Культура клеток, содержащая клетки-предшественники остеогенеза, имплантат на ее основе и его использование для восстановления целостности кости

Культура клеток, содержащая клетки-предшественники остеогенеза, имплантат на ее основе и его использование для восстановления целостности кости

Реферат

 

Изобретение относится к медицине, а именно к клеточной терапии, и касается культуры клеток, содержащей клетки - предшественники остеогенеза, имплантата на ее основе и его использования для восстановления целостности кости. Изобретение включает культуру клеток, содержащую клетки-предшественники остеогенеза, представляющую собой клетки стромального и лимфо-макрофагального ряда костного мозга млекопитающих, культивированные в питательной среде с 10%-ной бычьей эмбриональной сывороткой в течение 4-7 дней с использованием в качестве индукторов остеогенеза - инсулина, дексаметазона и -глицерофосфата с 24-часовой обработкой 5-азацитидином в середине цикла и формирующие монослойную культуру с адгезивной способностью не менее 4×10 ⁴ клеток/см². Имплантат представляет собой клетки стромального и лимфо-макрофагального аутологичного костного мозга, культивированные в указанной питательной среде на трехмерных носителях, представляющих собой аллогенный костный матрикс и губку из биодеградируемого материала, предварительно обработанных поли-L-орнитином. Указанный имплантат применен для восстановления целостности кости у 7 пациентов. Преимущество изобретения заключается в разработке новых методов стимуляции костеобразования. 4 н. и 9 з.п. ф-лы, 2 ил.

Изобретение относится к медицине, а именно к клеточной терапии, и касается культуры клеток, содержащей клетки-предшественники остеогенеза, имплантата, обладающего остеогенной активностью, способа получения этого имплантата и способа восстановления целостности кости.

Известен способ стимуляции остеорепаративного процесса костной ткани путем привнесения клеток костного мозга в зону дефекта без фиксации [1]. Недостатком данного способа является невозможность создания необходимой концентрации клеток, участвующих в регенерации кости, из-за вымывания их из зоны дефекта.

Известен способ лечения дефектов костей [2], основанный на выделении из костного мозга и размножении в монослойных культурах in vitro стромальных фибробластов костного мозга, заполнение ими трехмерного каркаса с последующей трансплантацией в область дефекта. Данный способ значительно эффективнее предыдущих, но также имеет ряд существенных недостатков:

- чрезвычайно длительные сроки культивирования костномозговых клеток для получения остеогенных клеток (1,5-2,0 месяца);

- удаление при культивировании клеток лимфо-макрофагального ряда, которые индуцируют процессы регенерации поврежденной ткани [3];

- необходимость при культивировании использовать гетерологические фидерные клеточные культуры.

Дальнейшие успехи в разработке методов стимуляции костеобразования связаны с открытием сигналов, стимулирующих рост костной ткани, т.е. выращиванием мезенхимальных стволовых клеток в культуральной среде с направленной дифференциацией их в остеогенные, что позволило исключить использование гетерологичных фидерных культур.

Так, в способе восстановления целостности кости [4], который основан на получении стромальных остеобластоидных клеток путем предварительной процедуры выделения и подготовки их к трансплантации, включающем резецирование аутологичной кости посредством трипсинизации ее измельченных фрагментов, помещением выделенных клеток в культуральные условия с использованием в качестве индукторов остеогенеза аскорбата натрия, гидрокортизона и метилпреднизолона. Клетки пересевают на 12-14 день на микроносители (коллагеновый или гидроксиапатит) с последующим накоплением необходимого количества стромальных клеток, далее проводят инкубацию микроносителей с губчатым каркасом (костный матрикс или пористый гидроксиапатит), предварительно обработанным раствором поли-L-лизина или раствором фибронектина. Подготовленный таким образом комбинированный трансплантат помещают в зону дефекта кости. Общее время подготовки трансплантата к использованию с момента резецирования кости составляет не менее 1-1,5 месяцев, указанный трансплантат использовался в эксперименте только на кроликах.

Указанный метод имеет преимущества по сравнению с методом, описываемым в источнике [2], который состоит в том, что позволяет исходно увеличить количество остеобластоидных клеток за счет трипсинизации кусочков резецированной аутологичной кости; покрытие губчатого каркаса поли-L-лизином или фибронектином существенно повышает адгезивные свойства матрикса для всех видов клеток; использование микроносителей с выращенными на их поверхности клетками препятствует вымыванию клеток из губчатого каркаса и сокращает время инкубации для его заполнения перед трансплантацией.

