2240327 - Ген и белок вирулентности и их использование

Ген и белок вирулентности и их использование

Реферат

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для лечения и профилактики заболевания, ассоциированного с инфекцией стрептококком или Гр+ бактерией. Изобретение охватывает пептид, который кодируется нуклеиновой кислотой S.pyogenes с нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы последовательностей, приведенных в материалах заявки. Изобретение включает также родственную пептиду молекулу, имеющую, по крайней мере, 80%-ное сходство или идентичность на аминокислотном или нуклеотидном уровне. Как пептид, так и кодирующий его полинуклеотид может быть использован как лекарственное средство для лечения или профилактики заболеваний, обусловленных стрептококком или Гр+ бактерией. Изобретение касается вакцины, используемой как упомянутую выше, а также антитела, способного связывать пептид. Идентификация генов, кодирующих продукты, ассоциированные с вирулентностью, позволяет продуцировать аттенуированные микроорганизмы, пригодные для изготовления вакцин для терапевтического применения. 4 с. и 10 з.п. ф-лы.

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к генам и белкам вирулентности и к их использованию. Более конкретно, настоящее изобретение относится к генам и белкам/пептидам, полученным из Streptococcus pyogenes, к их использованию в терапии и в скрининге на лекарственные средства.

Предпосылки создания изобретения

Стрептококки группы A (GAS) ответственны за большинство заболеваний, вызываемых стрептококкоками {Streptococcus}. Особый интерес представляет микроорганизм S. pyogenes, который ответственен за неинвазивные и инвазивные инфекции широкого ряда, такие как импетиго, фарингит, некротизирующий фасцит, бактериемия, синдром стрептококкового токсического шока (ССТШ), пневмония и ревматическая лихорадка.

Некоторые GAS-инфекции могут быть подвергнуты лечению антибиотиками, включая пенициллин и эритромицин. Однако из-за проблем, связанных с вырабатыванием резистентности к антибиотикам и с возникновением у пациентов аллергии к антибиотикам, необходима разработка других терапевтических средств, которые могут быть использованы для лечения или профилактики GAS-инфекций.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение основано на обнаружении генов вирулентности в S. pyogenes.

В соответствии с первым аспектом настоящего изобретения пептидом настоящего изобретения является пептид, который кодируется опероном, включающим любую из нуклеотидных последовательностей, идентифицированных в настоящем описании как SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59 и 61 S. pyogenes или его гомолог в грамположительной бактерии или его функциональный фрагмент, и который может быть использован в терапии или диагностике.

Пептиды могут иметь множество терапевтических применений для лечения инфекций, вызываемых стрептококками группы А, включая применение в качестве вакцин в целях профилактики.

В соответствии со вторым аспектом настоящего изобретения полинуклеотид, кодирующий пептид, определенный выше, также может быть использован в терапии или диагностике.

В соответствии с третьим аспектом настоящего изобретения, гены, кодирующие пептиды, могут быть использованы для продуцирования аттенуированных микроорганизмов. Аттенуированные микроорганизмы обычно имеют мутацию, которая нарушает экспрессию одного или более идентифицированных здесь генов, с получением штамма с отсутствием вирулентности. Такие микроорганизмы также могут быть использованы для терапии и диагностики.

В соответствии с четвертым аспектом настоящего изобретения, пептиды, гены и аттенуированные микроорганизмы настоящего изобретения могут быть использованы для лечения или профилактики состояния, связанного с инфекцией, вызываемой стрептококками или грамположительными бактериями.

Описание изобретения

Настоящее изобретение основано на обнаружении генов, кодирующих пептиды, ответственные за вирулентность. Поэтому пептиды и гены настоящего изобретения могут быть использованы в целях получения терапевтических агентов для лечения инфекционных заболеваний. При этом следует отметить, что понятие "терапия" также включает в себя профилактическую обработку, например вакцинацию. Кроме того, хотя продукты настоящего изобретения предназначены, в первую очередь, для лечения инфекций у человека, однако применение этих продуктов в ветеринарии также входит в объем настоящего изобретения.

