Рекомбинантная термостабильная днк-полимераза, способ ее получения и применение

Рекомбинантная термостабильная днк-полимераза, способ ее получения и применение

Реферат

 

Изобретение относится к области генной инженерии и молекулярной биологии и может быть использовано при разработке и осуществлении многих методов анализа ДНК. Предложены модифицированные формы термостабильных ДНК-полимераз, получаемые путем замены остатка глутамата в 4-м положении 11-членного критического мотива, принадлежащего нативной форме фермента бактерий р. Thermus, другим аминокислотным остатком, введение которого имеет результатом понижение уровня дискриминирующей способности фермента по отношению к нуклеотидам, меченным красителем из класса флуоресцеина. Предпочтительной является замена глутамата в указанном положении лизином. Описаны ДНК-последовательности, кодирующие предлагаемые варианты термостабильной ДНК-полимеразы, векторы для экспрессии этих последовательностей в различных типах хозяйских клеток, способ получения рекомбинантных форм модифицированных ДНК-полимераз по изобретению и наборы для осуществления анализов с их использованием, которое существенно упрощает экспериментальную процедуру. 5 с. и 6 з.п. ф-лы, 1 ил., 3 табл.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к термостабильным ДНК-полимеразам, обладающим повышенной эффективностью в отношении включения нуклеозидтрифосфатов, меченных красителями из класса флуоресцеина. В настоящем изобретении описаны способы выделения и получения таких модифицированных полимераз. Область применения ферментов по изобретению достаточно широка, в частности они находят применение в молекулярной биологии и прежде всего предпочтительны для секвенирования нуклеиновых кислот.

Предпосылки создания изобретения

Включение нуклеозидтрифосфатов (дНТФ), меченных флуоресцентными красителями, важно для многих случаев, когда используют синтез ДНК in vitro. Например, реакции секвенирования ДНК с использованием окрашенных терминаторов требуют включения флуоресцентных аналогов дидезоксинуклеотидов для терминации и мечения. Кроме того, при синтезе меченых продуктов in vitro может использоваться включение флуоресцентных нуклеотидов или аналогов нуклеотидов. Например, флуоресцентно меченную ДНК применяли в опытах по гибридизации с использованием упорядоченных микронаборов иммобилизованных зондов (Cronin и др., 1996, Human Mutation 7: 244).

Для обеспечения точности репликации ДНК ДНК-полимеразы обладают выраженной способностью к включению в растущую цепь естественных для них субстратов, которые в контексте настоящего описания называют обычными дезоксинуклеозидтрифосфатами (дНТФ), и способностью не включать необычные дНТФ, такие как дНТФ и аналоги дНТФ, меченные флуоресцентными красителями. В клетке эта способность приводит к уменьшению включения аномальных оснований, таких как дУТФ, в растущую цепь ДНК. Это свойство особенно ясно проявляется в опытах in vitro, когда присутствуют как обычные, так и необычные флуоресцентно меченные нуклеозидтрифосфаты, например в реакциях секвенирования ДНК с использованием варианта метода терминации дидезокси-цепи, основанного на применении окрашенных терминаторов (Lee и др., 1992, Nucl. Acids Res. 20: 2471, и эта публикация включена в настоящее описание в качестве ссылки).

Поступающие в продажу наборы для циклического секвенирования ДНК, предназначенные для методов, основанных на применении окрашенных терминаторов, содержат в качестве терминаторов цепи ддНТФ, меченные флуоресцентными красителями из класса родамина. Однако родаминовые красители биполярны по заряду, а нуклеозидтрифосфаты, меченные этими красителями, аномально мигрируют в электрофоретических гелях, которые применяются для разделения продуктов секвенирования с целью их обнаружения. Это свойство красителей из класса родамина требует внесения модификаций в стандартный протокол секвенирования, предусматривающий использование дезоксиинозинтрифосфата (дИТФ) и дополнительной стадии процессинга перед электрофорезом.