Однако указанный способ имеет ряд недостатков:

- он не сопровождается хирургической реваскуляризацией трансплантата и может быть использован для устранения только небольших дефектов;

- метод предусматривает длительный период подготовки трансплантата к использованию;

- является травматичным, т.к. связан с предварительной операцией по резецированию собственной здоровой кости;

- отсутствие стандартизации пористости губчатого каркаса не позволяет точно характеризовать степень его заполнения клетками, привнесенными на микроносителях.

Известен метод образования кости in vitro [5], который заключается в заборе костного мозга у крыс, выделении из него стромальных клеток и культивировании их в течение 4 недель в среде с добавлением фетальной сыворотки теленка, антибиотиков и индукторов остеогенеза - аскорбиновой кислоты, -глицерофосфата и дексаметазона. Аскорбиновая кислота добавляется для синтеза коллагена и остеогенеза, а также она регулирует синтез АТФ-азы, щелочной фосфатазы и синтез белков в культурах остеобласто-подобных клеток. -глицерофосфат используется как источник органического фосфора, являясь важным компонентом минерализации. Дексаметазон, являясь синтетическим глюкокортикоидом, индуцирует пролиферацию и заключительную стадию дифференциации остеогенных клеток. Культуру остеогенных клеток человека приготавливают таким же образом, но с использованием аутологичной сыворотки. Через 4 недели наблюдается образование трехмерной минерализованной узелковой структуры, которая содержит минерализованные коллагеновые нити, косте-специфический протеин - остеопонтин, а также отмечено присутствие щелочной фосфатазы, характерной для остеобластных клеток. Культивирование клеток в таких же условиях на гидроксиапатитных блоках показало их минерализацию через 8 недель. Предлагается использование таких клеток в различных имплантатах, однако результаты имплантации клеток при их подкожном введении в области спины экспериментальным животным (крысам) в материалах этого документа не представлены.

Заявка РСТ [6] посвящена процессу направленной дифференциации стромальных клеток, выделенных из клеток костного мозга в тканеспецифические клетки, в том числе и в остеобласты. Такая дифференциация осуществляется посредством их инкубации в искусственной синтетической среде в присутствии трехмерных биосовместимых и биодеградируемых производных гиалуроновой кислоты с добавлением в среду 10%-ной фетальной сыворотки теленка с использованием в качестве индукторов остеогенеза аскорбиновой кислоты и дексаметазона. Однако перед использованием производных гиалуроновой кислоты они обязательно предварительно замачиваются в водном растворе гидроксиапатита. Устойчивую фенотипическую экспрессию остеоцитов наблюдают морфологически, а также окрашиванием клеток на присутствие щелочной фосфатазы. Однако о применении такого материала с выросшими остеоцитами не сообщается.

Наиболее близким источником информации является публикация, касающаяся регенерации и приращения кости с использованием мезенхимальных стволовых клеток [7], которые получают из костного мозга нормальных волонтеров (людей), выращивают их в синтетической среде с 10%-ной фетальной бычьей сывороткой, неадгезированные клетки удаляют, а адгезированные клетки выращивают со сменой среды дважды в неделю и получают первичную культуру на 13 день. Далее клетки серийно размножают, помещая их в чашки с плотностью 3×10 клеток/см ² с добавлением свежей среды и остеогенных факторов, таких как дексаметазон, аскорбиновая кислота и -глицерофосфат. В течение каждых 4 дней просчитывается число клеток, определяют щелочную фосфатазу, а также степень минерализации матрикса. Имплантат готовят посредством инкубации керамических блоков, представляющих собой пористый гидроксиапатит/-трикальций фосфатные блоки с размерами пор 200-450 мкм, которые имеют форму в виде цилиндров ~4 мм в диаметре и 8 мм в длину с центральным каналом диаметром=1 мм или в форме куба с размером сторон 3×3×3 мм. Цилиндры или кубы, предварительно покрытые человеческим фибронектином, инкубируют в клеточной суспензии, содержащей 7,5×10 ⁶ клеток/мл, в течение 2 часов при 37°С, после чего считают имплантаты готовыми к трансплантации. Приготовление имплантата составляло не менее 8 недель. Однако активность таких имплантатов, содержащих стромальные клетки человека, была проверена только на экспериментальных животных - крысах с обширным повреждением бедра. Полученные результаты указывают на то, что произведенные в культуре клеток человеческие стволовые мезенхимальные клетки, покрывающие соответствующие носители, способны устранить клинически значимый костный дефект на хорошо разработанной модели костной репарации. При этом остеогенная потенция человеческих мезенхимальных клеток была также продемонстрирована на подкожных имплантатах и в исследованиях in vitro. Авторы отмечают свой приоритет, т.к. ими впервые было продемонстрировано, что указанные клетки обладают способностью костеобразования в зонах, которые нуждаются в репарации.

