Производные 3,4-бис(фуразан-3-ил)фуроксана, генерирующие оксид азота, активирующие растворимую форму гуанилатциклазы, ингибирующие агрегацию тромбоцитов и обладающие спазмолитическим, сосудорасширяющим, гипотензивным действием, и фармацевтическая композиция на их основе

Патент 2240321

Авторы

Классы МПК

Реферат

Изобретение относится к химии и медицине, в частности касается новых химических соединений - производных 3,4-бис(фуразан-3-ил)фуроксана общей формулы I:

где R = R¹ = ОН, NH₂, N₃ , низший алкоксил или группа общей формулы NR²R³, где R² = R³ = Н или R² и R³ вместе с атомом азота образуют пиперидиновый цикл, или R = NH₂ и R¹ - (низший алканоил)аминогруппа, при условии, что R и R¹ не обозначают метокси, обладающих фармакологической активностью. Описаны также фармацевтические композиции на их основе. Заявляемые соединения способны генерировать в организме оксид азота, ингибировать агрегацию тромбоцитов и активировать растворимую форму гуанилатциклазы (рГЦ), что обуславливает их спазмолитическое, сосудорасширяющее и гипотензивное действие, которое позволяет применять их для профилактики и купирования приступов стенокардии, нарушений, вызванных спазмом гладких мышц, и лечения острого инфаркта миокарда или острого тромбоза. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 4 табл., 12 ил.

где R=R¹=ОН, NH₂, N₃, низший алкоксил или группа общей формулы NR²R³, где R²=R³=H или R² и R³ вместе с атомом азота образуют пиперидиновый цикл, или R=NH₂ и R¹ - (низший алканоил)аминогруппа, обладающих фармакологической активностью, и фармацевтических композиций на их основе. Заявляемые соединения, в частности, способны генерировать в организме оксид азота, активировать растворимую форму гуанилатциклазы (рГЦ), что обуславливает их спазмолитическое, сосудорасширяющее, гипотензивное действие и способность ингибировать агрегацию тромбоцитов.

Новые соединения можно применять для лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы, включая лечение артериальной гипертонии, застойной сердечной недостаточности при инфаркте миокарда, гипертонических кризов, рефракторной сердечной недостаточности, инфаркта миокарда и острого инфаркта миокарда, стенокардии, ишемической болезни сердца, хронической сердечной недостаточности, легочной гипертонии, острой недостаточности левого желудочка, легочного сердца, отека легких, периферической артериальной эмболии, токсикогенных спазмов сосудов, для профилактики и купирования приступов стенокардии и спазмов коронарных артерий при использовании сердечных катетеров, ангиографии и ангиопластике, а также других заболеваний сердечно-сосудистой системы, при которых положительный лечебный эффект достигается при снижении кровяного давления, нормализации сократительной способности миокарда и/или ингибировании активности тромбоцитов, за исключением тех заболеваний, при которых противопоказано снижение кровяного давления и/или ингибирование агрегации тромбоцитов.

Предпочтительно применение новых соединений для профилактики и купирования приступов стенокардии, нарушений, вызванных спазмом гладких мышц, и лечения острого инфаркта миокарда или острого тромбоза.

Известно, что оксид азота (NO), синтезируемый эндотелиальными клетками и другими типами клеток и тканей, играет одну из ключевых ролей в поддержании нормального тонуса гладких мышц сосудов, влияющего на системное давление крови. Кроме того, NO оказывает спазмолитическое действие на мышцы желудочно-кишечного тракта, желчных путей, мочеточников, матки, бронхов и других органов, а также ингибирует процессы агрегации и адгезии тромбоцитов и нейтрофилов (М.Д.Машковский "Лекарственные средства", т.1, "Торсинг", Харьков, 1997 г., стр.385). Механизм молекулярного действия эндогенного оксида азота, синтезируемого ферментом NO-синтазой из аминокислоты L-аргинина в эндотелии кровеносных сосудов и в других типах клеток, органов и тканей, включает его диффузию через плазматические мембраны в полость кровеносного сосуда и его гладкомышечные клетки, где происходит связывание NO с гемовой группой рГЦ. Гуанилатциклаза /КФ 4.6.1.2; гуанозин-5’-трифосфат-пирофосфатлиаза (циклизующая)/ является ферментом, катализирующим биосинтез гуанозин-3’,5’-циклофосфата (цГМФ) - вторичного мессенджера, выполняющего роль универсального регулятора внутриклеточного метаболизма (F.Murad "Regulation of cytosolic guanylyl cyclase by nitric oxide: The NO-cGMP signal transduction system" Adv. Pharmacol. 1994, v.26, p.19-33). ГЦ существует в двух формах - мембранной и растворимой. В настоящее время установлено, что в результате взаимодействия оксида азота NO с атомом железа гема, входящего в состав фермента, и образования комплекса нитрозилгем, возникают конформационные изменения активного центра фермента, которые приводят к активации рГЦ и повышению синтеза цГМФ. В результате взаимодействия оксида азота с тромбоцитами и лейкоцитами снижается их агрегация и адгезия на стенках кровеносных сосудов. Следовательно, NO ингибирует процессы тромбообразования и оказывает противовоспалительное действие. С другой стороны, возрастание внутриклеточной концентрации цГМФ в гладкомышечных клетках сосуда вызывает активацию цГМФ-зависимых протеинкиназ, что индуцирует дефосфорилирование молекулы миозина, а следовательно, и расслабление гладких мышц коронарных и других кровеносных сосудов (сосудов мозга, брюшной полости, периферических сосудов), снижение сосудистого тонуса и сопротивления, то есть приводит к расширению просвета кровеносного сосуда. Таким образом, NO снижает давление крови, повышает кровоток и способствует восстановлению сосудистой функции (фиг.1). Аналогичным образом NO действует и на другие, несосудистые гладкие мышцы, включая мышцы желудочно-кишечного тракта, желчных путей, мочеточников, матки, бронхов и других органов.