В отличие от этого отрицательно заряженные флуоресцентные красители, такие как красители из класса флуоресцеина, по сравнению с нейтральными или положительно заряженными флуоресцентными красителями способствуют 1) лучшему разделению меченых нуклеозидтрифосфатов и меченых продуктов удлинения праймера и 2) лучшей электрофоретической миграции меченых продуктов секвенирования. Таким образом, применение красителей из класса флуоресцеина устраняет необходимость в дополнительных стадиях процессинга, которые требуются в случае использования красителей из класса родамина. Однако доступные красители из класса флуоресцеина не являются идеальными для применения в форматах циклического секвенирования ДНК, имеющихся в продаже в настоящее время, поскольку при использовании этих форматов ддНТФ, меченные этими красителями, не включаются достаточно эффективно в продукты секвенирования. Таким образом, существует необходимость в разработке для целей продажи термостабильных ДНК-полимераз, которые могут эффективно включать как обычные, так и флуоресцентно меченные нуклеотиды. Настоящее изобретение направлено на решение этой задачи. Кроме того, неожиданным свойством мутантных ферментов по настоящему изобретению является более высокая скорость удлинения праймера по сравнению с соответствующим ферментом дикого типа. Другим неожиданным свойством является более высокая однородность включения различных нуклеотидов-терминаторов при автоматизированном анализе последовательности ДНК.

Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к зависимым от матрицы термостабильным ДНК-полимеразам, которые обладают пониженной дискриминирующей способностью в отношении включения нуклеотидов, меченных красителями из класса флуоресцеина, по сравнению с ранее описанными ферментами. Эти ферменты позволяют включать нуклеотиды, в том числе дезоксинуклеотиды (дНТФ) и аналоги оснований, такие как дидезоксинуклеотиды (ддНТФ), меченные красителями из класса флуоресцеина, более эффективно в сравнении с обычными термостабильными ферментами. В настоящем изобретении также описаны гены, кодирующие эти ферменты, а также рекомбинантные векторы экспрессии, предназначенные для получения больших количеств очищенных ферментов.

В соответствии с настоящим изобретением в термостабильных ДНК-полимеразах выявлена область, имеющая наиболее важное значение (критическая область), которая ответственна за способность полимеразы включать нуклеотиды, меченные красителями из класса флуоресцеина, сохраняя при этом способность правильно включать естественные нуклеотиды. С целью реализации преимуществ изобретения в гены термостабильной ДНК-полимеразы с помощью методов рекомбинантной ДНК, таких как сайтспецифический мутагенез, может быть интродуцирована эта имеющая наиболее важное значение область или "критический мотив".

Таким образом, одним из объектов изобретения являются рекомбинантные термостабильные ферменты - ДНК-полимеразы, которые отличаются тем, что эти ферменты содержат мутации, обеспечивающие получение критического мотива, и они обладают пониженной дискриминирующей способностью в отношении включения нуклеотидов, меченных красителями из класса флуоресцеина, по сравнению с соответствующим ферментом дикого типа.

В соответствии с этим аспектом в изобретении предлагаются рекомбинантные термостабильные ферменты - ДНК-полимеразы, которые отличаются тем, что а) в своей нативной форме указанная полимераза включает аминокислотную последовательность LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO:1) (дана в однобуквенном коде), где Х обозначает любую аминокислоту; б) Х в положении 4 этой последовательности изменен по сравнению с указанной нативной последовательностью при условии, что Х не заменен на Е (глутамин); и в) указанная термостабильная ДНК-полимераза обладает пониженной дискриминирующей способностью в отношении включения нуклеотидов, меченных красителями из класса флуоресцеина, по сравнению с нативной формой указанного фермента. В трехбуквенном коде эта аминокислотная последовательность может быть записана в виде LeuSerXaaXaaLeuXaaXaaProXaaXaaGlu (SEQ ID NO:1), где "Хаа" в положениях 3, 4, 6, 9 и 10 этой последовательности обозначает остаток любой аминокислоты, а "Хаа" в положении 7 этой последовательности обозначает Val или Ilе.

В другом варианте рекомбинантные термостабильные ДНК-полимеразы отличаются тем, что а) нативная форма полимеразы включает аминокислотную последовательность LS(Q/G)XL(S/A)IPYEE (SEQ ID NO: 2), где Х обозначает любую аминокислоту; б) X в положении 4 указанной последовательности изменен по сравнению с указанной нативной последовательностью при условии, что Х не заменен на Е; и в) указанная термостабильная ДНК-полимераза обладает пониженной дискриминирующей способностью в отношении включения нуклеотидов, меченных красителями из класса флуоресцеина, по сравнению с нативной формой указанного фермента. В трехбуквенном коде эта аминокислотная последовательность может быть записана в виде LeuSerXaaXaaLeuXaaIleProTyrGluGlu (SEQ ID NO:2), где "Хаа" в положении 3 обозначает Gln или Gly, "Хаа" в положении 4 обозначает любую аминокислоту, а "Хаа" в положении 6 обозначает Ser или Аlа. В предпочтительном варианте аминокислотная последовательность представляет собой последовательность LSQXLAIPYEE (SEQ ID NO:3), где Х обозначает любую аминокислоту. В трехбуквенном коде эта аминокислотная последовательность может быть записана в виде LeuSerGlnXaaLeuAlaIleProTyrGluGlu (SEQ ID NO:3), где "Хаа" в положении 4 обозначает любую аминокислоту. В более предпочтительном варианте "Хаа" в положении 4 обозначает Lys.

