Производные 5-имино-13-дезокси антрациклина и способ их получения (варианты), фармацевтическая композиция, способ лечения рака, аутоиммунных заболеваний или иммунодефицитных нарушений

Производные 5-имино-13-дезокси антрациклина и способ их получения (варианты), фармацевтическая композиция, способ лечения рака, аутоиммунных заболеваний или иммунодефицитных нарушений

Реферат

 

Изобретение относится к производным 5-имино-13-дезокси антрациклина формулы

где R₁, R₂ и R₃ являются Н, ОН или ОСН₃ группой и R₄ представляет собой следующие группы:

Предложена фармацевтическая композиция, обладающая противоопухолевой активностью, содержащая по крайней мере одно производное 5-имино-13-дезокси антрациклина. Предложен способ лечения рака, аутоиммунных заболеваний или иммунодефицитных нарушений, включающий введение эффективного количества по крайней мере одного производного 5-имино-13-дезокси антрациклина. Также предложены способы (варианты) получения производных 5-имино-13-дезокси антрациклина. Способ осуществляют путем восстановления антрациклин 13-тозилгидразона цианборгидридом натрия в безводном метаноле при рН около 7,0 или ниже в присутствии п-толуолсульфокислоты посредством осторожного кипячения раствора с обратным холодильником в атмосфере азота при температуре приблизительно 75°С. Затем реакционную смесь охлаждают, обрабатывают водой и хлороформом, сушат, осушитель отфильтровывают. Фильтрат разделяют на колонке с силикагелем, промываемой градиентом хлороформ/метанол, при этом продукт 13-дезокси антрациклина элюируют метанолом. Проводят дальнейшую очистку метанольного элюата с помощью препаративной ВЭЖХ, затем к раствору очищенного 13-дезокси антрациклина в смеси метиленхлорида и воды добавляют гидрокарбонат калия и ди-трет-бутил-дикарбонат. Выделяют полученный 3’-N-Вос-дезокси антрациклин, растворяют его в безводном метаноле, охлаждают полученный раствор и проводят аминирование 3’-N-Boc-13-дезокси антрациклина посредством насыщения раствора аммиаком при температуре около 0-4°C. Удаляют растворитель и аммиак, растворяют остаток в безводном метаноле, удаляют 3’-N-Вос-группу и с помощью препаративной ВЭЖХ выделяют целевой продукт, который при необходимости превращают в гидрохлорид 5-имино-13-дезокси антрациклина. Технический результат - производные 5-имино-13-дезокси антрациклина, обладающие меньшим побочным эффектом кардиотоксичности. 6 н. и 7 з.п.ф-лы, 4 табл., 12 ил.

Область техники, к которой относится изобретение.

Изобретение относится к производным 5-имино-13-дезокси антрациклина, медицинскому использованию 5-имино-13-дезокси антрациклина и способам получения производных 5-имино-13-дезокси антрациклина.

Уровень техники

Наиболее известными противораковыми лекарствами антрациклинового типа являются доксорубицин и даунорубицин, которые содержат 13-кетогруппу и 5-кетогруппу. Доксорубицин, описанный в патенте США 3590028, обладает широким диапазоном применения при лечении раковых заболеваний и используется при лечении лейкозов, лимфом и твердых опухолей. Даунорубицин, описанный в патенте США 3616242, используется при лечении острых лейкемий. Однако, применение этих лекарств ограничено серьезным побочным эффектом кардиотоксичности, так что общее количество лекарства, которое может быть предписано пациенту, не может превышать 550 мг/М² (Е.А.Lefrak с соавт., Cancer, 32:302, 1973). Даже при данной или близкой к рекомендованному количеству максимальной общей кумулятивной дозе (430-650 мг/М ²) у 60% пациентов наблюдается значительная и устойчивая сердечная дисфункция и у 14% развивается застойная сердечная недостаточность (A.Dresdale с соавт., Cancer, 52:51, 1983). Таким образом, в то время как эти лекарства являются полезными при торможении роста раковых опухолей, пациент может умереть от застойной сердечной недостаточности из-за тяжелого кардиотоксического побочного эффекта лекарств.

