Ингибиторы для использования при гемостазе и иммунной функции

Ингибиторы для использования при гемостазе и иммунной функции

Реферат

 

Изобретение относится к медицине и касается ингибиторов для использования при гемостазе и иммунной реакции. Такими ингибиторами являются члены семейства белков, несущих коллагеноподобный и глобулярный домены, а именно различные последовательности zsig 37. Эти ингибиторы пригодны для стимуляции кровотока в сосудистой сети путем уменьшения тромбогенной активности и активности комплемента, а также пригодны для восстановления коллагеновых поверхностей и модуляции заживления ран. Преимущество изобретения заключается в ускорении репарации поврежденных сосудов. 4 н. и 62 з.п. ф-лы, 7 ил.

Предпосылки изобретения

Повреждение кровеносных сосудов запускает ряд событий для репарации этого повреждения и прекращения выделения крови из сосуда. Этот процесс известен как гемостаз. Тромбоциты играют раннюю роль в гемостазе путем образования тромба или пробки для временной репарации повреждения сосуда. В норме тромбоциты не взаимодействуют с эндотелиальной выстилкой стенок сосуда, но повреждение кровеносных сосудов вследствие несчастного случая или во время хирургических процедур может разрушать эндотелиальные клетки. В зависимости от степени повреждения, различные субэндотелиальные элементы, такие как коллагены, эластическая мембрана или клетки гладких мышц с ассоциированными фибриллярными коллагенами, будут экспонироваться протекающей кровью.

При экспонировании субэндотелия после повреждения сосуда тромбоциты, перемещающиеся в локальном кровотоке, взаимодействуют с экспонированным субэндотелиальным матриксом, содержащим коллаген, и замедляются. Последующее взаимодействие между рецепторами на поверхности тромбоцитов и экспонированным слоем коллагена приводит к связыванию и активации тромбоцитов, приводя к задержке локального кровотока. Связанные тромбоциты активируются и образуют агрегаты с тромбоцитами в проходящем кровотоке посредством образования фибриногеновых межтромбоцитных мостиков (Moroi and Jung, Frontiers in Bioscience 3:719-28, 1998; Barnes et al., Atherosclerosis XI, Jacotot et al., eds., Elsevier Science, pp. 299-306, 1998 и Barnes et al., Curr. Opin. Hematol. 5:314-20, 1998).

Гемостатическая реакция состоит из ряда стадий и зависит от степени повреждения кровеносного сосуда, компонентов конкретных экспонированных кровеносных сосудов и условий кровотока в поврежденной зоне (Rand et al., Thrombosis and Haemostasis 78:445-50, 1997). Экспонирование субэндотелиального матрикса (коллагена типа IV и фактора фон Виллебранда), например, во время мягкого васкулярного повреждения, стимулирует низкую степень адгезии и агрегации в зонах с условиями низкого кровотока. Повреждения, которые приводят к большей степени травмы сосуда, и экспонирование дополнительных сосудистых компонентов, таких как внутренняя эластическая мембрана и связанные с эластином микрофибриллы, будет стимулировать образование более прочных агрегатов тромбоцитов. Тяжелая васкулярная травма, обнажающая фибриллярные коллагены, провоцирует тромботическую реакцию тромбоцитов, которая защищает жертву от избыточной потери крови (Rand et al., ibid.).

Ингибиторы гемостаза были бы полезны для увеличения кровотока после васкулярного повреждения и для приведения в порядок коллагеновых поверхностей.

Фактор комплемента C1q состоит из шести копий трех родственных полипептидов (цепей А, В и С), причем каждый из этих полипептидов имеет длину приблизительно 225 аминокислот с расположенным вблизи амино-конца коллагеновым доменом и карбоксиконцевым глобулярным районом. Шесть районов с тройной спиралью образуются коллагеновыми доменами из шести цепей А, шести цепей В и шести цепей С, образуя центральный район и шесть стеблей. Глобулярный участок (головка) образуется связыванием глобулярного карбоксиконцевого домена А-, В- и С-цепи. Таким образом, C1q состоит из шести глобулярных головок, соединенных через шесть коллагеноподобных стеблей с центральным фибриллярным районом. Sellar et al., Biochem. J. 274: 481-90, 1991. Эту конфигурацию часто называют букетом цветов. Асrp30 имеет сходную структуру букета, образуемую из единственного типа полипептидной цепи.

Было обнаружено, что C1q стимулирует защитные механизмы, а также запускает генерирование токсичных разновидностей кислорода, которые могут вызывать повреждение ткани (Tenner, Behring Inst. Mitt. 93:241-53, 1993). Сайты связывания C1q найдены на тромбоцитах. Кроме того, комплемент и C1q играют роль в воспалении. Активация комплемента инициируется связыванием C1q с иммуноглобулинами.

