Способ фотохромной маркировки и/или обеспечения аутентичности предметов и композиция для его осуществления

Способ фотохромной маркировки и/или обеспечения аутентичности предметов и композиция для его осуществления

Реферат

 

Изобретение относится к способу обеспечения аутентичности предмета путем нанесения на него фотохромных чернил. Для реализации способа фотохромной маркировки и/или обеспечения аутентичности предметов, а также получения композиции для его осуществления применяют материалы из бактериородопсина и приготовленные из них композиции. Такие материалы и композиции применяются для нанесения на предметы, в которых используют признаки низкой и высокой степени защиты, предпочтительно в комбинации. Это обеспечивает оптическое обнаружение защитного признака, который под действием света видимого диапазона длины волн может обесцвечиваться или стираться. 4 н. и 19 з.п. ф-лы, 2 ил.

Изобретение относится к способу обеспечения аутентичности предмета путем нанесения на него фотохромных чернил.

Защитно-технические мероприятия по обеспечению аутентичности документов или предметов предусматривают применение соответствующих защитных признаков или маркировок аутентичности. Использование фотохромных материалов для защитно-технических целей описано, например, в US 4927180. Фотохромный идентифицирующий признак в известных примерах становится видимым при воздействии ультрафиолетовым светом. Однако примененный идентифицирущий признак не распознается или плохо распознается в этом качестве, вследствие чего присутствует риск того, что пользователь не заметит отсутствия идентифицирующего признака. Из-за применения ультрафиолетового света для глаз контролера аутентичности требуется соответствующая защита. Поэтому использование ультрафиолетового света в целях идентификации защитного признака может считаться неоптимальным. Подобный уровень техники описан в US 5807625. Здесь также используется ультрафиолетовый свет для визуализации защитного признака.

Органические фотохромные материалы, раскрытые в указанных документах, характеризуются типичным числом коммутационных циклов, равным 10⁴-10 ⁵. В результате ограничено число возможных проверочных операций по идентификации защитного признака. Поэтому применение автоматических способов тестирования, как, например, это практикуется в денежных автоматах или на КПП, для указанных защитных признаков невозможно или возможно только условно.

Кроме того, желательно, чтобы присутствовала возможность идентификации определенной порции маркировочной композиции и, например, в случае утери или неправомочного использования предназначенных для защитных цепей композиций можно было установить их происхождение. Защитные признаки, раскрытые в указанных материалах, описывающих уровень техники, не пригодны для подобных случаев.

Традиционные фотохромные материалы обладают, кроме того, тем недостатком, что одно из их обоих переключаемых состояний не характеризуется заметной собственной окраской.

Задачей изобретения является создание оптически обнаруживаемого защитного признака, который под действием света видимого диапазона длины волн может обесцвечиваться или стираться. В результате становится возможным вызывать смену цвета с применением дешевых и повсеместно имеющихся источников света, например светодиодов. В этом случае тестирование было бы возможным даже с помощью обычного лампового света, а обнаружение - невооруженным глазом. Кроме того, желательно создать защитный признак, характеризующийся числом коммутационных циклов, превышающим 10⁴ - 10 ⁵.

Еще одной задачей является обеспечение множества структурно схожих между собой фотохромных материалов, различающихся друг от друга своей окраской и/или сменой цвета.

Если известные из уровня техники защитные признаки могут быть обозначены ввиду низких технических затрат на их проверку как признаки низкой степени защиты, то отсюда вытекает следующая задача: дополнительно обеспечить наличие признаков высокой степени защиты, проверка которых представляет техническую сложность и следовательно не может быть проведена неспециалистом.

В WO 9806084 раскрыто применение молекул нуклеиновой кислоты, в частности молекул ДНК, в качестве невидимого признака высокой степени защиты, которые могут быть обнаружены соответствующими реакциями амплификации, как, например, реакцией PCR, с помощью специфических затравок.

Согласно настоящему изобретению удалось обнаружить материал, а именно бактериородопсин, в котором могут комбинироваться между собой признак низкой степени защиты, как, например, фотохромный, и признак высокой степени защиты, позволяющий, например, идентифицировать отдельные порции маркировочной композиции, а также использовать данный материал и для определения аутентичности предметов.