Некоторые исследователи полагают, что кардиотоксичность является результатом генерирования свободных радикалов хиноновой частью антрациклиновой молекулы (J.Dorowshow с соавт., J.Clin. Invest., 68:1053, 1981; D.V. Unverferth с соавт., Cancer Treat. Rev, 9:149, 1982; J.Goodman с соавт., Biochem. Biophys. Res. Commun., 77:797, 1977; J.L.Zweier, J.Biol. Chem., 259:6056, 1984). С другой стороны, существует четкое доказательство того, что генерирование свободных радикалов может являться не единственным механизмом кардиотоксичности, потому что в присутствии ловушек свободных радикалов лекарства все еще продуцируют сердечные повреждения (J.F.VanVleet c coaвт., Am.J.Pathol., 99:13, 1980; D.V.Unverferth с соавт., Am.J.Cardiol., 56:157, 1985; С.Myers с соавт., Seminars in Oncology, 10:53, 1983; R.H.M. Julicher c соавт., J. Pharm. Pharmacol., 38:277, 1986; E.A. Porta с соавт., Res. Comm. Chem. Pathol. Pharmacol., 41:125, 1983).

Было также найдено, что ингибирование процесса генерирования свободных радикалов не исключает кардиотоксичности этих антрациклинов (P.S. Mushlin с соавт., Fed. Proc., 45:809, 1986). Вместо этого, это исследование показало, что кардиотоксичность доксорубицина и даунорубицина, которая проявляется снижением сердечной сократительной способности, зависит также от метаболического восстановления 13-кето остатка до 13-гидрокси метаболита. В испытываемых системах, где доксорубицин не превращался в 13-дигидро соединение, кардиотоксические эфекты наблюдали только при очень высоких концентрациях (200-400 микрограмм/мл) (P.S. Mushlin с соавт., Fed. Proc., 44:1274, 1985; R.D. Olson с соавт., Fed. Proc., 45:809, 1986). В противоположность 13-дигидро метаболитам, доксорубицинол и даунорубицинол вызывают кардиотоксичность в тех же самых испытываемых системах при относительно низких концентрациях (1-2 микрограмма/мл, R.D. Olson с соавт., Proceed. Am. Assoc. Cancer Res., 26:227, 1985; R.D. Olson с соавт., Proceed. Am. Assoc. Cancer Res., 28:441, 1987).

Если доксорубицину позволяют оставаться в испытываемой системе даже в течение очень короткого периода времени, то протекают некоторые метаболические превращения и образуется 13-дигидро метаболит в достаточных количествах, так что начинает развиваться кардиотоксичность (L. Rossini с соавт., Arch. Toxicol. Suppl., 9:474, 1986; M. Del Tocca с соавт., Pharmacol. Res. Commun., 17:1073, 1985). Таким образом, были накоплены существенные доказательства того, что кардиотоксичность таких лекарств, как доксорубицин и даунорубицин является результатом сильных кардиотоксических эффектов, вызываемых их 13-дигидро метаболитами ((Р. Mushlin с соавт., Rational Drug Therapy, 22:1, 1988; S. Kuyper с соавт., FASEP Journal, 2:A1133, 1988; R. Boucek с соавт., J. Biol. Chem., 262:15851, 1987; и R. Olson с соавт., Proc. Natl. Acad. Sci., 85:3585, 1988).

В настоящем изобретении использован тот факт, что 13-дезокси формы доксорубицина и даунорубицина или других подобных антрациклинов не будут метаболически превращаться в кардиотоксичные 13-дигидро формы, и, таким образом, 5-кетогруппу модифицируют с образованием такого соединения, которое будет с меньшей вероятностью генерировать свободные радикалы, обеспечивая, таким образом, средство для введения соединений настоящего изобретения в некардиотоксических количествах без ограничения общей кумулятивной дозы.

Сущность изобретения

Целью настоящего изобретения являются новые производные 5-имино-13-дезоксиантрациклина, которые обладают меньшими побочными эффектами.

Соответственно, объектом настоящего изобретения являются способы получения производных 5-имино-13-дезокси антрациклина.

В соответствии с этой и другими целями и преимуществами настоящего изобретения в предпочтительных объектах предложен способ получения производных 5-имино-13-дезокси антрациклина.

Обычно, антрациклины формулы I

где R₁, R₂ и R₃ являются Н, ОН или ОСН₃ группой и R₄ представляет собой остаток сахара, отличный от морфолинил замещенного остатка сахара, легко превращаются в 13-тозилгидразоны согласно известным методам. Антрациклин 13-тозилгидразоны восстанавливают натрий цианборгидридом в кислых условиях до производных 13-дезокси антрациклина. Конечно, под морфолинилом подразумеваются замещенные морфолинильные остатки. Затем продукты подвергают очистке с помощью препаративной хроматографии без стадий экстракции. Очищенные производные 13-дезокси антрациклина превращают в N-Вос производные и затем обрабатывают NН₃ с получением N-Вос-5-имино-13-дезокси антрациклинов. Удаление N-Вос группы в кислых средах дает производные 5-имино-13-дезоксиантрациклина. Были найдены способы для того, чтобы получить выходы продукта от около 50% до около 60%.