Еще в одном из вариантов осуществления изобретения рекомбинантные термостабильные ДНК-полимеразы отличаются тем, что а) нативная форма полимеразы включает аминокислотную последовательность LSVXLG(V/I)PVKE (SEQ ID NO:4); б) X в положении 4 этой последовательности изменен по сравнению с указанной нативной последовательностью при условии, что Х не заменен на Е; и в) указанная термостабильная ДНК-полимераза обладает пониженной дискриминирующей способностью по отношению к включению нуклеотидов, меченных красителями из класса флуоресцеина, по сравнению с нативной формой указанного фермента. В трехбуквенном коде эта аминокислотная последовательность может быть записана в виде LeuSerValXaaLeuGlyXaaProValLysGlu (SEQ ID NO:4), где "Хаа" в положении 4 обозначает любую аминокислоту, а "Хаа" в положении 7 обозначает Val или Ilе. В предпочтительном варианте аминокислотная последовательность представляет собой последовательность LSVXLGVPVKE (SEQ ID NO:5), где Х в положении 4 обозначает любую аминокислоту. В трехбуквенном коде эта аминокислотная последовательность может быть записана в виде LeuSerValXaaLeuGlyValProValLysGlu (SEQ ID NO:5), где "Хаа" в положении 4 обозначает любую аминокислоту. В более предпочтительном варианте "Хаа" в положении 4 обозначает Arg. Еще в одном из предпочтительных вариантов аминокислотная последовательность представляет собой последовательность LSVXLGIPVKE (SEQ ID NO:6), где Х в положении 4 обозначает любую аминокислоту. В трехбуквенном коде эта аминокислотная последовательность может быть записана в виде LeuSerValXaaLeuGlyIleProValLysGlu (SEQ ID NO:6), где "Хаа" в положении 4 обозначает любую аминокислоту. В более предпочтительном варианте "Хаа" в положении 4 обозначает Arg.

В соответствии с другим объектом настоящего изобретения конкретная критическая область по настоящему изобретению может быть объединена с мотивами других областей гена полимеразы, для которых известно, что они позволяют получить термостабильные ДНК-полимеразы, обладающие пониженной дискриминирующей способностью в отношении включения необычных нуклеотидов, таких как рНТФ и дцНТФ. В качестве примера, приведенного в настоящем описании, была сконструирована рекомбинантная ДНК-полимераза Thermus aquaticus (Taq), содержащая две мутации. Первая мутация представляла собой замену Е (глутамина) на К (лизин) в остатке Х в положении 4 критического мотива по настоящему изобретению. Вторая мутация представляла собой мутацию, позволяющую более эффективно включать ддНТФ, известную как мутация F667Y. Эта мутация представляет собой замену фенилаланина на тирозин в положении 667 ДНК-полимеразы Taq (что описано в патенте США 5614365 и в заявке на патент США 8/448223, которые включены в настоящее описание в качестве ссылки). Было обнаружено, что в реакции секвенирования с использованием ддНТФ, меченных красителями из класса флуоресцеина, фермент с двойной мутацией Е681К F667Y позволяет получить четкую лестницу секвенирования. Таким образом, в этом варианте осуществления мотив, обусловливающий пониженную дискриминирующую способность по отношению к дидезоксинуклеотидам, объединяют с критическим мотивом по настоящему изобретению с целью получения фермента, обладающего повышенной эффективностью в отношении включения как меченых, так и немеченых ддНТФ.

Кроме того, неожиданно было обнаружено, что мутантный фермент Е681К F667Y обладает существенно увеличенной скоростью удлинения по сравнению с ферментом, имеющим одну мутацию F667Y. Таким образом, в соответствии с другим вариантом осуществления изобретения интродукция в термостабильную ДНК-полимеразу критического мотива, одного или в комбинации с другими мотивами, приводит к образованию ферментов, обладающих повышенной скоростью удлинения. Также неожиданно было обнаружено, что фермент с двойной мутацией приводит к получению более однородных по высоте пиков при дидезокси-секвенировании с окрашенным терминатором при использовании меченных родамином терминаторов. Таким образом, в соответствии с еще одним вариантом осуществления изобретения интродукция критического мотива в фермент термостабильную ДНК-полимеразу приводит к образованию ферментов, для которых характерны более однородные по высоте пики при секвенировании ДНК с помощью методов, основанных на использовании терминаторов, меченных красителями из класса родамина.

