержать некоторые ошибки. Нуклеотидные последовательности, определяемые такими методами, обычно являются идентичными по меньшей мере на 90%, более типично - по меньшей мере от 95% до 99,9%, действительной нуклеотидной последовательности секвенированной молекулы ДНК. Как известно также специалисту в данной области, единичная вставка или делеция в определенной нуклеотидной последовательности по сравнению с действительной последовательностью приводит к такому сдвигу рамки в трансляции нуклеотидной последовательности, что предсказанная аминокислотная последовательность, кодируемая определенной нуклеотидной последовательностью, будет совершенно иной, чем аминокислотная последовательность, в действительности кодируемая молекулой ДНК, начиная от точки расположения такой вставки или делеции.

Если не оговорено иного, каждая "нуклеотидная последовательность", изображенная здесь, представлена как последовательность дезоксирибонуклеотидов (аббревиатуры A, G, С и Т). Однако под "нуклеотидной последовательностью" молекулы нуклеиновой кислоты или полинуклеотида подразумевается для молекулы ДНК или полинуклеотида последовательность дезоксирибонуклеотидов, а для молекулы РНК или полинуклеотида соответствующая последовательность рибонуклеотидов (A,G,C и U), где каждый дезоксирибонуклеотид тимидин (Т) в специфической дезоксирибонуклеазной последовательности замещен рибонуклеотидом уридином (U). Например, упоминание о tag7-молекуле РНК, имеющей последовательность SEQ ID NO:1, представленную с использованием дезоксирибонуклеотидных аббревиатур, как предполагается, указывает на молекулу РНК, имеющую последовательность, в которой каждый дезоксирибонуклеотид A,G или С последовательности SEQ ID NO:1 был замещен соответствующим рибонуклеотидом А, G или С и каждый дезоксирибонуклеотид Т был замещен рибонуклеотидом U.

Используя данную здесь информацию, например, о нуклеотидной последовательности на фиг.1, можно получить молекулу нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, кодирующую полипептид tag7 с применением стандар