Дополнительные предпочтительные объекты настоящего изобретения обеспечивают способ получения производных 5-имино-13-дезокси дезоксиантрациклина. Способ включает получение кислого раствора антрациклин 13-тозилгидразона с цианборгидридом. Раствор осторожно кипятят с обратным холодильником. Реакционную смесь охлаждают. К раствору добавляют небольшое количество воды с последующим добавлением галогенсодержащего углеродного растворителя. Смесь фильтруют. Фильтрат подвергают очистке с помощью препаративной хроматографии с выделением производных 13-дезокси антрациклина. Очищенные производные защищают с помощью трет-бутоксикарбонильной группы с образованием 3’-N-Вос производных, которые затем обрабатывают аммиаком с получением 3’-N-Вос-5-имино-13-дезоксиантрациклинов. Удаление в кислых условиях защиты с аминогруппы приводит к 5-имино-13-дезоксиантрациклинам, которые затем очищают с помощью хроматографии.

Другой предпочтительный объект настоящего изобретения обеспечивает способ получения производных 5-имино-13-дезокси антрациклина. Способ включает приготовление раствора путем растворения около 1 г доксорубицин 13-тозилгидразон гидрохлорида и около 2,4 г п-толуолсульфокислоты в приблизительно 50 мл безводного метанола. К раствору добавляют около 0,8 г натрий цианборгидрида.

Раствор нагревают до температуры от около 68°С до около 72°С. Раствор осторожно кипятят с обратным холодильником в течение около 1 ч в атмосфере азота.

Реакционную смесь концентрируют до приблизительно 20 мл. Реакционную смесь охлаждают в морозильнике до температуры от около 0°С до около 4°С.

В реакционную смесь добавляют около 0,5 мл воды, затем около 200 мл хлороформа. К реакционной смеси добавляют безводный сульфат натрия. Соли отфильтровывают.

Фильтрат пропускают через колонку с силикагелем. Затем колонку промывают смесью хлороформ/метанол до получения бесцветного элюата.

Фракцию, содержащую продукт, элюируют метанолом. Метанольный элюат выпаривают. Остаток, получающийся после выпаривания, растворяют в 30% буферном растворе ацетонитрила в формиате аммония.

Продукт выделяют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием колонки, содержащей фенил. Продукт отделяют от других примесей с использованием градиента ацетонитрила/формиата аммония. Фракцию, очищенную с помощью ВЭЖХ, затем разбавляют приблизительно тем же объемом воды, что и собранная фракция, и этот раствор пропускают через препаративную фенильную колонку для ВЭЖХ. Колонку элюируют водой для удаления соли. Продукт элюируют метанолом. Метанольный элюат концентрируют и тот же самый продукт осаждают добавлением этилового эфира. Твердый продукт выделяют фильтрованием с получением около 600 мг 13-дезокси доксорубицина.

Около 600 мг очищенного 13-дезокси доксорубицина растворяют в около 60 мл метиленхлорида и около 10 мл воды и обрабатывают около 180 мг гидрокарбоната калия и около 180 мг ди-трет-бутилдикарбоната при комнатной температуре в течение около 2 ч. Органический раствор отделяют, промывают водой и сушат безводным сульфатом натрия. Раствор выпаривают досуха. Остаток растворяют в около 100 мл безводного метанола. Раствор, насыщенный аммиаком, хранят при температуре от около 0°С до около 4°С в течение 48 ч. Растворитель и аммиак удаляют в вакууме с получением 3’-N-Вос-5-имино-13-дезокси доксорубицина. 3’-N-Вос-5-имино-13-дезокси доксорубицин, полученный выше, обрабатывают около 60 мл безводного метанола, содержащего около 0,1 М хлористого водорода, при комнатной температуре в течение около 2 ч для удаления 3’-N-Вос-группы. Полученный раствор концентрируют до около 5 мл.

Концентрированный раствор выделяют с помощью препаративной ВЭЖХ с фенильной колонкой. Продукт отделяют от других примесей с использованием градиента ацетонитрила/формиата аммония. Фракцию, очищенную с помощью ВЭЖХ, разбавляют приблизительно равным объемом воды, вводят в препаративную фенильную колонку для ВЭЖХ и промывают водой для удаления солей. Затем продукт элюируют метанолом. Метанольный элюат подкисляют около 0,5 мл хлористого водорода в этиловом эфире. Затем раствор концентрируют до около 5 мл. К осажденному продукту добавляют около 10 мл этилового эфира. Осадок фильтруют с получением от около 40% до около 60% 5-имино-13-дезокси доксорубицин гидрохлорида.