Настоящее изобретение раскрыто на основе Streptococcus pyogenes. Однако все штаммы стрептококков группы А и многие другие штаммы грамположительных бактерий, по-видимому, содержат родственные пептиды или белки, имеющие аминокислотные последовательности, идентичные или подобные идентифицированным здесь последовательностям. Микроорганизмами, которые, вероятно, содержат указанные пептиды, являются, но не ограничиваются ими, Lactococcus, Enterococcus, Streptococcus и Staphylococcus.

Предпочтительно, чтобы пептиды, которые могут быть использованы в различных аспектах настоящего изобретения, имели более чем 40%-ное сходство с идентифицированными здесь пептидами. Более предпочтительно, чтобы указанные пептиды имели более чем 60%-ное сходство. Наиболее предпочтительно, чтобы указанные пептиды имели более чем 80%-ное сходство, например 95%-ное сходство. Что касается идентифицированных здесь полинуклеотидных последовательностей, то родственные полинуклеотиды, которые могут быть использованы в различных аспектах настоящего изобретения, могут иметь более чем 40%-ную идентичность с идентифицированными здесь последовательностями. Более предпочтительно, чтобы указанные полинуклеотидные последовательности имели более чем 60%-ную идентичность. Наиболее предпочтительно, чтобы указанные полинуклеотидные последовательности имели более чем 80%-ную идентичность, например 95%-ную идентичность.

Термины "сходство" и "идентичность" известны специалистам. Термин "идентичность" используется в том случае, когда сравнение последовательностей основано на идентичных совпадениях между соответствующими идентичными положениями в сравниваемых последовательностях. Термин "сходство" используется в том случае, когда при сравнении аминокислотных последовательностей принимаются во внимание не только идентичные аминокислоты в соответствующих положениях, но также и функционально схожие аминокислоты в соответствующих положениях. Таким образом, сходство полипептидных последовательностей, помимо сходства их последовательностей, указывает и на их функциональное сходство.

Уровни идентичности двух генных последовательностей и уровни идентичности или сходства аминокислотных последовательностей могут быть вычислены известными методами. В соответствии с настоящим изобретением общедоступными компьютерными методами для определения идентичности и сходства последовательностей являются программы BLASTP, BLASTN и FASTA (Atschul et al., J.Molec. Biol., 1990; 215:403-410), программа BLASTX, поставляемая NCBI, и программа Gap, поставляемая Genetics Computer Group, Madison WI. Описанные здесь степени сходства и идентичности были получены с использованием программы Gap, где при сравнении аминокислотных последовательностей штраф на "пробел-пропуск" составляет 12, а штраф на "пробел-удлинение" составляет 4, а при сравнении полинуклеотидных последовательностей штраф на "пробел-пропуск" составляет 50, а штраф на "пробел-удлинение" составляет 3.

Имея ген, охарактеризованный в соответствии с настоящим изобретением, можно использовать последовательность данного гена для поиска родственных генов или пептидов в других микроорганизмах. Это может быть осуществлено путем поиска в существующих базах данных, например в EMBL или Genbank.

Пептиды или белки настоящего изобретения могут быть очищены и выделены известными методами. В частности, имея идентифицированную генную последовательность, можно использовать рекомбинантные методы для экспрессии генов в соответствующем хозяине. Активные фрагменты и родственные молекулы могут быть идентифицированы и использованы в терапии. Так, например, пептиды или их активные фрагменты могут быть использованы в качестве антигенных детерминант в вакцине для выработки иммунного ответа. Они могут быть также использованы для получения антител для пассивной иммунизации или диагностики. Подходящими антителами являются моноклональные антитела или их фрагменты, включая одноцепочечные Fv-фрагменты. Методы получения антител известны каждому специалисту в данной области.

Активными фрагментами пептидов являются фрагменты, которые сохраняют биологическую функцию указанного пептида. Так, например, при использовании в целях вырабатывания иммунного ответа фрагмент должен иметь достаточный размер, такой, чтобы антитела, генерированные из указанного фрагмента, могли отличать один пептид от другого пептида бактериального микроорганизма. Обычно фрагмент должен иметь, по крайней мере, 30 нуклеотидов (10 аминокислот), предпочтительно 60 нуклеотидов (20 аминокислот), а наиболее предпочтительно более чем 90 нуклеотидов (30 аминокислот).