Ингибиторы C1q и пути комплемента были бы полезны для противовоспалительных применений, ингибирования активации комплемента и тромботической активности.

Данное изобретение обеспечивает такие полипептиды для этих и других использований, которые должны быть очевидными специалистам с квалификацией в данной области из приведенных здесь обсуждений.

Сущность изобретения

В одном аспекте данное изобретение обеспечивает способ стимуляции кровотока в сосудистой сети млекопитающего, предусматривающий введение указанному млекопитающему терапевтически эффективного количества белка, родственного комплементу адипоцитов, в фармацевтически приемлемом носителе, посредством чего указанный родственный комплементу адипоцитов белок снижает тромбогенную активность и активность комплемента в указанной сосудистой сети. В одном варианте родственный комплементу адипоцитов белок содержит полипептид, содержащий последовательность аминокислотных остатков, которая является по меньшей мере на 75% идентичной по аминокислотной последовательности остаткам 26-281 SEQ ID NО:2, причем указанная последовательность содержит: повторы Gly-Хаа-Хаа или Gly-Xaa-Pro, образующие коллагеновый домен, где Хаа является любой аминокислотой, и карбоксиконцевую глобулярную часть. В родственном варианте этот полипептид содержит последовательность аминокислотных остатков, которая является по меньшей мере на 90% идентичной по аминокислотной последовательности остаткам 22-281 SEQ ID NО:2. В другом варианте этот полипептид содержит аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 90% идентичной по аминокислотной последовательности остаткам 26-281 SEQ ID NО:2. Еще в одном варианте любые различия между указанным полипептидом и SEQ ID NО:2 обусловлены консервативными заменами аминокислот. В другом варианте коллагеновый домен состоит из 13 повторов Gly-Xaa-Xaa и 1 повтора Gly-Xaa-Pro. Еще в одном варианте глобулярный домен состоит из десяти бета-складок. В родственном варианте эти бета-складки ассоциированы с аминокислотными остатками, соответствующими 147-151, 170-172, 178-181, 191-203, 207-214, 219-225, 227-239, 244-250 и 269-274 SEQ ID NO:2. Еще в одном варианте этот полипептид содержит остатки 1-281 SEQ ID NОO2 или остатки 1-281 SEQ ID NО:44.

Данное изобретение обеспечивает также полипептид, находящийся в комплексе с другим полипептидом с образованием олигомера. В одном варианте эти полипептиды образуют комплекс при помощи межмолекулярных дисульфидных связей. В другом варианте этот олигомер является тримером. Еще в одном варианте этот олигомер является гексамером. Еще в одном варианте этот мультимер является 18-мером.

В другом варианте этот полипептид снижает тромбогенную активность и активность комплемента ингибированием пути комплемента и ингибированием опосредованной коллагеном адгезии, активации или агрегации тромбоцитов. В другом варианте полипептид вводят до, во время или после острого сосудистого повреждения в указанном млекопитающем. Еще в одном варианте это повреждение обусловлено хирургической реконструкцией (пластикой) сосудов. В родственном варианте хирургическая пластика сосудов включает в себя пластическую операцию на сосудах (реконструкцию сосудов), трансплантат шунта венечной артерии, эндартерэктомию, микрососудистую репарацию или анастомоз сосудистого трансплантата. В другом родственном варианте повреждение вызвано травмой, ударом или аневризмой.

В другом аспекте данное изобретение обеспечивает способ приведения в порядок (восстановления) поврежденных коллагеновых тканей в млекопитающих, предусматривающий введение указанному млекопитающему терапевтически эффективного количества родственного комплементу адипоцитов белка; посредством чего указанный белок делает поврежденную коллагеновую ткань инертной относительно активации комплемента, тромботической активности или иммунной активации. В одном варианте поврежденные коллагеновые ткани индуцируются повреждением, ассоциированным с ишемией и реперфузией. В другом варианте повреждение включает в себя ишемию, связанную с травматическим повреждением, интестинальную странгуляцию (сдавление) или повреждение, связанное с реакциями перед восстановлением или после восстановления кровотока. Еще в одном варианте этот полипептид вводят млекопитающему, страдающему от ишемии и перерывов в кровотоке, вызываемых искусственным кровообращением, инфаркта миокарда или посттравматического вазоспазама (сужения кровеносных сосудов). В родственном варианте посттравматический вазоспазм включает в себя удар, чрескожную чреспросветную ангиопластику, эндартерэктомию, случайную сосудистую травму или хирургически индуцированную сосудистую травму.

