Экспрессирующая конструкция, экспрессирующий вектор pedii cs150 и способ продуцирования рекомбинантного полипептида

Экспрессирующая конструкция, экспрессирующий вектор pedii cs150 и способ продуцирования рекомбинантного полипептида

Реферат

 

Данное изобретение относится к биотехнологии, в частности экспрессирующему вектору, который может использоваться в одностадийной методике очистки. Рекомбинантный белок продуцируется в виде гибридного белка с пектином, в особенности с дискоидином, в качестве маркера очистки. Гибридный белок может быть очищен на хроматографической колонке с сефарозой 4В с использованием галактозы в качестве элюента. Данное изобретение позволяет облегчить и убыстрить очистку полипептида, а также удешевить с применением более дешевых смол. 3 c. и 12 з.п. ф-лы, 6 ил.

Настоящее изобретение относится к новому экспрессирующему вектору, который может использоваться в новой методике очистки при получении полипептидов.

Увеличение уровня экспрессии рекомбинантного белка в отдельном хозяине и упрощение последующих стадий процессинга являются необходимыми для продукции соответствующих белков по низкой цене. Для этой цели были разработаны новые экспрессирующие векторы и методики очистки на основе, в числе других факторов, присутствия специфических пептидных маркеров для аффинной очистки (Smith and Pidgeon патент США 4569794; Sharma патент США 5594115; Romanos et al., 1995; Kim and Raines, 1993; Kroll et al., 1993; Smith and Johnson, 1988), детекции и/или стабилизации рекомбинантного белка (Riggs, патент США 4366246; LaVallie et al., 1993). Эти маркеры в основном могут быть удалены в результате протеолитического или химического расщепления (Норр et al. Патент США 4782137; Beghdadi et al., 1998), что обеспечивает продукцию рекомбинантного полипептида, не содержащего каких-либо посторонних аминокислот.

Основным недостатком известных способов на основе пептидных маркеров является использование специальных смол для аффинной очистки, что осложняет крупномасштабную очистку и приводит к высоким производственным ценам. Кроме того, технологии, основанные на использовании ионов металлов, приводят к модификации некоторых остатков белков, тогда как в других случаях элюирующие растворители и методики неблагоприятно влияют на каталитическую активность очищаемых белков.

Таким образом, предметом настоящего изобретения является предоставление новой экспрессирующей системы, которая делает возможной легкую и быструю очистку полипептида, производимую с помощью дешевых смол. Более конкретно, предметом настоящего изобретения является предоставление экспрессирующей системы, которая делает возможной очистку на сефарозе 4В, дешевой смоле, уже использующейся в крупномасштабных методиках очистки.

Это достигается в соответствии с данным изобретением с помощью экспрессирующей конструкции для продуцирования рекомбинантных полипептидов, эта конструкция включает экспрессирующую кассету, состоящую по меньшей мере из следующих элементов, которые являются оперативно связанными:

a) промотора;

b) кодирующей области ДНК, кодирующей белок, связывающий лектин, в основном ДНК, кодирующей член дискоидинового семейства белков в качестве маркерной последовательности очистки;

c) сайта клонирования для получения области, кодирующей искомый рекомбинантный полипептид; и

d) сигнала терминации транскрипции.

Для практического применения эта конструкция предпочтительно содержится в экспрессирующем векторе, таком как плазмида, подходящем для трансформации желаемого хозяина.

В исследовании, которое привело к созданию настоящего изобретения, возможность использования дискоидина I, лектина, регулируемого в процессе развития в D. discoideum, в качестве маркера для продукции и очистки рекомбинантных белков, исследовали с помощью экспрессирующих векторов Dictyostelium discoideum (которые, например, описаны в Fasel and Reymond патент США 5736358). Кроме того, добавление сигнального пептида может быть использовано для возвращения экспрессирующего белка в эндоплазматический ретикулум, что делает возможными вторичные модификации и секрецию (Reymond et al., 1995).