Нарушения, связанные с нормальным протеканием вышеуказанных реакций, лежат в основе патофизиологических процессов, характерных для развития различных заболеваний сердечно-сосудистой системы (гипертонии, инфаркта миокарда, сердечной недостаточности, острых тромбозов) и других органов. При таких заболеваниях наблюдаются множественные нарушения синтеза эндогенного NO, его рецепции рГЦ, а также регуляции уровня циклических нуклеотидов.

К настоящему времени доказано образование оксида азота в результате энзиматической биотрансформации тринитроглицерина и других нитратов, которые используются для лечения сердечно-сосудистых заболеваний в качестве антиишемических и антиангинальных препаратов (М.Д.Машковский "Лекарственные средства", т.1, "Торсинг", Харьков, 1997 г., стр.385-392). Однако их существенным недостатком является возникновение толерантности и других побочных эффектов при длительном применении. В связи с этим проводится поиск новых соединений, способных генерировать NO в живом организме не-энзиматическим путем (например, спонтанно или тиол-зависимо), что рассматривается как актуальный и перспективный подход для создания новых, более эффективных антигипертензивных и антиагрегантных фармпрепаратов, обладающих антиангинальной и антиишемической активностью.

Известны различные гетероциклические N-оксиды, биохимические и фармакологические свойства некоторых представителей данного класса соединений изучены и описаны в литературе.

Так, известен фармпрепарат "миноксидил" -6-(1-пиперидинил)пирролидин-2,4,-диамин-3-оксид формулы II:

являющийся периферическим вазодилятатором (М.Д.Машковский "Лекарственные средства", т.1, Харьков, "Торсинг", 1997 г., стр. 429). Данное соединение не обладает способностью генерировать NO, проявляет слабые антиагрегантные свойства, а его влияние на рГЦ не изучено.

Известны производные 2-(2,2-диметил-1,3-бензоксазин-4-ил)пиридин-1-оксида общей формулы III:

где R и R¹=F, Cl, Br и др., обладающие вазорелаксантным и гипотензивным действием (S.Yamamoto, S. Hashiguchi et al. "Synthesis and biological activity of novel 1,3-benzoxazine derivatives as K⁺ channel openers" Chem. Pharm. Bull. 1996, v.44, p.734-745). Данные соединения не обладают способностью генерировать NO, их влияние на рГЦ и антиагрегантные свойства не изучены.

Известны замещенные хиназолин-3-оксиды общей формулы IV:

где R-R⁵=H, низший алкил и др., проявляющие кардиотоническое и бронходилятирующее действие (патент США №4745118, 1988 г.). Данные соединения не обладают способностью генерировать NO, их влияние на рГЦ, а также гипотензивные и антиагрегантные свойства не изучены.

Известны различные 3,4-дизамещенные фуроксаны (1,2,5-оксадиазол-2-оксиды) общей формулы V:

где R¹ и R² - (замещенный) низший алкил, (замещенный) фенил, фенилсульфонильная, алкоксикарбонильная, (замещенная) карбоксамидная группа и др., обладающие выраженным вазорелаксантным действием на кольцах легочной артерии морской свинки, предварительно сокращенных под действием КСl, и проявляющие гипотензивную активность (выложенная заявка ФРГ №4401150, 1995 г., Европейские патенты №0054872, 1984 г.; №0054873, 1984 г.; №0575782, 1993 г., №0683159, 1995 г., №0687256, 1994 г.). NO-генерирующие свойства данных соединений, их влияние на активность рГЦ и способность ингибировать агрегацию тромбоцитов не исследовались.

Известны дизамещенные трифуроксаны общей формулы VI:

где R¹ и R² - (замещенный) метил, фенил и др., являющиеся донорами оксида азота и вызывающие вазодилятацию на изолированных кольцах аорты крысы, предварительно сокращенных под действием норадреналина (A.M.Gasco, C.Cena et al. "Synthesis and structural characterization of the trimeric furoxan (=furazan-2-oxide) system, a new potent vasodilating moiety" Helv. Chim. Acta 1996, v.79, p.1803-1817). Влияние данных соединений на активность рГЦ и их способность ингибировать агрегацию тромбоцитов (за исключением одного производного) не исследовались. Кроме того, подавляющее большинство дизамещенных трифуроксанов обладали крайне низкой растворимостью в условиях эксперимента, что затрудняло их изучение.