В соответствии с еще одним вариантом осуществления мутацию, которая позволяет более эффективно включать рНТФ, такую как мутацию, приводящую к замене глутаминовой кислоты на глицин в положении 615 ДНК-полимеразы Taq, или мутацию E615G (описанную в европейской заявке ЕР-А-823479, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки) объединяют с критическим мотивом по настоящему изобретению с целью получения фермента, обладающего повышенной эффективностью в отношении включения рибонуклеотидов, меченных красителями из класса флуоресцеина.

Следующим объектом настоящего изобретения являются гены, кодирующие полимеразы по настоящему изобретению, в частности гены, кодирующие рекомбинантные термостабильные полимеразы, которые содержат критический мотив по настоящему изобретению. Также этот объект относится к генам, кодирующим комбинации из двух или большего количества мутаций, которые включают мутации, приводящие к получению критического мотива по настоящему изобретению.

Еще одним объектом изобретения являются усовершенствованные способы секвенирования ДНК, позволяющие применять более низкие концентрации ддНТФ, меченных красителями из класса флуоресцеина, снижая тем самым стоимость проводимых реакций. Улучшенные способы по изобретению также позволяют использовать более низкие соотношения ддНТФ, меченных красителями из класса флуоресцеина, и дНТФ. Благодаря применению этих способов достигается целый ряд преимуществ, в том числе более эффективная полимеризация, более низкие требуемые концентрации нуклеиновой кислоты - матрицы и снижение вероятности внесения ингибиторов в реакционную смесь. Эти преимущества также облегчают секвенирование длинных матриц. Изобретение также относится к улучшенным способам секвенирования, при которых реакционные смеси для секвенирования могут быть внесены непосредственно в секвенирующие гели для последующего электрофореза без промежуточной очистки.

Таким образом, в изобретении предлагаются усовершенствованные способы определения последовательности нуклеиновой кислоты-мишени с использованием рекомбинантного фермента, который имеет а) мутацию в положении 4, которая позволяет получить критический мотив по настоящему изобретению, и б) обладает пониженной дискриминирующей способностью в отношении включения нуклеотидов, меченных красителями из класса флуоресцеина, по сравнению с соответствующим ферментом дикого типа. Настоящее изобретение также включает усовершенствованные способы секвенирования с использованием ферментов термостабильных ДНК-полимераз, происходящих из термофильных видов, причем эти ферменты содержат встречающиеся в естественных условиях вариации последовательности, которые приводят к получению критического мотива по настоящему изобретению. Эти нативные ферменты также могут обеспечивать пониженную дискриминирующую способность в отношении включения необычных нуклеотидов. Согласно этому варианту в изобретении предлагаются усовершенствованные способы секвенирования с использованием нативной термостабильной ДНК-полимеразы, которая а) имеет критический мотив по настоящему изобретению, в котором аминокислота в положении 4 не является Glu, и б) обладает пониженной дискриминирующей способностью в отношении включения нуклеотидов, меченных красителями из класса флуоресцеина.

Согласно настоящему изобретению предлагаются также усовершенствованные способы получения ДНК, меченной красителями из класса флуоресцеина. Ферменты по изобретению позволяют эффективно включать флуоресцентно меченные дНТФ при использовании метода полимеразной цепной реакции, приводя к получению амплифицированных продуктов, меченных в различных сайтах красителями из класса флуоресцеина. Таким образом, в этом варианте осуществления предлагаемый способ мечения ДНК включает а) получение реакционной смеси, содержащей дНТФ, меченные красителями из класса флуоресцеина, и фермент по изобретению, и б) проведение реакции амплификации нуклеиновой кислоты.

Дополнительными объектами изобретения являются ферменты по изобретению и гены, кодирующие эти ферменты, в виде наборов для секвенирования ДНК, которые содержат рекомбинантный фермент по изобретению и могут дополнительно включать отрицательно заряженное флуресцентное соединение-терминатор. Другие наборы для секвенирования ДНК включают а) отрицательно заряженное флуоресцентное соединение - терминатор и б) нативный фермент по изобретению.

