Гомодимерный слитый белок, имеющий активность ингибитора ангиогенеза (варианты), молекула днк, кодирующая гомодимерный слитый белок, вектор для экспрессии гомодимерного слитого белка, способ трансфекции клетки млекопитающего и способ получения гомодимерного слитого белка

Гомодимерный слитый белок, имеющий активность ингибитора ангиогенеза (варианты), молекула днк, кодирующая гомодимерный слитый белок, вектор для экспрессии гомодимерного слитого белка, способ трансфекции клетки млекопитающего и способ получения гомодимерного слитого белка

Реферат

 

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения слитых белков - ингибиторов ангиогенеза. Слитый белок представляет собой гомодимер, в котором область Fc иммуноглобулина гамма слита с целевым белком, включающим одну или более молекул с активностью ингибитора ангиогенеза, которая происходит от ангиостатина или эндостатина. Вариант гомодимерного слитого белка включает также второй целевой белок, содержащий одну или более молекул, имеющих активность ингибитора ангиогенеза, выбранных из ангиостатина, эндостатина, фрагмента плазминогена, обладающего активностью ангиостатина, и фрагмента коллагена XVIII, обладающего активностью эндостатина. Молекулы в составе гомодимерного слитого белка связаны с областью Fc иммуноглобулина гамма и между собой непосредственно или с помощью полипептидного мостика. Гомодимерный слитый белок получают путем трансфекции клетки млекопитающего вектором, содержащим молекулу ДНК, кодирующую целевой белок, культивирования клетки млекопитающего для продуцирования слитого белка и выделения слитого белка. Изобретение обеспечивает эффективную продукцию и секрецию ингибиторов ангиогенеза в разнообразных хозяевах – клетках млекопитающих, 6 н. и 7 з.п. ф-лы, 6 ил.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится большей частью к способам и структурам для получения и использования слитых белков, содержащих ингибитор ангиогенеза (развития кровеносных сосудов). Более конкретно, изобретение относится к способам и структурам для получения и использования слитых белков, называемых “иммунофузинами”, которые содержат область Fc иммуноглобулина и ингибитор ангиогенеза.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Были открыты два активных ингибитора ангиогенеза: ангиостатин (O’Reilly и др. // Cell. 1994. Т.79. С.315) и эндостатин (O’Reilly и др. // Cell. 1997. Т.88. С. 277). Было обнаружено, что они естественным образом продуцируются первичными опухолями. Оба белка специфически подавляют пролиферацию клеток эндотелия и ингибируют рост опухоли путем блокирования ангиогенеза - образования новых кровеносных сосудов, которые питают опухоль. Исследования показали, что эти ингибиторы ангиогенеза нетоксичны даже в очень высоких дозах и могут подавлять рост метастазов, а первичные опухоли могут регрессировать до размера, неразличимого под микроскопом. Оба ингибитора были идентифицированы как полученные протеолизом фрагменты намного больших интактных молекул. Было обнаружено, что ангиостатин является фрагментом плазминогена, а эндостатин - фрагментом коллагена XVIII.

Эти два белка привлекли пристальное внимание онкологов, так как было показано, что они подавляют у мышей рост многих различных типов опухолей, без видимых побочных эффектов или появления лекарственной устойчивости. Традиционная химиотерапия обычно приводит к приобретенной лекарственной устойчивости, которая главным образом вызвана генетической нестабильностью раковых клеток. Терапия с использованием ингибиторов ангиогенеза действует не столько на раковые клетки, сколько на нормальные клетки эндотелия, которые поддерживают рост опухоли. Поскольку клетки эндотелия генетически стабильны, методы терапии с помощью ингибиторов ангиогенеза могут приводить к меньшей лекарственной устойчивости. Исследования показывают, что лекарственная устойчивость не развивалась у мышей, подвергавшихся длительной антиангиогенной терапии с помощью эндостатина. Более того, повторные циклы лечения мышей эндостатином приводили к длительной “спячке” опухолей, и после прекращения терапии рецидивы опухолей не наблюдались (Boehm и др. // Nature. 1997. Т.390. С.404).

Несмотря на многообещающие результаты исследований на мышах, растворимые активные ангиостатин и эндостатин с квалификацией, пригодной для клинического использования, не удалось получить с помощью систем экспрессии на основе Е.соli, бакуловирусов, клеток дрожжей и млекопитающих. Результатом экспрессии в Е.соli были нерастворимые белковые агрегаты неопределенного состава, непригодные для инъекции людям. Для других способов продукции, включая системы экспрессии на основе бакуловирусов и клеток млекопитающих, был характерен очень низкий уровень продукции рекомбинантных белков (O’Reilly и др. // Cell. 1997. Т.88. С.277).