Наиболее близким к заявляемым соединениям по настоящему изобретению является 4,4’-дифeнил-3,3’:4’,3’’-тpифypaзaн-2,2’,2’’-тpиoкcид вышеуказанной формулы VI, где R¹=R²=С₆Н₅, который является донором NO, вызывает вазодилятацию на изолированных кольцах торакальной аорты кролика, предварительно сокращенных под действием норадреналина (IС₅₀=0,12 мкМ), и ингибирует агрегацию тромбоцитов (IC₅₀=1,8 мкМ) (A.M.Gasco, A.Di Stilo et al. "Synthesis and structure of a trimer of the furoxan system with high vasodilator and platelet antiaggregatory activity" Liebigs Ann. Chem. 1993, p.441-444).

Влияние данного трифуроксана на активность рГЦ и его гипотензивная активность не изучены. Кроме того, он обладает недостаточно эффективным вазорелаксантным и анти-агрегантным действием, а также низкой растворимостью в условиях эксперимента.

Поиск новых соединений, генерирующих оксид азота в организме и активирующих растворимую форму гуанилатциклазы (рГЦ), обладающих хорошей растворимостью и отсутствием толерантности, и создание лекарственных препаратов на их основе является актуальной задачей.

В основу изобретения положена задача расширения арсенала химических соединений, действующих на живой организм, в частности генерирующих оксид азота в организме и активирующих растворимую форму гуанилатциклазы (рГЦ) и обладающих улучшенной растворимостью и отсутствием толерантности, и создания лекарственных препаратов на их основе.

Задача решена тем, что согласно изобретению созданы новые химические соединения - производные 3,4-бис(фуразан-3-ил)фуроксана общей формулы I,

Изобретением является также то, что заявляемые соединения общей формулы I способны генерировать оксид азота, активировать растворимую форму гуанилатциклазы, ингибировать агрегацию тромбоцитов.

Изобретением также является фармацевтическая композиция, обладающая спазмолитическим, сосудорасширяющим, гипотензивным действием и ингибирующая агрегацию тромбоцитов, содержит в качестве активного компонента соединения общей формулы I в количестве, достаточном для достижения фармакологического эффекта, и фармацевтически приемлемый наполнитель.

Способность заявляемых соединений генерировать в организме оксид азота, а также активировать рГЦ обуславливает их спазмолитическое, сосудорасширяющее, гипотензивное действие и ингибирование агрегации тромбоцитов. Кроме того, предлагаемые соединения и фармацевтические композиции на их основе обладают улучшенной растворимостью и отсутствием толерантности.

Краткое описание чертежей, иллюстрирующих изобретение:

Фиг.1 - механизм действия оксида азота.

Фиг.2 - кумулятивные кривые релаксации торакальной аорты крысы, предварительно сокращенной под действием фенилэфрина, в присутствии соединений 1, 4 и тринитроглицерина.

Фиг.3 - влияние болюсного внутривенного введения соединения 1 в дозах 0,1; 0,5 и 1 мкМ/кг на артериальное давление (АД) у бодрствующих крыс.

Фиг.4 - влияние болюсного внутривенного введения соединения 1 в дозах 0,1; 0,5 и 1 мкМ/кг на частоту сердечных сокращений (ЧСС) у бодрствующих крыс.

Фиг.5 - влияние болюсного внутривенного введения соединения 2 в дозах 0,1; 0,5 и 1 мкМ/кг на АД у бодрствующих крыс.

Фиг.6 - влияние болюсного внутривенного введения соединения 2 в дозах 0,1; 0,5 и 1 мкМ/кг на ЧСС у бодрствующих крыс.

Фиг.7 - влияние болюсного внутривенного введения соединения 3 в дозах 0,1; 0,5 и 1 мкМ/кг на АД у бодрствующих крыс.

Фиг.8 - влияние болюсного внутривенного введения соединения 3 в дозах 0,1; 0,5 и 1 мкМ/кг на ЧСС у бодрствующих крыс.

Фиг.9 - влияние болюсного внутривенного введения соединения 5 в дозах 0,1; 0,5 и 1 мкМ/кг на АД у бодрствующих крыс.

Фиг.10 - влияние болюсного внутривенного введения соединения 5 в дозах 0,1; 0,5 и 1 мкМ/кг на ЧСС у бодрствующих крыс

Фиг.11 - влияние чередования периодов инфузии соединения 1 (0,5 мкМ/мин/кг) и восстановления на АД у бодрствующих крыс стрелками и сплошными линиями показано начало инфузии, а стрелками и пунктирными линиями показано прекращение инфузии.

