Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, химерный ген, рекомбинантный вектор, штамм бактерий, токсин, инсектицидная композиция, способ получения токсина, способ получения устойчивого к насекомым растения и способ борьбы с насекомыми

Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, химерный ген, рекомбинантный вектор, штамм бактерий, токсин, инсектицидная композиция, способ получения токсина, способ получения устойчивого к насекомым растения и способ борьбы с насекомыми

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к биотехнологии сельскохозяйственных растений. Выделяют нуклеотидные последовательности из Xenorhabdus nematophilus, Xenorhabdus poinarii и Photorhabdus lumintecens, при экспрессии которых образуются новые инсектицидные токсины. Трансформируют клетку-хозяна химерным геном, включающим одну из выделенных нуклеотидных последовательностей. Получают композиции и препаративные формы, содержащие инсектицидные токсины, пригодные для борьбы с насекомыми-вредителями. Изобретение позволяет повысить устойчивость растений к насекомым-вредителям, и тем самым повысить сбор сельскохозяйственной продукции. 8 н. и 15 з.п. ф-лы.

Изобретение относится к новым токсинам из Xenorhabdus nematophilus, Xenorhabdus poinarii и Photorhabdus lumintecens, к нуклеотидным последовательностям, в результате экспрессии которых образуются токсины, и к способам получения и способам применения токсинов и соответствующих нуклеотидных последовательностей для борьбы с насекомыми.

Насекомые-вредители являются основной причиной потерь урожая. Только в США ежегодные потери урожая вследствие поражения различными видами насекомых оцениваются приблизительно в 7,7 миллиардов долларов. Помимо того, что они приводят к потерям урожая полевых культур, насекомые-вредители также осложняют работу овощеводов и плодоводов, производителей декоративных цветов, и они являются источником неприятностей для садоводов и домовладельцев.

В основном с насекомыми-вредителями борются путем интенсивного применения химических инсектицидов, обладающих активностью в отношении ингибирования роста насекомых, предотвращения питания или размножения насекомых, или приводящих к их гибели. Этот метод позволяет эффективно бороться с насекомыми, но такие химические средства борьбы иногда также поражают другие полезные виды насекомых. Другой проблемой, возникающей при широком применении химических пестицидов, является возникновение устойчивых штаммов насекомых. Эта проблема частично решается с помощью различных стратегий управления устойчивостью, однако существует все возрастающая потребность в создании альтернативных агентов для борьбы с вредителями. Также применяли с удовлетворительным результатом биологические агенты борьбы с насекомыми, такие как штаммы Bacillus thuringiensis, экспрессирующие инсектицидные токсины, такие как -эндотоксины, и они представляют собой альтернативу и дополнение к химическим инсектицидам. Недавно были выделены гены, кодирующие некоторые из этих -эндотоксинов, и было установлено, что их экспрессия в гетерологичных хозяевах представляет собой еще одно средство борьбы с важными с экономической точки зрения насекомыми-вредителями. В частности, экспрессия в трансгенных растениях инсектицидных токсинов, таких как -эндотоксины Bacillus thuringiensis, обеспечивает эффективную защиту от определенных насекомых-вредителей, а трансгенные растения, экспрессирующие такие токсины, имеются в продаже, что позволяет фермерам уменьшить количества применяемых химических агентов борьбы с насекомыми. Однако даже в этом случае сохраняется возможность развития устойчивости и может быть ограничена численность только небольшого количества определенных видов насекомых-вредителей. Таким образом, сохраняется давно осознанная, но не удовлетворенная потребность в создании новых и эффективных агентов для борьбы с насекомыми, которые приносили бы фермерам экономическую выгоду и были приемлемыми с точки зрения воздействия на окружающую среду.

Настоящее изобретение направлено на решение давней проблемы создания новых агентов для борьбы с насекомыми. Прежде всего необходимы агенты, которые направлены на борьбу с важными с экономической точки зрения насекомыми-вредителями и которые позволяют эффективно бороться с штаммами насекомых, устойчивыми к существующим агентам для борьбы с насекомыми. Кроме того, предпочтительными являются агенты, применение которых наносит минимальный ущерб окружающей среде.