Низкий выход в использованных до настоящего времени системах экспрессии можно объяснить тем, что и ангиостатин, и эндостатин являются внутренними фрагментами белков намного большего размера. Усеченные белки не могут сворачиваться нужным образом в отсутствие аминокислотных остатков, отсекаемых от молекул-предшественников. Например, ангиостатин содержит 26 остатков цистеина, образующих множественные дисульфидные связи. Экспрессия собственно ангиостатина может не обеспечивать оптимальных условий для того, чтобы эти множественные дисульфидные связи сформировались нужным образом на стадии секреции. Что касается рекомбинантного белка эндостатина, при продуцировании клетками Е.соli он осаждается в ходе диализа - по-видимому, вследствие гидрофобности эндостатина (O’Reilly и др. // Cell. 1997. Т.88. С.277).

Основным препятствием в использовании ангиостатина и эндостатина в их нынешнем виде является то, что для достижения нужного клинического эффекта необходимо ежедневно вводить большие количества белков в течение длительного срока, от нескольких недель до нескольких месяцев. Например, в общепринятых схемах опытов на мышах для получения оптимальной эффективности необходимы дозировки эндостатина 20 мг/кг ежедневно (Boehm и др. // Nature. 1997. Т.390. С.404). Поскольку требуется срочная проверка клинической эффективности эндостатина и ангиостатина, важно разработать способ продукции, дающий большие количества материала клинической квалификации.

Одна из систем экспрессии, используемых для обеспечения высокого уровня экспрессии слитых белков в клетках млекопитающих, представляет собой конструкцию ДНК, которая кодирует сигнальную последовательность, участок Fc (константную часть) иммуноглобулина и целевой белок. Слитый продукт такой конструкции имеет общепринятое название “иммунофузин”. В виде иммунофузинов были успешно экспрессированы несколько целевых белков, включая IL2 (интерлейкин 2), CD26, Tat, Rev, OSF-2, (-IG-H3, рецептор IgE, PSMA и gp120. Эти экспрессируемые конструкции раскрыты в патентах США №5541087 и №5726044, описания которых включены сюда ссылкой.

Основной целью экспрессии рекомбинантных слитых белков в клетках млекопитающих было попытаться придать гибридным молекулам новые или полезные свойства, например нужное сворачивание, повышенную растворимость, специфическое взаимодействие in vivo с цитокином или токсином, связывание с рецептором Fc, фиксацию комплемента, связывание с белком А, увеличенное время полужизни в кровотоке и повышенную способность проникновения через гематоэнцефалический барьер. Примеры рекомбинантных слитых белков, продуцируемых в клетках млекопитающих, включают иммуноконъюгаты цитокинов (Gillies и др. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. Т.89. С.1428; Gillies и др. // Bioconjugate Chemistry. 1993. Т.4. С.230), иммуноадгезины (Capon и др. // Nature. 1989. Т.337. С.525), иммунотоксины (Chaudhary и др. // Nature. 1989. Т.339. С.394) и конъюгат фактора роста нерва (Friden и др. // Science. 1993. Т.259. С.373).

Цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы получить новые ДНК, обеспечивающие эффективную продукцию и секрецию ингибиторов ангиогенеза в разнообразных хозяевах - клетках млекопитающих. Другой целью настоящего изобретения является создание способов лечения животных нуклеиновыми кислотами, которые кодируют, или аминокислотными последовательностями, которые определяют белки-ингибиторы ангиогенеза, включая ненативные, биосинтетические или такие иным образом полученные искусственные белки, как белки, созданные путем рационального конструирования.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение предлагает способы и структуры, пригодные для получения и использования слитых белков, содержащих белок-ингибитор ангиогенеза. Слитые белки способны обеспечить высокий уровень экспрессии биологически активных белков-ингибиторов ангиогенеза. Белки-ингибиторы ангиогенеза могут быть затем отщеплены от слитого белка и объединены с фармацевтически пригодным носителем перед введением млекопитающему, например человеку. В качестве альтернативы нуклеотидные последовательности, кодирующие, или аминокислотные последовательности, определяющие содержащие ингибитор ангиогенеза слитые белки, могут быть объединены с фармацевтически пригодным носителем и введены млекопитающему.