Еще в одном варианте данное изобретение обеспечивает способ приспособления поверхности протезного биоматериала для применения в ассоциации с млекопитающим, предусматривающий введение указанному млекопитающему терапевтически эффективного количества родственного комплементу адипоцитов белка; посредством чего указанный полипептид делает поверхность указанного протезного биоматериала инертной относительно активации комплемента, тромботической активности или иммунной активности. В одном варианте поверхность указанного протезного материала покрывают коллагеном или фрагментами коллагена, желатином, фибрином или фибронектином.

В другом варианте данного изобретения обеспечен способ опосредования заживления репарации ран в млекопитающем, предусматривающий введение указанному млекопитающему терапевтически эффективного количества родственного комплементу адипоцитов белка; посредством чего указанный полипептид ускоряет прогрессирование заживления ран.

Краткое описание графических материалов.

Фиг.1 иллюстрирует множественное сопоставление полипептида zsig37 данного изобретения и HUMUPST2_1 (Maeda et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 221(2): 286-9, 1996); C1QA_HUMAN (Sellar et al., Biochem. J. 274: 481-90, 1991, Reid, Biochem. J. 179: 367-71, 1979; и Reid et al., Biochem. J. 203: 559-69, 1982), HP25_TAMAS (Takamatsu et al., Mol. Cell. Biol. 13: 1516-21, 1993 и Kondo and Kondo, J. Biol. Chem. 267: 473-8, 1992); HP27_TAMAS (Takamatsu et al., и Kondo and Kondo, выше); и CERL_RAT (Wada and Ohtani, Brain Res. Mol. Brain Res. 9: 71-7, 1991).

Фиг.2 представляет собой матрицу, показывающую процентную идентичность аминокислот в сравнении шести белков, показанных во множественном сопоставлении фиг.1.

Фиг.3а показывает связывание zsig37-FITC с коллагеном типа VI.

Фиг.3b показывает конкуренцию немеченого zsig37 с FIТС-меченым zsig37, связанным с коллагеном типа VI.

Фиг.4 показывает связывание комплемента C1q-FITC с zsig37.

Фиг.5 показывает ингибирование активности комплемента человека посредством zsig37.

Фиг.6 показывает процентную агрегацию тромбоцитов коллагеном в присутствии zsig37.

Фиг.7 показывает пролиферацию фибробластов SK5 в присутствии zsig37.

Подробное описание изобретения

Перед подробным изложением этого изобретения для его понимания может быть полезно определить следующие термины.

Термин "аффинная метка" применяется здесь для обозначения пептидного сегмента, который может быть присоединен к полипептиду для обеспечения очистки или обнаружения этого полипептида или обеспечения сайтов для присоединения этого полипептида к субстрату. В принципе, любой пептид или белок, для которого доступны антитело или другой агент специфического связывания, может быть использован в качестве аффинной метки. Аффинные метки включают в себя полигистидиновый участок, протеин A (Nilsson et al., EMBO J. 4:1075 (1985); Nilsson et al., Methods Enzymol. 198:3 (1991), глутатион-S-трансферазу (Smith and Johnson, Gene 67:31 (1988), вещество Р, FLAG^TM-пептид (Норр et al., Biotechnology 6:1204-1210 (1988), доступный из Eastman Kodak Co., New Haven, CT), стрептавидинсвязывающий пептид или другой антигенный эпитоп или связывающий домен. См., в общем, Ford et al., Protein Expression and Purification 2:95-107 (1991). ДНК, кодирующие аффинные метки, доступны из коммерческих источников (например, Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).

Термин "комплементы полинуклеотидных молекул" обозначает полинуклеотидную молекулу, имеющую последовательность комплементарных оснований и обратную ориентацию в сравнении со ссылочной последовательностью. Например, последовательность 5' ATGCACGGG 3' является комплементарной последовательности 5' CCCGTGCAT 3'.

Термин "вырожденная последовательность нуклеотидов" обозначает последовательность нуклеотидов, которая включает в себя один или несколько вырожденных кодонов (в сравнении со ссылочной молекулой полинуклеотида, которая кодирует полипептид). Вырожденные кодоны содержат отличающиеся триплеты нуклеотидов, но кодируют один и тот же аминокислотный остаток (т.е. каждый из триплетов GAU и GAC кодирует Asp).

Термин "изолированный" ("выделенный") в применении к полинуклеотиду означает, что этот полинуклеотид был удален из его природной генетической среды и, следовательно, не содержит других посторонних или нежелательных кодирующих последовательностей и находится в форме, пригодной для применения в системах получения генетически сконструированных белков. Такие изолированные молекулы являются молекулами, которые отделены от их природного окружения, и включают в себя клоны к ДНК и геномные клоны. Выделенные молекулы ДНК данного изобретения не содержат других генов, с которыми они обычно связаны, но могут включать в себя природно встречающиеся 5'- и 3'-нетранслируемые районы, такие как промоторы и терминаторы. Идентификация ассоциированных районов будет очевидной для специалиста с обычной квалификацией в данной области. См., например, Dynan and Tijan, Nature 316:774-78 (1985).