Способ обеспечения аутентичности предметов с использованием содержащих бактериородопсин чернил согласно изобретению изложен в п.1 формулы изобретения, причем в зависимых пунктах формулы приведены предпочтительные варианты осуществления.

Указанные выше задачи решаются согласно изобретению способом обеспечения аутентичности предмета посредством нанесения фотохромных чернил на предмет, при этом используются фотохромные чернила, содержащие по меньшей мере один вариант бактериородопсина в качестве фотохромного компонента, который при облучении светом видимого диапазона длин волн претерпевает визуально обнаруживаемое, обратимое изменение состояния, используемое в качестве признака низкой степени защиты во время проверки аутентичности, в частности изменение цвета, и который дополнительно к признаку низкой степени защиты обладает одним или несколькими визуально не обнаруживаемыми признаками высокой степени защиты, наличие которого (которых) обнаруживается только с помощью инструментального анализа.

Предметом настоящего изобретения является следовательно применение фотохромных чернил в способе обеспечения аутентичности предмета. Применяемые согласно изобретению чернила содержат в качестве фотохромного компонента по меньшей мере один вариант бактериородопсина. Этот вариант бактериородопсина обеспечивает наличие как визуально обнаруживаемого при проверке на аутентичность признака низкой степени защиты, так и присущего ему дополнительного признака высокой степени защиты, обнаруживаемого только с помощью инструментального анализа.

Под понятием "фотохромия" подразумевается вызываемое светом обратимое изменение состояния (в частности изменение окраски) вещества, при котором меняется цвет (спектр поглощения) исходного вещества. Затем может быть вызвана обратная реакция, например, светом с другой длиной волны или теплом. В результате применения согласно изобретению варианта бактериородопсина в качестве фотохромного компонента, который при облучении светом видимого диапазона длин волн изменяет свое состояние, необходимость в облучении ультрафиолетовым светом согласно изобретению отпадает. В результате могут быть устранены связанные с ультрафиолетовым облучением недостатки, в частности отпадают связанные с этим требования к аппаратурному оформлению и защитные меры.

Из применяемых согласно изобретению вариантов бактериородопсина предпочтительными являются такие, при которых окрашивание происходит при обоих, особо предпочтительно при всех переключаемых состояниях.

Поэтому один из аспектов изобретения касается способа обеспечения аутентичности предметов, причем фотохромная композиция в виде чернил, содержащих бактериородопсин и/или вариант бактериородопсина в качестве фотохромного компонента, наносится на предмет, при этом облучение такой фотохромной композиции светом видимого диапазона длин волн ведет к изменению состояния, в частности к изменению окраски, обнаруживаемому при проверке аутентичности. Обнаруживаемое изменение состояния, в частности изменение окраски, должно быть предпочтительно обратимым, причем применяемые согласно изобретению варианты бактериородопсина характеризуются в частности числом коммутационных циклов (т.е. числом изменения окраски для контрольных целей) >10⁵, более предпочтительно >10⁶ и особо предпочтительно >10⁷ . В результате становится возможной повторная проверка защиты аутентичности предмета с помощью признака низкой степени защиты в рамках рутинных мероприятий. Если изменение состояния становится необратимым, например, в результате разрушения фотохромно-активной части бактериородопсина, признак низкой степени защиты может быть нейтрализован, т. е. приведен в негодность.

Проверка на аутентичность проводится предпочтительно облучением фотохромных чернил видимым светом для обесцвечивания бактериородопсина, затем фотохромные чернила облучаются светом другого диапазона волн с тем, чтобы фотохимическим способом перевести бактериородопсин в его исходное состояние, или проводится термическая релаксация для перевода в необесцвеченное состояние. Изменение оптических свойств во время обесцвечивания и/или гашения может наблюдаться невооруженным глазом или с помощью оптического измерительного прибора.

Под признаком низкой степени защиты понимается признак, наличие или отсутствие которого может проверяться неспециалистом без применения вспомогательных технических средств простым способом или при незначительных технических затратах.

Напротив, под признаком высокой степени защиты понимается признак, наличие или отсутствие которого неспециалисту определить невозможно и который может быть проверен только специалистами при больших технических затратах.