В настоящем изобретении предложены также соединения, имеющие следующую формулу

где R₁, R₂ и R₃ являются Н, ОН или ОМе группой и R₄ представляет собой остаток сахара, отличный от морфолинил замещенного остатка сахара. Должно быть понятно, что под морфолинилом подразумеваются замещенные морфолинильные остатки. Соединения, которые включают морфолинил замещенный остаток сахара, проявляют значительно повышенную токсичность.

Далее, настоящее изобретение представляет фармацевтическую композицию, содержащую по крайней мере одно производное 5-имино-13-дезокси антрациклина.

Кроме того, настоящее изобретение предлагает также способ лечения рака, включая лейкозы, лимфомы и твердые опухоли, причем данный способ включает стадию введения эффективного количества по крайней мере одного производного 5-имино-13-дезокси антрациклина.

Последующие цели и преимущества настоящего изобретения будут понятны и очевидны для специалиста в данной области из следующего описания. Подробное описание показывает и описывает только предпочтительные варианты изобретения с тем, чтобы проиллюстрировать наилучшую форму осуществления изобретения. Для тех специалистов, которые будут осуществлять изобретение, изобретение включает иные и различные варианты. Детали изобретения можно изменять в различных аспектах, без отклонения от сути изобретения. Таким образом, чертежи и описание должны рассматриваться в виде иллюстративных по своей природе, но не ограничивающих объем изобретения.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения.

Настоящее изобретение предлагает производные 5-имино-13-дезокси антрациклина, их использование и способы для получения производных 5-имино-13-дезокси антрациклина. В таблице 1 представлены примеры производных 5-имино-13-дезокси антрациклина, которые могут быть получены согласно настоящему изобретению. Как обсуждалось выше, соединения, такие как те, которые показаны в таблице 1, обладают, как известно, противоопухолевыми свойствами. Соединения обладают также меньшими побочными эффектами.

Способы настоящего изобретения могут быть осуществлены при температуре от около 0°С до около 75°С. Предпочтительно способы осуществляют при температуре от около 65°С до около 75°С. Более предпочтительно, способы осуществляют при температуре от около 68°С до около 72°С.

Способ согласно настоящему изобретению включает ряд общих условий. Например, реакцию восстановления предпочтительно проводят в кислых условиях. Другими словами, рН должно быть около 7,0 или ниже. Известные способы для получения приведенных выше соединений, которые используют щелочные условия в реакционной смеси, как было найдено, вызывают разложение реагирующих веществ и продуктов.

Кроме того, и кислород, и вода должны быть исключены при проведении реакции восстановления. Предпочтительно реакцию проводить в атмосфере азота или инертного газа с использованием безводных растворителей. Кроме того, реакция аминирования должна проводиться при температуре около 0-4°С. Более высокие температуры могут вызывать разложение реагирующих веществ и продуктов.

Кроме того, вода должна быть исключена из реакции аминирования. Предпочтительно реакцию проводят в безводных растворителях.

В соответствии с приведенным выше, настоящее изобретение обеспечивает способы получения соединений общей формулы, приведенной выше.

Следующая схема обеспечивает пример превращения молекулы в процессе протекания реакции.

Следующая блок-схема иллюстрирует пример варианта осуществления способа согласно настоящему изобретению для получения 5-имино-13-дезокси доксорубицина, который является 13-дезокси антрациклиновым производным.

Далее в таблице 1 представлены примеры антрациклиновых производных, синтез которых описан здесь.

В соединениях R₄ может быть модифицированным вариантом различных антрациклиновых аналогов. Кроме того, кольцо D может быть замещено галогеном или гидроксильной группой. Например, кольцо D может быть замещено фтором, иодом или любым другим галогеном.

Обычно способы согласно настоящему изобретению включают приготовление кислого раствора 5-имино-13-дезокси антрациклина. Раствор осторожно кипятят с обратным холодильником. Затем реакционную смесь можно охладить. Согласно одному из примеров, реакционную смесь охлаждают до температуры от около 0°С до около 4°С. Затем может быть добавлено небольшое количество воды для гидролиза продукта. К реакционной смеси может быть добавлен галогенсодержащий углеродный растворитель. Галогенсодержащий углеродный растворитель может быть охлажден. Например, галогенсодержащий углеродный растворитель может находиться при температуре от около 0°С до около 4°С. Примером галогенсодержащего углеродного растворителя, который может быть здесь использован, является хлороформ. Реакционную смесь можно затем отфильтровать после добавления безводного сульфата натрия. Фильтрование можно проводить при пониженной температуре. Например, фильтрование можно проводить при температуре от около 4°С до около 15°С.