Дискоидины кодируются регулируемым в процессе развития мультигенным семейством (Poole and Firtel, 1984; Rowekamp et al., 1980; Tsang et al., 1981). У D. discoideum были описаны два класса дискоидинов, I и II. Оба являются тетрамерными белками, которые могут различаться по молекулярной массе субъединиц (интервал 2528 кДа), изоэлектической точке и пептидной карте (Frazier et al., 1975). У D. discoideum был идентифицирован один единичный ген, кодирующий дискоидин II, тогда как дискоидин I был вовлечен в клеточно-субстратную адгезию и упорядочивал клеточную миграцию в процессе аггрегации. Эта активность, по-видимому, зависит тем не менее от фибронектин-подобного клеточного связывающего сайта дискоидина I, который отличается от его углеводного связывающего сайта (Springer et al., 1984). Хотя большая часть дискоидина аккумулируется в клетке, некоторое его количество секретируется посредством еще неизвестного механизма, возможно, включенного в мультиламеллярные тела (Barondes et al., 1985). Дискоидины не содержат каких-либо ER транслокационных сигналов, и, следовательно, эти белки не являются ни секретируемыми посредством обычного секреторного механизма, ни гликозилированными, хотя в их последовательности присутствует несколько потенциальных сайтов N-гликозилирования.

В соответствии с данным изобретением теперь было обнаружено, что лектин-подобная, галактозил-связывающая активность дискоидинов может быть использована для очистки экспрессирующих гибридных белков, содержащих дискоидин и полипептид, с помощью аффинной хроматографии на сефарозе 4В и N-ацетилгалактозамин-конъюгированной агарозе, что приводит таким образом к единой системе для экспрессии и очистки рекомбинантных белков.

Отдельными преимуществами данного изобретения является то, что элюирование проводят галактозой, растворителем, который не взаимодействует с большей частью белков и/или не модифицирует их. Дополнительным преимуществом является то, что дискоидин сам не является токсичным и может легко детектироваться с помощью специфических антител. Более того, уровень продукции целевого белка может увеличиваться в случае экспрессии в виде гибрида с дискоидином. Наконец, оказалось, что ни один белок из Е. coli, клеток млекопитающих или Dictyostelium, кроме дискоидина, не связывается специфически с сефарозой и не высвобождается с помощью галактозы, что приводит к уменьшению уровня примесей в очищаемых образцах.

В экспрессирующем векторе данного изобретения маркерная последовательность очистки, например, расположена выше (относительно направления транскрипции) сайта клонирования и ниже (относительно направления транскрипции) промотора. Альтернативно маркер очистки помещают после сайта клонирования целевого белка. В обоих случаях получение гибрида маркера очистки и целевого белка позволяет проводить очистку на конкретных смолах.

Для того, чтобы сделать возможным легкое отделение маркера от экспрессирующего полипептида, сайт расщепления предпочтительно располагается между маркером очистки и сайтом клонирования целевого белка. Сайт расщепления представляет собой, например, сайт расщепления под действием тромбина. В других возможных сайтах расщепления происходит расщепление под действием фактора Х или химическое расщепление, особенно под действием CNBr. Сайт тромбинового расщепления состоит из последовательности ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность LVPRGSDP.

Сам дискоидин не направляется автоматически в специфический клеточный компартмент, так как он не включает сигнальной последовательности. Следовательно, в некоторых воплощениях экспрессирующий вектор может дополнительно содержать последовательность, кодирующую сигнальный пептид для направления продуцируемого полипептида в специфический клеточный компартмент. Эта сигнальная последовательность обычно находится ниже промотора и выше гибрида маркера очистки и последовательности целевого белка. Преимущественно сигнальный пептид представляет собой пептид, предназначенный для направления полипептида в эндоплазматический ретикулум, такой как лидерный пептид из 21 аминокислоты из белка преспоровый антиген (PsA). Это является выгодным, так как продуцируемый пептид может затем гликозилироваться и секретироваться.

