Способ введения dsрнк или днк, способной к продуцированию dsрнк в c.elegans (варианты), способ негативной регуляции экспрессии интересующего гена в c.elegans (варианты)

Способ введения dsрнк или днк, способной к продуцированию dsрнк в c.elegans (варианты), способ негативной регуляции экспрессии интересующего гена в c.elegans (варианты)

Реферат

 

Изобретение касается характеристики или идентификации функции гена с использованием ингибирования двунитевой РНК (dsРНК). Предложены способ введения dsРНК или ДНК, способной к продуцированию dsРНК, в C.elegans (варианты) и способ негативной регуляции экспрессии интересующего гена в C.elegans (варианты). Предложенные способы предусматривают введение в C.elegans dsРНК или ДНК, способную к продуцированию dsРНК, в результате экспрессии которой происходит ингибирование экспрессии мишеневого гена. Изобретение позволяет проводить исследования, касающиеся установления функции мишеневых генов, и может быть использовано в генной инженерии. 8 c. и 90 з.п. ф-лы, 19 ил.

Настоящее изобретение касается характеристики или идентификации функции гена с использованием ингибирования двунитевой РНК (dsPHKi) и способов идентификации ДНК, ответственной за индукцию конкретного фенотипа в клетке, а также способа определения функции последовательностей известных генов.

Недавно в Nature Vol. 391, pp. 806-811, February 98, было описано, что введение двунитевой РНК в клетку приводит к сильной и специфичной интерференции с экспрессией эндогенных генов в этой клетке, причем эта интерференция является по существу более эффективной, чем обеспечиваемая одной из двух нитей РНК индивидуально, как предполагается в антисмысловой (antisense) технологии. Было также обнаружено, что у червя нематоды Caenorhabditis elegans (C.elegans) это специфичное ослабление активности гена происходит, когда РНК вводят в геном или в полость тела этого червя.

Авторы настоящего изобретения использовали эту методику, а затем применили ее для разработки новых и имеющих изобретательский уровень способов определения функций генов или фрагментов ДНК, которые секвенированы в различных проектах, таких как, например, проект генома человека, и которые еще нужно согласовывать с конкретной функцией, а также для использования при идентификации ДНК, ответственной за придание конкретного фенотипа.

Таким образом, согласно первому аспекту настоящего изобретения предложен способ идентификации ДНК, ответственной за придание фенотипа клетке, при котором а) конструируют кДНК или геномную библиотеку ДНК указанной клетки в ориентации относительно промотора (промоторов), способного поддерживать транскрипцию указанной кДНК или ДНК на двунитевую (ds) РНК при связывании соответствующего фактора транскрипции с указанным промотором (промоторами), б) вводят указанную библиотеку в одну или более чем одну из указанных клеток, содержащих указанный фактор транскрипции, и в) идентифицируют и выделяют желаемый фенотип указанной клетки, содержащей указанную библиотеку, и идентифицируют фрагмент ДНК или кДНК из указанной библиотеки, ответственный за придание указанного фенотипа.

В предпочтительном воплощении изобретения перед стадией б) эта библиотека может быть организована в иерархические пулы, как описано более детально в предложенных примерах, так, чтобы она включала в себя, например, семейства генов.

Согласно следующему аспекту изобретения предложен также способ определения функции известной последовательности ДНК, при котором а) идентифицируют гомолог (гомологи) указанной ДНК в клетке, б) выделяют гомолог (гомологи) соответствующей ДНК или его фрагмент из указанной клетки, в) клонируют указанный гомолог или его фрагмент в соответствующий вектор в ориентации относительно промотора (промоторов), способного поддерживать транскрипцию dsPHK при связывании соответствующего фактора транскрипции с указанными промоторами, г) вводят указанный вектор в указанную клетку со стадии а), содержащую указанный фактор транскрипции, и д) идентифицируют фенотип указанной клетки по сравнению с диким типом.

В каждом аспекте изобретения нуклеотидная или ДНК последовательность может быть представлена либо в смысловой, либо в антисмысловой ориентации относительно одиночного промотора, который обладает свойствами, определенными выше, или альтернативно она может быть представлена между двумя идентичными промоторами. В обоих воплощениях dsPHK обеспечивается транскрипцией, инициируемой с этого промотора после его связывания с соответствующим фактором транскрипции.