Добавление воды, описанное выше, предпочтительно инициирует гидролиз. Любой избыток воды может быть удален путем добавления безводного сульфата натрия. Затем неорганические соли предпочтительно отфильтровывают из реакционной смеси. Фильтрат может быть подвергнут хроматографированию на колонке с силикагелем. Гидрофобные примеси могут быть выделены путем элюирования менее полярными растворителями.

13-дезокси антрациклиновые продукты могут быть затем элюированы и элюат далее очищен.

Очищенные производные 13-дезокси антрациклина могут быть растворены в смешанном растворителе метиленхлорида и воды, содержащем основание и ди-трет-бутил-дикарбонат. Раствор может быть перемешан при температуре около комнатной температуры в течение около 2 ч. Органический раствор может быть выделен и промыт водой. Затем растворитель может быть удален и остаток может быть растворен в спиртовом растворителе. Спиртовый раствор может быть насыщен аммиаком при температуре от около 0°С до около 4°С в течение около 24 ч. Растворитель может быть удален и затем сухой остаток может быть обработан подкисленным спиртовым растворителем при температуре около комнатной температуры в течение около 2 ч. Получаемый раствор может быть подвергнут концентрированию и подвергнут дальнейшей очистке, затем подкислен и подвергнут осаждению в эфир с получением гидрохлоридных солей 5-имино-13-дезокси антрациклина.

Предпочтительно, способы согласно настоящему изобретению включают приготовление раствора антрациклин 13-тозилгидразонов в безводном метаноле с п-толуолсульфокислотой и цианборгидридом натрия. Раствор осторожно кипятят с обратным холодильником в атмосфере азота и затем охлаждают. Добавляют воду с последующим добавлением хлороформа. Осажденные соли отфильтровывают и фильтрат выделяют на колонке с силикагелем. Гидрофобные примеси, образовавшиеся при разложении, элюируют смешанным раствором хлороформа и метанола. Продукты 13-дезокси антрациклинов элюируют метанолом. Метанольный элюат далее чистят с помощью препаративной ВЭЖХ.

Очищенные 13-дезокси антрациклины растворяют в смеси метиленхлорида и воды и обрабатывают гидрокарбонатом калия и ди-трет-бутил-дикарбонатом. Раствор перемешивают при температуре около комнатной температуры в течение около 2 ч. Органический слой отделяют, промывают водой и сушат над безводным сульфатом натрия. Затем растворитель удаляют в вакууме. Остаток растворяют в безводном метаноле, насыщенном аммиаком, и хранят при температуре от около 0°С до около 4°С в течение около 48 ч. Метанол и аммиак удаляют из продукта реакции, который обрабатывают разбавленным раствором кислоты в спирте при температуре около комнатной температуры в течение около 2 ч с получением соединения 5-имино-13-дезокси антрациклина. Указанное соединение в растворе концентрируют и затем очищают с помощью препаративной ВЭЖХ для удаления примесей, а затем солей. Продукт элюируют метанолом, подкисляют и осаждают с получением гидрохлоридной соли 5-имино-13-дезокси антрациклина.

Следующее ниже описание иллюстрирует пример осуществления способа согласно настоящему изобретению.

Пример 1

Получение гидрохлорида 5-имино-13-дезокси доксорубицина

Около 1 г доксорубицин 13-тозилгидразон гидрохлорида и около 2,4 г п-толуолсульфокислоты растворяют в около 50 мл безводного метанола. К этому раствору добавляют около 0,8 г цианборгидрида натрия. Полученный раствор нагревают до около 68-72°С и выдерживают при осторожном кипячении с обратным холодильником в течение около одного часа в атмосфере азота.

Затем реакционную смесь концентрируют до около 20 мл и охлаждают в морозильнике до около 0-4°С. Добавляют около 0,5 мл воды с последующим добавлением около 200 мл хлороформа. Добавляют безводный сульфат натрия и после встряхивания отфильтровывают соли.

Затем раствор пропускают через колонку с силикагелем (2,5×5 см). Далее колонку промывают смесью хлороформ/метанол (10/1) до получения бесцветного элюата. Объединенную фракцию, содержащую продукт, элюируют метанолом. Метанольный элюат выпаривают и остаток растворяют в 30% буферном растворе ацетонитрила в формиате аммония (pH 4,0, 0,5%) и выделяют с помощью препаративной ВЭЖХ. Используют фенильную колонку и отделение продукта от других примесей достигают использованием градиента ацетонитрила/формиата аммония (от 27 до 30% ацетонитрила в течение около 30 мин).