Следовательно признаками низкой степени защиты являются такие признаки, на анализ которых расходуются незначительные финансовые средства (копеечные расходы), который может проводиться любым лицом, в то время, как признаки высокой степени защиты представляют собой признаки, анализ которых может стоить несколько сотен тысяч марок ФРГ и проводится специалистами в лабораторных условиях. Признаки низкой степени защиты обеспечивают защиту от приемов фальсификации "любого и каждого", поскольку фотохромия невоспроизводима с помощью известных приемов. Признаки высокой степени защиты включают в себя индивидуализацию отдельных защитных красок, предназначенных для применения или для пользователя, вплоть до уровня кодирования порций композиции.

Так, например, фотохромия вариантов бактериородопсина, т. е. изменение окраски, легко прослеживаемое наблюдателем при облучении видимым светом, представляет собой признак низкой степени защиты. Другими визуально обнаруживаемыми признаками низкой степени защиты являются, например, различные начальные окраски содержащих бактериородопсин чернил, разные фотоциклы или/и изменения кинетических свойств.

В противоположность признакам низкой степени защиты, которые просто воспринимаются визуально любым человеком, признаки высокой степени защиты проверяются только с помощью технически сложных аналитических аппаратов, т.е. посредством инструментального анализа. Следовательно для проверки наличия признаков высокой степени защиты необходимы технические вспомогательные средства. Так, например, замена аминокислот в последовательности бактериородопсина приводит к вариантам, масса которых, отклоняющаяся от исходного типа, может быть выявлена посредством масс-спектрометрии. Присутствует также возможность образовать путем сцепления атомов или/и молекул варианты бактериородопсина, которые могут обнаруживаться, например, на основе разности их массы, их модели фрагментации или прочих отличительных свойств, например, посредством электронного парамагнитного резонанса или ЯМР.

В результате замещения аминокислот могут быть обеспечены в частности следующие признаки высокой степени защиты. При детектировании посредством жидкостной хроматографии - масс-спектрометрии/масс-спектрометрии (например, ESI) можно замерить изменение молекулярной массы или/и характеристическое изменение модели фрагментации при проведении масс-спектрометрии. В результате детектирования с помощью ЖХВР и абсорбционного или флюоресцирующего детектирования могут быть обнаружены характеристические изменения пептидных расщеплений, например, деления или присоединение точки пересечения, в результате чего число фрагментов либо возрастает, либо убывает. С помощью этих методов возможно также обнаруживать изменение количества ароматических аминокислот. Присоединение специфических моноклональных антител к последовательности бактериородопсина или ее частям может быть обнаружено посредством ферментного иммуносорбентного теста или подобных ему способов.

Примерами признаков высокой степени защиты, получаемых в результате сцепления, служат спиновые метки, обнаруживаемые посредством электронного парамагнитного резонанса, и модификации, вводимые посредством протеинмодифицирующих реактивов, меченых устойчивыми изотопами (например, ¹³ С, ¹⁵N).

Применяемые согласно изобретению чернила придают защищаемому предмету как признак низкой степени защиты, например, фотохромный, так и признак высокой степени защиты, как, например, информация о последовательности использованного бактериородопсина, позволяющий, например, идентифицировать отдельные порции композиции.

Следовательно с помощью способа согласно изобретению достигается двойная защита маркированных предметов. В то время, как признаки низкой степени защиты легко различаются и следовательно могут быть незамедлительно и быстро выявлены, признаки высокой степени защиты представляют собой скрытые защитные признаки, которые обнаруживаются только в результате трудоемкого анализа, и потенциальным подделывателем или фальсификатором возможно совершенно не обнаруживаются. Потенциальный подделыватель даже и не знает, должен ли присутствовать определенный признак или нет, так как существует целый ряд признаков высокой степени защиты, которые могут комбинироваться с бактериородопсином.

Такая дополнительная защита обеспечивает высокую степень предохранения от подделки и одновременно позволяет применять кодирование предметов, например кодирование изготовителя или композиции. В результате применения варианта бактериородопсина признаки низкой и высокой степеней защиты, кроме того, неразрывно связаны между собой, так как образованы одной и той же молекулой.