Фиг.12 - влияние чередования периодов инфузии соединения 1 (0,5 мкМ/мин/кг) и восстановления на ЧСС у бодрствующих крыс стрелками и сплошными линиями показано начало инфузии, а стрелками и пунктирными линиями показано прекращение инфузии

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Согласно изобретению, предложены производные 3,4-бис(фуразан-3-ил)фуроксана вышеуказанной общей формулы I, обладающие фармакологической активностью. Физико-химические и фармакологические свойства производных предложенного соединения общей формулы I согласно изобретению показаны на примерах следующих соединений:

-3,4-бис(4-аминофуразан-3-ил)фуроксан (соединение 1),

-3,4-бис(4-(пиперидин-1-ил)фуразанил]фуроксан (соединение 2),

-3,4-бис(4-гидроксифуразан-3-ил)фуроксан (соединение 3),

-3,4-бис(4-азидофуразан-3-ил)фуроксан (соединение 4),

-3-[4-(ацетиламино)фуразан-3-ил)-4-(4-аминофуразан-3-ил)фуроксан (соединение 5).

Вышеуказанные соединения согласно изобретению были синтезированы способом, основанным на известной реакции - направленной димеризации нитрилоксидов, генерируемых на основе хлороксимов, и заключающимся в обработке соответствующего 3-замещенного 4-[хлор(гидроксимино)метил]фуразана основанием (например, раствором NaHCO₃ низкой концентрации) в среде органического растворителя (эфир, этилацетат) (Л.И.Хмельницкий, С.С.Новиков, Т.И.Годовикова "Химия фуроксанов. Строение и синтез" М., Наука, 1996, с.165-178). Амидные производные были получены в результате селективного моно-N-ацилирования соединения 1 ангидридом соответствующей низшей карбоновой кислоты (например, уксусной) в присутствии соответствующей соли щелочного металла (например, ацетата натрия) в условиях, аналогичных известному способу ацилирования аминопроизводных 1,2,5-оксадиазола (Л.И.Хмельницкий, С.С.Новиков, Т.И.Годовикова "Химия фуроксанов. Реакции и применение" М., Наука, 1996, с.310).

Приводим конкретные примеры получения вышеперечисленных производных соединения общей формулы I.

Пример 1. Получение соединения 1 (3,4-Бис(4-аминофуразан-3-ил)фуроксана)

К суспензии 1,62 г (0,01 моль) 4-амино-3-[(гидроксимино)хлорметил]фуразана в 35 мл этилацетата при интенсивном перемешивании и температуре 0-3° С добавляли небольшими порциями 18 мл 5%-ного раствора NaHCO₃. После этого реакционную смесь перемешивали в течение 2 ч при температуре не выше 5° С, осадок отфильтровали, промыли 10 мл холодной воды и высушили на воздухе. Получили 1,72 г (69%) соединения 1. Т.пл.167-168° С. ИК спектр (в тонком слое на подложке из NaCl), , см^-1: 3480, 3440, 3340, 1650,1620, 1470, 1420, 1360, 1220,1150, 1130, 1020, 1000, 970, 930, 880, 840. ЯМР ¹ Н спектр, , м.д.: 6,64 (2H, NH₂) и 6,59 (2H, NH₂). ЯМР ¹³С спектр, , м.д.: 156,12; 155,20; 146,66; 136,29; 133,41; 104,33. Масс спектр, m/z: 252 (М+), 222 (M-NO), 192 (M-NO-NO). Найдено, %: С 28,41; H 1,75; N 44,56, MM 258. C₆H₄N ₈O₄. Вычислено, %: С 28,57; H 1,59; N 44,44, MM 252.

Пример 2. Получение соединения 2 (3,4-Бис[4-(пиперидин-1-ил)фуразан-3-ил]фуроксан)

Синтез соединения 2 проводили из 2,3 г (0,01 моль) 3-[(гидроксимино)хлорметил]-4-(пиперидин-1-ил)фуразана при условиях аналогичных примеру 1. Выход конечного продукта -2,93 г (76%). Т. пл. 89-90° С. ИК спектр, , см^-1: 2980, 2960, 1640, 1610, 1570, 1475, 1405, 1305, 1290, 1235, 1190, 1250, 1230, 1020, 980. ЯМР ¹ Н спектр, , м.д.: 3,15 (4Н, СН₂); 1,5 (4Н, СН₂). ЯМР ¹³С спектр, , м.д.: 159,59; 159,55; 144,84; 137,79; 134,26; 105,06; 50,04; 49,57; 24,43; 24,36; 22,92. Найдено, %: С 49,89; Н 5,49; N 29,20. MM 386. C₁₆H₂₀N₈O₄ . Вычислено, %: С 45,90; Н 5,20; N 33,50. MM 418.