В первом воплощении данного изобретения дискоидин, который составляет маркерную последовательность очистки, представляет собой дискоидин I. Другим подходящим дискоидином является дискоидин II или любой другой лектин-связывающий белок, способный связывать полимеры галактозы.

Данное изобретение в соответствии с его следующим аспектом относится к способу продуцирования полипептида, включающему:

a) получение экспрессирующего вектора для полипептида, подлежащего продуцированию, путем клонирования кодирующей последовательности полипептида в сайте клонирования экспрессирующего вектора данного изобретения;

b) трансформация подходящей клетки-хозяина экспрессирующим вектором, полученным таким образом;

c) культивирование клетки-хозяина в условиях, при которых создается возможность для экспрессии гибридного полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности маркера очистки и ковалентно связанной с ней аминокислотной последовательностью полипептида, подлежащего экспрессии;

d) выделение гибридного полипептида из клетки-хозяина или культуральной среды посредством связывания присутствующего там гибридного полипептида через связывание аминокислотной последовательности маркера очистки с полисахаридной матрицей и элюирования гибридного полипептида с матрицы; и

e) удаление аминокислотной последовательности маркера очистки.

В случае, если вектор содержит сайт расщепления, удаление маркера очистки проводят путем отщепления аминокислотной последовательности маркера очистки гибридного полипептида через сайт расщепления.

В случае дискоидина I полисахаридная матрица предпочтительно представляет собой сефарозу 4В в виде сферических частиц (в гранулированной форме), так как это вещество является дешевым и очищает в основном дискоидин I и II. Элюирование может быть затем проведено с помощью галактозы. Агарозная матрица с конъюгированными на ней N-ацетилгалактозаминовыми группами является особенно подходящей матрицей в качестве второй стадии, так как сродство дискоидина I к этой матрице относительно выше, чем дискоидина II.

Данное изобретение далее относится к новому гибридному полипептиду, который может быть получен с помощью этого способа, и к применению этих гибридных полипептидов в производстве рекомбинантных полипептидов.

В данной заявке подразумевается, что слово "промотор" охватывает цис-активную последовательность ДНК, расположенную выше 5’ сайта инициации последовательности, кодирующей полипептид, с этой последовательностью ДНК может связываться РНК-полимераза и инициировать корректную транскрипцию, а также необязательно охватывает энхансеры.

"Гибридный белок" представляет собой комбинацию аминокислотной последовательности дискоидина и аминокислотной последовательности полипептида, который должен быть экспрессирован.

Подразумевается, что термин "дискоидин" относится к лектин-связывающему белку, имеющему сродство к галактозным полимерам.

Все другие использующиеся термины имеют общепринятые в данной области значения, например, как приведено в "Dictionary of Gene Technology" by Kahl, VCH, Weinheim, Germany (1995).

В этом описании используются следующие аббревиатуры:

ER: эндоплазматический ретикулум

CS: белок, окружающий спорозоит Plasmodium

DisPfl50, Dis-PfCter, Dis-PyCter: Гибридные белки, включающие аминоконцевой маркер дискоидин Iа и соответственно остатки от Leu₁₉ до Суs₃₈₂ или от Lys₂₈₂ до Суs₃₈₂ Р. falciparum CS, или остатки от Asn₂₇₇ до ser₃₄₅ P.yoelii CS. SP-Dis-PyCter, Dis-PyCter, несущие аминоконцевой ER-транслокационный сигнал.

ТСА: трихлоруксусная кислота

PBS: фосфатный буферный солевой раствор

mAB: моноклональное антитело

Данное изобретение далее иллюстрируется нижеследующим примером, в котором экспрессия и очистка различных форм белка, окружающего спорозоит (CSP), как из Plasmodium falciparum (Pf), так и из Plasmodium yoelii (Py) в виде дискоидин I гибридных белков описывается как модельная система. Ясно, что эта система является подходящей для всех других экспрессирующих рекомбинантных полипептидов. Эти примеры не являются ограничительными, и дискоидиновые гибридные белки могут экспрессироваться в других хозяевах, таких как Е. coli, дрожжи, бакуловирус или млекопитающие. Кроме того, связывающий галактозу фрагмент дискоидина или весь дискоидин могут быть синтезированы химически и добавлены к целевому полипептиду.