Проверка маркированных согласно изобретению предметов может осуществляться разными способами. При рутинной проверке, как она проводится в банке или кредитном учреждении при каждом поступлении банкнот, могут применяться, например, простые средства для проверки только на наличие признака низкой степени защиты. Однако возможно одновременно проверять наличие двух и более признаков низкой степени защиты. При более тщательном исследовании может проверяться наличие одного или нескольких признаков высокой степени защиты, присущие варианту (вариантам) бактериородопсину. Подтверждение наличия по меньшей мере двух признаков высокой степени защиты может быть получено в результате применения двух разных вариантов бактериородопсина или дважды модифицированного варианта бактериородопсина. Кроме того, возможно проведение и комбинированной проверки на признаки низкой и высокой степеней защиты.

Бактериородопсин является мембранным протеином галофильных бактерий. Из микроорганизмов рода Halobacterium можно в больших количествах извлекать протеин бактериородопсин. Бактериородопсин исходного типа и его основные фотохимические и физические свойства специалисту хорошо известны в качестве фотохромного материала, который активируется светом и проходит циклическую серию промежуточных форм. В целях моделирования фотохромных свойств применяется сильно упрощенный фотоцикл, состоящий только из двух состояний, обозначаемых как состояния В и М. После облучения светом с длиной волны 568 нм пурпурная окраска состояния В переходит в желтую окраску состояния М, которое, в свою очередь, в результате абсорбции света с длиной волны 412 нм снова переходит в состояние В. Следовательно материал бактериородопсин может обесцвечиваться желто-зеленым светом, причем пурпурная окраска исчезает и появляется желтая. Затем ожидают до того момента, пока в результате термической релаксации снова не произойдет окрашивания в желтый цвет или используют синий цвет для фотохимического возвращения материала бактериородопсин в состояние В. Перечень названных свойств бактериородопсина приводится в N.N. Vsovolodov, Biomolecular Electronics: An Introduction via Photosensitive Proteins, Birkhauser, Boston, 1998, и D.Oesterhelt, C.Brauchle, N. Hampp, Bacteriorhodopsin: A Biological Material for Information Processing, Quarterly Review of Biophysics, 24, 1991 г., стр. 425-278.

Специалисту известно, что существует целый ряд вариантов бактериородопсина, которые хотя и обладают одинаковой начальной окраской, что и исходный тип, однако иногда значительно отличаются между собой по кинетике фотоцикла. Предпочтительным примером служит вариант бактериородопсина D96N. Свойства последнего описаны в различных публикациях, например, в A. Miller, D. Oesterhelt, Kinetic Optimization of Bacteriorhodopsin by Aspartic Acid 96 as an Internal Proton Donor, Biochim. Biophys. Acta 1020, 1990 г., стр. 57-64.

Согласно изобретению предпочтительно применять бактериородопсин, который обесцвечивается преимущественно видимым светом.

Оказался оптимальным диапазон волн от 500 до 600 нм. Приведение бактериородопсина в исходное состояние можно обеспечить термической релаксацией или облучением света другого диапазона длин волн. Таким другим диапазоном длин волн предпочтительно применять диапазон длин волн от 400 до 450 нм.

Видимое обесцвечивание бактериородопсина под действием облучения тем легче обнаружить, чем больше продолжительность состояния М. Обычно обесцвечивание материала бактериородопсина на около 90% достигается при световой мощности менее 100 мВт/см при длине волн 532 нм.

До настоящего времени в литературе отсутствовало описание композиций, таких как лаки, чернила или печатные краски, предназначенных для нанесения средствами печатной техники и/или для применения в сфере защитной техники, в которых бактериородопсин содержится в качестве фотохромного компонента. По сравнению с названными традиционными фотохромными материалами бактериородопсин обеспечивает следующие преимущества:

1. Для смены цвета может применяться свет видимого диапазона длин волн.

2. Оба переключаемые состояния обладают обнаруживаемой собственной окраской.

3. В результате применения генно-технических методов можно получать функциональные варианты бактериородопсина путем аминокислотного обмена. Полученные при этом варианты отличаются от бактериородопсина исходного типа кинетикой (бактериородопсин D96N) и/или начальным поглощением и фотоциклом (бактериородопсин D85N).