При поиске новых агентов для борьбы с насекомыми особый интерес представляют определенные классы нематод из родов Heterorhabdus и Steinernema, что обусловлено их инсектицидными свойствами. Они убивают личинки насекомых и их потомство питается в мертвых личинках. В действительности инсектицидная активность обусловлена симбиотическими бактериями, живущими в нематодах. Такими симбиотическими бактериями являются Photorhabdus в случае Heterorhabdus и Xenorhabdus в случае Steinernema. Настоящее изобретение относится к нуклеотидным последовательностям, выделенным из Xenorhabdus nematophilus, к нуклеотидным последовательностям, практически аналогичным им, экспрессия которых приводит к продуцированию инсектицидных токсинов, которые являются высокотоксичными для важных с экономической точки зрения вредителей, прежде всего вредителей растений. Кроме того, изобретение относится к инсектицидному токсину, образующемуся в результате экспрессии нуклеотидной последовательности, и к композициям и препаративным формам, включающим инсектипидный токсин, которые обладают способностью ингибировать (подавлять) выживаемость насекомых-вредителей, их рост или репродуктивную способность, или ограничивать вызываемые насекомыми повреждения или потери урожая культурных растений. Кроме того, изобретение относится к способу получения токсина и к способам применения нуклеотидной последовательности, например, в микроорганизмах, для борьбы с насекомыми или в трансгенных растениях для придания устойчивости к насекомым, а также к способу применения токсина, и композиций и препаративных форм, включающих токсин, например, путем обработки токсином, композицией или препаративной формой зараженных насекомыми площадей, или для профилактической обработки восприимчивых к насекомым площадей или растений, которые являются потенциальными мишенями, с целью обеспечения защиты или создания устойчивости в отношении вредных насекомых.

Новый токсин обладает высокой инсектицидной активностью в отношении Plutella xylostella (моль капустная), важного с экономической точки зрения насекомого-вредителя. Токсин может применяться в многочисленных стратегиях борьбы с насекомыми, приводя к достижению максимальной эффективности в сочетании с минимальным воздействием на окружающую среду.

Одним из объектов настоящего изобретения является выделенная молекула нуклеиновой кислоты, включающая: (а) нуклеотидную последовательность, практически аналогичную нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, включающей: нуклеотиды 569-979 SEQ ID NО:1, нуклеотиды 1045-2334 SEQ ID NО:1, SEQ ID NО:4, SEQ ID NО:6, SEQ ID NО:8, SEQ ID NО:10, SEQ ID NО:12 и SEQ ID NО:14; или (б) нуклеотидную последовательность, изокодонной нуклеотидной последовательности, указанной в подпункте (а); причем экспрессия молекулы нуклеиновой кислоты приводит к образованию по крайней мере одного токсина, обладающего активностью в отношении насекомых. В одном из вариантов осуществления изобретения нуклеотидная последовательность является изокодонной нуклеотидной последовательности, практически аналогичной нуклеотидам 569-979 SEQ ID NО:1, нуклеотидам 1045-2334 SEQ ID NО:1, SEQ ID NО:4, SEQ ID NО:6, SEQ ID NО:8, SEQ ID NО:10, SEQ ID NО:12 или SEQ ID NО:14. Предпочтительно нуклеотидная последовательность является практически аналогичной нуклеотидам 569-979 SEQ ID NО:1, нуклеотидам 1045-2334 SEQ ID NО:1, SEQ ID NО:4, SEQ ID NО:6, SEQ ID NО:8, SEQ ID NО:10, SEQ ID NО:12 или SEQ ID NО:14. Более предпочтительно нуклеотидная последовательность кодирует аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NО:2, 3, 5, 7, 9, 11, 13 и 15. Наиболее предпочтительно нуклеотидная последовательность включает нуклеотиды 569-979 SEQ ID NО:1, нуклеотиды 1045-2334 SEQ ID NО:1, SEQ ID NО:4, SEQ ID NО:6, SEQ ID NО:8, SEQ ID NО:10, SEQ ID NО:12 или SEQ ID NО:14. В другом варианте осуществления нуклеотидная последовательность включает фрагмент ДНК длиной приблизительно 3,0 т.п.н., содержащийся в pCIB9369 (NRRL В-21883).

Согласно предпочтительному варианту осуществления токсины, образующиеся в результате экспрессии молекул нуклеиновой кислоты по изобретению, обладают активностью в отношении Plutella xylostella.