В одном из аспектов изобретение предоставляет молекулы нуклеиновой кислоты, например молекулы ДНК или РНК, кодирующие слитый белок по данному изобретению. Молекула нуклеиновой кислоты кодирует сигнальную последовательность, область Fc (константную часть) иммуноглобулина и по меньшей мере один целевой белок, обозначаемый здесь также как белок-ингибитор ангиогенеза, выбранный из группы, состоящей из ангиостатина, эндостатина, фрагмента плазминогена с активностью ангиостатина, фрагмента коллагена XVIII с активностью эндостатина и их комбинаций. В предпочтительном осуществлении молекула нуклеиновой кислоты кодирует последовательно, в направлении от 5’-конца к 3’-концу, сигнальную последовательность, область Fc иммуноглобулина и последовательность целевого белка. В другом предпочтительном осуществлении молекула нуклеиновой кислоты кодирует последовательно, в направлении от 5’-конца к 3’-концу, сигнальную последовательность, последовательность целевого белка и область Fc иммуноглобулина.

Еще в одном предпочтительном осуществлении область Fc иммуноглобулина содержит шарнирную область иммуноглобулина и предпочтительно содержит по меньшей мере одну константную часть тяжелой цепи иммуноглобулина, например домен 2 константной части тяжелой цепи (CH₂), домен 3 константной части тяжелой цепи (СН₃) и, в зависимости от типа иммуноглобулина, используемого для формирования области Fc, но не обязательно, - домен 4 константной части тяжелой цепи (СН₄). В более предпочтительном осуществлении область Fc иммуноглобулина содержит шарнирную область, домен CH₂ и домен СН ₃. При определенных обстоятельствах область Fc иммуноглобулина предпочтительно лишена домена CH₁. Хотя области Fc иммуноглобулина могут иметь основой любой класс иммуноглобулинов, например IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, предпочтительными являются области Fc иммуноглобулина на основе IgG (гамма-иммуноглобулина).

В ином осуществлении нуклеиновая кислота по настоящему изобретению может быть включена в функциональной связи в способный к репликации экспрессирующий вектор, который затем можно трансфецировать в клетку-хозяин млекопитающего. В другом предпочтительном осуществлении настоящее изобретение предоставляет клетки-хозяева, воспринимающие такие последовательности нуклеиновой кислоты, соответствующие данному изобретению.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к слитому белку, содержащему область Fc иммуноглобулина, соединенную (либо непосредственно пептидной связью, либо через полипептидный мостик) с целевым белком, выбранным из группы, состоящей из ангиостатина, эндостатина, имеющего активность ангиостатина фрагмента плазминогена, имеющего активность эндостатина фрагмента коллагена XVIII, и их комбинаций. Целевой белок может быть сцеплен своим С-концом с N-концом области Fc иммуноглобулина. Однако в более предпочтительном варианте осуществления целевой белок сцеплен своим N-концом с С-концом области Fc иммуноглобулина.

В другом варианте осуществления слитый белок может содержать второй целевой белок, выбранный из группы, состоящей из ангиостатина, эндостатина, имеющего активность ангиостатина фрагмента плазминогена и имеющего активность эндостатина фрагмента коллагена XVIII. В конструкции этого типа первый и второй целевые белки могут быть одним и тем же белком или же разными белками. Например, в предпочтительном осуществлении слитый белок содержит первый целевой белок - ангиостатин, область Fc иммуноглобулина и второй целевой белок - эндостатин. Первый и второй целевые белки могут быть соединены вместе либо непосредственно, либо посредством полипептидного мостика. В качестве альтернативы оба целевых белка могут быть соединены либо непосредственно, либо с помощью полипептидного мостика с областью Fc иммуноглобулина. В последнем случае первый целевой белок присоединен к N-концу области Fc иммуноглобулина, а второй целевой белок присоединен к С-концу области Fc иммуноглобулина.

В другом варианте осуществления два слитых белка могут быть соединены или ковалентно, например, дисульфидной или пептидной связью или нековалентно, с получением мультимерного белка. В предпочтительном варианте осуществления два слитых белка соединены ковалентно с помощью одной или нескольких дисульфидных связей между остатками цистеина, предпочтительно расположенными внутри шарнирных областей иммуноглобулина, находящихся внутри областей Fc иммуноглобулина обоих цепей.