Однако ни в одном из представленных источников не описано применение таких имплантированных клеток для устранения костного дефекта у человека.

В свете изложенного, задача предлагаемого изобретения заключается в разработке культуры мезенхимальных стволовых клеток человека, которые при имплантации in vivo способны к устранению дефекта костной ткани у человека, в том числе и значительного.

Указанная задача решается посредством введения в зону дефекта кости не только клеток стромального ряда, но и лимфо-макрофагального, культивируемых in vitro в присутствии индукторов дифференцировки. направляющих в сторону образования остеобластных и остеокластных клеток, а также секреции цитокинов, стимулирующих костеобразование.

Сущность изобретения

Сущность изобретения заключается в культуре клеток, содержащей клетки стромального и лимфо-макрофагального ряда костного мозга млекопитающих, культивированные в питательной среде с 10%-ной бычьей эмбриональной сывороткой в течение 4-7 дней с использованием в качестве индукторов остеогенеза - инсулина, дексаметазона и -глицерофосфата с 24-часовой обработкой 5-азацитидином в середине цикла и формирующие монослойную культуру с адгезивной способностью не менее 4×10 ⁴ клеток/см².

Еще одним аспектом изобретения является то, что в указанной культуре клетки стромального и лимфо-макрофагального ряда костного мозга представлены клетками человека.

Другим аспектом изобретения является то, что указанные клетки являются клетками крысы, морской свинки, кролика, кошки или собаки.

Аутологичный имплантат, который используется в ходе операции по устранению костного дефекта и являющийся имплантатом, обладающий остеогенной активностью, представляет собой трехмерный аллогенный костный матрикс или губку из биодеградируемого материала, полученные культивированием на них клеток стромального и лимфо-макрофагального ряда аутологичного костного мозга млекопитающих в питательной среде с 10%-ной бычьей эмбриональной сывороткой в течение 4-7 дней с использованием в качестве индукторов остеогенеза - инсулина, дексаметазона и -глицерофосфата с 24-часовой обработкой 5-азацитидином в середине цикла и формирующие монослойную культуру с адгезивной способностью не менее 4×10 ⁴ клеток/см² и 3×10⁵ клеток/см ³ губки из биодеградируемого материала.

Преимущественно в имплантате клетки млекопитающих являются клетками человека.

Еще одним вариантом изобретения является то, что имплантат, представляющий собой аллогенный костный матрикс, выполнен в виде соломки (хвороста) деминерализованной кости, имеющей среднее сечение 1,5-2,0 мм² и длину 50-100 мм.

Также дополнительно имплантат изготавливают в виде губки из биодеградируемого материала, представляющей собой пластинку толщиной 1,5±0,5 мм шириной 30±5 мм и длиной - в зависимости от длины окружности места стыка имплантата и собственной кости пациента.

Способ получения имплантата заключается в том, что его иготавливают путем адгезии клеток стромального и лимфо-макрофагального ряда аутологичного костного мозга на поверхности аллогенного костного матрикса или губки из биодеградируемого материала, предварительно покрытых поли-L-орнитином с последующим их высушиванием при комнатной температуре и набуханием перед использованием в изотоническом растворе с рН 7,2-7,4, при этом адгезия осуществляется в течение 2 дней посредством культивирования клеток в питательной среде с 10%-ной бычьей эмбриональной сывороткой с добавлением в среду в качестве индукторов остеогенеза - инсулина, дексаметазона и -глицерофосфата с последующей 24-часовой обработкой 5-азацитидином, сменой среды и дополнительным культивированием в течение 1-4 дней в среде без 5-азацитидина.

Еще одним аспектом способа получения имплантата является то, что культивирование клеток осуществляют в течение 4-7 дней при 37°С путем их инкубации в атмосфере воздуха с 5% СO₂ при 99%-ной влажности.