Другим объектом настоящего изобретения является выделенная молекула нуклеиновой кислоты, включающая состоящую из 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 (предпочтительно 20) пар оснований часть нуклеотидной последовательности, идентичную соответствующей состоящей из 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 (предпочтительно 20) последовательных пар оснований части нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, включающей: нуклеотиды 569-979 SEQ ID NО:1, нуклеотиды 1045-2334 SEQ ID NО:1, SEQ ID NО:4, SEQ ID NО:6, SEQ ID NО:8, SEQ ID NО:10, SEQ ID NО:12 и SEQ ID NО:14, причем экспрессия молекулы нуклеиновой кислоты приводит к образованию по крайней мере одного токсина, обладающего активностью в отношении насекомых.

Объектом настоящего изобретения также является химерный ген, содержащий гетерологичную промоторную последовательность, функционально связанную с молекулой нуклеиновой кислоты по изобретению. Кроме того, объектом настоящего изобретения является рекомбинантный вектор, содержащий такой химерный ген. Еще одним объектом настоящего изобретения является клетка-хозяин, содержащая такой химерный ген. Клетка-хозяин согласно данному объекту изобретения может представлять собой бактериальную клетку, клетку дрожжей или растительную клетку, предпочтительно растительную клетку. И еще одним объектом настоящего изобретения является растение, содержащее такую растительную клетку. Предпочтительно растение представляет собой кукурузу.

Другим объектом настоящего изобретения являются токсины, образующиеся в результате экспрессии молекул ДНК по настоящему изобретению. Согласно предпочтительному варианту осуществления токсины по настоящему изобретению обладают активностью в отношении Plutella xylostella.

В одном из вариантов осуществления токсины продуцируются штаммом Е.coli, имеющим регистрационный номер NRRL В-21883.

В другом варианте осуществления токсин по изобретению содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NО:2, 3, 5, 7, 9, 11, 13 и 15.

Также объектом изобретения является композиция, включающая эффективное в качестве инсектицида количество токсина по изобретению. Другим объектом настоящего изобретения является способ получения токсина, обладающего активностью в отношении насекомых, предусматривающий: (а) получение клетки-хозяина, содержащей химерный ген, который включает гетерологичную промоторную последовательность, функционально связанную с молекулой нуклеиновой кислоты по изобретению; и (б) экспрессию молекулы нуклеиновой кислоты в клетке, что приводит к образованию по крайней мере одного токсина, обладающего активностью в отношении насекомых.

Еще одним объектом настоящего изобретения является способ получения устойчивого к насекомым растения, предусматривающий интродукцию в растение молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению, причем молекула нуклеиновой кислоты способна экспрессироваться в растении в количестве, эффективном в отношении борьбы с насекомыми. Согласно предпочтительному варианту осуществления насекомым является Plutella xylostella.

И еще одним объектом настоящего изобретения является способ борьбы с насекомыми, предусматривающий введение насекомому эффективного количества токсина по настоящему изобретению. Согласно предпочтительному варианту осуществления насекомое представляет собой Plutella xylostella. Предпочтительно токсин поступает в организм насекомого оральным путем.

Еще одним объектом настоящего изобретения является способ осуществления мутации молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, согласно которому молекулу нуклеиновой кислоты расщепляют с получением популяции случайных двухцепочечных фрагментов нужной длины и осуществляют следующие стадии:

а) добавление к полученной популяции случайных двухцепочечных фрагментов одного или нескольких одно- или двухцепочечных олигонуклеотидов, причем каждый из олигонуклеотидов содержит область идентичности и область гетерологичности по отношению к двухцепочечному матричному полинуклеотиду;

б) денатурацию образовавшейся смеси случайных двухцепочечных фрагментов и олигонуклеотидов с получением одноцепочечных фрагментов;

в) инкубацию полученной популяции одноцепочечных фрагментов с полимеразой в условиях, в которых происходит ренатурация указанных одноцепочечных фрагментов в области идентичности с образованием пар ренатурированных фрагментов, причем указанные области идентичности являются достаточными для того, чтобы один член из пары примировал репликацию другого, приводя к образованию двухцепочечного полинуклеотида, содержащего мутацию; и

г) повторение второй и третьей стадий по крайней мере в течение еще двух циклов, причем образовавшаяся смесь на второй стадии дополнительного цикла содержит двухцепочечный полинуклеотид с мутацией, полученный на третьей стадии предыдущего цикла, в результате чего дальнейшие циклы приводят к образованию дополнительного количества двухцепочечного полинуклеотида, содержащего мутацию.

Другие объекты и преимущества настоящего изобретения будут очевидны для специалистов в данной области на основе изучения описания изобретения и примеров, не ограничивающих его объема.