Изобретение также относится к наборам для получения меченой ДНК, которые включают рекомбинантный фермент по изобретению. Другие наборы для получения меченой ДНК включают а) отрицательно заряженное флуоресцентное соединение - нуклеозидтрифосфат и б) нативный фермент по изобретению.

Краткое описание чертежей

На чертеже представлено схематическое изображение гена ДНК-полимеразы Taq. Сайты рестрикции обозначены в соответствии с примером I и с описанием способов получения дополнительных мутантов и векторов экспрессии, представленных в настоящем описании.

Подробное описание изобретения

Для облегчения понимания сущности изобретения ниже определен ряд понятий, используемых в описании.

Понятие "ген" относится к последовательности ДНК, которая включает контролирующие и кодирующие последовательности, необходимые для получения выделяемого, биологически активного полипептида или предшественника. Полипептид может кодироваться полноразмерной последовательностью гена или любой частью кодирующей последовательности, имеющей достаточную длину для того, чтобы сохранить ферментативную активность.

Понятие "нативный" относится к гену или к продукту гена, который выделяют из источника, встречающегося в естественных условиях. Это понятие также относится к рекомбинантной форме нативного протеина, полученной с использованием методов молекулярной биологии, которая имеет аминокислотную последовательность, идентичную последовательности нативной формы.

Понятие "мутант" относится к гену, нуклеотидная последовательность которого была модифицирована, или к продукту гена, аминокислотная последовательность которого была модифицирована, что приводит к получению продукта гена, который может обладать измененными функциональными свойствами по сравнению с нативным геном или геном дикого типа либо продуктом гена. Такие модификации включают точковые мутации, делеции и инсерции.

Понятие "клетка (и)-хозяин(ева)" относится как к одноклеточным прокариотическим или эукариотическим организмам, таким как бактерии, дрожжи и актиномицеты, так и к отдельным клеткам растений или животных высших отрядов, которые способны расти в культуре клеток.

Понятие "система экспрессии" относится к последовательностям ДНК, содержащим требуемую кодирующую последовательность и контролирующие последовательности в функционально связанном виде таким образом, что клетки-хозяева, трансформированные этими последовательностями, обладают способностью продуцировать кодируемые протеины. Для осуществления трансформации система экспрессии может быть включена в вектор, хотя пригодная ДНК также может быть включена в хромосому хозяина.

Понятие "олигонуклеотид" в контексте данного описания относится к молекуле, состоящей из двух или из нескольких, предпочтительно из более чем трех и обычно из более чем десяти дезоксирибонуклеотидов или рибонуклеотидов. Точный размер олигонуклеотида может зависеть от многих факторов, включающих основную функцию или применение олигонуклеотида.

Олигонуклеотиды могут быть получены любым пригодным методом, включая, например, клонирование и рестрикцию соответствующих последовательностей, а также методом прямого химического синтеза, таким как фосфотриэфирный метод, описанный у Narang и др., 1979, Meth. Enzymol. 68: 90-99; фосфодиэфирный метод, описанный у Brown и др., 1979, Meth. Enzymol. 68: 109-151; диэтилфосфорамидитный метод, описанный у Beaucage и др., 1981, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862; триэфирный метод, описанный у Matteucci и др., 1981, J. Am. Chem. Soc. 103: 3185-3191; или автоматизированными методами синтеза; или методом с использованием твердой подложки, описанным в патенте США 4458066, при этом каждая из этих публикаций включена в настоящее описание в качестве ссылки.

Понятие "праймер" в контексте данного описания относится к олигонуклеотиду, естественному или синтетическому, который обладает способностью действовать в качестве точки инициации синтеза в условиях, при которых инициируется удлинение праймера. Праймер предпочтительно представляет собой одноцепочечный олигодезоксирибонуклеотид. Пригодная длина праймера зависит от назначения праймера, но обычно составляет от 15 до 35 нуклеотидов. Короткие молекулы праймера обычно нуждаются в более низких температурах для образования достаточно стабильных гибридных комплексов с матрицей. Праймер не обязательно должен отражать точную последовательность матрицы, но для того, чтобы происходило удлинение праймера, он должен быть в достаточной степени комплементарным, чтобы гибридизоваться с матрицей.

При необходимости праймер может быть помечен путем включения метки, которая может быть обнаружена спектроскопическими, фотохимическими, биохимическими, иммунохимическими или химическими способами. Например, пригодные метки включают ³²Р, флуоресцентные красители, электронно-плотные реагенты, ферменты (такие, которые обычно применяются в методах ELISA), биотин или гаптены и протеины, для которых имеются антисыворотки или моноклональные антитела.