Пример 3. Получение соединения 3 (3,4-Бис(4-гидроксифуразан-3-ил)фуроксан)

В условиях примера 1 из 1,62 г (0,01 моль) 4-гидрокси-3-[(гидроксимино)хлорметил]фуразана после перекристаллизации из хлороформа получили 0,35 г (14%) соединения 3. Т.пл. 88-90° С. ИК спектр, , см^-1: 3632, 3566, 1651, 1622, 1563, 1545, 474, 1429, 1391, 1351, 1220, 1151, 1075, 1000, 976, 930, 899, 891, 828. ЯМР ¹Н спектр (хлороформ -d6), , м.д.: 4,76 (2Н, ОН). ЯМР ¹³С спектр, , м.д.: (см. табл.1). Найдено, %: С 28,81; Н 0,95; N 33,42. MM 252. С₆Н₂N₆О₆. Вычислено, %: С 28,35; Н 0,79; N 33,07. MM 254.

Пример 4. Получение соединения 4 (3,4-Бис(4-азидофуразан-3-ил)фуроксан)

В условиях примера 1 из 1,88 г (0,01 моль) 4-азидо-3-[(гидроксимино)хлорметил]фуразана получили 0,72 г (24%) соединения 4. Т.пл. 51° С (из этанола). ИК спектр, , см^-1: 2144, 1632, 1456, 1328, 1232, 992, 960. ЯМР ¹С спектр, , м.д.: (см. табл.1). Найдено, %: С 23,80; Н 0,50; N 55,37. C ₆N₁₂O₄. Вычислено, %: С 23,68; Н 0,00; N 55,26.

Пример 5. Получение соединения 5 (4-(4-Аминофуразан-3-ил)-3-[4-(ацетиламино)фуразан-3-ил]фуроксан)

Смесь 0,6 г (0,0024 моль) соединения 1 и 0,5 г свежеприготовленного ацетата натрия в 10 мл уксусного ангидрида выдержали при перемешивании и комнатной температуре до полного исчезновения исходного соединения 1 (контроль по ТСХ; время реакции около 2 ч), после чего упарили на воздухе досуха. Полученный твердый остаток промыли водой, 5%-ным раствором соды и снова водой. После кристаллизации из метанола с углем получили 0,4 г (57%) соединения 6. Т.пл. 134-135° С. ИК спектр, , см^-1: 3976, 3752, 3744, 3688, 3648 (NH), 3336 (NH ₂), 1744 (С=O), 1692, 1664, 1632, 1580, 1552, 1480, 1450, 1424, 1384, 1276, 1256, 1168, 1148, 1024, 992, 973. ЯМР ¹Н спектр, , м.д.: 10,5 уш. (1H, NH); 6,1 уш. (2Н, NH₂); 2,07с (3Н, СН₃) (растворитель -ацетон-d6). Найдено, %: С 32,05; Н 1,96; N 38,78. MM 300. C₈H₆N₈O₅. Вычислено, %: С 32,65; Н 2,04; N 38,10. MM 294.

Характеристика спектров ЯМР ¹³С полученных производных представлена в таблице 1.

Далее на примере полученных производных показаны химические основы молекулярного механизма действия предложенного соединения общей формулы I, преимущественно заключающегося в селективной генерации оксида азота.

Пример 6. Исследование образования оксида азота из производных 3,4-бис(фуразан-3-ил)фуроксана общей формулы I.

Для определения оксида азота использовали известный способ, основанный на реакции оксида азота с кислородом воздуха в водной среде с образованием нитрита, количество которого измеряли по интенсивности окрашивания пробы продуктом реакции азосочетания с помощью спектрофотометра.

Проба конечным объемом 1 мл содержала 50 мМ калий-фосфатный буфер (рН 7,4), 0,5 мМ цистеин или глутатион, изучаемое соединение в концентрации 0,1 мМ и 0,2% диметилсульфоксид (ДМСО). В качестве отрицательного контроля использовали водный раствор ДМСО в концентрации 0,2%, а в качестве положительного контроля 0,1 мМ нитрит натрия, содержащий 0,2% ДМСО. Пробы инкубировали 60 мин при 37° С и добавляли последовательно 100 мкл 3 М ацетата натрия, 400 мкл 0,92% раствора сульфаниловой кислоты в 30% уксусной кислоте и 400 мкл 0,05% N-нафтилэтилендиамина. Пробы инкубировали 10 мин и измеряли оптическую плотность при длине волны 554 нм на спектрофотометре.

В вышеуказанных условиях при рН 7,4 не наблюдалось образование заметного количества нитрита (<0,01 моль нитрита/моль исходного соединения(исх.с)) в отсутствие тиолов. В присутствии тиолов соединения 1-5 генерировали 0,057-0,411 моль нитрита на моль исходного соединения в присутствии цистеина и 0,017-0,162 моль нитрита на моль исх.соед. в присутствии глутатиона. Результаты эксперимента представлены в таблице 2.

Согласно данным, NO-генерирующие свойства наиболее близкого известного аналога в условиях, близких к описанным (в присутствии тиолов), изучить не удалось вследствие его крайне низкой растворимости в условиях эксперимента.

Пример 7. Исследование образования S-нитрозотиолов (S-нитрозоглутатиона) производными 3,4-бис(фуразан-3-ил)фуроксана общей формулы I.