В предпочтительном варианте осуществления целевой белок содержит фрагмент плазминогена, имеющий молекулярный вес около 40 кДа и может содержать аминокислотную последовательность, как указано далее в последовательности SEQ ID NO: 3. В другом предпочтительном варианте осуществления целевой белок содержит фрагмент коллагена XVIII, имеющий аминокислотную последовательность, представленную далее в последовательности SEQ ID NO: 1. Кроме того, целевой белок может быть ангиостатином или эндостатином полной длины или же их биологически активными фрагментами. Источник целевого белка для создания определенных слитых белков зависит от намечаемого использования целевого белка. Например, если целевой белок должен вводиться людям, целевой белок предпочтительно должен быть человеческого происхождения.

В ином аспекте настоящее изобретение предусматривает способы получения слитого белка, содержащего область Fc иммуноглобулина и целевой белок, выбранный из группы, состоящей из ангиостатина, эндостатина, имеющего активность ангиостатина фрагмента плазминогена и имеющего активность эндостатина фрагмента коллагена XVIII. Способ включает этапы: (а) получения клетки млекопитающего, содержащей молекулу ДНК, кодирующую такой слитый белок, с сигнальной последовательностью или без нее, и (б) культивирования клетки млекопитающего для получения слитого белка. Полученный целевой белок может быть затем собран, упорядочен, если необходимо, иным образом и очищен с использованием обычных методов очистки, хорошо известных и используемых в данной области. Если допустить, что слитый белок содержит сайт протеолитического расщепления, расположенный между областью Fc иммуноглобулина и целевым белком, тогда целевой белок может быть выщеплен из слитого белка с помощью обычных протеолитических ферментов и при необходимости очищен перед использованием.

В ином аспекте настоящее изобретение предусматривает способы лечения млекопитающих, например людей, при необходимости применения терапии на основе ингибиторов ангиогенеза. Например, предполагается, что ингибиторы ангиогенеза в соответствии с настоящим изобретением можно вводить людям, имеющим опухоль. Лечение ингибитором ангиогенеза может замедлять или останавливать рост опухоли и, при определенных условиях, может приводить к регрессии опухоли. Лечение может включать введение млекопитающему ингибитора ангиогенеза в количестве, достаточном для замедления или остановки роста опухоли. Ингибитор ангиогенеза может быть в форме слитого белка или в виде нуклеиновой кислоты, предпочтительно функционально соединенной с экспрессирующим вектором, в комбинации с фармацевтически пригодным носителем.

Изложенное выше, а также другие цели, особенности и преимущества настоящего изобретения будут более понятными из нижеследующих подробного описания, графических материалов и формулы.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг.1A-1F представляют собой схематическое изображение типичных слитых белков с ингибитором ангиогенеза, сконструированных в соответствии с настоящим изобретением (см. примеры 10-15). На них изображены следующие конструкции.

Фиг.1А: Fc-1-й домен Крингла (Kringle) ангиостатина;

Фиг.1В: Fc-внутренняя часть 1-го домена Крингла ангиостатина;

Фиг.1С: Fc-эндостатин-мостик Gly-Ser (глицин-серин)-внутренняя часть 1-го домена Крингла ангиостатина;

Фиг.1D: Fc-эндостатин-мостик Gly-Ser-1-й домен Крингла ангиостатина;

Фиг.1Е: Fc-эндостатин-мостик Gly-Ser-ангиостатин;

Фиг.1F: ангиостатин-Рс-эндостатин.

Вертикальными линиями обозначены возможные дисульфидные связи, соединяющие остатки цистеина (С), находящиеся внутри шарнирной области молекулы Fc.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение предусматривает слитые белки, называемые здесь иммунофузинами, которое пригодны для производства в коммерческих количествах ингибиторов ангиогенеза с квалификацией, пригодной для клинического применения. Ингибиторы ангиогенеза перед использованием могут быть отщеплены от белковой конструкции иммунофузина. Однако предполагается, что иммунофузины или нуклеиновые кислоты, кодирующие иммунофузины, можно прямо вводить млекопитающим при необходимости лечения ингибитором ангиогенеза.

Поэтому настоящее изобретение предусматривает слитые белки, содержащие область Fc иммуноглобулина и по меньшей мере один целевой белок, называемый здесь ингибитором ангиогенеза. Ингибитор ангиогенеза предпочтительно выбран из группы, состоящей из ангиостатина, эндостатина, имеющего активность ангиостатина фрагмента плазминогена, имеющего активность эндостатина фрагмента коллагена XVIII. Предполагается однако, что и другие полипептиды, имеющие активность ингибитора ангиогенеза, которые известны в настоящее время или будут открыты позднее, могут быть экспрессированы как слитые белки описанного здесь типа.