Определения

Понятие "активность" применительно к токсинам по изобретению означает, что действие токсинов как агентов для борьбы с насекомыми, обладающих активностью при оральном введении, приводит к токсическому воздействию, или они обладают способностью прекращать или нарушать питание насекомого, что может вызвать или может не вызвать гибель насекомого. Если токсин по изобретению поступает в организм насекомого, то результатом, как правило, является смерть насекомого, или насекомое перестает питаться от источника, от которого токсин поступает к насекомому.

Понятие "соединенный с/функционально связанный с" относится к двум нуклеотидным последовательностям, которые связаны физически или функционально. Например, промоторная или регуляторная последовательность ДНК "связана с" последовательностью ДНК, кодирующей РНК или протеин, если две последовательности являются функционально связанными или расположены так, что регуляторная последовательность ДНК оказывает воздействие на уровень экспрессии кодирующей или структурной последовательности ДНК.

Понятие "химерный ген" обозначает рекомбинантную нуклеотидную последовательность, в которой промоторная или регуляторная нуклеотидная последовательность функционально связана или соединена с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует мРНК или которая экспрессируется в виде протеина, так что регуляторная нуклеотидная последовательность способна регулировать транскрипцию или экспрессию связанной с ней нуклеотидной последовательности. Регуляторная нуклеотидная последовательность химерного гена в норме не является функционально связанной с соединенной с ней нуклеотидной последовательностью, как это происходит в естественных условиях.

Понятие "кодирующая последовательность" обозначает нуклеотидную последовательность, которая транскрибируется с образованием РНК, такой как, например, мРНК, рРНК, тРНК, snPHK (М.я.РНК), смысловая РНК или антисмысловая РНК. Предпочтительно затем РНК транслируется в организме с образованием протеина.

Понятие "бороться" с насекомыми означает ингибировать в результате токсического действия способность насекомых-вредителей выживать, расти, питаться и/или размножаться, или ограничивать связанные с насекомыми повреждения или потери урожая культурных растений. При "борьбе" с насекомыми можно убивать или не убивать насекомых, хотя предпочтительно это понятие означает убивать насекомых.

Понятие "введение (поступление в организм)" токсина означает, что токсин вступает в контакт с насекомым, что приводит к токсическому действию и борьбе с насекомым. Токсин может поступать в организм многими известными путями, например, орально при поедании насекомым, или при контакте с насекомым в результате экспрессии токсина трансгенным растением, с использованием препаративной(ых) формы на основе протеина, композиции (й) для опрыскивания на основе протеина, основы приманки или любых других известных в данной области систем введения токсина.

Понятие "кассета экспрессии" в контексте настоящего описания обозначает нуклеотидную последовательность, способную обеспечивать экспрессию конкретной нуклеотидной последовательности в соответствующей клетке-хозяине, которая включает промотор, функционально связанный с представляющей интерес нуклеотидной последовательностью, которая функционально связана с сигналами терминации. Она в норме также включает последовательности, необходимые для правильной трансляции нуклеотидной последовательности. Кассета экспрессии, содержащая представляющую интерес нуклеотидную последовательность, может быть химерной, это означает, что по крайней мере один ее компонент является гетерологичным по отношению по крайней мере к одному из остальных компонентов. Кассета экспрессии также может представлять собой кассету, которая встречается в естественных условиях, но которая была получена в рекомбинантной форме, пригодной для гетерологичной экспрессии. Однако, как правило, кассета экспрессии является гетерологичной относительно хозяина, т.е. определенная последовательность ДНК кассеты экспрессии не встречается в естественных условиях в клетке-хозяине и должна быть интродуцирована в клетку-хозяина или в предка клетки-хозяина путем трансформации. Экспрессия нуклеотидной последовательности в кассете экспрессии может находиться под контролем конститутивного промотора или индуцибельного промотора, который инициирует транскрипцию только тогда, когда клетку-хозяина обрабатывают определенным внешним стимулом. В случае многоклеточного организма, такого как растение, промотор также может быть специфичным по отношению к определенной ткани или органу или стадии развития.

Понятие "ген" обозначает определенную область внутри генома, которая помимо указанной выше кодирующей последовательности содержит другие, прежде всего регуляторные нуклеотидные последовательности, ответственные за контроль экспрессии, т.е. за транскрипцию и трансляцию кодирующей области. Ген также может включать другие 5’- и 3’-нетранслируемые последовательности и терминирующие последовательности. Другими элементами, которые также могут присутствовать в гене, являются, например, интроны.