Для определения S-нитрозотиолов использовали известный способ, основанный на реакции с хлоридом ртути (II), в ходе которой происходит образование нитрита. Для учета образования нитрита в ходе реакции соединений настоящего изобретения с глутатионом реакцию проводили, как описано в примере 6, а затем определяли нитрит по способу, описанному в примере 6, в отсутствие и в присутствии хлорида ртути (II) в концентрации 0,1%. Разность полученных значений соответствует количеству S-нитрозоглутатиона.

В вышеуказанных условиях не происходит образования S-нитрозоглутатиона из соединений общей формулы I. Возможность генерации известным аналогом S-нитрозотиолов не исследовалась.

Пример 8. Исследование образования восстановленной формы оксида азота производными 3,4-бис(фуразан-3-ил)фуроксана общей формулы I.

Для определения восстановленной формы оксида азота (NO^-/HNO) использовали известный способ, основанный на том, что образовавшийся в ходе реакции нитроксил реагирует с тиолами с образованием гидроксиламина (или происходит конкурентное образование N₂O), который после окисления ионами I^-₃дает нитрит, определяемый по реакции азосочетания (см. пример 7). Поскольку изучаемые соединения также генерируют и нитрит, который аналогичным образом вступает в реакцию азосочетания на заключительном этапе, в качестве положительного контроля использовали гидроксиламина гидрохлорид и нитрит натрия в концентрации 0,1 мМ, а инкубацию проводили так же, как описано в примере 6, при рН 7,4. После инкубации в пробы последовательно с интервалами 20 с добавляли 100 мкл 3 М ацетата натрия, 400 мкл 0,92% раствора сульфаниловой кислоты в 30% уксусной кислоте, 100 мкл 1,25% I₂ в 2% KI, 30 мкл 0,5 М 2-меркаптоэтанола и 400 мкл 0,05% N-нафтилэтилендиамина. Пробы инкубировали 15 мин и измеряли оптическую плотность при длине волны 554 нм на спектрофотометре. Параллельно с этим опытом проводили измерения образования нитрита, как описано в примере 6. Содержание гидроксиламина рассчитывали по формуле: Х=(А-Y· N)/H, где Х соответствует концентрации гидроксиламина, мкМ; А - оптическая плотность пробы, содержащей исследуемое соединение, Y - концентрация образовавшегося нитрита натрия, определенная как описано в примере 6, мкМ; N - оптическая плотность положительного контроля, содержащего нитрит натрия, мкМ^-1; и Н - оптическая плотность положительного контроля, содержащего гидроксиламина гидрохлорид, мкМ^-1 .

В вышеуказанных условиях не наблюдалось образования гидроксиламина из соединений данного изобретения в присутствии цистеина или глутатиона. Возможность генерации известным аналогом восстановленной формы оксида азота не исследована.

Таким образом, соединения настоящего изобретения являются селективными донорами NO и не образуют окисленных или восстановленных форм NO.

Пример 9. Исследование образования метгемоглобина из оксигемоглобина под действием производных 3,4-бис(фуразан-3-ил)фуроксана общей формулы I.

Определение генерации NO в присутствии оксигемоглобина, сопровождающееся количественным превращением оксигемоглобина в метгемоглобин в ходе реакции, изучали известным способом в спектрофотометрической кювете конечным объемом 3 мл при 25° С. Пробы содержали: 25 мМ калий-фосфатный буфер (рН 7,4), 3 мкМ оксигемоглобин, 0,5 мМ цистеин или глутатион и исследуемые соединения 1-5 в концентрации 0,1 мМ. Определяли скорость возрастания оптической плотности при 401 нм и по линейному начальному участку рассчитывали скорость образования оксида азота (коэффициент молярного поглощения метгемоглобина принимали равным 39,9 мМ^-1·см^-1). В отсутствие тиолов заметного прироста оптической плотности при 401 нм не наблюдалось. Кажущуюся константу скорости реакции первого порядка выражали в мин^-1. Из данных литературы известно, что процесс превращения оксигемоглобина в метгемоглобин может сопровождаться образованием гемихрома или холеглобина, поэтому в отдельных экспериментах проверяли отсутствие этих форм гемоглобина. Для этого пробы инкубировали в калий-фосфатном буфере рН 7,4 в присутствии 25 мкМ оксигемоглобина, 0,2 мМ цистеина или глутатиона и 20 мкМ исследуемых соединений. Измеряли оптическую плотность при 560, 577, 630 и 700 нм и рассчитывали концентрации оксигемоглобина, гемихрома, метгемоглобина и холеглобина. Эти эксперименты показали, что при инкубации исследуемых соединений с оксигемоглобином в отсутствие тиолов или в присутствии цистеина или глутатиона не наблюдается образования холеглобина или гемихрома, а происходит исключительно превращение оксигемоглобина в метгемоглобин.

В вышеуказанных условиях исследуемые соединения 1-5 по настоящему изобретению вызывали образование метгемоглобина из оксигемоглобина, причем данный эффект усиливался в присутствии цистеина и глутатиона. Результаты исследований (константы скорости реакции NO+оксигемоглобин NO^-₃+метгемоглобин) представлены в таблице 2. Соединения не реагировали в аналогичных условиях с метгемоглобином.