"Выделенный" полипептид или белок является полипептидом или белком, который обнаруживается в условиях, иных, чем его нативное окружение, например, отдельно от крови и ткани животного. В предпочтительной форме, выделенный белок является по существу не содержащим других полипептидов, в частности, других полипептидов животного происхождения. Предпочтительно, обеспечивать полипептиды в высокоочищенной форме, а именно, с чистотой более 95%, более предпочтительно с чистотой более 99%. При использовании в этом контексте, термин "выделенный" не исключает присутствия того же самого полипептида в альтернативных физических формах, таких как димеры или альтернативно гликозилированные или дериватизованные формы.

Термин "ортолог" обозначает полипептид или белок, полученный из одного вида, который является функциональной копией полипептида или белка из другого вида. Различия последовательностей среди ортологов являются результатом видообразования.

Термин "полинуклеотид" обозначает одно- или двухцепочечный полимер дезоксирибонуклеотидных или рибонуклеотидных оснований, считываемых от 5'-конца к 3'-концу. Полинуклеотиды включают в себя РНК и ДНК и могут быть изолированы из природных источников, синтезированы in vitro или получены из комбинации природных и синтетических молекул. Размеры полинуклеотидов выражаются как пары нуклеотидов (сокращенно "п.н."), нуклеотиды ("нт") или тысячи пар нуклеотидов ("т.п.н."). Там, где позволяет контекст, два последних термина могут описывать полинуклеотиды, которые являются одноцепочечными или двухцепочечными. При применении этого термина к двухцепочечным молекулам его используют для обозначения общей длины, и должно быть понятно, что он является эквивалентным термину "пары нуклеотидов". Специалистам с квалификацией в данной области будет понятно, что две цепи двухцепочечного полинуклеотида могут слегка отличаться по длине и что их концы могут быть расположены зигзагами в результате ферментативного расщепления; таким образом, не все нуклеотиды в двухцепочечной полинуклеотидной молекуле могут быть спаренными. Такие неспаренные концы обычно не будут превышать длину 20 нт.

"Полипептид" является полимером аминокислотных остатков, соединенных пептидными связями, получен ли он природным путем или синтетическим путем. Полипептиды, имеющие менее приблизительно 10 аминокислотных остатков, обычно называют "пептидами".

"Зондами и/или праймерами", в применении здесь, могут быть РНК или ДНК. ДНК может быть либо кДНК, либо геномной ДНК. Полинуклеотидные зонды и праймеры являются одноцепочечными или двухцепочечными ДНК или РНК, обычно синтетическими олигонуклеотидами, но они могут быть генерированы из клонированных последовательностей кДНК или геномных последовательностей или их комплементов. Аналитические зонды обычно имеют длину по меньшей мере 20 нуклеотидов, хотя могут быть использованы несколько более короткие зонды (14-17 нуклеотидов). ПЦР-праймеры имеют длину по меньшей мере 5 нуклеотидов, предпочтительно 15 или более нуклеотидов, более предпочтительно 20-30 нуклеотидов. Короткие полинуклеотиды могут быть использованы, когда целью анализа является небольшой участок гена. Для валового (gross) анализа генов полинуклеотидный зонд может содержать полный экзон или более. Зонды могут быть мечеными для обеспечения детектируемого сигнала, например, ферментом, биотином, радионуклидом, флуорофором, хемилюминесцирующим соединением, парамагнитной частицей и т.п., которые являются коммерчески доступными из многих источников, таких как Molecular Probes, Inc., Eugene, OR, и Amersham Corp., Arlington Heights, IL, с использованием способов, которые хорошо известны в этой области.

Должно быть понятно, что молекулярные массы и длины полимеров, определяемые неточными аналитическими методами (например, гель-электрофорезом), являются приблизительными величинами. Когда такая величина выражается как "около" X или "приблизительно" X, указанная величина X должна пониматься как величина, определенная с точностью до ±10%.

Данное изобретение основано частично на открытии, что новый гомолог родственного комплементу адипоцитов белка ингибирует опосредованную коллагеном активацию тромбоцитов и путь комплемента, включающий в себя C1q. Этот белок назван zsig37 и полно описан в обычно переданной опубликованной патентной заявке РСТ WO 99/04000.