Фракцию, очищенную с помощью ВЭЖХ, разбавляют приблизительно равным объемом воды. Раствор пропускают через препаративную фенильную колонку для ВЭЖХ. Колонку элюируют водой для удаления солей. Затем продукт элюируют метанолом. Метанольный элюат концентрируют, и продукт осаждают добавлением этилового эфира, содержащего хлористый водород, и собирают фильтрованием с получением 600 мг 13-дезокси доксорубицин гидрохлорида. Выход составляет 80%.

Данные тонкослойной хроматографии (ТСХ):

Данные УФ спектров: _max=233, 252, 293, 485 нм.

Данные масс спектрометрии (MS):

530 (M⁺ H)

Данные ¹H ЯМР-спектров (метанол d₄ ): (смотри ниже)

1,30 (d, 3H, 6’-СН₃),

1,85 (m, 2H, 13-Н ₂),

2,05 (m, 2H, 10-Н₂),

2,60 (d, 1H, 12-Н),

3,05 (d, 1H, 12-Н),

3,55 (m, 1H, 5’-Н),

3,90 (m, 2H, 14-Н₂),

4,05 (s, 3H, O-СН ₃),

4,25 (m, 1H, 4’-H),

4,95 (m, 1H, 3’-Н),

5,40 (m, 1H, 1'-Н),

7,55 (d, 1Н, 3-Н),

7,85 (d, 1H, 2-H),

7,95 (d, H, 1-Н).

Около 600 мг очищенного 13-дезокси доксорубицина растворяют в около 60 мл метиленхлорида и около 10 мл воды и обрабатывают около 180 мг гидрокарбоната калия и около 180 мг ди-трет-бутилдикарбоната при температуре около комнатной температуры в течение около 2 ч. Органический раствор отделяют, промывают водой и сушат над безводным сульфатом натрия. Раствор выпаривают досуха и остаток растворяют в около 100 мл безводного метанола. Раствор, насыщенный аммиаком, выдерживают при температуре от около 0°С до около 4°С в течение 48 ч. Растворитель и аммиак удаляют в вакууме с получением 3’-N-Вос-5-имино-13-дезокси доксорубицина, который обрабатывают около 60 мл безводного метанола, содержащего около 0,1 М хлористого водорода, при температуре около комнатной температуры в течение около 2 ч для удаления 3’-N-Boc-группы. Полученный раствор концентрируют, а продукт выделяют с помощью препаративной ВЭЖХ. Фракцию, очищенную с помощью ВЭЖХ, разбавляют приблизительно равным объемом воды. Раствор вводят в препаративную фенильную колонку для ВЭЖХ и элюируют водой для удаления солей. Продукт элюируют метанолом. Метанольный элюат подкисляют хлористым водородом в этиловом эфире и раствор концентрируют.

Добавляют этиловый эфир и образовавшийся осадок фильтруют с получением около 360 мг (60%) 5-имино-13-дезокси доксорубицин гидрохлорида.

Данные тонкослойной хроматографии (ТСХ): R_f=0,35.

Данные УФ спектров: _max=222, 251, 310, 544, 585 нм.

Данные ¹H ЯМР-спектров: (МеОН-d₄).

1,30 (d, 3H, 6’-СН₃),

1,85 (m, 2H, 13-Н ₂),

2,10 (m, 2H, 10-H₂),

2,60 (d, 1Н, 12-Н),

2,75 (d, 1H, 12-Н),

2,95 (d, 1H, 12-Н),

3,50 (m, H, 5’-H),

3,90 (m, 2H, 14-Н2),

4,15 (s, 3Н, O-СН₃),

4,25 (m, 1Н, 4’-Н),

5,10 (m, 1H, 3’-Н),

5,60 (m, 1H, 1’-Н),

7,50 (d, 1H, 3-Н),

7,80 (d, 1H, 2-Н),

8,05 (d, 1H, 1-Н).

Данные масс-спектрометрии (MS): 529 (M+H)

Настоящее изобретение предлагает также соединения, имеющие следующую формулу:

Кроме того, настоящее изобретение предлагает фармацевтическую композицию, содержащую по крайней мере одно производное 5-имино-13-дезокси антрациклина.

Кроме того, настоящее изобретение еще предлагает способ лечения рака, лейкозов, лимфом и твердых опухолей. Способ включает стадию введения эффективного количества по крайней мере одного производного 5-имино-13-дезокси антрациклина. Дозировки будут аналогичны известным соединениям. Благодаря их аналогии с известными соединениями, специалист в этой области будет способен определить схемы лечения, приводящие к аналогичной эффективности, без излишнего экспериментирования. Однако, как обсуждалось выше, настоящее изобретение обеспечивает значительно уменьшенные побочные эффекты, включая пониженную кардиотоксичность.