Клетка согласно изобретению либо может быть выделена из организма, либо может содержаться в организме. Когда клетка содержится в организме, этот организм может быть адаптирован к экспрессии соответствующего фактора транскрипции. Этот организм может представлять собой любой из следующих: растение, животное, гриб или дрожжи, но предпочтительно может представлять собой червя нематоду C.elegans, который может представлять собой любое из следующего: дикий тип, мутант nuc-1 или pha-ts C.elegans или комбинацию указанных мутаций. В альтернативном воплощении ДНК или кДНК библиотеку, либо гомолог ДНК или его фрагмент можно предпочтительно трансфецировать или трансформировать в микроорганизм, такой как бактериальная или дрожжевая клетка, который можно скармливать организму, который предпочтительно представляет собой червя нематоду C.etegans. В данном воплощении изобретения микроорганизм может быть адаптирован к экспрессии соответствующего фактора транскрипции. Предпочтительно этот микроорганизм представляет собой E.coli.

В каждом аспекте изобретения ДНК библиотеку, гомолог ДНК или фрагмент ДНК можно конструировать в подходящем ДНК векторе, который содержит последовательность нуклеотидов, которая кодирует указанный фактор транскрипции. Альтернативно указанный фактор транскрипции кодируется дополнительным вектором. Даже в следующем альтернативном воплощении клетка или организм могут либо экспрессировать, либо быть адаптированными к экспрессии указанного фактора транскрипции. Предпочтительно, любой из векторов, используемых в способе согласно изобретению, содержит селективный маркер, который может представлять собой, например, нуклеотидную последовательность, кодирующую sup-35 или его фрагмент. Эту нуклеотидную последовательность можно ориентировать относительно промотора так, что связывание фактора транскрипции с этим промотором инициирует транскрипцию ДНК на двунитевую РНК. На фиг.10 проиллюстрированы векторы и ориентация последовательности ДНК, которая обеспечивает продуцирование двунитевой РНК в C.etegans. Таким образом, в одном воплощении ДНК локализована между двумя промоторами на векторе, способном экспрессировать dsPHK при связывании соответствующего фактора транскрипции с указанными промоторами. Альтернативно этот вектор содержит две копии последовательности ДНК, организованные в смысловой и в антисмысловой ориентации относительно промотора, и причем этот маркер является селективным, когда содержится в мутанте pha-1 C.elegans. Предпочтительно эти промоторы представляют собой любые из Т7, Т3 или SP6 промоторов, и фактор транскрипции включает в себя соответствующую полимеразу.

Предпочтительно селективный маркер включает в себя нуклеотидную последовательность, способную ингибировать или предотвращать экспрессию гена в указанной клетке, причем этот ген является ответственным за придание известного фенотипа. Эта нуклеотидная последовательность может представлять собой участок указанного гена, либо быть идентичной указанному гену, который придает указанный фенотип, причем эта нуклеотидная последовательность сама по себе ориентирована относительно подходящего промотора (промоторов), способного инициировать транскрипцию двунитевой РНК при связывании соответствующего фактора транскрипции с указанным промотором (промоторами). Альтернативно эта нуклеотидная последовательность может представлять собой участок указанной последовательности гена или быть идентичной указанной последовательности гена, который придает указанный фенотип, причем эта нуклеотидная последовательность является такой, что дает возможность интеграции указанного подходящего или дополнительного вектора посредством гомологичной рекомбинации в геном указанной клетки, и после указанной интеграции указанная нуклеотидная последовательность способна ингибировать экспрессию указанной последовательности гена, придающего указанный фенотип. В данном воплощении указанная нуклеотидная последовательность содержит стоп-кодоны, достаточные для предотвращения трансляции указанной нуклеотидной последовательности после ее интеграции в указанный геном.

Предпочтительно при указанном способе к указанной клетке или организму можно добавлять соединения в целях скрининга на желаемые фенотипы, такие как, например, устойчивость или чувствительность к этому соединению по сравнению с диким типом. Промоторы предпочтительно являются индуцируемыми. Фактор транскрипции в некоторых воплощениях может иметь фаговое происхождение, как, например, Т7 полимераза, управляемая фаговым промотором. Однако когда используют C.elegans, можно применять специфичный для червей или тканеспецифичный промотор, такой как, например, let858, SERCA, UL6, myo-2 или myo-3. Предпочтительно штамм E.coli представляет собой штамм, отрицательный по РНКазе III, и даже более предпочтительно представляет собой РНКазо-отрицательный штамм.