Нуклеотидная последовательность zsig37 (SEQ ID NО:1) кодирует полипептид (SEQ ID NО:2), имеющий аминоконцевую сигнальную последовательность, смежный N-концевой район не-гомологии, укороченный коллагеновый домен, состоящий из повторов Gly-Xaa-Xaa или Gly-Xaa-Pro, и карбоксиконцевую глобулярную часть. Эта новая полинуклеотидная последовательность содержит также длинный 3'-нетранслируемый район. Эта общая структура полипептида, представленная выше, является общей со структурой Асrр30 и HUMUPST2_1, за исключением того, что коллагеноподобный домен каждого из этих белков является более длинным, чем этот домен полипептидов zsig37. Также последовательность ДНК HUMUPST2_1 характеризуется длинным 3'-нетранслируемым районом. Кроме того, Асrр30 и все последовательности, сопоставленные на фиг.1, за исключением CERL_RAT, имеют общий консервативный остаток цистеина в положении 187 полипептида zsig37, как показано на фиг.1 и в SEQ ID NO:2. Полипептиды zsig37 данного изобретения включают в себя также предполагаемый N-связанный сайт гликозилирования при аминокислоте 93 (Asn) SEQ ID NO:2.

Анализ тканевого распределения мРНК, соответствующей zsig37, показал, что экспрессия была наивысшей в сердце и плаценте, с относительно менее интенсивными сигналами в почке, яичнике, надпочечнике и скелетной мышце и более низкими сигналами в широком разнообразии других тканей, присутствующих на Нозерн-блоте.

Для zsig37 было установлено гомологичное родство с родственным комплементу адипоцитов белком Асrp30 (SEQ ID NO:3) и секретируемым адипоцитами белком арМ1 (HUMUPST2_1 на фиг.1 и 2). Несколько более отдаленная гомология была также идентифицирована с А-цепью компонента C1q, двумя факторами, наблюдаемыми в активном состоянии переносящих зиму в зимней спячке Сибирских сурков (HP25_TAMAS и HP27_TAMAS), и белком мозга крысы (CERL_RAT), как показано на фиг.1 и 2.

Нуклеотидная последовательность zsig37 описана в SEQ ID NO:1, а ее расшифрованная аминокислотная последовательность описана в SEQ ID NO:2. Вырожденная нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид SEQ ID NO:2, обеспечена в SEQ ID NO:23. Как описано в общем виде выше, полипептид zsig37 включает в себя сигнальную последовательность, простирающуюся от аминокислоты 1 (Met) до аминокислотного остатка 21 (Gly). Альтернативная сигнальная последовательность простирается от аминокислоты 1 (Met) до аминокислоты 25 (Ser). Таким образом, зрелый полипептид простирается от аминокислоты 22 (Leu) или 26 (Arg) до аминокислоты 281 (Pro). В зрелом полипептиде обнаружен N-концевой район неизвестной гомологии, расположенный между аминокислотными остатками 22 (Leu) и 98 (Lys). Кроме того, был обнаружен укороченный коллагеновый домен между аминокислотами 99 (Gly) и 140 (Аrg). В укороченном коллагеновом домене наблюдали 1 точный повтор Gly-Xaa-Рrо и 13 неточных повторов Gly-Xaa-Xaa. В противоположность этому, Асrр30 содержит 22 точных или неточных повторов. Полипептид zsig37 включает в себя также карбоксиконцевой глобулярный домен, простирающийся от приблизительно аминокислоты 141 (Cys) до аминокислоты 281 (Pro). Полипептид zsig37, HUMUPST2_1 и Асrр30, по-видимому, являются гомологичными в коллагеновом домене и в глобулярном домене, но не в N-концевой части зрелого полипептида.

Было определено, что глобулярный домен C1q ACRP30 имеет топологию “рулета” из 10 бета-тяжей (Shapiro and Scherer, Curr. Biol. 8:335-8, 1998), которая обнаруживает значительную структурную гомологию с TNF-семейством, а последовательность zsig37, представленная SEQ ID NО:2, содержит все 10 бета-тяжей этой структуры (аминокислотные остатки 147-151, 170-172, 178-181, 185-188, 191-203, 207-214, 219-225, 227-238, 244-250 и 269-274 SEQ ID NO:2). Эти тяжи были названы соответственно.

Zsig37 имеет две рецепторсвязывающие петли, при аминокислотных остатках 152-180 и 213-226. Аминокислотные остатки 191 (Gly), 193 (Туr), 238 (Leu) и 272 (Gly), по-видимому, являются консервативными во всем этом суперсемействе, в том числе в CD40, TNF , TNF , ACRP30 и zsig37.