Понятие "термостабильная полимераза" относится к стабильному при нагревании ферменту, который является устойчивым к нагреванию и сохраняет достаточную активность для того, чтобы влиять на последующие реакции удлинения праймера, и который не способен необратимо денатурироваться (инактивироваться) при воздействии повышенных температур в течение времени, необходимого для осуществления денатурации двухцепочечных нуклеиновых кислот. Условия нагревания, необходимые для денатурации нуклеиновой кислоты, хорошо известны в данной области, и их примеры приведены в патентах США 4683202 и 4683195, которые включены в настоящее описание в качестве ссылки. В контексте данного описания термостабильная полимераза пригодна для использования в реакции с температурными циклами, такой как полимеразная цепная реакция (ПЦР). Понятие "необратимая денатурация" в контексте настоящего описания относится к постоянной и полной потере ферментативной активности. Для термостабильной полимеразы под ферментативной активностью понимают способность соответствующим образом катализировать комбинации нуклеотидов для формирования продуктов удлинения праймера, которые комплементарны цепи матричной нуклеиновой кислоты.

Понятие "обычный" или "естественный", когда оно относится к основаниям нуклеиновой кислоты, нуклеозидтрифосфатам или нуклеотидам, относится к таковым, которые встречаются в естественных условиях в указанном полинуклеотиде (например, для ДНК это дАТФ, дГТФ, дЦТФ и дТТФ). Кроме того, в реакциях синтеза ДНК in vitro, таких как секвенирование, вместо дГТФ часто используются дИТФ и 7-деаза-дГТФ и вместо дАТФ может использоваться 7-деаза-дАТФ. Они все вместе могут быть названы дезоксирибонуклеозидтрифосфатами (дНТФ).

Понятие "необычный" или "модифицированный", когда оно относится к основанию нуклеиновой кислоты, нуклеозиду или нуклеотиду, включает модификацию, производные или аналоги обычных оснований, нуклеозидов или нуклеотидов, встречающихся в конкретном полинуклеотиде в естественных условиях. Дезоксирибонуклеотидная форма урацила (дУМФ) представляет собой необычное или модифицированное основание для ДНК, в то время как рибонуклеотидная форма урацила (УМФ) представляет собой обычное основание для РНК. В контексте настоящего описания необычные нуклеотиды включают соединения, применяемые в качестве терминаторов при секвенировании нуклеиновых кислот, но не ограничены ими. Соединения-терминаторы включают соединения, имеющие 2',3'-дидезокси-структуру, которые называют дидезоксинуклеозидтрифосфатами, но не ограничены ими. Дидезоксинуклеозидтрифосфаты ддАТФ, ддТТФ, ддЦТФ и ддГТФ все вместе называют ддНТФ. Другие необычные нуклеотиды включают фосфортиоаты дНТФ ([-S]дНТФ), 5'--боран-дНТФ, -метилфосфонаты дНТФ и рибонуклеозидтрифосфаты (рНТФ). Необычные основания могут быть мечены радиоактивными изотопами, такими как ³²P, ³³P или ³⁵S, флуоресцентными метками, хемилюминесцентными метками, биолюминесцентными метками, гаптеновыми метками, такими как биотин, или ферментными метками, такими как стрептавидин или авидин. Флуоресцентные метки могут включать отрицательно заряженные красители, такие как красители из класса флуоресцеина, или нейтральные по заряду красители, такие как красители из класса родамина, положительно заряженные красители, такие как красители из класса цианина. Красители из класса флуоресцеина включают, например, FAM, HEX, TET, JOE, NAN и ZOE. Красители из класса родамина включают Texas Red, ROX, R110, R6G и TAMRA. FAM, HEX, TET, JOE, NAN, ZOE, ROX, R110, R6G и TAMRA поставляются на рынок фирмой Perkin-Elmer (Foster City, CA), a Texas Red поставляются фирмой Molecular Probes. Красители из класса цианина включают Су2, Су3, Су5 и Су7 и поставляются фирмой Amersham (Amersham Place, Little Chalfont, Buckinghamshire, Великобритания).

Понятие "реакция синтеза ДНК" относится к способам получения копий ДНК, включающим ПЦР, амплификацию замещения цепи, опосредуемую транскрипцией амплификацию, удлинение праймера и обратную транскрипцию, но не ограничено ими.

С целью дальнейшего облегчения понимания сущности изобретения в описании используются конкретные термостабильные ДНК-полимеразы и флуоресцентные красители, но эти ссылки не ограничивают объем изобретения.