При этом следует отметить, что помимо родственных молекул, происходящих от других микроорганизмов, настоящее изобретение охватывает модификации, внесенные в идентифицированные здесь пептиды и полинуклеотиды, которые, в основном, не изменяют их биологическую функцию. Для специалиста в данной области очевидно, что вырожденность генетического кода может приводить к образованию полинуклеотидов, которые по сравнению с определенными здесь полинуклеотидами имеют небольшие различия в основаниях, но которые, тем не менее, кодируют те же самые пептиды. Комплементарные полинуклеотиды также входят в объем настоящего изобретения. Рассматриваются также консервативные замены на аминокислотном уровне, т.е. различные кислотные или основные аминокислоты могут быть заменены в том случае, если эти замены не будут приводить к значительной потере их функции.

Получение вакцин на основе аттенуированных микроорганизмов известно специалистам. Вакцинные композиции могут быть изготовлены с использованием подходящих носителей или адъювантов, например квасцов, если это необходимо для эффективной иммунизации против инфекции. Получение вакцинных препаратов известно специалисту. Аттенуированные микроорганизмы могут быть получены путем введения мутаций, которые нарушают экспрессию любых раскрытых здесь генов. Специалистам должны быть известны методики нарушения экспрессии конкретных генов. Способы, которые могут быть использованы в этих целях, предусматривают инсерционную инактивацию или делецию генов. Аттенуированные микроорганизмы настоящего изобретения могут также включать дополнительные мутации в других генах, например во втором идентифицируемом здесь гене или в отдельном гене, необходимом для роста микроорганизма, например мутации в гене аrо. Аттенуированные микроорганизмы могут быть также использованы в качестве систем-носителей для доставки гетерологичных антигенов, терапевтических белков или нуклеиновых кислот (ДНК или РНК). В этом варианте осуществления изобретения аттенуированные микроорганизмы используются для доставки гетерологичного антигена, белка или нуклеиновой кислоты в конкретный участок in vivo. Введение гетерологичного антигена, пептида или нуклеиновой кислоты в аттенуированный микроорганизм может быть осуществлено стандартными методами, предусматривающими использование рекомбинантных конструкций, например векторов, которые содержат полинуклеотиды, экспрессирующие гетерологичный антиген или терапевтический белок, а также подходящие промоторные последовательности. Альтернативно, ген, кодирующий гетерологичный антиген или белок, может быть встроен в геном организма, а эндогенные промоторы могут быть использованы для контрольной экспрессии.

В более общем смысле, и как это хорошо известно специалистам, подходящее количество активного компонента настоящего изобретения может быть выбрано в соответствии с его терапевтическим применением, а также могут быть выбраны подходящие носители или наполнители и способы введения. Эти факторы должны быть выбраны или определены в соответствии с известными критериями, такими как природа/тяжесть состояния, подвергаемого лечению, типа и/или состояния здоровья индивидуума и т.п.

В одном из вариантов осуществления изобретения продукты настоящего изобретения могут быть использованы в анализе-скрининге, проводимом для идентификации потенциальных противомикробных лекарственных средств и для детекции вирулентности. Рутинные анализы-скрининги известны специалистам и могут быть соответствующим способом адаптированы с использованием продуктов настоящего изобретения. Так, например, продукты настоящего изобретения могут быть использованы в качестве мишеней для потенциальных лекарственных средств, где способность данного лекарственного средства инактивировать данную мишень или связываться с ней указывает на его потенциальную противомикробную активность.

Различные продукты настоящего изобретения могут быть также использованы в ветеринарии.

Ниже приведен краткий обзор экспериментальной процедуры, используемый для идентификации генов вирулентности. Гены вирулентности в S. pyogenes были идентифицированы посредством мутагенеза с использованием индексных маркеров (STM) для скрининга банка мутантов S. pyogenes в целях поиска аттенуированных мутантов (Hensel et al., 1995, Science 269 (5222):400-3).

Мутанты генерировали посредством встраивания транспозона Тn917 с использованием плазмидного вектора. Помимо фрагмента Тn917 этот вектор содержал ген резистентности к спектромицину, ген резистентности к хлорамфениколу (ген CAT) с синтетическим промотором, сайт инициации репликации грамотрицательной бактерии (rop.ori) и сайт клонирования для STM-меток. После лигирования меток в вектор осуществляли трансформацию Е. coli и отбирали 96 плазмид, которые гибридизовались с исходными метками.