Другой аспект данного изобретения включает в себя фрагменты полипептидов zsig37 как ингибиторы гемостаза и иммунных функций. Предпочтительные фрагменты включают в себя коллагеноподобный домен полипептидов zsig37, простирающийся от аминокислоты 99 (Gly) до аминокислоты 140 (Arg) SEQ ID NО:2, часть полипептида zsig37, содержащую коллагеноподобный домен или часть коллагеноподобного домена, способную к димеризации или олигомеризации. Другие предпочтительные фрагменты включают в себя глобулярный домен полипептидов zsig37, простирающийся от аминокислоты 140 (Arg) или 141 (Cys) до 281 (Pro) SEQ ID NО:2, часть полипептида zsig37, содержащую подобный глобулярному домен или активную часть подобного глобулярному домена. Другой фрагмент полипептида zsig37 данного изобретения включает в себя как коллагеноподобный домен, так и подобный глобулярному домен, простирающийся от аминокислотного остатка 99 (Gly) до 281 (Pro) SEQ ID NО:2. Эти фрагменты являются особенно применимыми в ингибировании опосредованной коллагеном активации тромбоцитов и ингибировании комплемента и C1q.

Данное изобретение обеспечивает также применение слитых (гибридных или химерных) белков zsig37. Например, слитые белки данного изобретения включают в себя (1) полипептид, выбранный из группы, включающей в себя: (а) полипептидные молекулы, содержащие последовательность аминокислотных остатков, показанную в SEQ ID NО:2, от аминокислотного остатка 1 (Met), 22 (Leu) или 26 (Arg) до аминокислотных остатков 281 (Pro); (b) полипептидные молекулы, простирающиеся от аминокислоты 99 (Gly) до аминокислоты 140 (Arg) SEQ ID NО:2, причем часть этого полипептида zsig37 содержит коллагеноподобный домен или часть коллагеноподобного домена, способную к димеризации или олигомеризации; (с) полипептидные молекулы, простирающиеся от аминокислоты 140 (Arg) или 141 (Cys) до 281 (Pro) SEQ ID NО:2, причем часть этого полипептида zsig37 содержит подобный глобулярному домен или активную часть подобного глобулярному домена; или (d) полипептидные молекулы, простирающиеся от аминокислоты 99 (Gly) до 281 (Pro), причем часть этого полипептида zsig37 включает в себя коллагеноподобный домен и глобулярный домен; и (2) другой полипептид. Этот другой полипептид может быть альтернативным или дополнительным глобулярным доменом, альтернативным или дополнительным коллагеноподобным доменом, сигнальным пептидом для облегчения секреции гибридного белка или т.п.

В способах данного изобретения применимы также агонисты и антагонисты zsig37. Способы идентификации антагонистов хорошо известны в данной области. Например, антагонисты полипептида zsig37 могут быть идентифицированы обеспечением клеток, чувствительных к полипептиду zsig37, культивированием первой порции этих клеток в присутствии полипептида zsig37, культивированием второй порции этих клеток в присутствии полипептида zsig37 и тест-соединения и детектированием уменьшения в клеточной ответной реакции второй порции клеток в сравнении с первой порцией этих клеток. Кроме этих описанных здесь тестов, пробы могут быть тестированы на ингибирование активности zsig37 в многочисленных анализах, предназначенных для измерения связывания рецептора или стимуляции/ингибирования zsig37-зависимых клеточных ответных реакций. Например, чувствительные к zsig37 клеточные линии могут быть трансфицированы конструкцией с репортерным геном, которая отвечает на стимулируемый zsig37 клеточный путь. Конструкции с репортерным геном этого типа известны в данной области и обычно будут содержать чувствительный к zsig37 ДНК-элемент, функционально связанный с геном, кодирующим детектируемый тестом белок, такой как люцифераза. Чувствительные ДНК-элементы могут включать в себя, но не ограничиваются ими, циклический АМФ-чувствительные элементы (CRE), гормон-чувствительные элементы (HRE), инсулин-чувствительный элемент (IRE) (Nasrin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:5273-7, 1990) и сыворотка-чувствительные элементы (SRE) (Shaw et al., Cell, 56:563-72, 1989). Циклические АМФ-чувствительные элементы рассматриваются в обзоре Roestler et al., J. Biol. Chem. 263 (19):9063-6; 1988 и Habener, Molec. Endocrinol. 4 (8): 1087-94 (1990). Гормон-чувствительные элементы рассматриваются в Beato, Cell 56:335-44; 1989. Соединения-кандидаты, растворы, смеси или экстракты или кондиционированные среды от различных типов клеток тестируют на их способность ингибировать активность zsig37 на клетках-мишенях, определяемую уменьшением стимуляции zsig37 экспрессии репортерного гена. Тесты этого типа будут детектировать соединения, которые непосредственно блокируют связывание zsig37 с рецепторами поверхности клеток, а также соединения, которые блокируют процессы в клеточном пути, следующие за связыванием рецептор-лиганд. Альтернативно, соединения или другие пробы могут быть тестированы на прямое блокирование связывания zsig37 с рецептором с использованием zsig37, меченого детектируемой меткой (например, ¹²⁵I, биотином, пероксидазой хрена, FITC и т.п.). В анализах этого типа способность тест-пробы ингибировать связывание меченого zsig37 с рецептором указывает на ингибирующую активность, которая может быть подтверждена при помощи вторичных анализов. Рецепторы, используемые в анализах связывания, могут быть клеточными рецепторами или выделенными иммобилизованными рецепторами.