В этом примере сделаны ссылки на следующие чертежи

Фигура 1:

Карта Dis-меченных гибридных белков

D. discoideum трансформационный вектор pEDII CS150 модифицируют путем замены промотора дискоидина на промотор актина 6. Всю область, кодирующую дискоидин I, амплифицируют с помощью PCR с сопутствующим добавлением нижней по ходу транскрипции последовательности, кодирующей консенсусный сайт расщепления под действием тромбина. Продукт PCR вставляют в структуру с СS-кодирующей областью. Dis-PyCter и Dis-PfCter получают путем замены фрагмента BamHI/SacI Pf150 на продукты PCR амплификации, полученные из генов CSP Р. yoelii и Р. falciparum соответственно, как описано в материалах и методах. SP-Dis-PyCter получают из DisPyCter путем замены промотора актина 6 на продукт PCR, содержащий промотор актина 15, и затем на кодирующую последовательность сигнального пептида PsA D. discoideum. (74-229) Dis-Pf150 получают путем замены последовательности, кодирующей дискоидин, на продукт PCR, кодирующий остатки от 74 до 229.

Фигура 2

Экспрессия и аффинная очистка Dis-PfCter

Растворимые экстракты от ~4×10⁸ Dis-PfCter-экспрессирующих клеток хроматографируют на колонке с сефарозой 4В объемом 1 мл, как описано в материалах и методах. Связанный белок элюируют 0,3 М раствором галактозы в TBS и собирают фракции объемом 0,7 мл.

А. Вестерн-блоттинг с использованием мышиных поликлональных антител проводят против карбоксильного конца PfCter. Специфичность антител подтверждают путем анализа растворимой фракции контрольных клеток DP4 (линия 1). Линии 2-7 показывают очистку фракций Dis-PfCter: линия 2 обозначает растворимые экстракты; линия 3 обозначает неудерживаемую на колонке фракцию; линии 4-7 обозначают 1-4 фракции, элюируемые 0,3 М раствором галактозы.

В и С. Окрашивание гелей с фракциями Dis-PfCter и DP4 Кумасси синим/Bismarck коричневым соответственно. Линия 1 обозначает растворимую фракцию; линия 2 обозначает удерживаемые фракции (содержащие вещество, заходящее в гранулы сефарозы); линии 3-6 обозначают фракции 1-4, элюируемые 0,3 М раствором галактозы.

Стрелки показывают положение рекомбинантного белка массой приблизительно 44 кДа. Около 15 мкг белка вносят для каждого из общих и удерживаемых образцов. Для фракций, элюируемых галактозой, для каждой линии вносят образец объемом, соответствующим 1/50 объема фракции.

Фигура 3

Экспрессия и аффинная очистка Dis-PyCter

А. Вестерн-блоттинг фракций Dis-PyCter с использованием J-III мышиных поликлональных антител (см. материалы и методы). Растворимые клеточные экстракты очищают, как описано в фиг.2. Линия 1 обозначает растворимую фракцию; линия 2 обозначает удерживаемую фракцию; линии 3-4 обозначают фракции 2-3, элюируемые 0,3 М раствором галактозы; линия 5 показывает, как подтверждают специфичность антител путем проведения анализа на параллельных растворимых экстрактах из контрольных клеток DP4.

В и С. Окрашивание Кумасси синим 12% гелей, содержащих очищенные на сефарозе фракции Dis-PyCter (В) и DP4 (С). Линия 1 обозначает растворимую фракцию; линии 2-4 обозначают фракции 2-4, элюируемые галактозой.