Фиг.1A-1F иллюстрируют шесть типичных вариантов осуществления белковых конструкций, воплощающих настоящее изобретение. Поскольку предпочтительными являются димерные конструкции, все они изображены как димеры, сшитые парой дисульфидных связей между цистеинами, расположенными на соседствующих субъединицах. На чертежах показаны дисульфидные мостики, которые связывают участки двух областей Fc иммуноглобулина в шарнирной области иммуноглобулина и, таким образом, являются характерными для нативных форм этих молекул. Хотя конструкции, содержащие шарнирную область Fc, предпочтительны и многообещающи как терапевтические агенты, изобретение предполагает, что при необходимости может быть выбрана сшивка в других местах. Кроме того, при некоторых обстоятельствах димеры или мультимеры, полезные в практике применения изобретения, могут быть получены путем нековалентного связывания, например с помощью гидрофобных взаимодействий.

Так как гомодимерные конструкции являются важными вариантами осуществления изобретения, Фиг.1 иллюстрирует такие конструкции. Следует подчеркнуть, что гетеродимерные конструкции также пригодны, но они, как это известно специалистам в данной области, часто могут плохо поддаваться очистке. Однако могут быть сконструированы пригодные для ингибирования ангиогенеза у различных видов млекопитающих жизнеспособные конструкции, представляющие собой смесь гомодимеров и гетеродимеров. Например, одна цепь гетеродимерной структуры может содержать эндостатин, а другая может содержать ангиостатин.

На Фиг.1А представлена димерная конструкция, полученная в соответствии с процедурой, описанной далее в примере 10. Каждый мономер димера содержит область Fc иммуноглобулина (1), включающую шарнирную область, домен СН ₂ и домен СН₃. Непосредственно к С-концу области Fc (1) прикреплен первый участок Крингла ангиостатина (2), включающий и внутреннее, и внешнее кольца. На Фиг.1В представлен второй вариант осуществления изобретения (см. пример 11). В нем имеется такая же область Fc, как на Фиг.1А, но на этот раз к С-концу области Fc (1) присоединено только внутреннее кольцо первой области ангиостатина (3). Фиг. с 1С по 1Е показывают различные варианты осуществления белковых конструкций в соответствии с настоящим изобретением, которые включают в качестве целевого белка несколько ингибиторов ангиогенеза, расположенных тандемом и соединенных мостиком. На Фиг.1С целевой белок содержит эндостатин полной длины (4), полипептидный мостик (5) и внутреннее кольцо первого участка Крингла ангиостатина (3). Фиг.1D показывает белок, содержащий такую же область Fc, как на Фиг.1А, и целевой белок, содержащий эндостатин полной длины (4), полипептидный мостик (5) и полную область 1-го участка Крингла ангиостатина (как внутреннее, так и внешнее кольца) (2). Фиг.1Е отличается от конструкции, изображенной на Фиг.1D, тем, что большая часть домена С-концевой части белка представляет собой копию ангиостатина полной длины (7).

Хотя Фиг.1А-1Е представляют конструкции типа Fc-X, где Х - целевой белок, предполагается, что конструкции типа X-Fc могут также быть полезными в практике осуществления изобретения. Кроме того, предполагается, что полезные белки в соответствии с настоящим изобретением могут быть обозначены также формулой X-Fc-X, где знаки Х могут обозначать одни и те же или различные целевые белки. Фиг.1F показывает такую конструкцию, которая содержит в направлении от N-конца к С-концу ангиостатин человека полной длины (7), область Fc иммуноглобулина человека (6), включая шарнирную область, и домен эндостатина человека полной длины (4).