Штамм S. pyogenes B514-SM (тип М50) был трансформирован каждой из 96 меченных плазмид, и трансформанты отбирали по их резистентности к спектиномицину и хлорамфениколу. Для каждого из трансформированных штаммов S. pyogenes посредством встраивания транспозона Тn917 было генерировано 20 мутантов для создания банка мутантов.

Банк мутантов скринировали либо на мышиной модели инфицирования с инвазивным поражением кожи (Schrager et al., J. Clinical Investigation 1996; 98:1954-1958), либо на мышиной модели инфицирования с бактериальной колонизацией глотки (Husmann et al., Infection and Immunity, 1997; 65 (4):935-944).

Для кожной модели каждую из пяти мышей CD1 внутрикожно инокулировали 1х10⁸ клеток в объеме 50 мкл культуры, представляющей собой коллекцию из 96 различных и легко различимых мутантов. Через 48 часов после инокуляции брали образцы и выделяли бактерии. Повреждения кожи подвергали мацерации в 2хВНI-среде, и бактерии высвобождались из участка поражения путем обработки в искусственном желудке в течение 10 минут. Выделенные бактерии высевали, и минимум от 3 мышей выделяли минимум 10000 колоний. Из этих образцов выделяли ДНК и использовали для амплификации меченной ДНК, присутствующей в выделенных бактериях. ДНК, выделенную из каждого полученного пула, использовали в качестве гибридизационного зонда для выявления в каждом пуле тех мутантов, которые не удалось выделить у животных, и которые поэтому являются аттенуированными у данной животной модели инфицирования.

Для модели бактериальной колонизации глотки 2х10⁸ клеток интраназально инокулировали шести мышам C57BL/6 и через 48 часов брали образцы. Как в случае кожной модели бактерии, содержащие встроенный транспозон Тn917 в гене вирулентности, не были выделены у мышей, инокулированных смешанной популяцией мутантов, а поэтому они, вероятно, были аттенуированными.

Для определения индекса конкурентоспособности (CI) были проведены дополнительные эксперименты на мутантах, идентифицированных посредством скрининга на STM. Отдельные мутанты были протестированы на модели инфицирования с поражением кожи смешанными инфекциями, вызываемыми штаммами дикого типа (Chiang S.L. & Mekalanos, J.J. Molecular Microbiology 1998; 27 (4):797-805). Как и в случае предварительного скрининга, группы из четырех мышей CD1 инокулировали равным количеством клеток дикого типа и мутантных клеток, общее число которых составляло 1х10⁸ клеток. Бактерии, выделенные через 48 часов, высевали на селективные среды, которые позволяют различать колонии дикого типа и мутантные колонии. Отношение мутантных бактерий к бактериям дикого типа, наблюдающееся в инокуляте, по сравнению с соответствующим отношением в выделенных бактериях представляет собой индекс конкурентоспособности (отношение бактерий-мутантов к бактериям дикого типа в инокуляте, деленное на отношение бактерий-мутантов к бактериям дикого типа, выделенных у животного-модели).

Настоящее изобретение проиллюстрировано нижеследующими примерами.

Пример 1

Был идентифицирован первый мутант и была клонирована нуклеотидная последовательность, непосредственно примыкающая к встроенному транспозону.

Нуклеотидная последовательность была на 100% идентична на нуклеотидном уровне кодирующей последовательности в геноме S. pyogenes, представленной как SEQ ID N0:l, с предполагаемой последовательностью белка, представленной как SEQ ID NO:2.

Аминокислотная последовательность предсказанного белкового продукта была на 43% идентична предполагаемой последовательности нитроредуктазы NAD(P)H Н. influenzae (номер доступа: SW:Q57431).

Если принять во внимание сходство предполагаемого гена нитроредуктазы NAD(P)H в S. pyogenes с геном нитроредуктазы NAD(P)H в Н. influenzae, то следует ожидать, что аналогичные последовательности в других стрептококках и грамположительных бактериях могут быть также ассоциированы с вирулентностью.

В тесте на аттенуацию вирулентности было показано, что мутированный микроорганизм был аттенуирован с индексом конкурентоспособности (CI) 0,644.

Пример 2

Был идентифицирован другой мутант и была клонирована нуклеотидная последовательность, непосредственно примыкающая к встроенному транспозону.