Стрелки показывают положение рекомбинантного белка массой приблизительно 35 кДа.

Фигура 4

Экспрессия и аффинная очистка Dis-Pf150

А. Растворимые клеточные экстракты очищают, как описано в фиг.2, с помощью хроматографии на сефарозе. После прохождения образцов в 10% геле Dis-Pf150 детектируют с помощью Вестерн-блоттинга, используя мышей SP3E9 (см. материалы и методы). Линия 1 обозначает растворимую фракцию; линия 2 обозначает неудерживаемый белок; линии 3-4 обозначают соответственно фракции 2 и 3, элюируемые 0,3 М раствором галактозы; линия 5 показывает, как подтверждают специфичность антител путем анализа параллельных экстрактов DP4.

В. Dis-Pf150 и (74-229)Dis-Pf150 клетки выращивают в среде HL5 до плотности, составляющей приблизительно 5×10⁶ клеток/мл. После центрифугирования приблизительно при 500 g равные аликвоты клеточного осадка (С) и супернатантной среды (М) разделяют с помощью электрофореза SDS-PAGE и CSP детектируют методом Вестерн-блоттинга, как описано в А.

С. Растворимые клеточные экстракты (74-229)Dis-Pf150 подвергают методикам, как описано в фиг.2, и анализу с помощью Вестерн-блоттинга, как в разделе А. Линия 1 обозначает растворимую фракцию; линия 2 обозначает неудерживаемый белок; линии 3-6 обозначают фракции 1-4, элюируемые 0,3 М раствором галактозы.

Стрелки показывают положение рекомбинантного белка массой приблизительно 84 кДа. Около 15 мкг белка вносят для каждого из общих и удерживаемых образцов.

Фигура 5

Гликозилирование SP-Dis-PyCter

Лизаты SP-Dis-PyCter (линии а и b) и Dis-PyCter (линии c и d) обрабатывали либо реакционным буфером (К), либо PN-глюканазой F (G) (линии 2 и 4) (линии 1 и 3) в соответствии с инструкциями производителя. После 1 ч инкубации при 37°С реакцию останавливают путем добавления 4х буфера Laemmli для образцов и PyCter анализируют методом электрофореза SDS-PAGE на 12,5% геле и Вестерн-блоттинга с использованием сыворотки мышей J-III.

Фигура 6

Тромбиновое расщепление Dis-PyCter

Клетки, экспрессирующие SP-Dis-PyCter, подвергают лизису, как описано в материалах и методах, за исключением того, что ингибиторы протеаз не были включены в лизирующий буфер. Экстракты инкубируют при 25°С в присутствии увеличивающихся концентраций тромбина, как указано на фигуре (единиц/мл). Затем PyCter детектируют, как описано на фигуре 5.

ПРИМЕР

ВВЕДЕНИЕ

Этот пример описывает конструирование нового экспрессирующего вектора, который создает возможность для продукции гибридных белков в Dictyostelium discoideum. Применение основано на способности дискоидина I связываться с сефарозой 4В, что дает возможность проводить процедуру очистки почти в одну стадию. Область, кодирующая дискоидин I, сопряжена с несколькими формами гена CSP малярийного паразита в экспрессирующем векторе Dictyostelium, что создает возможность внутриклеточной аккумуляции, а также частичной секреции через путь, не имеющий отношения к эндоплазматическому ретикулуму и аппарату Гольджи. Гибридные белки, присутствующие в клеточных экстрактах, подвергали аффинной очистке на колонках с сефарозой 4В. Добавление сигнального пептида создает возможность для распознавания в качестве мишени эндоплазматического ретикулума и гликозилирования гибридного белка. Введение тромбинового сайта расщепления делает возможным отщепление дискоидина от CSP белка. Применение стабильной и дешевой сефарозы 4В в качестве аффинной матрицы создает возможность для широкомасштабного получения.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Реагенты

Нитроцеллюлозные мембраны были получены от Schleicher & Schuell (Dassel, Germany). Реагенты для ECL-Вестерн-блоттинга были получены от Amersham.