В способах данного изобретения применимы также антитела, которые специфически связываются с эпитопами, пептидами или полипептидами полипептида zsig37. Способы получения и выделения поликлональных и моноклональных антител хорошо известны в данной области (см., например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, NY, 1989 и Hurrell, J.G.R., Ed., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1982).

Как должно быть очевидно специалисту с обычной квалификацией в данной области, поликлональные антитела могут быть получены инокуляцией различных теплокровных животных, таких как лошади, коровы, козы, овцы, собаки, куры, кролики, мыши, хомячки, морские свинки и крысы, а также трансгенные животные, такие как трансгенные овцы, коровы, козы или свиньи. Антитела могут также экспрессироваться в дрожжах и грибках в модифицированных формах, а также в клетках млекопитающих и насекомых. Полипептид zsig37 или его фрагмент служит в качестве антигена (иммуногена) для инокуляции животного или индукции иммунной реакции. Подходящие антигены могли бы включать в себя полипептид zsig37, кодируемый SEQ ID NО:2, от аминокислотного остатка 22 до аминокислотного остатка 281 SEQ ID NО:2, от аминокислотного остатка 26 до аминокислотного остатка 281 SEQ ID NО:2 или его фрагмент непрерывных аминокислотных остатков 9-281. Иммуногенность полипептида zsig37 может быть увеличена путем применения адъюванта, такого как квасцы (гидроксид алюминия) или полный или неполный адъювант Фрейнда. Полипептиды, применимые для иммунизации, включают в себя также слитые (гибридные) полипептиды, такие как гибриды zsig37 или его части с полипептидом иммуноглобулина или с аффинной меткой. Полипептидный иммуноген может быть полноразмерной молекулой или ее частью. Если эта часть полипептида является "гаптен-подобной", такая часть может быть предпочтительно соединена или связана с макромолекулярным носителем (таким как гемоцианин фиссуреллы (KLH), бычий сывороточный альбумин (БСА) или столбнячный токсоид) для иммунизации.

В применении здесь, термин "антитела" включает в себя поликлональные антитела, аффинно-очищенные поликлональные антитела, моноклональные антитела и антигенсвязывающие фрагменты, такие как протеолитические F(ab')₂- и Fab-фрагменты. Также включены генетически сконструированные интактные антитела или фрагменты, такие как химерные антитела, Fv-фрагменты, одноцепочечные антитела и т.п., а также синтетические антигенсвязывающие пептиды и полипептиды. Антитела не из человека могут быть "очеловечены" (гуманизированы) прививкой CDR не человека на каркасные и константные области иммуноглобулина человека или включением полных вариабельных доменов не человека (необязательно "окутыванием" их подобной человеческой поверхностью путем замены экспонированных остатков, результатом чего является "облицованное" антитело). В некоторых случаях "гуманизированные" антитела могут сохранять остатки иммуноглобулина не человека в каркасных доменах вариабельной области человека для усиления характеристик правильного связывания. Посредством "гуманизирования" антител может быть увеличен биологический полупериод существования в организме, и потенциал неблагоприятных иммунных реакций при введении людям уменьшается. Альтернативные способы генерирования или отбора антител, применимые здесь, включают в себя экспонирование in vitro лимфоцитов белку или пептиду zsig37 и отбор библиотек представления антител в фаговых или подобных векторах (например, посредством использования иммобилизованного или меченого белка или пептида zsig37).

Антитела определяются как специфически связывающие, если: 1) они проявляют пороговый уровень связывающей активности и/или 2) они не имеют значимой перекрестной реактивности с родственными полипептидными молекулами. Во-первых, описанные здесь антитела специфически связываются, если они связываются с полипептидом, пептидом или эпитопом zsig37 с аффинностью связывания (К_а) 10⁶ моль^-1 или большей, предпочтительно 10⁷ моль^-1 или большей, более предпочтительно 10⁸ моль^-1 или большей, и наиболее предпочтительно 10⁹ моль^-1 или большей. Аффинность связывания антитела может быть легко определена специалистом с обычной квалификацией в этой области, например, при помощи анализа Скетчарда (Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51: 660-672, 1949).