Нуклеотидная последовательность была на 98% идентична на нуклеотидном уровне последовательности в геноме S. pyogenes, представленной как SEQ ID NO:3. Предсказанная аминокислотная последовательность представлена как SEQ ID NO:4.

Аминокислотная последовательность была на 81% идентична предполагаемой последовательности фермента интегразы S. mutans (номер доступа: TREMBL: 069155).

Это свидетельствует о том, что разрушенный ген, по крайней мере, частично идентичен предполагаемому гену интегразы S. mutans. Однако ранее было не известно о присутствии этого гена в S. pyogenes и о его роли в вирулентности.

Если принять во внимание сходство гена в S. pyogenes с предполагаемым геном интегразы S. mutans, то следует ожидать, что аналогичные последовательности в других стрептококках и грамположительных бактериях могут также быть детерминантами вирулентности.

В тесте на аттенуацию вирулентности было показано, что мутированный микроорганизм был аттенуирован с индексом конкурентоспособности (CI) 0,229.

Пример 3

Нуклеотидная последовательность была на 97% идентична на нуклеотидном уровне последовательности в геноме S. pyogenes, представленной как SEQ ID NO:5. Предсказанная аминокислотная последовательность представлена как SEQ ID NO:6.

Аминокислотная последовательность была на 37% идентична на аминокислотном уровне белку GlgP одноклеточной цианобактерии Synechocystis spp. (номер доступа: TREMBL:P73511).

Это свидетельствует о том, что разрушенный ген, по крайней мере, частично идентичен гену glgP Synechocystis spp.

Если принять во внимание сходство гена в S. pyogenes с геном glgP Synechocystis spp., то следует ожидать, что аналогичные последовательности в других стрептококках и грамположительных бактериях могут также быть детерминантами вирулентности.

В тесте на аттенуацию вирулентности было показано, что мутированный микроорганизм был аттенуирован с индексом конкурентоспособности (CI) 0,011.

Пример 4

Нуклеотидная последовательность была на 97% идентична на нуклеотидном уровне последовательности в геноме S. pyogenes, представленной как SEQ ID NO:7. Предсказанная аминокислотная последовательность представлена как SEQ ID NO:8.

Аминокислотная последовательность была на 35% идентична на аминокислотном уровне белку ВrаВ В. subtilis (номер доступа: TREMBL: 035545).

Это свидетельствует о том, что разрушенный ген, по крайней мере, частично идентичен гену bгаВ В. subtilis.

Если принять во внимание сходство гена braB в S. pyogenes с геном braB В. subtilis, то следует ожидать, что аналогичные последовательности в других стрептококках и грамположительных бактериях могут быть также ассоциированы с вирулентностью.

В тесте на аттенуацию вирулентности было показано, что мутированный микроорганизм был аттенуирован с индексом конкурентоспособности (CI) 0,88.

Пример 5

Нуклеотидная последовательность была на 99% идентична на нуклеотидном уровне последовательности в геноме S. pyogenes, представленной как SEQ ID NO:9. Предсказанная аминокислотная последовательность представлена как SEQ ID NO:10.

Был также идентифицирован еще один аттенуированный мутант с нуклеотидной последовательностью, имеющей 98%-ную идентичность, на нуклеотидном уровне, с последовательностью в геноме S. pyogenes, представленной как SEQ ID NO:11. Предсказанная аминокислотная последовательность представлена как SEQ ID NO:12.

Предсказанный белок первого мутанта был на 53% идентичен на аминокислотном уровне белку AdcR S. pneumoniae (номер доступа: TREMBL: 033703). Предсказанный белок второго мутанта был на 79% идентичен на аминокислотном уровне белку AdcC S. pneumoniae (номер доступа: TREMBL: 087862).

Это свидетельствует о том, что разрушенные гены, по крайней мере, частично идентичны генам adcR и adcC S. pneumoniae. Гены adcR и adcC являются частью оперона adc (включающего adcR, adcC adcB и adcA) в S. pneumoniae. Поэтому аттенуация мутантов adcR и adcC S. pyogenes могла быть обусловлена отсутствием экспрессии генов adcR и adcC, или предсказанных и нижерасположенных генов (гомологов adcB и adcA). Ранее не считалось, что эти гены играют какую-либо роль в вирулентности S. pyogenes.