Сефарозу 4В получали от Pharmacia (Uppsala, Sweden). D(+)-галактоза, конъюгированный с пероксидазой протеин А, туникамицин и человеческий тромбин были получены от Sigma (St. Louis, МО). Пептид: N-гликозидаза F (PNGase F) был получен от New England Biolabs (Beverly, MA), и ингибиторы протеаз - от Boehringer (Mannheim, Germany).

Конъюгированные с пероксидазой анти-мышиные иммуноглобулины козла были получены от Nordic Immunological Laboratories (Tilburg, The Netherlands). Иммуноглобулины против повтора (NANP)₃ были выделены из гибридомных клеток SP3E9 (Boulanger et al., 1988).

Мышиная сыворотка IV-4 была получена против синтетического пептида, включающего аминокислоты 282-382 из карбокси-концевой области Р. falciparum CSP (Roggero et al., 1995). Мышиная сыворотка J-III была получена против синтетического пептида, включающего аминокислоты 277-344 из карбокси-концевой области Р. yoelii CSP (M.A. Roggero and G.P. Coggadin, неопубликованные результаты).

2. Конструкции ДНК

Конструкцию Dis-Pf150 получают из pEDII-CS150 (Reymond et al., 1995), в которой промотор дискоидина заменен на промотор актина 6 и сигнальный пептид CsA на область, кодирующую дискоидин 1а. Промотор актина 6 амплифицируют методом PCR из плазмиды pDNeoII (Witke et al., 1987), используя олигонуклеотид 5’GCGCTCGAGACTAGAGAGGTTTATTTTTAA3’ в качестве 5’ амплимера, который гибридизуется с 20 нуклеотидами промотора актина 6 и содержит сайт рестрикции XhoI выше этой последовательности. В качестве 3’амплимера используют олигонуклеотид 5’TTCTCTAGACATTTTATATTATATTTATTTATTTG3’. Он гибридизуется с 23 нуклеотидами промотора актина 6 и содержит инициирующий кодон ATG и сайт рестрикции XbaI.

Амплифицируемый фрагмент начинается с нуклеотида 1663 и заканчивается инициирующим кодоном ATG (нуклеотид 948). После XhoI/XbaI двойного расщепления фрагмент ДНК вставляют в вектор pEDII-CS 150, из которого была удалена вставка XhoI/Xbal, содержащая промотор дискоидина.

Область, кодирующую дискоидин Iа, амплифицируют, используя BamHI линеаризованную pWR7 плазмиду (Poole et al., 1981) в качестве матрицы и 5’ATGTCTAGACAAGGTTTAGTTCAACTCCTCG3’ и 5’CATGAATTCTGGATCCGAACCACGTGGAACTAATTCCAAAGCGGTAGCAATGT3’ в качестве 5’ и 3’ амплимеров соответственно. 5’ амплимер соответствует первым 33 основаниям области, кодирующей дискоидин и предоставляет сайт рестрикции XbaI. 3’ амплимер начинается с 33 оснований, начиная с сайта рестрикции EcoRI и кодирующей последовательности сайта тромбинового расщепления, оптимизированной для используемого кодона D. discoideum, затем следует участок, который гибридизуется с последними 20 основаниями области, кодирующей дискоидин. Гибридный ген кодирует полипептид длиной в 629 аминокислот, включающий дискоидиновый маркер (от Met₁ до Met₂₅₇ ) и фрагмент Р. falciparum CSP длиной в 364 аминокислоты (от Leu₁₉ до Суs₃₈₂), между которыми введен тромбин-распознающий сайт длиной в 8 аминокислот (LVPRGSAP).

Для получения экспрессии С-концевого сегмента из 101 аминокислоты Р. falciparum CSP (от Lуs₂₈₂ до Суs₃₈₂) соответствующую ДНК амплифицируют из гена CS NF54 (Caspers et al., 1989), используя 5’GGTGGATCCAGGAATTCAAAAAAACAATCAAGGTAATGGA3’ и 5’AAGCGAGCTCTTAACATMCCATMACAAAT3’ в качестве 5’ и 3’ амплимеров соответственно.