Понятие "представляющий интерес ген" обозначает любой ген, который при переносе в растение придает растению требуемые свойства, такие как устойчивость к антибиотикам, устойчивость к вирусам, устойчивость к насекомым, устойчивость к болезням или устойчивость к другим вредителям, устойчивость к гербицидам, улучшенная питательная ценность, улучшенные характеристики с точки зрения промышленной переработки или измененная способность к размножению. "Представляющий интерес ген" может представлять собой ген, который переносят в растения для производства важных с экономической точки зрения ферментов или метаболитов в растении.

"Гетерологичная" нуклеотидная последовательность обозначает нуклеотидную последовательность, которая в естественных условиях не связана с клеткой-хозяином, в которую ее вводят, включая не встречающиеся в естественных условиях множественные копии встречающихся в естественных условиях нуклеотидных последовательностей.

"Гомологичная" нуклеотидная последовательность обозначает нуклеотидную последовательность, которая в естественных условиях связана с клеткой-хозяином, в которую ее вводят.

Понятие "гомологичная рекомбинация" обозначает взаимный обмен фрагментами нуклеиновой кислоты между гомологичными молекулами нуклеиновых кислот.

Понятие "инсектицидный" относится к токсической биологической активности, с помощью которой оказывается возможным бороться с насекомыми, предпочтительно убивать их.

Нуклеотидная последовательность является "изокодонная" нуклеотидной последовательности, с которой производится сравнение, если нуклеотидная последовательность кодирует полипептид, имеющий такую же аминокислотную последовательность, что и полипептид, кодируемый нуклеотидной последовательностью, с которой производится сравнение.

"Выделенная" молекула нуклеиновой кислоты или "выделенный" фермент обозначают молекулу нуклеиновой кислоты или фермент, которые благодаря человеку существуют вне их естественного окружения и, следовательно, не являются природными продуктами. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты или фермент могут существовать в очищенной форме или могут существовать в неестественном окружении, таком как, например, рекомбинантная клетка-хозяин.

"Молекула нуклеиновой кислоты" или "нуклеотидная последовательность" обозначает линейный сегмент одно- или двухцепочечной ДНК или РНК, который может быть выделен из любого источника. В контексте настоящего изобретения молекула нуклеиновой кислоты предпочтительно обозначает сегмент ДНК. Понятие "ORF" обозначает открытую рамку считывания.

Понятие "растение" обозначает любое растение на любой стадии развития, в частности семенной материал растения.

Понятие "растительная клетка" обозначает структурную и физиологическую единицу растения, включающую протопласт и клеточную оболочку. Растительная клетка может находиться в форме выделенной отдельной клетки или культивируемой клетки, или представлять собой часть высокоорганизованной единицы, такой как, например, ткань растения, орган растения или целое растение.

Понятие "культура растительных клеток" обозначает культуры структурных или физиологических единиц растения, таких как, например, протопласты, клетки в культуре клеток, клетки в тканях растения, пыльца, пыльцевые трубки, семяпочки, зародышевые мешки, зиготы и зародыши на различных стадиях развития.

Понятие "растительный материал" относится к листьям, стеблям, корням, цветкам или частям цветков, плодам, пыльце, яйцеклеткам, зиготам, семенам, отводкам, культурам клеток или тканей, или любой другой части или продукту растения.

Понятие "орган растения" обозначает отдельную и структурно оформленную дифференцированную часть растения, такую как корень, стебель, лист, листовая почка или зародыш.

Понятие "ткань растения" в контексте настоящего описания обозначает группу растительных клеток, организованных в структурную или функциональную единицу. Подразумевается любая ткань растения in planta или в культуре. Это понятие включает целые растения, органы растений, семена растений, культуру ткани и любые группы растительных клеток, организованные в структурные и/или функциональные единицы, но не ограничено ими. Применение этого понятия в сочетании с конкретным типом растительной ткани, как она определена выше, или по каким-то другим признакам подпадает под это определение, или вне зависимости от типа ткани, не подразумевает, что при этом исключается любой другой тип растительной ткани.

Понятие "промотор" обозначает нетранслируемую последовательность ДНК, расположенную против хода транскрипции кодирующей области, которая содержит сайт связывания РНК-полимеразы II и инициирует транскрипцию ДНК. Промоторная область также может включать другие элементы, которые действуют в качестве регуляторов экспрессии гена.