Настоящее изобретение относится к новым и улучшенным композициям на основе термостабильных ДНК-полимераз. К ферментам по изобретению относятся рекомбинантные полимеразы, которые более эффективно включают нуклеозидтрифосфаты, меченные красителями из класса флуоресцеина, по сравнению с соответствующими ферментами дикого типа. Термостабильные ДНК-полимеразы по изобретению являются наиболее пригодными и целесообразными для применения в таких процессах, как секвенирование ДНК и синтез меченых продуктов in vitro, в сравнении с полимеразами, являющимися ближайшими аналогами. Улучшенные способы секвенирования ДНК по изобретению включают применение этих рекомбинантных полимераз, а также применение нативных ферментов, которые более эффективно включают нуклеозидтрифосфаты, меченные красителями из класса флуоресцеина, по сравнению с ранее описанными ферментами. Также описаны последовательности ДНК, кодирующие эти ферменты, и векторы, предназначенные для экспрессии протеинов.

Термостабильные ДНК-полимеразы по изобретению содержат внутри аминокислотной последовательности домена полимеразной активности фермента критическую область. Критическая область по настоящему изобретению внутри аминокислотной последовательности термостабильной ДНК-полимеразы приведена ниже с использованием общепринятого однобуквенного кода аминокислот (Lehninger, Biochemistry, New York, Worth Publishers Inc., 1970, стр. 67, и эта публикация включена в настоящее описание в качестве ссылки): SEQ ID NO:7: LSXXLX(V/I)PXXE, где X в положении 4 обозначает любую аминокислоту, кроме Е. В трехбуквенном коде аминокислот эта последовательность записывается в виде LeuSerXaaXaaLeuXaaXaaProXaaXaaGlu (SEQ ID NO:7), причем "Хаа" в положении 3, 6, 9 и 10 обозначает любую аминокислоту, "Хаа" в положении 4 этой последовательности обозначает любую аминокислоту, кроме остатка глутаминовой кислоты (Glu), а "Хаа" в положении 7 обозначает Val или Ile. Эта критическая область позволяет получить термостабильные ДНК-полимеразы, характеризующиеся способностью эффективно включать нуклеотиды, меченные красителями из класса флуоресцеина.

Например, в производном гена ДНК-полимеразы Thermus aquaticus (Taq), который уже содержит мутацию в положении 46, состоящую в замене глицина на аспарагиновую кислоту (мутация G46D), и мутацию F667Y, мутация, состоящая в замене G на А в первом положении кодона для глутаминовой кислоты на остатке 681 полноразмерной последовательности ДНК-полимеразы Taq (что соответствует положению 4 критического мотива) приводит к синтезу фермента, который имеет критический мотив. Этот фермент характеризуется 1) приблизительно 2-10-кратным увеличением эффективности включения нуклеотидов, меченных красителями из класса флуоресцеина, без ухудшения способности фермента участвовать в осуществлении ПЦР в присутствии обычных нуклеотидов и 2) 3-4,3-кратным увеличением скорости удлинения. В ДНК-полимеразе Taq эта конкретная мутация приводит к замене аминокислоты Е (глутаминовая кислота) на К (лизин).

Хотя эта конкретная аминокислотная замена приводит к созданию критического мотива и в значительной степени изменяет способность фермента включать необычные нуклеотиды, вероятно замена конкретно Е на К не имеет такого же решающего значения для изобретения, как и выявленное в настоящее время положение внутри критической области. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к рекомбинантным ферментам термостабильным ДНК-полимеразам, которые отличаются тем, что а) в своей нативной форме эта полимераза включает аминокислотную последовательность LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO:1), где X обозначает любую аминокислоту; б) Х в положении 4 указанной последовательности изменен по сравнению с указанной нативной последовательностью при условии, что Х в положении 4 не заменен на Е; и в) указанная термостабильная ДНК-полимераза обладает пониженной дискриминирующей способностью в отношении включения нуклеотидов, меченных красителями из класса флуоресцеина, по сравнению с нативной формой указанного фермента. В более предпочтительном варианте X в положении 4 замещен аминокислотой, имеющей положительный заряд, такой как К, R или Н, или полярной аминокислотой, такой как Q или N. В наиболее предпочтительном варианте Х в положении 4 замещен на К.