В следующем аспекте настоящего изобретения предложен способ создания трансгенного организма, не являющегося человеком, содержащего экзогенный фактор транскрипции и трансген, содержащий промотор, операбельно сцепленный с фрагментом ДНК, который экспрессируется при связывании с ним указанного фактора транскрипции, при котором: а) получают первый трансгенный организм, содержащий первую конструкцию, включающую в себя ДНК, кодирующую экзогенный фактор транскрипции, и второй трансгенный организм, содержащий вторую конструкцию, включающую в себя по меньшей мере один промотор, операбельно сцепленный с желаемой последовательностью ДНК, которая экспрессируется при связывании с ним фактора транскрипции указанного первого трансгенного организма, б) скрещивают указанные первый и второй трансгенные организмы и отбирают потомство, экспрессирующее указанную желаемую последовательность ДНК. В одном воплощении указанные первый и второй трансгенные организмы создают посредством трансформации указанных первой и второй конструкций в соответствующие микроорганизмы для последующего скармливания соответствующему организму. Предпочтительно указанная вторая конструкция содержит указанную желаемую последовательность ДНК в такой ориентации относительно указанного промотора, чтобы он был способен инициировать транскрипцию указанной ДНК в dsPHK при связывании с ним указанного фактора транскрипции. В данном воплощении указанная вторая конструкция содержит два промотора, фланкирующие указанную желаемую последовательность ДНК, причем эти промоторы могут инициировать транскрипцию указанной последовательности ДНК в dsPHK при связывании указанного фактора транскрипции с указанными промоторами. Альтернативно указанная последовательность ДНК представлена в смысловой и в антисмысловой ориентации относительно указанного промотора так, чтобы продуцировать dsPHK при связывании этого фактора транскрипции с этими промоторами. В каждом из этих воплощений первую и/или вторую конструкции можно предпочтительно обеспечивать репортерным геном, операбельно сцепленным с промотором, который способен инициировать транскрипцию указанного репортерного гена при связывании с ним указанного фактора транскрипции. Предпочтительно этот репортерный ген кодирует любое из следующего: люцифераза, зеленый флуоресцентный белок, -галактозидаза или -лактамаза.

В настоящее изобретение также включен способ оценивания клонов, идентифицированных в экспериментах с дрожжевыми двухгибридными векторами, причем эти эксперименты хорошо известны специалистам в данной области и были впервые предложены Chien et al. (1991) для обнаружения белок-белковых взаимодействий. При этом способе согласно изобретению обеспечивают конструкцию, включающую в себя ДНК, кодирующую белок, идентифицированный в эксперименте с двухгибридным вектором, причем эта конструкция является такой, что указанная ДНК представлена в ориентации относительно одного или более чем одного промотора, способного поддерживать транскрипцию указанной ДНК в двунитевую РНК при связывании соответствующего фактора транскрипции с указанными промоторами; трансформируют клетку, такую как бактериальная клетка, или альтернативно трансформируют организм, содержащий указанный фактор транскрипции, указанными конструкциями, и идентифицируют фенотипическое изменение в указанной клетке или в указанном организме, который может представлять собой C.elegans или тому подобный, по сравнению с диким типом. Предпочтительно этот фактор транскрипции является индуцируемым в этой клетке или в этом организме. Еще раз, эта последовательность ДНК может быть локализована либо между двумя промоторами, либо в обеих ориентациях, как смысловой, так и антисмысловой, относительно одиночного промотора, как описано выше. Предпочтительно этот промотор представляет собой промотор фаговой полимеразы, а указанный фактор транскрипции представляет собой РНК-полимеразу, и предпочтительно Т7 полимеразу. В объем настоящего изобретения также включены векторы, используемые для трансформации указанных клеток или указанных организмов, а также сами эти клетки или организмы.

В следующем аспекте настоящего изобретения предложен способ облегчения инвазии растений вредителями, при котором а) идентифицируют последовательность ДНК от указанного вредителя, которая является критической для его выживания, роста, пролиферации или воспроизводства, б) клонируют указанную последовательность со стадии а) или ее фрагмент в подходящий вектор относительно одного или более чем одного промотора, способного транскрибировать указанную последовательность в РНК или dsPHK при связывании соответствующего фактора транскрипции с указанными промоторами, и в) вводят указанный вектор в растение.