Понятие "протопласт" обозначает выделенную растительную клетку без клеточной оболочки или только с частью клеточной оболочки.

Понятие "регуляторные элементы" относится к последовательностям, участвующим в контроле экспрессии нуклеотидной последовательности. Регуляторные элементы включают промотор, функционально связанный с представляющей интерес нуклеотидной последовательностью, и сигналы терминации. Они также обычно включают последовательности, необходимые для правильной трансляции нуклеотидной последовательности.

В наиболее широком смысле понятие "практически аналогичная", когда оно используется в настоящем описании применительно к нуклеотидной последовательности, обозначает нуклеотидную последовательность, соответствующую нуклеотидной последовательности, с которой производится сравнение, причем рассматриваемая последовательность кодирует полипептид, имеющий практически такую же структуру и функции, что и полипептид, кодируемый нуклеотидной последовательностью, с которой производится сравнение, например, полипептид, имеющий только такие замены аминокислот, которые не влияют на функцию полипептида. Предпочтительно практически аналогичная нуклеотидная последовательность кодирует полипептид, кодируемый нуклеотидной последовательностью, с которой производится сравнение. Желательно, чтобы процент идентичности практически аналогичной нуклеотидной последовательности и нуклеотидной последовательностью, с которой производится сравнение, составлял по меньшей мере 80%, более желательно по меньшей мере 85%, предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере 99%. Нуклеотидная последовательность, "практически аналогичная" нуклеотидной последовательности, с которой производится сравнение, как правило, гибридизуется с молекулой нуклеиновой кислоты, с которой проводится сравнение, в следующих условиях: 7%-ный додецилсульфат натрия (ДСН), 0,5М NaPО₄ , 1 мМ ЭДТК при 50°С; отмывка двукратным SSC (2xSSC), 0,1%-ным ДСН при 50°С, более желательно 7%-ный додецилсульфат натрия (ДСН), 0,5М NaPО₄, 1 мМ ЭДТК при 50°С; отмывка однократным SSC (1xSSC), 0,1%-ным ДСН при 50°С, еще более желательно 7%-ный додецилсульфат натрия (ДСН), 0,5 М NaPО₄, 1 мМ ЭДТК при 50°С; отмывка 0,5xSSC, 0,1%-ным ДСН при 50°С, предпочтительно 7%-ный додецилсульфат натрия (ДСН), 0,5М NaPО₄, 1 мМ ЭДТК при 50°С; отмывка 0,1xSSC, 0,1%-ным ДСН при 50°С, более предпочтительно 7%-ный додецилсульфат натрия (ДСН), 0,5 М NaPО₄, 1 мМ ЭДТК при 50°С; отмывка 0,1xSSC, 0,1%-ным ДСН при 65°С.

Понятие "синтетическая" относится к нуклеотидной последовательности, включающей структурные особенности, которые не присутствуют во встречающейся в естественных условиях последовательности. Например, синтетической последовательностью называют искусственную последовательность, характеризующуюся наиболее близким содержанием G+C и нормальным распределением кодонов, свойственным генам двудольных и/или однодольных растений.

Понятие "трансформация" обозначает интродукцию гетерологичной нуклеотидной последовательности в клетку-хозяина или в организм. В частности, "трансформация" обозначает стабильную интеграцию молекулы ДНК в геном представляющего интерес организма.

Понятие "трансформированный/трансгенный/рекомбинантный" относится к организму-хозяину, такому как бактерия или растение, в который введена гетерологичная молекула нуклеиновой кислоты. Молекула нуклеиновой кислоты может быть стабильно интегрирована в геном хозяина или молекула нуклеиновой кислоты также может присутствовать в виде внехромосомной молекулы. Такая внехромосомная молекула может обладать способностью к саморепликации. Следует понимать, что понятия трансформированные клетки, ткани или растения включают не только конечный продукт процесса трансформации, но также и его трансгенное потомство. Понятия "нетрансформированный", "нетрансгенный" или "нерекомбинантный" относятся к организму дикого типа, например бактерии или растению, который не содержит гетерологичную молекулу нуклеиновой кислоты.