Преимущественно питательная среда содержит 0,4-0,8 мкМ инсулина, 10-15 нМ дексаметазона и 7,0 мМ -глицерофосфата.

Дополнительно питательная среда в качестве индуктора остеогенеза может содержать аскорбиновую кислоту в концентрации 0,2 мМ.

Преимущественно обработку 5-азацитидином в течение 24 часов осуществляют в концентрации 3,0-10,0 мкМ.

Способ восстановления целостности кости заключается в том, что костный дефект заполняют реваскуляризованным аутотрансплантатом, представляющим собой часть здоровой кости с надкостницей или отсепарированную надкостницу в случае использования имплантата, представляющего собой аллогенный костный матрикс, выполненный в виде соломки (хвороста), а дистальные и проксимальные области дополнительно окутывают и уплотняют имплантатом, выполненным в виде губки из биодеградируемого материала.

Примеры и осуществление изобретения

Пример 1. Получение клеточной культуры, содержащей клетки предшественники остеогенеза. Стандартный стерильный аллогенный костный матрикс, представляющий собой высушенную деминерализованную кость, полученную по способу [8], из Центрального научно-исследовательского института травматологии и ортопедии им. Н.Н. Приорова и стерильную губку из биодеградируемого материала (коллагена), полученного из Лужского завода “Белкозин”, пропитывают 0,01%-ным раствором поли-L-орнитина и высушивают в потоке стерильного воздуха до полного высыхания. За 24 часа до заселения костномозговыми клетками костный матрикс и губку стерильно замачивают в стандартном растворе Эрла или Хэнкса, содержащем 25 мМ HEPES, рН 7,2-7,4, при комнатной температуре.

Забор клеточного материала и его культивирование для получения клеток-предшественников остеогенеза. Под местным обезболиванием пунктируют подвздошную кость пациента и забирают костный мозг в объеме 40-150 мл в стерильную емкость с раствором Хэнкса, содержащим 200 мкг/мл гентамицин, 10,0 мкг/мл инсулин, 0,25 мкМ дексометазон, 250 ед/мл гепарина, за 4-7 дней до основного оперативного вмешательства. Суспензию клеток центрифугируют 5 мин при 1500 об/мин, осадок клеток ресуспендируют в лизирующем растворе (114 мМ NH₄ Cl; 7,5 мМ КНСО₃; 100 мкМ EDTA) в соотношении 1:4 от исходного объема аспирата, в течение 5-10 мин и центрифугируют 3 мин при 1500 об/мин при комнатной температуре. Гемолизированный супернатант полностью удаляют отсасыванием. Добиваются полного лизиса эритроцитов, для чего процедуру лизирования проводят дважды или трижды с последующим отмыванием клеток центрифугированием. Клеточный осадок, свободный от эритроидных и тромбоцитарных форм, ресуспендируют в ростовой среде Искова, содержащей 0.58 г/л глютамина, 50 мкг/л гентамицина, 10% бычьей эмбриональной сыворотки, 0,4 мкМ инсулина, 10 нМ дексаметазона и 7,0 мМ -глицерофосфата, в концентрации 3×10⁵ кл/мл. Клетки костного мозга засевают в чашки Петри, которые могут быть покрыты коллагеном, поли-L-орнитином или поли-L-лизином, фибронектином или различными смесями матриксных белков, способствующих выживанию и адгезии стволовых мезенхимальных клеток из костного мозга. Адгезированные клетки в культуре пролиферируют и начинают дифференцироваться в остеогенном направлении, при наличии в культуре стволовых гематопоэтических клеток лимфо-макрофагального ряда. На третьи сутки инкубации в культуральную среду вносят 5-азацитидин в концентрации 3,0 мкМ. Через 24 часа среду заменяют на свежую, но без 5-азацитидина и инкубацию продолжают в течение 1-4 дней. Среда инкубации может дополнительно содержать 0,2 мМ аскорбиновой кислоты. Количество жизнеспособных клеток составляет не менее 95% и в концентрации не менее 4×10⁴ кл/см².

Полученная культура клеток может использоваться или может пересеваться с использованием стандартной процедуры трипсинизации, и/или клеточная суспензия может быть криоконсервирована при -196°С в жидком азоте в среде для криоконсервирования, содержащей бычью эмбриональную сыворотку не менее 50% и 10%-ный диметилсульфоксид.

Аналогичным способом может быть получена культура клеток из экспериментальных животных: крыс, кошек, кроликов, собак и морских свинок.