Таким образом, предпочтительно, способ согласно изобретению обеспечивает особенно селективный механизм облегчения инвазии вредителями и в некоторых случаях паразитарной инвазии растений так, что когда вредитель питается на растении, он будет ферментативно расщеплять экспрессируемую dsPHK в этом растении, таким образом ингибируя экспрессию ДНК внутри этого вредителя, которая является критической для его роста, выживания, пролиферации или воспроизводства. В предпочтительном воплощении вредитель может представлять собой любой из следующих: Tylenchulus ssp., Radopholus ssp., Rhadinaphelenchus ssp., Heterodera ssp., Rotylenchulus ssp., Pratylenchus ssp., Belonolaimus ssp., Canjanus ssp., Meloidogyne ssp., Globodera ssp., Nacobbus ssp., Ditylenchus ssp., Aphelenchoides ssp., Hirschmenniella ssp., Anguina ssp., Hoplolaimus ssp., Heliotylenchus ssp., Criconemella ssp., Xiphinema ssp., Longidorus ssp., Trichodorus ssp., Paratrichodorus ssp., Aphelenchs ssp. Последовательность ДНК или ее фрагмент согласно данному аспекту изобретения можно клонировать между двумя тканеспецифичными промоторами, как, например, между двумя корнеспецифичными промоторами.

Следующий аспект изобретения касается вектора, используемого в каждом из способов по изобретению для конструирования указанной библиотеки, причем этот вектор содержит два идентичных промотора, ориентированных так, что они способны инициировать транскрипцию последовательности ДНК, локализованной между указанными промоторами, в dsPHK при связывании соответствующего фактора транскрипции с указанными промоторами. Эта последовательность ДНК может, например, включать в себя множественный сайт клонирования. Предпочтительно этот вектор экспрессии содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую селективный маркер. В одном воплощении эта нуклеотидная последовательность, кодирующая указанный селективный маркер, локализована между двумя идентичными промоторами, ориентированными так, что они способны инициировать транскрипцию ДНК, локализованной между указанными промоторами, на двунитевую РНК при связывании соответствующего фактора транскрипции с указанными промоторами. Предпочтительно этот селективный маркер включает в себя нуклеотидную последовательность, кодирующую sup-35, для введения в C.elegans, имеющий мутацию pha-1.

Предпочтительно фактор транскрипции включает в себя фаговую полимеразу, которая связывается либо с соответствующим фаговым промотором, либо со специфичным для C.elegans промотором, и даже более предпочтительно Т7 полимеразу. Предпочтительно вектор включает в себя множественный сайт клонирования между указанными идентичными промоторами.

В следующем аспекте изобретения предложен вектор экспрессии для экспрессии соответствующего фактора транскрипции для использования в способе согласно изобретению, причем этот вектор содержит последовательность нуклеотидов, кодирующую указанный фактор транскрипции, операбельно сцепленную с подходящими последовательностями регуляции экспрессии. Предпочтительно эти последовательности регуляции экспрессии включают в себя промоторы, которые представляют собой индуцируемые, конститутивные, общие или тканеспецифичные промоторы, либо их комбинации. Предпочтительно фактор транскрипции включает в себя фаговую полимеразу, и предпочтительно Т7, Т3 или SP6 РНК-полимеразу.

В следующем аспекте изобретения предложена селективная система для идентификации трансформации клетки или организма вектором согласно изобретению, причем эта система включает в себя вектор согласно изобретению, где указанный селективный маркер включает в себя нуклеотидную последовательность, способную ингибировать или предотвращать экспрессию гена в указанной клетке или в указанном организме, причем этот ген является ответственным за придание известного фенотипа. Предпочтительно указанная нуклеотидная последовательность соответствует участку указанного гена или является идентичной указанному гену, который придает указанный известный фенотип, и причем сама эта нуклеотидная последовательность локализована между двумя идентичными промоторами, способными инициировать транскрипцию двунитевой РНК при связывании с ними соответствующего фактора транскрипции. Альтернативно эта нуклеотидная последовательность включает в себя нуклеотидную последовательность, которая представляет собой участок указанной последовательности гена или является идентичной указанной последовательности гена, который придает известный фенотип указанной клетке или указанному организму, и которая является такой, что после интеграции указанного вектора посредством гомологичной рекомбинации в хромосому указанной клетки или указанного организма указанная последовательность ингибирует экспрессию указанной последовательности гена, придающего указанный известный фенотип. Предпочтительно согласно этому воплощению эта нуклеотидная последовательность содержит стоп-кодоны, достаточные для предотвращения трансляции этой нуклеотидной последовательности после интеграции в указанную хромосому. Предпочтительно последовательность известного гена включает в себя ген sup-35 или его фрагмент, который является селективным при идентификации потомства, растущего при температуре выше 25°С, после введения в мутант pha-1 et123ts червя C.elegans.