Если принять во внимание сходство гена в S. pyogenes с генами adcR и adcC S. pneumoniae, то следует ожидать, что аналогичные последовательности в других стрептококках и грамположительных бактериях могут быть также ассоциированы с вирулентностью.

В тесте на аттенуацию вирулентности было показано, что мутированные микроорганизмы были аттенуированы с индексом конкурентоспособности (CI) 0,548 (adcR) и 0,028 {adcC}.

Пример 6

Нуклеотидная последовательность была на 99% идентична на нуклеотидном уровне последовательности в геноме S. pyogenes, представленной как SEQ ID NO:13. Предсказанная аминокислотная последовательность представлена как SEQ ID NO:14.

Аминокислотная последовательность была на 39% идентична на аминокислотном уровне гомологу белка ДНК-репарации radC (orfB) В. subtilis (номер доступа: SK: Q02170).

Это свидетельствует о том, что разрушенный ген, по крайней мере, частично идентичен гену orfB В. subtilis.

Если принять во внимание сходство гена orfB S. pyogenes с геном В. subtilis, то следует ожидать, что аналогичные последовательности в других стрептококках и грамположительных бактериях могут быть также ассоциированы с вирулентностью.

В тесте на аттенуацию вирулентности было показано, что мутированный микроорганизм был аттенуирован с индексом конкурентоспособности (CI) 0,766.

Пример 7

Нуклеотидная последовательность была на 98% идентична на нуклеотидном уровне последовательности в геноме S. pyogenes, представленной как SEQ ID NO:15. Предсказанная аминокислотная последовательность представлена как SEQ ID NO:16.

Аминокислотная последовательность была на 54% идентична на аминокислотном уровне белку-переносчику карбоксил-биотина (ВССР) в S. mutans (номер доступа: SW: P29337).

Это свидетельствует о том, что разрушенный ген, по крайней мере, частично идентичен гену, кодирующему ВССР S. mutans. O присутствии этого гена в S. pyogenes и о его роли в вирулентности ранее не было известно.

Если принять во внимание сходство транслированного гена S. pyogenes с ВССР S. mutans, то следует ожидать, что аналогичные последовательности в других стрептококках и грамположительных бактериях могут быть также ассоциированы с вирулентностью.

В тесте на аттенуацию вирулентности было показано, что мутированные микроорганизмы были аттенуированы с индексом конкурентоспособности (CI) 0,044.

Пример 8

Была идентифицирована серия мутантов, имеющих последовательности, сходные с последовательностями генов, ответственных за нитратное брожение. Нуклеотидные последовательности восьми мутантов были на 100% идентичны последовательности в геноме S. pyogenes, представленной как SEQ ID NO:17. Предсказанная аминокислотная последовательность представлена как SEQ ID NO:18.

Предсказанный белок гена S. pyogenes был на 58% идентичен на аминокислотном уровне белку citF, альфа-цепи цитратлиазы, Е. coil (номер доступа SW: P75726).

Нуклеотидная последовательность трех других мутантов была на 99% идентична другой последовательности в геноме S. pyogenes. Эта нуклеотидная последовательность представлена как SEQ ID NO:19, а предсказанная аминокислотная последовательность представлена как SEQ ID NO:20.

Указанные аминокислотные последовательности были на 55% идентичны на аминокислотном уровне белку citE, бета-цепи цитратлиазы, Е. coli (номер доступа SW: P77770).

Нуклеотидные последовательности двух других мутантов были на 99% идентичны нуклеотидной последовательности S. pyoqenes, идентифицированной здесь как SEQ ID NO:21. Предсказанная аминокислотная последовательность представлена как SEQ ID NO:22.

Аминокислотная последовательность была на 46% идентична на аминокислотном уровне белку CitD, белку-переносчику цитратлиазацила (гамма-цепи цитратлиазы) в Е. coli (номер доступа SW: P77618).

Были идентифицированы два других мутанта с нуклеотидными последовательностями, имеющими 99%-ную идентичность с нуклеотидной последовательностью S. pyoqenes, идентифицированной здесь как SEQ ID NO:23. Предсказанная аминокислотная последовательность представлена как SEQ ID NO:24.