Согласно известным данным, NO-генерирующие свойства наиболее близкого известного аналога в условиях, близких к описанным (в присутствии тиолов), изучить не удалось вследствие его крайне низкой растворимости в условиях эксперимента.

Результаты вышеперечисленных примеров 6-9, представленные в таблице 2, показывают, что новые производные 3,4-бис(фуразан-3-ил)фуроксана общей формулы I являются эффективными донорами оксида азота.

Пример 10. Изучение влияния производных 3,4-бис(фуразан-3-ил)фуроксана общей формулы I на активацию растворимой формы гуанилатциклазы (рГЦ)

Активацию рГЦ под действием производных 3,4-бис(фуразан-3-ил)фуроксана общей формулы I на примере соединений 1-5 изучали известным способом с применением частично очищенного препарата рГЦ из легких быка. Также активность рГЦ измеряли известным непрямым способом по накоплению цГМФ в препаратах изолированной аорты кролика.

Активность рГЦ измеряли в препаратах из легких быка, полученных известным способом. Легкие измельчали при 4° С, гомогенизировали в пяти объемах буфера А (50 мМ триэтаноламин-НСl рН 7,6, содержащий 5 мМ ДТТ и 75 мМ NaCl) и центрифугировали при 100000 g в течение 1 ч. Супернатант наносили на колонку ДЭАЭ-Тойоперл 650М (Toyosoda, Япония), уравновешенную буфером А, и проводили элюцию линейным градиентом NaCl (от 0,075 до 0,5 М) в буфере А. Пик активности фермента элюировался при ионной силе, соответствующей концентрации NaCl 0,22 М. Фракции, содержащие максимальную активность, концентрировали и подвергали гель-фильтрации на колонке с сефакрилом S-300 (Pharmacia, Швеция), уравновешенной буфером А. Активные фракции объединяли, концентрировали и и проводили хроматографию на колонке с голубой агарозой CL-4B (Таллиннский ХФЗ, Эстония), уравновешенной 50 мМ триэтаноламин-НСl рН 7,6, 10 мМ ДТТ и 10 нМ гемином. Белок элюировали линейным градиентом NaCl (от 0,05 до 1 М). Активные фракции объединяли, концентрировали и хроматографировали на колонке с Q-сефарозой (Fast Flow, Pharmacia, Швеция), уравновешенной буфером А. Фермент элюировали линейным градиентом NaCl от 0,075 до 1,5 М. Очищенную рГЦ хранили в атмосфере азота в 50 мМ триэтаноламин-HCl рН 7,6, содержащем 30% глицерин, 10 мМ ДТТ и 1 М NaCl при -70° С.

Активность фермента определяли по количеству [³²Р]цГМФ, образовавшегося из [ -³²P]ГТФ, известным способом. Белок (около 0,2-0,5 мкг белка частично очищенного препарата из легких быка) на льду добавляли в инкубационную смесь (конечный объем проб 100 мкл), содержащую (конечные концентрации) 50 мМ трис-НСl рН 7,6, 1 мМ 3-изобутил-1-метилксантин, 5 мМ MgCl₂, 0,4 мг/мл креатинфосфокиназы, 5 мМ креатинфосфат, 2 мМ цГМФ, 0,2 мМ ГТФ, 10000-20000 имп/мин/пмоль [ -³²P]ГТФ (Изотоп, ИЯФ, Обнинск), a также 10 мМ ДТТ или другие тиолы, как указано в тексте дополнительно. При определении активирующего действия в среду инкубации вносили изучаемое соединение в концентрации 10 мкМ в виде раствора в водном ДМСО, а в контрольные пробы добавляли ДМСО до концентрации 0,02%. Контрольная проба показала отсутствие влияния ДМСО в указанной концентрации на базальную активность рГЦ. Пробы инкубировали при 37° С в течение 15 мин. Реакцию останавливали кипячением проб в течение 2 мин. После охлаждения до комнатной температуры в пробы добавляли 0,5 мл 30 мМ Nа₂СО₃ и 0.6 мл 36 мМ Zn(СН ₃СОО)₂, перемешивали, инкубировали при 4° С в течение 10 мин и центрифугировали при 15 000 g в течение 5 мин. Супернатант наносили на колонки с подкисленной известным способом окисью алюминия, которые промывали водой. Элюцию [³²Р]ГМФ проводили 0,2 М формиатом аммония во флаконы для сцинтилляционного счета, и радиоактивность измеряли с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика известным способом Черенкова.

Определение белка проводили по известному способу Лоури с использованием бычьего сывороточного альбумина в качестве стандарта.

Результаты опытов представлены в таблице 3.

Анализ данных, представленных в таблице 3, показывает, что соединения настоящего изобретения в зависимости от концентрации в 2,09-35,8 раз активировали рГЦ из легких быка.

Таким образом, производные 3,4-бис(фуразан-3-ил)фуроксана общей формулы I являются эффективными активаторами рГЦ.