Пример 2. Получение имплантата, обладающего остеогенной активностью.

Забор клеточного материала производят, как описано в примере 1.

Клеточный осадок, свободный от эритроидных и тромбоцитарных форм, ресуспендируют в ростовой среде Искова, содержащей 0,58 г/л глютамина, 50 мкг/л гентамицина, 10% бычьей эмбриональной сыворотки, 0,8 мкМ инсулина, 15 нМ дексаметазона и 7,0 мМ -глицерофосфата, в концентрации 3×10⁵ кл/мл. Клетки костного мозга засевают в чашки Петри, в которых находятся подготовленные к адгезии клеток аллогенный костный матрикс и губка из биодеградируемого материала. На третьи сутки инкубации в питательную среду вносят 5-азацитидин до конечной концентрации 10 мкМ. Через 24 ч среду отбирают и заменяют на свежую того же состава, но без 5-азацитидина, и инкубируют 1-4 суток в асептических условиях, постоянно микроскопически контролируя жизнеспособность клеток. После чего считают трансплантат годным к применению. Перед использованием трансплантат промывают в растворе Хэнкса, содержащем 50 мкг/мл гентамицина, 0,8 мкМ инсулина, 15 нМ дексаметазона и 7,0 мМ -глицерофосфата, для освобождения от бычьей эмбриональной сыворотки, и в этом свежем растворе при температуре 4-6°С доставляют в операционную и хранят 36 часов до применения. Полученный имплантат содержит не менее 4×10⁴ клеток/см² и 3×10 ⁵ клеток/см³ губки.

Аллогенный костный матрикс перед использованием нарезают в виде соломки (хвороста), имеющей среднее сечение 1,5-2,0 мм² и длину 50-100 мм. Губку из биодеградируемого материала нарезают в виде пластин толщиной 1,5±0,5 мм, шириной 30±5 мм и длиной в зависимости от длины окружности места стыка имплантата и собственной кости пациента, см. фиг.1.

Пример 3. Использование полученного имплантата для восстановления целостности кости. При использовании костно-надкостничного реваскуляризированного аутотрансплантата, после включения в кровоток и определения проходимости анастомозов, а также адекватности кровообращения зоны костного соединения дистального и проксимального концов окутывают и уплотняют губкой из биодеградируемого материала с адгезированными на ней аутоклетками В случае заполнения зоны дефекта аллогенным костным матриксом в виде соломки (хвороста) с адгезированными на нем аутоклетками применяют отсепарированный надкостничный реваскуляризированный аутотрансплантат с использованием окутывания и уплотнения губкой, как и в случае с использованием костно-надкостничного реваскуляризированного аутотрансплантата.

Пластика дефекта выполнена после резекции бедренной кости по поводу саркомы, проведена на 6 больных, седьмой больной имел рецидив ложного сустава бедренной кости после многократных реконструктивных операций. Костная пластика дефектов костно-надкостничным реваскуляризированным аутотрансплантатом и надкостничным реваскуляризированным аутотрансплантатом была выполнена в размере от 5 до 20 см. Для контроля использовали клинические и рентгенологические методы исследования на различных сроках наблюдения. Во всех случаях отмечено полное приживление трансплантата. При этом формирование костной мозоли и восстановление функции конечности наступало в среднем на 1,5-3 месяца раньше, чем после пластики дефектов васкуляризованным аутотрансплантатом иалоберцовой кости или надкостницы без дополнительного применения имплантата с плюрипотентными стволовыми клетками аутологичного костного мозга, см фиг.2 Срок наблюдения 3 года без побочных эффектов.

Таким образом, представленное изобретение показало высокую эффективность имплантатов, заселенных аутологичными клетками стромального и лимфо-макрофагального ряда, при пластике обширных костных дефектов.

При этом применение указанной культуры клеток не может быть ограничено приведенными примерами, поскольку одним из преимуществ ее получения довольно короткий период культивирования 4-7 дней, что позволяет значительно сократить сроки подготовки имплантата к применению и возможность ее использования в пластике любых костных дефектов.

Источники информации

1. Амирбекян В.Х. и др. Тезисы докл. Научной конференции, Ереван, 1978 г.

2. SU 1400616 A1, 07.06.1988

3. Долгушин И.И., Эберт Л.Я., Лифшиц Р.И. Иммунология травмы. Свердловск. Медицина, 1989, с.188.