Термин “ингибитор ангиогенеза”, как он использован здесь, обозначает любую полипептидную цепь, которая уменьшает или подавляет у млекопитающего образование новых кровеносных сосудов. При противораковой терапии ингибитор ангиогенеза уменьшает или подавляет образование новых кровеносных сосудов в или на опухоли, предпочтительно в или на солидной опухоли. Предполагается, что с помощью различных хорошо известных методов анализа можно идентифицировать и использовать в данной области полезные ингибиторы ангиогенеза. Такие методы анализа включают, например, тест на пролиферацию клеток эндотелия капилляров крупного рогатого скота, анализ с помощью хориоаллантоисной мембраны кур (ХАМ) или анализ на роговой оболочке глаз мышей. Однако предпочтителен анализ на ХАМ (см., например, работы O’Reilly и др. // Cell. 1994. Т.79. С.315-328 и O’Reilly и др. // Cell. 1997. Т.88. С.277-285, изложение которых включено сюда ссылкой). Вкратце, зародыши с интактными желтками извлекали из трехдневных оплодотворенных белых яиц и помещали в чашки Петри. После инкубации в течение 3 дней при 37°С в атмосфере 3% СО₂ к хориоаллантоисной мембране индивидуального зародыша прикладывали метилцеллюлозный диск с нанесенным на него предполагаемым ингибитором ангиогенеза. После инкубации в течение приблизительно 48 час хориоаллантоисные мембраны исследовали под микроскопом на наличие зон ингибирования.

Предпочтительными ингибиторами ангиогенеза, пригодными в практике использования настоящего изобретения, являются, например, ангиостатин (O’Reilly и др. // Cell. 1994. Т.79. С.315-328 и патенты США №5733876, 5837682 и 5885795) и эндостатин (O’Reilly и др. // Cell. 1997. Т.88. С.277-285 и патент США №5854205). Как установлено ранее, ангиостатин и эндостатин являются специфическими ингибиторами пролиферации клеток эндотелия и способны подавлять рост опухолей путем блокирования ангиогенеза, то есть образования новых кровеносных сосудов, питающих опухоли.

Ангиостатин был идентифицирован как протеолитический фрагмент плазминогена (O’Reilly и др. // Cell. 1994. Т.79. С.315-328 и патенты США №5733876, 5837682 и 5885795, изложение которых включено сюда ссылкой). Конкретно, ангиостатин - это внутренний фрагмент плазминогена с молекулярной массой 38 кДа, содержащий по меньшей мере три из областей Крингла плазминогена. Эндостатин был идентифицирован как протеолитический фрагмент коллагена XVIII (O’Reilly и др. // Cell. 1997. Т.88. С.277-285 и патент США №5854205, изложение которых включено сюда ссылкой). Конкретно, эндостатин является С-концевым фрагментом коллагена XVIII с молекулярной массой 20 кДа. Термины “ангиостатин” и “эндостатин”, как они использованы здесь, означают не только белки полной длины, но также и их варианты и биологически активные фрагменты, а также биологически активные фрагменты соответственно плазминогена и коллагена XVIII. Термин “биологически активный фрагмент” в применении к ангиостатину обозначает любой белковый фрагмент плазминогена или ангиостатина, который имеет по меньшей мере 30%, более предпочтительно по меньшей мере 70% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% активности ангиостатина полной длины, определенной тестом в ХАМ. Термин “биологически активный фрагмент” в применении к эндостатину обозначает любой белковый фрагмент коллагена XVIII или эндостатина, который имеет по меньшей мере 30%, более предпочтительно по меньшей мере 70% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% активности эндостатина полной длины, определенной тестом в ХАМ.

Термин “варианты” включает особые разновидности и аллельные варианты, а также другие существующие в природе или возникающие отличным от природного способа варианты, например полученные обычными генетико-инженерными методами, которые по меньшей мере на 70% подобны или на 60% идентичны, более предпочтительно по меньшей мере на 75% подобны или на 65% идентичны, а наиболее предпочтительно по меньшей мере на 80% подобны или на 70% идентичны любой из существующих природных последовательностей эндостатина или ангиостатина, раскрытых здесь.

Чтобы определить, имеет ли рассматриваемый полипептид требуемую степень подобия или идентичности с полипептидом сравнения (референсным полипептидом), прежде всего проводят параллельное сопоставление рассматриваемой аминокислотной последовательности и аминокислотной последовательности сравнения, используя алгоритм динамического программирования, описанный в работе Smith и Waterman // J. Mol. Biol. 1981. Т.147. С.195-197, в комбинации с матрицей замещения BLOSUM62, описанной на Фиг.2 работы Henikoff и Henikoff “Amino acid substitution matrices from protein blocks” // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. Т.89. С.10915-10919. Для настоящего изобретения подходящее значение критерия недостоверности заполнения пробела равно - 12, а подходящее значение критерия недостоверности удлинения просвета равно - 4. Компьютерные программы, выполняющие параллельные сопоставления последовательностей с использованием алгоритма Смита-Уотермана (Smith-Waterman) и матрицы BLOSUM62, например программное обеспечение GCG (Oxford Molecular Group, Oxford, Англия), являются коммерческой продукцией и широко используются специалистами в данной области.