Нуклеотиды обозначены по их основаниям с помощью следующих стандартных сокращений: аденин (А), цитозин (С), тимин (Т) и гуанин (G). Аналогично этому аминокислоты обозначены следующими стандартными сокращениями: аланин (Аlа; А), аргинин (Arg; R), аспарагин (Asn; N), аспарагиновая кислота (Asp; D), цистеин (Cys; С), глутамин (Gln; Q), глутаминовая кислота (Glu; Е), глицин (Gly; G), гистидин (His; Н), изолейцин (Ilе; I), лейцин (Leu; L), лизин (Lys; К), метионин (Met, М), фенилаланин (Phe, F); пролин (Pro, Р); серин (Ser, S); треонин (Thr, Т); триптофан (Trp; W), тирозин (Тyr; Y) и валин (Val; V). Кроме того, (Хаа; X) обозначает любую аминокислоту.

Краткое описание последовательностей, представленных в перечне последовательностей

SEQ ID NO:1 представляет собой последовательность фрагмента ДНК длиной приблизительно 3,0 т.п.н., содержащуюся в клоне Xenorhabdus nematophilus pCIB9369, которая включает перечисленные ниже ORF в указанных положениях нуклеотидов:

SEQ ID NO:2 представляет собой последовательность протеина с молекулярной массой ~15 кДа, кодируемую orf1 клона pCIB9369.

SEQ ID NO:3 представляет собой последовательность сходного с протеином эстеразы ювенильного гормона с молекулярной массой ~47,7 кДа, кодируемую orf2 клона рСIВ9369.

SEQ ID NO:4 представляет собой последовательность ДНК orf1 клона Xenorhabdus nematophilus pCIB9381.

SEQ ID NO:5 представляет собой последовательность протеина, кодируемого orf1 клона pCIB9381.

SEQ ID NO:6 представляет собой последовательность ДНК orf2 клона Xenorhabdus nematophilus pCIB9381.

SEQ ID NO:7 представляет собой последовательность сходного с протеином эстеразы ювенильного гормона, кодируемую orf2 клона pCIB9381.

SEQ ID NO:8 представляет собой последовательность ДНК orf1 клона Xenorhabdus poinarii pCIB9354.

SEQ ID NO:9 представляет собой последовательность протеина, кодируемого orf1 клона pGIB9354.

SEQ ID NО:10 представляет собой последовательность ДНК orf2 клона Xenorhabdus poinarii pCIB9354.

SEQ ID NO:11 представляет собой последовательность сходного с протеином эстеразы ювенильного гормона, кодируемую orf2 клона pCIB9354.

SEQ ID NО:12 представляет собой последовательность ДНК orf1 клона Photorhabdus luminescens pCIB9383-21.

SEQ ID NО:13 представляет собой последовательность протеина, кодируемого orf1 клона pCIB9383-21.

SEQ ID NО:14 представляет собой последовательность orf2 клона Photorhabdus luminescens pCIB9383-21.

SEQ ID NO:15 представляет собой последовательность сходного с протеином эстеразы ювенильного гормона, кодируемую orf2 клона pCIB9383-21.

Депонирование

Перечисленные ниже продукты были депонированы в Коллекции запатентованных культур службы сельскохозяйственных исследований (Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), 1815 Northern University Street, Пеория, Иллинойс 61604, США) в соответствии с Будапештским договором о международном признании депонированных микроорганизмов для целей процедуры патентования. Все ограничения по доступности депонированных продуктов должны быть необратимым образом устранены после выдачи патента.

Новые нуклеотидные последовательности, экспрессия которых приводит к образованию инсектицидных токсинов

Настоящее изобретение относится к нуклеотидным последовательностям, экспрессия которых приводит к образованию новых токсинов, и к получению и применению токсинов для борьбы с насекомыми-вредителями. Нуклеотидные последовательности выделяют из Xenorhabdus nematophilus, Xenorhabdus poinarii и Photorhabdus luminescens, являющихся представителями семейства Enterobacteriaceae. Бактерии рода Xenorhabdus представляют собой симбиотические бактерии нематод рода Steinernema. Бактерии рода Photorhabdus представляют собой симбиотические бактерии нематод рода Heterorhabditis. Нематоды колонизируют личинку насекомого, убивают ее и их потомство питается мертвой личинкой. В действительности инсектицидная активность обусловлена симбиотическими бактериями р.р. Xenorhabdus и Photorhabdus. Заявители были первыми, кому удалось выделить нуклеотидные последовательности по настоящему изобретению. Экспрессия нуклеотидных последовательностей по настоящему изобретению приводит к образованию токсинов, которые могут быть использованы для борьбы с чешуекрылыми насекомыми, такими как Plutella xylostella (моль капустная).