В следующем аспекте изобретения предложена указанная последовательность известного гена, включающая в себя ген sup-35 или его фрагмент, который является селективным при идентификации потомства, растущего при температуре выше 25°С, после введения указанного вектора в мутант pha-1 et123ts червя C.elegans. В еще одном аспекте предложен способ определения функции последовательности ДНК многоклеточного организма, при котором а) обеспечивают i) конструкцию, содержащую фрагмент указанной ДНК, клонированный между двумя промоторами, способными поддерживать транскрипцию в указанном многоклеточном организме, в многоклеточном организме, способном инициировать транскрипцию с указанного промотора; б) идентифицируют фенотип указанного многоклеточного организма по сравнению с диким типом.

Настоящее изобретение можно понять более ясно с помощью следующих примеров, которые приведены исключительно для примера, со ссылкой на сопровождающие чертежи, где:

Фиг.1 представляет собой нуклеотидную последовательность плазмиды PGN1 в соответствии с настоящим изобретением.

Фиг.2 представляет собой нуклеотидную последовательность плазмиды PGN100 в соответствии с настоящим изобретением.

Фиг.3 представляет собой схематическое изображение используемых векторов и режим трансформации, используемый в способах согласно настоящему изобретению.

Фиг.4 представляет собой иллюстрацию вектора экспрессии, используемого в соответствии с изобретением.

Фиг.5 представляет собой схематическую иллюстрацию векторов экспрессии Т7 РНК-полимеразы, используемых для трансформации C.elegans.

Фиг.6 представляет собой иллюстрацию плазмиды PGN1.

Фиг.7 представляет собой диаграммное изображение усиленного вектора для dsPHK ингибирования, кодирующего sup-35 dsPHK.

Фиг.8 представляет собой иллюстрацию вектора для интеграции в геном C.elegans.

Фиг.9 представляет собой иллюстрацию положения последовательности (последовательностей) ДНК относительно подходящего промотора для инициации экспрессии dsPHK с этой последовательности (последовательностей) ДНК.

Фиг.10 представляет собой изображение плазмиды pGN108.

Фиг.11 представляет собой изображение плазмиды pGN105.

Фиг.12 представляет собой изображение плазмиды pGN400.

Фиг.13 представляет собой изображение плазмиды pGN401.

Фиг.14 представляет собой изображение плазмиды pGN110.

Фиг.15 представляет собой изображение плазмиды pAS2 с прямым и обратным T7/T3/SP6 промоторами.

Фиг.16 представляет собой изображение плазмиды pGAD424 с прямым и обратным T7/T3/SP6 промоторами.

Фиг.17 представляет собой изображение плазмиды pAS2-cyh2-HA+, both-T7-final.

Фиг.18 представляет собой изображение плазмиды pGAD424-without-FULL-ICE-BOTH-T7.

Фиг.19 (а) представляет собой изображение плазмиды pGN205 и (б) представляет собой изображение плазмиды pGN207.

Пример А: Конструирование упорядоченной и иерархически сгруппированной кДНК библиотеки и ее применения.

Случайно упорядоченная и сгруппированная библиотека:

Вектор представляет собой вектор E.coli, содержащий два Т7 промотора, с множественным сайтом клонирования (МСК) между ними. Эти два промотора ориентированы по направлению друг к другу и по направлению к МСК. В присутствии Т7 РНК-полимеразы, экспрессируемой в E.coli, C.elegans или в любом другом организме, РНК будет продуцироваться, начиная с этих двух Т7 промоторов. Поскольку они ориентированы в противоположном направлении, обе нити РНК будут продуцироваться с ДНК, встроенной (клонированной) в МСК между этими двумя промоторами, что приводит в результате к образованию двунитевой РНК (dsPHK) при связывании с ними Т7 РНК-полимеразы.