Настоящее изобретение также предлагает способ лечения аутоиммунных заболеваний или иммунодефицитных нарушений, таких как СПИД (AIDS). Способ включает стадию введения эффективного количества по крайней мере одного производного 5-имино-13-дезокси антрациклина.

БИОЛОГИЧЕСКИЕ ИСПЫТАНИЯ

Сравнительная оценка кардиотоксичности доксорубицина, GPX-150 и GPX-100 на хронической модели кроликов

Описание эксперимента

Двадцать четыре белых новозеландских кролика одного возраста весом 3,0 кг разбивают случайным образом на 4 группы (N=6 кроликов/группе). В данных группах постоянно применяют, соответственно, доксорубицин, GPX-150, GPX-100 и простой растворитель-наполнитель (0,9% NaCl) в качестве контроля. Дозу лекарства или наполнителя вводят внутривенно (iv) в ушную вену два раза/неделю (по вторникам и пятницам). Каждую неделю (по понедельникам) отбирают пробы сыворотки и крови, а для оценки работы сердца еженедельно или через неделю (по четвергам) проводят М-эхокардиографическое обследование с получением данных фракционного сокращения левого желудочка (LVFS). Ежедневно оценивают потребление корма, а массу тела измеряют еженедельно (см. фиг.6). Контрольные кролики получают то же количество корма, что и кролики, на которых испытывают доксорубицин (парное кормление). После забивания животных получают образцы свободных стенок верхушки сердца и левого желудочка, которые сохраняют в 4%-ном глутаральдегиде (рН 7,4) для гистологического исследования и анализа посредством световой и трансмиссионной электронной микроскопии. Образцы ткани левого желудочка получают также для оценки кардиологических уровней антрациклинов и метаболитов. Кроликов забивают при появлении кардиотоксичности (LVFS <30% или снижение LVFS на 10% единиц, т.е. с 42% до 32% LVFS), проявлениях угрозы жизни или токсичности, вызывающей слабость (т.е. при сильной миелосупрессии или мукозите), или через 13 недель после начала исследования.

Схема дозирования

Оптимальные противоопухолевые дозы GPX-100 приблизительно в два раза превышают дозы доксорубицина, в то время как оптимальные противоопухолевые дозы GPX-150 превышают оптимальные дозы доксорубицина в 4-8 раз. Таким образом, были выбраны такие дозы GPX-100 и GPX-150, которые в два раза (для GPX-100) и в 7 раз (для GPX-150) превышают кумулятивную кардиотоксическую дозу доксорубицина (17,5 мг/кг). Доксорубицин вводят в дозе 1,25 мг/кг два раза/неделю в течение 7 недель (кумулятивная доза 17,5 мг/кг), GPX-100 вводят в дозе 2 мг/кг два раза/неделю в течение 10 недель (кумулятивная доза 40 мг/кг), а GPX-150 вводят в дозе 5 мг/кг два раза/неделю в течение 12 недель (кумулятивная доза 120 мг/кг).

Результаты

Наиболее чувствительным к действию доксорубицина типом клеток крови оказались красные кровяные клетки (RBC). На фиг.9 продемонстрировано, что контрольный уровень ВВС (верхний график - Еженедельные уровни RBC) оставался стабильным на протяжении всего эксперимента. В течение двух недель после начала эксперимента по введению аналогов антрациклина уровень RBC снижается во всех группах по сравнению с контролем (фиг.9). Действие GPX-150 на RBC является средним между воздействием доксорубицина и GPX-100, однако значительно отличается от контроля на протяжении эксперимента. Величина RBC в группе, получающей доксорубицин, возрастает через 7 недель и возвращается к значениям, соответствующим контролю, в связи с прекращением лечения доксорубицином на седьмой неделе. Воздействие GPX-100 на уровни RBC и гематокрит (НТС) продолжает снижаться на протяжении всего исследования (см. фиг.10). К концу эксперимента два кролика, получающие GPX-100, имеют гематокрит ниже 10%, а один из кроликов этой группы умирает во время эксперимента. Хотя причина смерти остается неизвестной, одним из факторов, способствующих его гибели, могла быть анемия.