4. Число возможных коммутационных циклов составляет свыше 10⁵ . В микроорганизмах рода Наlоbасterium бактериородопсин присутствует в так называемой пурпурно-мембранной форме. Техника получения и выделения бактериородопсина в пурпурно-мембранной форме хорошо известна (см., например, ЕР 0406850 В1).

Бактериородопсин присутствует в исходном типе в виде двухмерного элемента клеточной мембраны, состоящего исключительно из бактериородопсина и липидов. Этот элемент назван пурпурной мембраной. В этом виде бактериородопсин особо термодинамически устойчив, для протеина даже необыкновенно устойчив. Это служит предпосылкой для множества случаев технического применения, также и в области композиций согласно изобретению, где бактериородопсин используется в качестве пигмента. Поэтому бактериородопсин согласно изобретению или/и вариант бактериородопсина особо предпочтительно применять в пурпурно-мембранном виде.

В качестве бактериородопсина может применяться исходный тип, согласно изобретению фотохромные чернила предпочтительно содержат по меньшей мере один вариант бактериородопсина в качестве фотохромного компонента. Вариант бактериородопсина отличается от исходного типа по меньшей мере одним изменением. Предпочтительно выбирать вариант бактериородопсина из функциональных вариантов, вариантов последовательности, вариантов ответвления, хромофорных вариантов, изотопных вариантов или/и вариантов спиновых клеток.

Варианты последовательностей бактериородопсина, которые могут быть также функциональными вариантами бактериородопсина, могут быть подвергнуты экспрессии в среде Halobacterium salinarum. При этом бактериородопсин встраивается в клеточную мембрану, которая затем может быть выделена. В отдельных случаях полученный материал не обладает двухмерной кристаллизацией, но бактериородопсин связан с мембраной.

При получении вариантов бактериородопсина целевым обменом отдельных аминокислот в результате такого обмена в незначительных для фотохромной функции диапазонах могут быть получены варианты последовательностей. Аминокислотный обмен может проводиться посредством локально ориентированного мутагенеза гена, закодированного на бактериородопсин.

В результате обеспечивается начало для образования признака высокой степени защиты, так как целевой аминокислотный обмен в молекуле бактериородопсина может использоваться для идентификации и следовательно превращается в защитный признак. При замене, например, только четырех аминокислотных позиций с 20 биогенными аминокислотами можно получить 4²⁰ 10¹² различных материалов бактериородопсина.

В результате становится возможным без больших технически затрат получить огромное количество молекул бактериородопсина, включающих в себя фотохромно-функциональные идентичные материалы бактериородопсина, но однозначно различающихся между собой, в частности своей последовательностью аминокислот.

Дополнительный признак высокой степени защиты нельзя различить без дорогостоящего анализа. В уровне техники описаны разные способы, с помощью которых надежно может быть определен состав материалов бактериородопсин вместе с названными модификациями. Прежде всего следует указать на масс-спектроскопию (см. K.L.Schey, D.I.Papac, D.R.Knapp, R.K.Crouch, Matrix-Assisted Laser Desorption Mass Spectrometry of Rhodopsin and Bacteriorhodopsin, Biophys., J.63, 1992 г., стр. 1240-1243; Р. Hufnagel, U. Schweiger, C. Eckerskorn, D. Oesterhelt, Electrospray lonization Mass Spectrometry of Genetically modified Bacteriorhodopsin, Anal. Biochem. 243, 1996 г., №1, стр. 46-54; L/E/ Ball, J.E.Jr. Oatis, K. Dharmasiri, M.Busman, J. Wang, L.B. Cowden, A.Galijatovic, N. Chen, R.K. Crouch, D.R. Knapp, Mass Spectrometric Analisys of Integral Membrane Proteins: Application to Complete mapping of Bacterirhodopsins and Rhodopsin, Protein Sci.5, 1998 г., №3, стр. 758-764). Предпочтительные материалы бактериородопсин обеспечивают комбинацию признака низкой степени защиты, а именно оптически легко обнаруживаемую фотохромию признаком высокой степени защиты, например вариацию последовательности в аминокислотной последовательности самого бактериородопсина.

К признакам низкой степени защиты, обеспечиваемым изобретением, относятся

1. Разные начальные окраски материалов бактериородопсина.