Библиотеку кДНК C.elegans конструируют в МСК, используя стандартные молекулярно-биологические методики. Эту библиотеку трансформируют в E.coli, и полученные E.coli выращивают в культуре и хранят в 96-многолуночных планшетах. На этой стадии плазмидную ДНК можно выделить и хранить в 96-многолуночных планшетах, соответствующих планшетам с колониями E.соli. Оценивают примерно 100000 колоний. Таким образом, эта библиотека будет содержать примерно в 5 раз больше вариантов суммарной экспрессируемой кДНК C.elegans, что дает возможность присутствия в этой библиотеке последовательностей с низкой экспрессией. Это будет давать в результате примерно 1041 96-луночный планшет. Эти планшеты, если необходимо, иерархически группируют. Для настоящего группирования клоны располагают в ряд от 10 до 100. Если иерархическое группирование осуществляют по 8 или 12 (числа более удобны, так как 96-луночные планшеты имеют решетку 8 на 12), это будет давать в результате примерно 87 многолуночных планшетов и примерно 8352 лунки. Если иерархическое группирование осуществляют по 96 лунок, которые составляют полный планшет, это дает в результате примерно 11 планшетов и примерно 1041 лунку. На любой стадии иерархического группирования плазмидную ДНК можно выделить, что будет менее трудоемким, когда используют меньше планшетов, но приведет к потере сложности, хотя этого не должно быть в случае группирования по 12. Группирование ДНК можно также осуществлять с исходной ДНК.

В приведенных ниже экспериментах описано, как следует осуществлять иерархическое группирование, как для библиотеки ДНК, так и для библиотеки E.coli.

Упорядоченная библиотека для PHKi технологии, содержащая каждый ген генома C.elegans, с ее применениями.

Как только проект секвенирования генома подходит к концу, эту информацию можно использовать при применении технологии Т7 РНК ингибирования. Каждый ген генома C.elegans можно клонировать, используя ПЦР технологию. Предпочтительно будут клонированы экзоны с минимальной длиной 500 п.о. (пар оснований). Если экзоны слишком малы, фрагменты меньшего размера будут выделены с помощью ПЦР, либо даже участки интронов и прилежащие экзоны будут выделять с помощью ПЦР технологии таким образом, чтобы клонировать по меньшей мере существенную часть транслируемого района гена. Для этого необходимо провести по меньшей мере 17000 реакций ПЦР. Эту коллекцию продуктов ПЦР будут клонировать в Т7 вектор, как описано (два Т7 промотора, ориентированных по направлению друг к другу, с множественным сайтом клонирования между ними). Каждый продукт ПЦР либо клонируют независимо, либо его можно использовать для создания случайной библиотеки, аналогичной описанной библиотеке кДНК. Если каждый продукт ПЦР клонируют индивидуально, полученные в результате бактерии и плазмидную ДНК можно группировать различными способами. Во-первых, эту коллекцию индивидуально клонированных продуктов ПЦР в Т7 PHKi векторе можно группировать случайным образом, как описано для случайной библиотеки. Это группирование можно также осуществлять более рациональным путем. Например, гены генома C.elegans можно анализировать, используя биоинформационные средства (в силикобиологии (silico biology)). Различные гены генома будут принадлежать к семейству генов или будут иметь гомологи в геноме. Эти члены семейства генов будут группировать, либо будут группировать члены, являющиеся гомологами. Таким образом, суммарное число примерно из 17000 клонов сокращают до более удобного количества. Эту библиотеку можно использовать для скрининга на фенотипы в способах согласно изобретению. Полученный в результате фенотип дает функциональное описание гена или семейства генов, либо гомологов генов генома C.elegans. Поскольку эта библиотека состоит из участка каждого гена в геноме, этот способ обеспечивает описание полного генома в функционально-фенотипическом отношении. Для этого двунитевую РНК (dsPHK) необходимо ввести червю. Этого введения одиночных клонов, либо сгруппированных клонов, которые группировали случайным образом или рациональным путем, можно достичь несколькими способами, как описано.

Пример вектора для экспрессии двунитевой PHKi

Можно использовать любой вектор, содержащий Т7 промотор, который содержит также множественный сайт клонирования (существует много коммерчески доступных векторов). Сконструированы праймеры, содержащие Т7 промотор, и праймер с обратной комплементарной нитью, оба с соответствующими концами. Эти праймеры можно гибридизовать и, если желательно, клонировать в выбранный вектор. Минимальной последовательностью для Т7 промотора является TAATACGACTCACTATAGGGCGA. Хотя любой вектор можно использовать для конструирования вектора экспрессии Т7, далее следует пример, как достичь этого с вектором pGEM-Szf(-).

- Вектор pGEM-3zf(+) (PROMEGA) подвергали ферментативному гидролизу HindIII и SaII.

- Праймеры oGN1 и oGN2 смешивали вместе в конечной концентрации 1 мкг/30 мкл, кипятили и медленно охлаждали до комнатной температуры.