Влияние известного структурного аналога на активность рГЦ не изучено.

Для определения накопления цГМФ в препаратах изолированной аорты кролика сегмент аорты инкубировали в течение 30 мин в растворе Кребса (130 мМ NaCl, 4,7 мМ КСl, 2,5 мМ СаСl₂, 1,18 мМ КH₂PO₄ 14.9 мМ NаНСО₃, 1,2 мМ MgSO₄, 11 мМ глюкоза) при 37° С в присутствии 1 мМ 3-изобутил-1-метилксантина, а затем добавляли соединение 1 до конечной концентрации 10 мкМ. Инкубацию проводили в течение 3 мин, затем ткань замораживали в жидком азоте, взвешивали 20 мг порошка и растирали с ступке с жидким азотом. Проводили экстракцию 0,5 мл 1 М раствора хлорной кислоты в течение 60 мин при 4° С. Смесь центрифугировали при 10000g в течение 5 мин, осадок отбрасывали, а супернатант нейтрализовывали добавлением 0,25 мл 1 М раствора К₂СО₃. Осадок удаляли центрифугированием, супернатант отбирали и определяли количество цГМФ известным способом с помощью наборов для определения цГМФ производства компании “Биоиммуноген” (Москва, Россия). Результаты выражали в пмоль цГМФ/мг белка. В отсутствие соединения 1 (0,02% ДМСО) уровень цГМФ составлял 2,55 пмоль цГМФ/мг белка, а в присутствии соединения 1-3,9 пмоль цГМФ/мг белка. Следовательно, соединение 1 повышает уровень цГМФ в препарате изолированной аорты кролика. Влияние известного структурного аналога на уровень цГМФ в гладких мышцах не изучено.

Пример 11. Определение сосудорасширяющей и спазмолитической активности производных 3,4-бис(фуразан-3-ил)фуроксана общей формулы I

Сосудорасширяющую и спазмолитическую активности соединений настоящего изобретения изучали на модели изометрического сокращения гладких мышц изолированного сегмента аорты крысы под действием вазоконстриктора (спазмогена) - фенилэфрина. Активность предлагаемых производных общей формулы I определяли на примере соединений 1 -5 в условиях in vitro на кольцах торакальной аорты крыс-самцов линии Вистар средней массой 280 г (210-330 г) известным способом. Крыс декапитировали, вырезали торакальную аорту и очищали от жировой ткани. Затем вырезали кольца шириной 2,5 мм, которые подвешивали на двух параллельных крючках из нержавеющей стали. Один из крючков закрепляли на стенке камеры, а другой соединяли с изометрическим датчиком DY1, соединенным с восьмиканальным самописцем (фирмы Beckman, США). Камера содержала 30 мл раствора Кребса (130 мМ NaCl, 4,7 мМ КСl, 2,5 мМ СаСl₂, 1,18 мМ КН₂РO₄, 14,9 мМ NaHCO₃, 1,2 мМ MgSO₄, 11 мМ глюкоза) при 37° С, который находился в условиях постоянной аэрации 95% O₂/5% СO₂ для поддержания рН 7,4. В раствор Кребса добавляли индометацин до концентрации 1 мкМ. При необходимости эндотелий удаляли механическим способом. Кольца перед опытом уравновешивали в течение часа под нагрузкой 2,5 г. Перед началом эксперимента кольца предсокращали 10 нМ норадреналином, а через 20 мин вызывали сокращение препарата добавлением фенилэфрина в концентрации 0,3 мкМ. После стабилизации состояния мышцы сосуда регистрировали ее расслабление в ответ на кумулятивные дозы соединений 1-5 в диапазоне концентраций от 0,003 нМ до 50 000 нМ. После этого изучаемое соединение отмывали 6-7 сменами среды инкубации в течение 1 ч и контролировали интактное состояние гладкой мышцы сосуда с использованием 0,5 мкМ нитропруссида натрия. В связи с тем, что растворителем изучаемых соединений в настоящем эксперименте являлся ДМСО, определяли влияние растворителя на изометрическое сокращение сосуда в отдельных экспериментах. Было установлено, что ДМСО в концентрации до 0,1-0,2% практически не оказывает влияния на сосудистый тонус, что позволяет тестировать вазорелаксантную активность изучаемых соединений в концентрации до 100 мкМ. Все эксперименты повторяли не менее 3 раз. Величину концентрации исследуемых соединений, соответствующую 50%-ной релаксации сосуда (IC₅₀), рассчитывали с применением программы SigmaPlot версии 2,0 (Jandel Scientific Corp., США) по стандартному уравнению для сигмоидных зависимостей вида , где R соответствует релаксации сосуда при концентрации соединения с, Rmax соответствует максимальной релаксации под действием этого же соединения, а n представляет собой виртуальный коэффициент кооперативности, варьировавший в пределах от 1,1 до 1,8. Достоверность подбора параметров (n и IC50) контролировали по методу наименьших квадратов и она составляла не менее 95%. Статистическую обработку результатов проводили по тест