2. Разные фотоциклы.

3. Изменение кинетических свойств.

Признак низкой степени защиты согласно изобретению предпочтительно получать в результате применения функциональных вариантов бактериородопсина, однако он может быть получен и с помощью других вариантов бактериородопсина, таких как, например, варианты ответвления бактериородопсина и/или хромофорные варианты бактериородопсина.

Под функциональными вариантами бактериородопсина следует понимать в частности варианты, которые отличаются по своему спектру поглощения и/или своему фотоциклу от исходного типа бактериородопсина.

Известным функциональным вариантов является, например, вариант D96N, в котором аспарагиновая кислота замещена аспарагином в позиции 96. Такой функциональный вариант бактериородопсина и некоторые другие описаны в "Н. Otto, T.Marti, M. Holz, T.Mogi, M.Lindau, H.G.Khorana, M.P.Heyn, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1989 г., стр. 9229-9232" и "Т.Е.Thorgeirsson, S.J.Milder, L.J.Miercke, M.C.Betlach, R.F.Shand, R.M.Stroud, D.S.Kliger, Biochemistry 30, 1991 г., стр. 9133-9142".

Под вариантами ответвления бактериородопсина следует понимать в частности варианты бактериородопсина, которые отличаются от исходного типа ковалентной связью молекул. Перед такими молекулами может стоять, например, задача: увеличить молекулярный вес бактериородопсина с тем, чтобы при масс-спектроскопии можно было идентифицировать подобную молекулу, или служить цветной молекулой для того, чтобы изменить спектр поглощения бактериородопсина, или служить флюоресцирующей молекулой с тем, чтобы можно было наблюдать связанную с бактериородопсином флюоресценцию. Материал бактериородопсина может быть также ковалентно связан с полимером. Сопряженная реакция может проводиться, например, согласно Chignell & Chignell, Biochem. Res. Commun. 62, 1975 г., стр. 136-143, и согласно Renthall et al., Biochemistry 22, 1983 г., стр. 5-12.

На начальный цветовой эффект от материала бактериородопсин или от фотохромных чернил, а также на цветовой эффект от обесцвеченного состояния может сильно повлиять ковалентная связь соответствующих красителей с молекулами бактериородопсина или/и простое примешивание пассивных красителей или пигментов. Визуальный эффект от образовавшихся красочных смесей легко можно видеть с помощью диаграммы CIE. Специалист может определить цветовое воздействие с помощью известных методов.

К бактериородопсину можно присоединить молекулы линкера, которые позволяют снова присоединять к себе другие соединения. Молекулы, которые присоединяют в соответствии с задачами согласно изобретению, служат для увеличения молекулярного веса бактериородопсина с тем, чтобы при масс-спектросхопии можно было идентифицировать подобную молекулу.

Под хромофорными вариантами бактериородопсина следует понимать в частности варианты бактериородопсина, которые отличаются от исходного типа удалением или заменой хромофорной группы ретинилиден другой молекулой, в частности, так называемыми ратиналаналогичными молекулами. Ратиналаналогичная молекула может быть ковалентно связана с бактериородопсином через лизин-216.

Следовательно существуют другие возможности получения вариантов бактериородопсина в результате замены хромофорной группы ретинилиден. При этом достигается модификация фотофизических свойств, причем предпочтительно применять дигидроретинал или 4-кеторетинал.

Под изотопными вариантами бактериородопсина следует понимать такие варианты бактериородопсина, в которых некоторые или все аминокислоты частично или полностью мечены с помощью ¹³С или ¹⁵С. Это достигается за счет того, что некоторые меченые аминокислоты добавляются в среду для роста или что применяется пептон, который метится как единое целое. Посредством высокоразрешающего ЯМР могут быть идентифицированы соединения, меченые таким образом.

Под вариантами спиновых меток бактериородопсина следует понимать в частности такие варианты бактериородопсина, которые содержат спиновую метку, ковалентно связанную с молекулой бактериородопсина. Это достигается, например, за счет того, что производное TEMPO (2,2,6,6-тетраметилпиперидин-N-оксил) или DOXYL (4,4-диметилоксазолидин-N-оксил) или PROXYL (2,2,5,5-тетраметилпирролидин-N-оксил) ковалентно связано с материалом бактериородопсин. С помощь электронного парамагнитного резонанса можно проверить наличие и вид спиновой метки.