Аминокислотные последовательности были на 34% идентичны на аминокислотном уровне белку CitC, цитрат (рrо-3s)-лиазе (лигазе), Е. coli (номер доступа SW: P77390).

Был идентифицирован другой мутант с нуклеотидной последовательностью, имеющей 99%-ную идентичность с нуклеотидной последовательностью S. pyoqenes, идентифицированной здесь как SEQ ID NO:25. Предсказанная аминокислотная последовательность представлена как SEQ ID NO:26.

Аминокислотная последовательность была на 37% идентична на аминокислотном уровне белку CitX E. coil (номер доступа SW: P77563).

Были идентифицированы еще три мутанта с нуклеотидными последовательностями, имеющими 100%-ную идентичность с нуклеотидной последовательностью S. pyogenes, идентифицированной здесь как SEQ ID NO:27. Предсказанная аминокислотная последовательность представлена как SEQ ID NO: 2 8.

Аминокислотные последовательности были на 59% идентичны на аминокислотном уровне белку OadA, субъединицы альфа оксалоацетат-декарбоксилазы К. pneumoniae (номер доступа SW: Р13187).

Все предсказанные белковые последовательности вышеуказанных мутантов имели различные степени идентичности генным продуктам E. coli или К. pneumoniae, необходимым для нитратного брожения.

Это свидетельствует о том, что разрушенные гены, по крайней мере, частично идентичны генам citF, E, D, С, Х и oadA E. coli и К. pneumoniae. Гены, участствующие в цитратном брожении, локализованы в одном локусе на хромосоме в E. coli и К. pneumoniae. Поэтому аттенуация мутантов S. pyogenes могла быть обусловлена отсутствием экспрессии генов citFEDCX и oadA или нижерасположенных генов. Ранее этим генам не приписывали какой-либо роли в вирулентности.

Если принять во внимание сходство гена в S. pyogenes с генами, присутствующими в E. coli или К. pneumoniae, то следует ожидать, что аналогичные последовательности в других стрептококках и грамположительных бактериях могут быть также ассоциированы с вирулентностью.

Мутанты для каждого из citF, Е, D, Х и oadA были протестированы на аттенуацию вирулентности. Было показано, что мутированные микроорганизмы были аттенуированы с индексом конкурентоспособности (CI) 0,122 (citF), 0,064 (citE), 0,078 (citD), 0,025 (citX) и 0,251 (oadA).

Пример 9

Нуклеотидная последовательность была на 98% идентична на нуклеотидном уровне последовательности в геноме S. pyogenes, идентифицированной здесь как в SEQ ID NO:29. Предсказанная аминокислотная последовательность представлена как SEQ ID N0:30.

Аминокислотная последовательность была на 27% идентична на аминокислотном уровне белку femB S. aureas (номер доступа: TREMBL: Q9X9D7).

Это свидетельствует о том, что разрушенный ген, по крайней мере, частично идентичен гену femB S. aureas. Однако ранее не было известно о присутствии этого гена в S. pyogenes и о его роли в вирулентности.

Если принять во внимание сходство гена S. pyogenes с геном femB S. aureas, то следует ожидать, что аналогичные последовательности в других стрептококках и грамположительных бактериях могут быть также ассоциированы с вирулентностью.

Пример 10

Нуклеотидная последовательность была в значительной степени идентична последовательности в геноме S. pyoqenes, представленной как SEQ ID NO:31. Предсказанная аминокислотная последовательность представлена как SEQ ID NO:32.

В тесте на аттенуацию вирулентности было показано, что мутированный микроорганизм был аттенуирован с индексом конкурентоспособности (CI) 0,160.

Пример 11

Нуклеотидная последовательность была на 100% идентична последовательности в геноме S. pyogenes, представленной как SEQ ID NO:33. Предсказанная аминокислотная последовательность представлена как SEQ ID NO:34.

Пример 12

Нуклеотидная последовательность была на 98% идентична на нуклеотидном уровне последовательности в геноме S. pyogenes, представленной как SEQ ID NO:35. Предсказанная аминокислотная последовательность представлена как SEQ ID NO:36.

Аминокислотная последовательность была на 46% идентична на аминокислотном уровне ATP-связывающему белку транспорта субтилина в Bacillus subtilis (номер доступа: SW:P33116).