После того как проведено параллельное сопоставление рассматриваемой и референсной последовательностей, можно рассчитать величину процента подобия. Последовательно сопоставляются индивидуальные аминокислоты в каждой последовательности с определением их подобия друг другу. Если значение матрицы BLOSUM62, соответствующее двум сопоставляемым аминокислотам, равно нулю или является отрицательной величиной, то подобие в пределах пары обозначается как ноль. В ином случае подобие в пределах пары обозначается как 1,0. Общее значение подобия является суммой подобий в пределах пар для сопоставляемых параллельно аминокислот. Затем общее значение подобия нормализуют путем его деления на число аминокислот в меньшей рассматриваемой или в референсной последовательности. Нормализованное общее значение и представляет собой процент подобия. В качестве альтернативы для вычисления процента идентичности снова поочередно сопоставляют выстроенные в ряд параллельно аминокислоты каждой последовательности. Если аминокислоты не идентичны, значение идентичности в пределах пары равно нулю; в ином случае значение идентичности в пределах пары равно 1,0. Общее значение идентичности является суммой идентичных выстроенных в ряд параллельно аминокислот. Затем общее значение идентичности нормализуют путем его деления на число аминокислот в меньшей рассматриваемой или в референсной последовательности. Нормализованное общее значение и представляет собой процент идентичности. Для вычисления процента подобия и идентичности вставками и делециями пренебрегают. Соответственно, в этих вычислениях не используют величины критерия недостоверности заполнения пробела, хотя они используются при первичном выстраивании последовательностей.

Заявленные здесь целевые белки экспрессируются как слитые белки, имеющие область Fc иммуноглобулина. Как известно, константная часть каждой тяжелой цепи иммуноглобулина состоит из 4 или 5 доменов. Домены обозначаются последовательно следующим образом: СН₁-шарнир-СН₂-СН₃(-СН₄ ). Последовательности ДНК доменов тяжелой цепи имеют перекрестную гомологию среди классов иммуноглобулинов, например домен CH ₂IgG гомологичен домену CH₂IgA и IgD, а также домену СН₃IgM и IgE.

Понятно, что в использованном здесь смысле термин “область Fc иммуноглобулина” означает часть карбоксильного конца константной области цепи иммуноглобулина, предпочтительно константной области тяжелой цепи иммуноглобулина, или ее части. Например, область Fc иммуноглобулина может содержать (1) домен CH₁, домен CH₂ и домен СН ₃; (2) домен CH₁ и домен СН₂; (3) домен CH₁ и домен СН₃; (4) домен CH ₂ и домен СН₃ или (5) комбинацию двух или более доменов и шарнирную область иммуноглобулина. В предпочтительном осуществлении область Fc, отраженная в конструкции ДНК, включает по меньшей мере шарнирную область иммуноглобулина, домен CH ₂ и домен СН₃ и предпочтительно лишена по меньшей мере домена CH₁.

Общепринято, что предпочтительным классом иммуноглобулина, из которого происходит константная область тяжелой цепи, является IgG (Ig) ( подклассы 1, 2, 3 или 4). Могут быть использованы другие классы иммуноглобулинов: IgA (Ig), IgD (Ig), IgE (Ig) и IgM (Ig). Выбор подходящих константных областей тяжелой цепи иммуноглобулина подробно описан в патентах США №5541087 и 5726044. Считается, что квалификация специалистов в данной области достаточна при выборе конкретных последовательностей константной области тяжелой цепи иммуноглобулина среди определенных классов и подклассов иммуноглобулинов для достижения конкретного результата. Часть конструкции ДНК, кодирующая область Fc иммуноглобулина, предпочтительно содержит последовательности по меньшей мере для части шарнирного домена и по меньшей мере части домена СН₃ области Fс или гомологичных доменов любого иммуноглобулина из IgA, IgD, IgE или IgM.