Под вариантами последовательности бактериородопсина следует в частности понимать такие варианты бактериородопсина, которые отличаются от исходного типа потерей, или заменой, или присоединением одной или нескольких аминокислот, которые однако не вызывают существенного влияния на фотоцикл. Вариантами последовательности бактериородопсина являются, например, D36C или варианты, в которых к терминатору N или терминатору С присоединены аминокислоты.

Комбинация модификаций приведенных выше вариантов ведет к новым вариантам, в результате чего становится возможным огромное число разных композиций бактериородопсина. В результате получают признак высокой степени защиты, так как затраты на проведение анализа очень большие и одновременно каждая отдельная порция композиции может однозначно идентифицироваться ввиду большого многообразия.

Варианты бактериородопсина предпочтительно выбирать из ряда D36X, D96X и D85X, где Х означает одну из природных аминокислот. Особо предпочтительно выбирать вариант бактериородопсина из ряда D36C, D96N и D85N.

Особенно предпочтительно применять мутанты, обладающие повышенной световой чувствительностью, и, в частности, материалы, используемые в голографии.

Композиция из бактериородопсина может содержать наряду с бактериородопсином также обычный, нефотохромный пигмент, или/и фторохром или/и ковалентно связанный с бактериородопсином пигмент, или/и дополнительный фотохромный пигмент. В результате смешивания с бактериородопсином нефотохромный пигмент или фторохром может присутствовать в скрытой форме в защитной метке. В таком варианте осуществления может оказаться также целесообразным дополнительно применять наряду с видимым светом ультрафиолетовый свет.

Флюоресцирующие и фосфоресцирующие молекулы могут сцепляться с молекулами бактериородопсина, в результате чего их эмиссия служит дополнительным признаком. В результате соответствующего выбора позиции эмиссии флюоресценция может быть подавлена при условии, что материал бактериродопсин не находится в обесцвеченном состоянии. Это достигается за счет того, что позиция начального поглощения бактериородопсина и позиция эмиссии флюоресцирующего или фосфоресцирующего материала сильно накладываются друг на друга. В этом случае материал бактериородпсин поглощает испускаемые фотоны, и невооруженным глазом флюоресценция не воспринимается. Флюоресценция становится заметной только в том случае, когда материал бактериродопсин обесцвечивается фотохимическим способом.

Проверка состава нанесенного бактериородопсина может проводиться, например, способом, при котором с помощью микроаналитического секвенирования определяют полностью или частично аминокислотную последовательность материала бактериородопсина и посредством иммунологических методов замеряют реакцию, протекающую со специфическим антителом.

Материалы бактериородопсина, содержащие признаки высокой степени защиты, состоят преимущественно из вариантов бактериородопсина:

1. С целенаправленно измененными аминокислотными последовательностями, причем изменение последовательности не влияет на фотофизические свойства;

2. С ковалентно присоединенными молекулами;

3. С аминокислотами, которые мечены с помощью ¹³С и/или других изотопов. Особо предпочтительны комбинации из двух и более приведенных выше вариантных типов бактериородопсина.

Особенно предпочтительно применять в способе согласно изобретению по меньшей мере один вариант бактериородопсина со следующими признаками:

а) необходимый для образования пурпурно-мембранной формы протеина диапазон сохраняется неизмененным по отношению к исходному типу бактериородопсина;

б) в петлях, или/и терминаторе С, или/и терминаторе N полипептидной цепи происходит по меньшей мере один аминокислотный обмен по сравнению с исходным типом бактериородопсина, сопровождающийся делениями, присоединениями, включениями или/и заменами, причем такие аминокислотные обмены не вызывают изменения фотохромных свойств бактериородопсина, определенных фотохромным диапазоном.

Такие бактериородопсины сохраняются неизменными в диапазоне, необходимом для образования пурпурно-мембранной формы протеина, по сравнению с исходным типом бактериородопсина. Достаточным условием для целей данного изобретения является также то, что бактериородопсин, несмотря на незначительные изменения, и далее способен к образованию пурпурной мембраны в этом диапазоне.