Во-вторых, антитела специфически связываются, если они не имеют значимой перекрестной реактивности с родственными полипептидами. Антитела не имеют значимой перекрестной реактивности с родственными полипептидными молекулами, например, если они обнаруживают полипептид zsig37, но не обнаруживают известные родственные полипептиды, с использованием стандартного Вестерн-блот-анализа (Ausubel et al., ibid.). Примеры известных родственных полипептидов включают в себя другие члены семейства белков, такие как Асrр30 (SEQ ID NO:1), полипептиды, показанные в сопоставлении фиг.1, и т.п. Они могут также включать, если желательно, ортологи и мутант полипептидов zsig37 человека. Кроме того, антитела могут быть "скринированы против" известных родственных полипептидов для выделения популяции, которая специфически связывается с полипептидами данного изобретения. Например, антитела, индуцированные к полипептидам zsig37 человека, адсорбируют с родственными полипептидами, прикрепленными к нерастворимому матриксу; антитела, специфические для полипептида zsig37 человека, будут протекать через этот матрикс при подходящих буферных условиях. Такой скрининг ("просеивание") позволяет выделить поликлональные и моноклональные антитела, не имеющие перекрестной реактивности с близкородственными полипептидами (Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; Current Protocols in Immunology, Cooligan, et al. (eds.), National Institutes of Health, John Wiley and Sons, Inc., 1995). Скрининг и выделение специфических антител хорошо известны в этой области (см. Fundamental Immunology, Paul (eds.), Raven Press, 1993; Getzoff et al., Adv. in Immunol. 43: 1-98, 1988; Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Coding, J.W. (eds.), Academic Press Ltd., 1996; Benjamin et al., Ann. Rev. Immunol. 2: 67-101, 1984). Характерные примеры таких анализов включают в себя: конкурентный иммуноэлектрофорез, радиоиммуноанализ, радиоиммунопреципитацию, твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), дот-блот или Вестерн-блот анализ, ингибиторный или конкурентный анализ и сэндвич-анализ.

Действие полипептидов, фрагментов, гибридных белков, агонистов или антагонистов zsig37 на гемостаз, в частности, на адгезию и активацию тромбоцитов, приводящие к агрегации тромбоцитов, может быть определено с использованием способов и анализов, обеспеченных здесь, и способов и анализов, известных в данной области. Коллаген является сильным индуктором агрегации тромбоцитов. Это поднимает вопрос о риске для пациентов, восстанавливающихся после сосудистых повреждений. Ингибиторы индуцированной коллагеном агрегации тромбоцитов могли бы быть использованы для таких целей. Было обнаружено, что zsig37 связывается с фибронектином и коллагенами типа I, II, III, V и VI. В частности, zsig37 связывается со специфическими доменами на коллагене VI зависимым от концентрации образом. Было обнаружено, что zsig37 ингибирует опосредованную коллагеном активацию тромбоцитов. Индуцированное zsig37 ингибирование было селективным в отношении активации коллагена, zsig37 не влиял на тромбоциты, активируемые известными активаторами тромбоцитов АДФ или тромбином. Эти результаты описаны более подробно ниже в разделе примеров. Авторы считают, что полипептиды, фрагменты, слитые белки, агонисты или антагонисты zsig37 будут применимы для блокирования связывания тромбоцитов с покрытыми коллагеном поверхностями и уменьшения ассоциированной индуцированной коллагеном агрегации тромбоцитов.

C1q является компонентом пути комплемента, и было обнаружено, что C1q стимулирует защитные механизмы, а также запускает генерирование токсичных разновидностей кислорода, которые могут вызывать повреждение ткани (Tenner, Behring Inst. Mitt. 93:241-53, 1993). Сайты связывания C1q найдены на тромбоцитах. Было обнаружено, что C1q, независимо от партнера иммунного связывания, ингибирует агрегацию тромбоцитов, но не адгезию или изменение формы тромбоцитов. Аминоконцевой район C1q имеет гомологию с коллагеном (Peerschke and Ghebrehiwet, J. Immunol. 145:2984-88, 1990). Zsig37 связывается с C1q комплемента зависимым от концентрации образом. Было обнаружено, что zsig37 является эффективным в ингибировании пути комплемента, включающего C1q, как с сенсибилизированными, так и с несенсибилизированными эритроцитами овцы.

Полипептиды, фрагменты, слитые белки, антитела, агонисты или антагонисты zsig37 данного изобретения могут быть использованы в способах стимуляции кровотока в сосудистой сети млекопитающего путем уменьшения числа тромбоцитов, которые прикрепляются и является активированными, и размера агрегатов тромбоцитов. Такие способы могут включать в себя в