Нуклеотидная последовательность по настоящему изобретению, содержащаяся в клоне рСIВ9369, характеризуется наличием фрагмента ДНК длиной приблизительно 3,0 т.п.н., который депонирован согласно Будапештскому договору о депонировании для целей патентования под регистрационным номером NRRL В-21883. Последовательность этого фрагмента ДНК представлена в SEQ ID NО:1. В SEQ ID NО:1 присутствуют две открытые рамки считывания (ORF) (нуклеотиды 569-979 и нуклеотиды 1045-2334 соответственно), кодирующие протеины с предсказанными молекулярными массами 15 кДа и 47,7 кДа (последовательности SEQ ID NО:2 и SEQ ID NО:3 соответственно). Две ORF упорядочены в виде оперон-подобной структуры. Поиск известных последовательностей, обладающих гомологией с каждой отдельной ORF, с помощью программ UWGCG Blast и Gap не выявил последовательности, обладающей какой-либо значительной гомологией с ОRF№1, и выявил лишь 21%-ную идентичность между ОRF№2 и последовательностью протеина cry3А Bacillus thuringiensis, которая в данной области не считается значительной. Gap-анализ протеина, кодируемого ORF№2 рСIВ9369, проведенный с помощью программы Blast, выявил 30,6%-ную идентичность аминокислотной последовательности и 44,1%-ное сходство аминокислотной последовательности с последовательностью протеина, связанного с эстеразой ювенильного гормона (GenBank, регистрационный номер 2921553, Henikoff и др., PNAS USA 89: 10915-10919 (1992)). Нуклеотидную последовательность по настоящему изобретению также сравнивали с известными последовательностями Xenorhabdus nematophilus, кодирующими инсектицидный токсин tox4 (WO 95/00647), однако значительной гомологии обнаружено не было. Фрагмент ДНК длиной 3,0 т.п.н. также сравнивали с нуклеотидной последовательностью, опубликованной в WO 98/08388. С использованием программы UWGCG Gap сравнивали двадцать две последовательности по 60 нуклеотидов каждая (60-меры) из фрагмента ДНК длиной 38,2 т.п.н., описанного в WO 98/08388, с фрагментом ДНК длиной 3,0 т.п.н. по настоящему изобретению. Нуклеотидная последовательность первого 60-мера начинается с основания 1 фрагмента ДНК длиной 38,2 т.п.н., а остальные 60-меры расположены с интервалами приблизительно 2,0 т.п.н. Анализировали каждую из 22 последовательностей, а также комплементарные им последовательности. Наибольший процент идентичности, который был обнаружен между фрагментом ДНК длиной 3,0 т.п.н. по настоящему изобретению и одним из этих 60-меров, был равен 53%, что не считается значительной гомологией. Кроме того, методом Саузерн-блоттинга пять различных фрагментов ДНК последовательности длиной 38,2 т.п.н. тестировали в отношении гибридизации с фрагментом ДНК длиной 3,0 т.п.н. по настоящему изобретению. Ни для одной из них не был выявлен положительный сигнал гибридизации.

В нуклеотидных последовательностях каждого из клонов рСIВ9381, рСIВ9354 и рСIВ9383-21 также были обнаружены две открытые рамки считывания. Нуклеотидные последовательности двух ORF в каждом из рСIВ9381 и рСIВ9383-21 обладали высокой степенью гомологии с последовательностями ORF рСIВ9369. Следовательно, ОRF№2 протеинов рСIВ981 и рСIВ9383-21 обладают практически такой же гомологией с протеином, связанным с эстеразой ювенильного гормона, что и ОRF№2 протеина рСIВ9369. Нуклеотидная последовательность ОRF№1 рСIВ9354 на 77% идентична нуклеотидной последовательности ORF№1 рСIВ9369, нуклеотидная последовательность ОRF№2 рСIВ9354 на 79% идентична нуклеотидной последовательности ОRF№2 pCIB9369. ORF№2 протеина рСIВ9354 также обладает гомологией с протеином, связанным с эстеразой ювенильного гормона (29,2%-ная идентичность аминокислотных последовательностей, 42,2%-ное сходство аминокислотных последовательностей).

В предпочтительном варианте осуществления изобретение включает нуклеотидную последовательность, практически аналогичную нуклеотидам 569-979 SEQ ID NO:1, нуклеотидам 1045-2334 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12 и SEQ ID NO:14,