- Праймер лигировали в вектор, используя стандартные методики лигирования. Полученный в результате вектор представляет собой pGN1 (показан на фиг.1) и содержит два Т7 промотора, ориентированных по направлению друг к другу, а также содержит множественный сайт клонирования между ними.

Последовательностями oGN1 и oGN2 являются:

- oGN1: AGC TGT ААТ ACG ACT CAC TAT AGG GCG AGA AGC ТТ

- oGN2: TCG ААА GCT TCT CGC АТА АТА GTG AGT CGT АТТ АС

Пример конструирования библиотеки

Можно выделить РНК из каждого организма, который чувствителен к PHKi. Как правило, выделенную РНК затем копируют на двунитевую кДНК, а затем конструируют в подходящие вектора для клонирования. Существует несколько методик, и можно заказать молекулярно-биологические наборы от различных фирм, включая Promega, Clontech, Boehringer Mannheim, BRL и т. д., которые обеспечивают:

- выделение РНК,

- в конечном счете, можно выделить полиА РНК (в распоряжении имеются несколько методик и наборов),

- синтез первой нити с обратной транскриптазой AMV (вирус миелобластоза птиц), случайными гексамерными праймерами и/или олиго(dТ) праймером,

- синтез второй нити с РНКазой Н, ДНК полимеразой I,

- заполнение концов с ДНК полимеразой Т4,

- добавление адаптера с Т4 ДНК лигазой,

- в конечном счете, обработка Т4 полинуклеотидкиназой,

- клонирование кДНК в вектор.

Полученную в результате лигазную смесь можно считать кДНК библиотекой. Эта лигазная смесь содержит все кДНК по этой методике, лигированные в интересующий вектор. Чтобы упорядочить эту библиотеку, эту лигазную смесь нужно трансформировать в штаммы E.coli.

Применение этой библиотеки E.coli или ДНК

Штамм, продуцирующий Т7 РНК:

- стандартным штаммом является BL21 (DE3): F-ompT[lon]hsds(r-m-; и штамм В E.coli)(DE3). В конечном счете, можно использовать варианты BL21 (DE3), хотя используют BL21 (DE3) pLysS;

- любой другой штамм E.coli, который продуцирует Т7 РНК-полимеразу, который можно иметь в распоряжении, необходимо конструировать. Его можно легко получить, используя фаг, который является коммерчески доступным, в этом случае используют вектор СЕ6 (поставляемый Promega). Почти каждый штамм E.coli можно трансфецировать этим фагом, и он будет продуцировать Т7 РНК-полимеразу;

- мутант E.coli no РНКазе III:

В принципе, в распоряжении имеются различные штаммы; авторы изобретения для использования в первом эксперименте выбрали штамм АВ301-105: rna-19, suc-11, bio-3, gdhA2, his95, rnc-105, relА1, spoT1, metB1 (Kinder et al., 1973, Mol. Gen. Genet., 126:53), однако, другие штаммы могут подходить лучше. Данный штамм инфицируют СЕ6, и, таким образом, будет сконструирован вариант, продуцирующий Т7.

Червей С.elegans дикого типа можно выращивать на пулах бактерий. Эти бактерии экспрессируют Т7 РНК-полимеразу. Это приводит к образованию в кишке С.elegans больших количеств dsPHK, которая будет диффундировать в организме и приводить к ингибированию экспрессии. Теперь эту библиотеку можно использовать для скрининга нескольких фенотипов. Эта методика имеет преимущество в том, что она является значительно более быстрой для обнаружения генов, имеющих отношение к определенным путям метаболизма, чем известная технология С.elegans. Кроме того, если обнаруживают интересующий фенотип, ответственный за него ген можно легко клонировать.

При использовании иерархического группирования можно легко обнаружить во втором скрининге соответствующий клон из пула. Затем встроенную ДНК этого клона можно секвенировать. В результате этого эксперимента создают базу генетических и биохимических данных в одну стадию.

Штаммы C.elegans дикого типа можно комбинировать с соединениями для скрининга на фенотип, лекарственную устойчивость или лекарственную чувствительность. Штамм C.elegans может представлять собой мутантный штамм, подвергаемый скринингу на усиленный фенотип, ослабленный фенотип или новый фенотип. Штамм C.elegans может представлять собой мутантный штамм, и скрининг библиотеки можно комбинировать с соединениями. Так можно проводить скрининг на лекарственную устойчивость, лекарственную чувствительность, усиленный фенотип, ослабленный фенотип или новый фенотип. Штамм E.coli может представлять собой любой штамм, экспрессирующий Т7 РНК-полимеразу, подобный, например, BL21 (DE3), но образование двунитевой РНК можно усилить с помощью использования специального штамма E.coli, который является отрицательным по РНКазе III.