4. RU 2167662 С1, 27.05.2001.

5. US 6152964, 28.11.2000.

6. WO 97/18842 А1, 29.05.1997.

7. WO 97/40137 А1, 30.10.1997.

8. RU 2147800 C1, 17.02.1999.

Формула изобретения

1. Культура клеток, содержащая клетки-предшественники остеогенеза, характеризующаяся тем, что она представляет собой клетки стромального и лимфо-макрофагального ряда костного мозга млекопитающих, культивированные в питательной среде с 10% бычьей эмбриональной сывороткой в течение 4-7 дней с использованием в качестве индукторов остеогенеза - инсулина, дексаметазона и -глицерофосфата с 24-часовой обработкой 5-азацитидином в середине цикла и формирующие монослойную культуру с адгезивной способностью не менее 4·10 ⁴ клеток/см².

2. Культура клеток по п.1, отличающаяся тем, что клетки стромального и лимфо-макрофагального ряда костного мозга являются клетками человека.

3. Культура клеток по п.1, отличающаяся тем, что клетки стромального и лимфо-макрофагального ряда костного мозга являются клетками крысы, морской свинки, кролика, кошки или собаки.

4. Имплантат, обладающий остеогенной активностью, характеризующийся тем, что он представляет собой трехмерный аллогенный костный матрикс или губку из биодеградируемого материала, полученные культивированием на них клеток стромального и лимфо-макрофагального ряда аутологичного костного мозга млекопитающих в питательной среде с 10% бычьей эмбриональной сывороткой в течение 4-7 дней с использованием в качестве индукторов остеогенеза - инсулина, дексаметазона и -глицерофосфата с 24-часовой обработкой 5-азацитидином в середине цикла и формирующие монослойную культуру с адгезивной способностью не менее 4·10 ⁴ клеток/см² и 3·10⁵ клеток/см ³ губки из биодеградируемого материала.

5. Имплантат по п.4, отличающаяся тем, что млекопитающим является человек.

6. Имплантат по п.4, отличающаяся тем, что аллогенный костный матрикс представляет собой соломку (хворост) из деминерализованной кости, имеющей среднее сечение 1,5-2,0 мм² и длину 50-100 мм.

7. Имплантат по п.4, отличающаяся тем, что губка из биодеградируемого материала представляет собой пластинку толщиной (1,5±0,5) мм, шириной (30±5) мм и длиной в зависимости от длины окружности места стыка имплантата и собственной кости пациента.

8. Способ получения имплантата по пп.4-7, отличающийся тем, что его изготавливают путем адгезии клеток стромального и лимфо-макрофагального ряда аутологичного костного мозга на поверхности аллогенного костного матрикса или губки из биодеградируемого материала, предварительно покрытых поли-L-орнитином с последующим их высушиванием при комнатной температуре и набуханием перед использованием в изотоническом растворе с рН 7,2-7,4, при этом адгезия осуществляется в течение 2 дней посредством культивирования клеток в питательной среде с 10% бычьей эмбриональной сывороткой с добавлением в среду в качестве индукторов остеогенеза - инсулина, дексаметазона и -глицерофосфата с последующей 24-часовой обработкой 5-азацитидином, сменой среды и дополнительным культивированием в течение 1-4 дней в среде без 5-азацитидина.

9. Способ по п.8, отличающийся тем, что культивирование клеток осуществляют в течение 4-7 дней инкубации при 37°С в атмосфере воздуха с 5% СО₂ при 99% влажности.

10. Способ по любому из п.8 или 9, отличающийся тем, что питательная среда содержит 0,4-0,8 мкМ инсулина, 10-15 нМ дексаметазона и 7,0 мМ -глицерофосфата.

11. Способ по любому из пп.8-10, отличающийся тем, что в качестве индукторов остеогенеза дополнительно используют аскорбиновую кислоту в концентрации 0,2 мМ.

12. Способ по любому из пп.8-11, отличающийся тем, что обработку 5-азацитидином осуществляют в концентрации 3-10 мкМ.

13. Способ восстановления целостности кости, включающий заполнение дефекта реваскуляризованным аутотрансплантатом, отличающийся тем, что в качестве аутотрансплантата используют часть здоровой кости с надкостницей или отсепарированную надкостницу с имплантатом по пп.4-7, выполненного в форме аллогенного костного матрикса в виде соломки (хвороста), а дистальный и проксимальный области дефекта дополнительно окутывают и уплотняют губкой из биодеградируемого материала.

РИСУНКИ