Это свидетельствует о том, что разрушенный ген, по крайней мере, частично идентичен гену braB В. subtilis.

Если принять во внимание сходство гена в S. pyogenes с указанным геном В. subtilis, то следует ожидать, что аналогичные последовательности в других стрептококках и грамположительных бактериях могут быть также ассоциированы с вирулентностью.

В тесте на аттенуацию вирулентности было показано, что мутированный микроорганизм был аттенуирован с индексом конкурентоспособности (CI) 0,128.

Пример 13

Был идентифицирован другой мутант и сразу после инсерции транспозона была клонирована нуклеотидная последовательность.

Указанная нуклеотидная последовательность была на 98% идентична последовательности в геноме S. pyogenes, представленной как SEQ ID NO:37. Предсказанная аминокислотная последовательность представлена как SEQ ID NO:38.

Пример 14

Нуклеотидная последовательность была на 98% идентична на нуклеотидном уровне последовательности в геноме S. pyogenes, представленной как SEQ ID NO:37. Предсказанная аминокислотная последовательность представлена как SEQ ID NO:40.

Аминокислотная последовательность была на 29% идентична на аминокислотном уровне гипотетическому 36,9 кДа-белку Е. coli (номер доступа: SW: P33019).

Это свидетельствует о том, что разрушенный ген, по крайней мере, частично идентичен указанному гену Е. coli. Другие аналогичные последовательности могут быть ассоциированы с вирулентностью.

В тесте на аттенуацию вирулентности было показано, что мутированный микроорганизм был аттенуирован с индексом конкурентоспособности (CI) 0,747.

Пример 15

Нуклеотидная последовательность была на 99% идентична на нуклеотидном уровне последовательности в геноме S. pyogenes, представленной как SEQ ID NO:41. Предсказанная аминокислотная последовательность представлена как SEQ ID NO:42.

Аминокислотная последовательность была на 29% идентична на аминокислотном уровне гипотетическому 89 кДа-белку A. fulgidus (номер доступа: TREMBL: 028425).

Это свидетельствует о том, что разрушенный ген, по крайней мере, частично идентичен указанному гену E.coli. Другие аналогичные последовательности могут быть ассоциированы с вирулентностью.

В тесте на аттенуацию вирулентности было показано, что мутированный микроорганизм был аттенуирован с индексом конкурентоспособности (CI) 0,588.

Пример 16

Нуклеотидная последовательность была на 99% идентична последовательности в геноме S. pyogenes, представленной как SEQ ID NO:43. Предсказанная аминокислотная последовательность представлена как SEQ ID NO:44.

Пример 17

Нуклеотидная последовательность была на 98% идентична последовательности в геноме S. pyogenes, представленной как SEQ ID NO:45. Предсказанная аминокислотная последовательность представлена как SEQ ID NO:46.

Пример 18

Нуклеотидная последовательность была на 97% идентична последовательности в геноме S. pyogenes, представленной как SEQ ID NO:47. Предсказанная аминокислотная последовательность представлена как SEQ ID NO:48.

Пример 19

Нуклеотидная последовательность была на 98% идентична на нуклеотидном уровне последовательности в геноме S. pyogenes, представленной как SEQ ID NO:49. Предсказанная аминокислотная последовательность представлена как SEQ ID NO:50.

Аминокислотная последовательность была на 47% идентична на аминокислотном уровне белку ciaH в S. pneumoniae (номер доступа: SW: Q54955).

Это свидетельствует о том, что разрушенный ген, по крайней мере, частично идентичен гену ciaH S. pneumoniae.

Если принять во внимание сходство гена ciaH S. pyogenes с геном ciaH S. pneumoniae, то следует ожидать, что аналогичные последовательности в других стрептококках и грамположительных бактериях могут быть также ассоциированы с вирулентностью.

В тесте на аттенуацию вирулентности было показано, что мутированный микроорганизм был аттенуирован с индексом конкурентоспособности (CI) 0,205.

Пример 20

Нуклеотидная последовательность была на 98% идентична на нуклеотидном уровне последовательности в геноме S. pyogenes, представленной как SEQ ID NO:51. Предсказанная аминокислотная последовательность представлена как SEQ ID NO:52.

Аминокислотная последо

Ген и белок вирулентности и их использование

Патент 2240327