РНКаза III распознает специфичные петли в dsPHK. В конечном счете, можно использовать штамм E.coli, который является делетированным по иным РНКазам, чем РНКаза III, либо можно использовать штамм E.coli, который является делетированным по одной или более чем одной РНКазе. Экспрессия Т7 РНК-полимеразы в наиболее известных штаммах E.coli и конструкции, которые имеются в распоряжении для создания штаммов E.coli, продуцирующих Т7 РНК-полимеразу, как правило, включают в себя индуцируемый промотор. Таким образом, продуцирование Т7 РНК-полимеразы и, следовательно, продуцирование dsPHK является регулируемым. Преимущественно этот признак можно использовать для “импульсного” кормления червей C.elegans на определенных стадиях роста. Этих червей выращивают на не индуцированных штаммах E.coli. Когда червь достигает интересующей стадии, индуцируют продуцирование Т7 РНК-полимеразы в бактериях. Это дает возможность изучения функции любого гена в любой момент жизненного цикла животного.

Скрининг библиотеки на гомологи предполагаемых представляющих интерес генов человека и определение функции этих генов

Сотни генов выделены в различных проектах, представляющих собой геномные проекты, направления дифференциальной экспрессии, гибридизационные исследования и т. д. Описанная библиотека кДНК может обеспечить путь оценивания и/или определения функции этих генов быстрым и эффективным способом. Прежде всего, гомолог или гомологи, либо гены червя необходимо идентифицировать с помощью биоинформационных средств (в силикобиологии). Конструируют праймеры ПЦР, и фрагмент кДНК выделяют, используя ПЦР технологию. ПЦР можно проводить на иерархических пулах. Положительный пул или индивидуальные лунки, содержащие бактерии, которые имеют соответствующую кДНК, скармливают C.elegans и оценивают фенотип.

ПЦР можно проводить на кДНК, выделенной из C.elegans. Полученную в результате ДНК можно клонировать в Т7 вектор и трансформировать в продуцирующую dsPHK E.coli, на которой затем кормят червей C.elegans.

Нужно делать выбор в зависимости от того, какой путь является более быстрым и более надежным.

Если ген принадлежит к семейству генов, может быть необходимо кормить червя на смеси бактерий. Каждая из них содержит участок члена этого семейства генов. Штаммы E.coli, условия роста, комбинации с соединениями можно подбирать, как описано выше.

Если используют рациональную библиотеку, в которой все гены C.elegans клонированы организованным и структурированным путем, гомолог C.elegans, а также, в конечном счете, другие гомологи, ортологи и члены семейства генов легко прослеживать в библиотеке, используя силикобиологию. ПЦР не вовлечена в эту стадию, и можно выделить бактерии и/или ДНК, на которых будут выращивать червя.

Примеры

Идея этой серии экспериментов состояла в тестировании как PHKi вектора, так и различных штаммов E.coli, которые были сконструированы.

1) Конструирование тест-плазмиды

Можно использовать любую кДНК, которая дает явный фенотип у червя при ее выключении или использовании в PHKi эксперименте. Известно, что хорошим кандидатом является unс-22, но возможны и другие гены. Авторы изобретения выбрали чувствительную систему, которую можно использовать на более поздней стадии. Эту систему тестировали с sup-35 на генетическом фоне pha-1. Экзон 5 sup-35 выделяли с помощью ПЦР и клонировали в вектор с Т7 промотором pGN1. Полученный в результате вектор обозначили pGN2. Мутантные черви pha-1 (е2123) не могут производить потомство при температурах выше 25°С. Это происходит вследствие проблемы развития в эмбриогенезе. Когда sup-35 выключен или ингибирован в этом штамме, потомство может расти при этой температуре. Комбинация мутантных червей pha-1 и PHKi sup-35 является хорошей системой для оценки различных возможных вариантов.

2) Тестирование PHKi с использованием штамма E.coli, который продуцирует dsPHK.

- pGN2 вводили в штамм E.coli BL21 (DE3) и индуцировали Т7 РНК-полимеразу с помощью ИПТГ (изопропилтиогалактозид). Червей C.elegans (pha-1 (e2123)) высевали на эти бактерии и выращивали при ограничивающей температуре 25°С. Поскольку этот мутант при данной температуре является эмбриональным мутантом, никакого потомства не буде