В зависимости от применения могут быть использованы гены константной области не только человека, но и других видов, например мыши или крысы. Обычно область Fc, используемая как партнер для соединения в ДНК-конструкции для иммунофузина, может происходить из любого вида млекопитающих. В том случае, когда нежелательно получение в клетке-хозяине или в животном иммунного ответа на область Fc, область Fc может происходить из того же вида, что и клетка-хозяин или животное. Например, если животное-хозяин или клетка-хозяин - человек, можно использовать Fc человека; подобным же образом в том случае, когда животное-хозяин или клетка-хозяин - мышь, можно использовать мышиный Fc. Кроме того, можно использовать также замещение или делецию конструкций этих константных областей, где один или более аминокислотных остатков доменов константной области замещены или делетированы. Одним из примеров может служить введение аминокислотных замен в верхнюю область CH₂ для получения варианта Fc с пониженным сродством к рецепторам Fc (Cole и др. // J. Immunol. 1997. Т.159. С.3613). Имеющие обычный опыт в данной области могут приготовить такие конструкции, применяя хорошо известные методы молекулярной биологии.

Использование Fc1 человека в качестве последовательности области Fc имеет несколько преимуществ. Например, если слитый белок, содержащий ингибитор ангиогенеза вместе с Fc, должен быть использован как биологически активное лекарство, домен Fc1 может придавать слитому белку активность в смысле эффекторных функций. Такие эффекторные функции включают такие типы биологической активности, как связывание комплемента, реализуемую через антитела клеточную цитотоксичность, транспорт в плаценте и увеличенное время полужизни в сыворотке. Домен Fc делает возможным также обнаружение методом твердофазного иммуноферментного анализа ELISA и очистку связыванием с белком A Staphylococcus aureus (Protein А). В некоторых применениях, однако, может оказаться желательным снять с области Fc некоторые эффекторные функции, такие, как связывание с рецепторами Fc или связывание комплемента.

В случае иммунофузинов - ингибиторов ангиогенеза одной из функций Fc иммуноглобулина в качестве партнера по связыванию является стимуляция должного сворачивания белка - ингибитора ангиогенеза для получения активного белка - ингибитора ангиогенеза и для придания активным компонентам растворимости, хотя бы во внеклеточной среде. Поскольку Fc как партнер по слиянию гидрофилен, иммунофузин с ингибитором ангиогенеза хорошо растворим, в отличие, например, от рекомбинантного эндостатина, продуцируемого в Е.coli (O’Reilly // Cell. 1997. Т.88. С.277). Во всех приведенных здесь примерах были получены высокие уровни продукции иммунофузинов. Иммунофузины - ингибиторы ангиогенеза выделялись (секретировались) в среду с концентрацией обычно в пределах от 30 до 100 мкг/мл и могли быть с успехом очищены до гомогенности с помощью хроматографии с белком А. Кроме того, иммунофузины - ингибиторы ангиогенеза можно было расщепить и дополнительно очистить с помощью стандартных методов очистки, включающих, например, очистку на гепарин-сефарозе, лизин-сефарозе или аффинную очистку.

В дополнение к высоким уровням экспрессии слитые белки в соответствии с настоящим изобретением обнаруживают также более длительное время полужизни в сыворотке, по-видимому, благодаря большему размеру их молекул. Например, ангиостатин человека, связанный с Fc человека, имеет время полужизни в сыворотке мыши 33 ч, а ангиостатин человека 4-6 ч (O’Reilly и др. // Nature Medicine. 1996. Т.2. С.689). Считается, что ангиостатин с молекулярным весом 40 кДа и эндостатин с молекулярным весом 20 кДа, благодаря их малому размеру, быстро выводятся из организма путем фильтрации через почки. Напротив, димерные формы Fc-ангиостатина и димерный Fc-эндостатин имеют молекулярный вес соответственно 145 и 100 кДа, поскольку имеются две области Fc иммуноглобулина, связанные либо с двумя молекулами ангиостатина, либо с двумя молекулами эндостатина. Такая бивалентная конструкция может проявлять более высокую активность в связывании с рецепторами ангиостатина или эндостатина. Если активность в подавлении ангиогенеза осуществляется через рецепторы, слитые белки, содержащие Fc, потенциально более эффективны в подавлении опухолей, чем моновалентный ангиостатин или моновалентный эндостатин сами по себе. Кроме того, если ангиостатин и/или эндостатин принадлежат к классу димерных белковых лигандов, физическое воздействие, оказываемое Fc на ангиостатин или эндостатин, будет превращать димеризацию во внутримолекулярный процесс, сдвигая таким образом равновесие в сторону образования димера и усиливая его связывание с рецептором. Для стабилизации димера путем образования ковалентных дисульфидных связей в мономер с помощью стандартной технологии рекомбинантной ДНК могут быть введены в подходящих местах остатки цистеина.

В том смысле, как он использован здесь, термин “мультивалентный” обозначает рекомбинантную