Подсчет белых кровяных клеток (WBC) показал, что их уровень в меньшей степени подвержен действию антрациклинов, чем RBC (см. фиг.8, верхний график - Еженедельные уровни WBC). GPX-100 и GPX-150 приводят к такому снижению числа WBC, которое сходно с реакцией на действие доксорубицина. Значения антрациклиновых групп отличаются от контрольных значений между 3 и 7 неделями. Группа, получающая GPX-100, была единственной группой, леченной антрациклином, которая имела существенно более низкое число нейтрофилов, чем контрольная группа (см. фиг.11 - Еженедельные уровни нейтрофилов).

Подводя итог, можно заключить, что при используемых в данных экспериментах дозах GPX-100 вызывает равное или большее снижение числа кровяных клеток, чем доксорубицин. Хотя GPX-150 также подавляет число кровяных клеток по сравнению с контролем, его величина в целом занимает промежуточное значение между той же величиной в доксорубициновой и контрольной группах.

Дозы GPX-100 и доксорубицина приводят к ухудшению прибавки в весе по сравнению с контрольными кроликами. Действие доксорубицина, приводящее к замедлению прибавки веса по сравнению с контролем, нельзя объяснить различиями в потреблении корма, т.к. контрольная группа кроликов и доксорубициновая группа кроликов находятся в условиях парного кормления. GPX-100 вызывает аналогичные снижение потребления корма и замедление прибавки веса в сравнении с кроликами, леченными доксорубицином. Кролики, леченные GPX-150, показывают большее потребление корма по сравнению с контрольными кроликами (поскольку контрольная и доксорубициновая группы кроликов получают парное кормление), хотя они не имеют большую прибавку в весе, чем контрольные кролики, из чего можно предположить, что GPX-150 может также вмешиваться в механизмы, связанные с прибавкой веса у кроликов.

Доксорубицин вызывает сильную токсичность, которая не наблюдается в группах, леченных GPX-100 или GPX-150. У четырех из шести кроликов, леченных доксорубицином, был сильный мукозит, у двух сильно вздулись и кровоточили рот и губы. Эти эффекты (мукозит, вздутие или кровотечение из губ) не наблюдались ни у одного из кроликов, леченных GPX-100 или GPX-150. У трех из шести кроликов, леченных доксорубицином, наблюдалось истощение скелетных мышц, а у двух - отек (задних конечностей и стенки грудной клетки). Ни у одного из кроликов, леченных GPX-100 или GPX-150, не наблюдалось истощения мускулатуры, хотя у одного кролика, леченного GPX-100, при забивании был небольшой отек стенки грудной клетки. Все кролики, леченные доксорубицином, отличаются выпадением шерсти, т.е. шерсть выпадает либо умеренно, либо очень сильно. Только у двух из пяти кроликов, леченных GPX-100, выпала шерсть, а у четырех из шести кроликов, леченных GPX-150, выпадение шерсти было значительным.

GPX-100 вводят в максимально переносимой дозе, и один из шести кроликов, леченных GPX-100, погиб в конце эксперимента и не был обследован. К концу опыта кролики, леченные GPX-100, были вялыми, с бледными ушами, носом и глазами, а 4 из 5 кроликов были холодными на ощупь. Такие симптомы не наблюдаются у других кроликов, леченных GPX-150 или доксорубицином.

Доксорубицин также вызывает нарушение сердечной деятельности, что оценено с помощью М-эхокардиографии (LVFS). Еженедельные данные эхографии (см. фиг.7) показывают прогрессирующее снижение фракционных сокращений левого желудочка (LVFS) после шести недель лечения доксорубицином. После забивания животных все шесть кроликов, леченных доксорубицином, имеют сердечные дисфункции по данным эхокардиографии, а LVFS у них значительно отличается от значений в контрольной группе (Р<0,001). В противоположность этому, ни один из кроликов, леченных GPX-100 или GPX-150, в любой момент времени по ходу эксперимента не имеет каких-либо нарушений сердечной деятельности по данным эхокардиографии.

При забивании выделяют левое предсердие, разделяют его пополам и для оценки сердечной деятельности исследуют обе половинки в ванночке для тканей, где во время всего исследования остается постоянной предварительная нагрузка и нагрузка после опыта. Предсердие, полученное от кроликов, леченных доксорубицином, характеризуется ухудшением сердечной сократимости (dF/dt) по сравнению с контролем на протяжении целого диапазона сила-частота (1, 2 и 3 Гц). Для предсердия, полученного от кроликов, леченных GРХ-100 и GPX-150, не характерно ухудшение dF/dt по сравнению с контролем. Сердечную сократимость оценивают также по первому сокращению, следующему за 20-, 30- и 60-секундными интервалами отдыха (20-, 30- и 60-секундные PRP). Усиленная сократимость следует в результате увеличения запасов кальция в саркоплазматическом ретикулуме (SR), который о