Изменения аминокислотной последовательности согласно изобретению включают в себя аминокислотные обмены, как, например, делеция, включение, замещение и/или присоединение в любых позициях внутри всей полипептидной цепи. Особенно предпочтительны присоединения аминокислот к терминаторам N, или/и С, или/и к петлям полипептидной цепи, расположенным в частности вне мембраны. Следовательно осуществляемые согласно изобретению изменения при кодировании признака высокой степени защиты предпочтительно не проводить в диапазоне бактериородопсина, влияющего на фотохромные свойства. Аминокислотный обмен в петлях, и/или в терминаторе С, или/и в терминаторе N полипептидной цепи при надлежащем проведении не приводит к изменению фотохромных свойств исходного бактериородопсина. Здесь необходимо подчеркнуть, что в качестве исходного бактериородопсина могут применяться как бактериородопсин исходного типа, так и уже модифицированный, в частности бактериородопсин D96N.

Используемые при анализе аминокислотные обмены вызывают изменения массы молекулы бактериородопсина предпочтительно на 1 Да, более предпочтительно по меньшей мере на 10 Дальтон и наиболее предпочтительно более чем на 100 Да. При анализе применяются приборы и способы ионизации, известные из уровня техники, как, например, FTMS (масс-спектрометер с Фурье-преобразованием), и/или ТОР (масс-спектрометер времени полета), и/или MALDI (Matrix-assisted Laser Desorption lonisation (матричная лазерно-десорбционная ионизация)), и/или ESI (электрораспылительная ионизация).

При включении/присоединении аминокислот количество дополнительных аминокислот может достигать в частности до 1000, предпочтительно до 100, особо предпочтительно до 50 и по меньшей мере до одной, но наиболее предпочтительно до 3-20 аминокислот. Можно присоединять по меньшей мере 6 радикалов гистидина к терминатору С для того, чтобы обнаруживать присутствие варианта бактериородопсина через связь с металлами посредством XRF или TXRF.

Делеция или замещение касается в частности 1-10, особо предпочтительно 1-4 аминокислот.

В качестве вариантов замещения предпочтительно применять вариант бактериородопсина, остаток аспарагиновой кислоты которого в позиции 36 замещен цистеином (вариант бактериородопсина D36C).

Молекулярные веса вариантов аминокислотной последовательности молекул бактериородопсина могут определяться масс-спектроскопией с применением электрораспылительной ионизации (ESI) или матрично-лазерной десорбционной ионизации (МАLDI)/масс-спектрометрии во время полета (TOF). После обратного счета масс-спектров получают молярные массы исследуемых веществ с разрешением до массового числа. При изменении аминокислотной последовательности, например, в результате делеции или включения происходят сравнительно большие изменения массового числа, которые аналитически хорошо обнаруживаются. Даже если лишь некоторые немногие аминокислоты замещаются другими аминокислотами, то результирующие изменения массы достаточны для анализа.

Предпочтительно применять вариант бактериородопсина, в котором к терминатору С присоединена по меньшей мере одна аминокислота. Также предпочтительно применять варианты бактериородопсина, в которых содержится по меньшей мере один цистеин. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения применяется по меньшей мере один вариант бактериородопсина, который имеет отличающийся от исходного типа фотоцикл или/и отличающуюся от исходного типа начальную окраску.

Наиболее предпочтительно применять варианты бактериородопсина, которые характеризуются пониженной адаптацией к свету и темноте. Бактериородопсин, характеризующийся максимальным поглощением при 570 нм (состояние В), в темноте подвергается релаксации медленно при времени полуобмена от 10 до 20 минут с частичным переходом в состояние максимального поглощения при 548 нм, в так называемое состояние D. В исходном типе бактериородопсина в темноте устанавливается равновесие между состояниями В и D, составляющее приблизительно 50:50. Состояние В имеет конфигурацию "all-trans", состояние D - 13-цисконфигурацию ретинала. При облучении светом бактериородопсин на 100% переходит в состояние В, при котором начинается фотоцикл, в ходе которого происходит требуемое интенсивное изменение цвета (смещение поглощения к 412 нм).

Если в течение длительного времени чернила, содержащие бактериор