В другом предпочтительном варианте изобретение отличается тем, что фермент а) обладает пониженной дискриминирующей способностью по отношению к включению нуклеотидов, меченных красителями из класса флуоресцеина и б) включает аминокислотную последовательность LS(Q/G)XL(S/A)IPYEE, где Х обозначает любую аминокислоту (SEQ ID NO:2). В трехбуквенном коде эта аминокислотная последовательность может быть записана в виде LeuSerXaaXaaLeuXaaIleProTyrGluGlu, причем "Хаа" в положении 3 обозначает Gln или Gly, "Хаа" в положении 4 обозначает любую аминокислоту, а "Хаа" в положении 6 обозначает Ser или Аlа.

В более предпочтительном варианте фермент, обладающий пониженной дискриминирующей способностью в отношении включения нуклеотидов, меченных красителями из класса флуоресцеина, включает аминокислотную последовательность LSQXLAIPYEE, где Х обозначает любую аминокислоту (SEQ ID NO:3). В трехбуквенном коде эта аминокислотная последовательность может быть записана в виде LeuSerGlnXaaLeuAlaIleProTyrGluGlu, причем "Хаа" в положении 4 обозначает любую аминокислоту. В более предпочтительном варианте "X" обозначает остаток К.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения фермент, обладающий пониженной дискриминирующей способностью в отношении включения нуклеотидов, меченных красителями из класса флуоресцеина, включает аминокислотную последовательность LSVXLG(V/I)PVKE, где Х обозначает любую аминокислоту (SEQ ID NO:4). В трехбуквенном коде эта аминокислотная последовательность может быть записана в виде LeuSerValXaaLeuGlyXaaProValLysGlu, причем "Хаа" в положении 4 обозначает любую аминокислоту, а "Хаа" в положении 7 обозначает Val или Ilе.

В более предпочтительном варианте осуществления изобретения фермент, обладающий пониженной дискриминирующей способностью в отношении включения нуклеотидов, меченных красителями из класса флуоресцеина, включает аминокислотную последовательность LSVXLGVPVKE, где Х обозначает любую аминокислоту (SEQ ID NO:5). В трехбуквенном коде эта аминокислотная последовательность может быть записана в виде LeuSerValXaaLeuGlyValProValLysGlu, причем "Хаа" в положении 4 обозначает любую аминокислоту. В наиболее предпочтительном варианте Х обозначает остаток R.

В еще одном из наиболее предпочтительных вариантов осуществления фермент, обладающий пониженной дискриминирующей способностью в отношении включения нуклеотидов, меченных красителями из класса флуоресцеина, включает аминокислотную последовательность LSVXLGIPVKE, где Х обозначает любую аминокислоту (SEQ ID NO:6). В трехбуквенном коде эта аминокислотная последовательность может быть записана в виде LeuSerValXaaLeuGlyIleProValLysGlu, причем "Хаа" в положении 4 обозначает любую аминокислоту. В наиболее предпочтительном варианте Х обозначает остаток R.

Характеристика мутации Е681К, приведенной в настоящем описании, позволила определить область в гене ДНК-полимеразы, которая оказывает воздействие на способность полимеразы взаимодействовать с отрицательно заряженными флуоресцентными нуклеотидами. Этот сайт, периферический по отношению к спирали О, находится на конце спирали О_a и в начале спирали O_b полимеразы (Kim и др., 1995, Nature 376: 612). В соответствии с принципами молекулярного моделирования, хорошо известными в данной области, можно предположить, что замены в структуре спирали О_a-O_b, отличные от замены Е на К в положении 681, также могут вызвать изменения дискриминирующей способности в отношении включения нуклеотидов, меченных красителями из класса флуоресцеина. Таким образом, мутации в других положениях критического мотива, отличные от мутации остатка Х в положении 4, также подпадают под объем настоящего изобретения. В этом варианте осуществления изобретение относится к рекомбинантной термостабильной ДНК-полимеразе, которая отличается тем, что а) в своей нативной форме эта полимераза включает аминокислотную последовательность LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO:1), где X обозначает любую аминокислоту; б) рекомбинантная полимераза включает по крайней мере одну мутацию внутри аминокислотной последовательности при условии, что Х в положении 4 не заменен на Е; и в) фермент обладает пониженной дискриминирующей способностью в отношении включения нуклеотидов, меченных красителями из класса флуоресцеина, по сравнению с соответствующим нативным ферментом.

Аналогично этому термостабильные ДНК-полимеразы, которые содержат критические мотивы, которые сходны, но не идентичны критическому мотиву, имеющему аминокислотную последовательность LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO:7), где X в положении 4 обозначает любую амин