5’ амплимер гибридизуется с 21 нуклеотидом гена CSP. Выше последовательности CSP 5’ амплимер содержит сайт рестрикции BamHI и 10 нуклеотидов, представляющих сайт рестрикции EcoRI и кодирующих аминокислоты G, I и Q.

3’ амплимер гибридизуется с 22 нуклеотидами гена CSP и создает возможность для вставки в этот ген UAA в рамке считывания и сайта рестрикции SacI. После двойного расщепления BamHI/SacI полученный фрагмент используют для замещения соответствующей вставки в экспрессирующем векторе DisPf150. Полученный ген кодирует полипептид длиной 369 аминокислотных остатков, включающий 257 остатков дискоидинового маркера, 8 остатков тромбинового сайта расщепления и 108 аминокислот из гена CS.

Конструкцию Dis-PyCter создают подобно Dis-PfCter, за исключением того, что продукт PCR, кодирующий С-концевой сегмент (от Asn ₂₇₇ до Ser₃₄₅) гена CS, амплифицируют из ДНК Р. yoelii 17X (de la Cruz et al., 1988) и используют для замены вставки BamHI/SacI в экспрессирующем векторе Dis-Pf150. В качестве 5’ и 3’ амплимеров используют соответственно два следующих нуклеотида:

5’ GGTGGATCCAGGAATTCAAAATGAAGATTCTTATGTCCCA3’

5’ CGTACGAGCTCTTAAGATATCAATGAACAMATCCATMAC3’

5’ амплимер гибридизуется с 21 нуклеотидом гена CSP. Выше последовательности CSP 5’ амплимер содержит сайт рестрикции BamHI и 10 нуклеотидов, представляющих сайт рестрикции EcoRI и кодирующих аминокислоты G, I и Q.

3’ амплимер гибридизуется с 20 нуклеотидами гена CSP и создает возможность для вставки в этот ген 12 дополнительных нуклеотидов, содержащих сайт рестрикции EcoRV и кодирующих линкер Lys-Ile-Ser между аминокислотами L, I, S, и стоп-кодона UAA в считывающей рамке выше сайта рестрикции SacI. Полученный ген кодирует полипептид длиной 340 аминокислот, включающий 257+8 последовательность дискоидин-тромбинового сайта, которая сопровождается 79 остатками CSP P.yoelii.

Экспрессирующий вектор для гибридного белка Dis-PyCter, содержащий аминоконцевой ER-транслокационный сигнальный пептид (PS-Dis-PyCter) получают из экспрессирующего вектора Dis-PyCter (описано выше), в котором промотор актина 6 заменен на промотор актина 15 (Knecht et al., 1986), с последующей последовательностью сигнального пептида D. discoideum PsA (Early et al., 1988). Лидерный пептид D. discoideum PsA (аминокислоты 1-21) амплифицируют методом PCR из вектора PMUW1630 (К. Williams and M. Slade, School of Biological Sciences, Macquarie University, Sydney, Australia), используя 5’AGCTCGAGATTCACAAATTAATTAATCCCATC3’ и 5’AATCTAGATTCATATGCATTGGCGTATGTTAA3’ в качестве 5’ и 3’ амплимеров.

5’ амплимер гибридизуется с 20 нуклеотидами промотора актина 15 и содержит сайт рестрикции XhoI выше этой последовательности. 3’ амплимер гибридизуется с 24 нуклеотидами гена PsA и содержит сайт рестрикции XbaI ниже этой последовательности. После амплификации и расщепления рестрикционными ферментами XhoI и XbaI фрагмент ДНК вставляют в вектор Dis-PyCter вместо промотора актина 6.

Конечный вектор кодирует белок, начинающийся с первых 21 аминокислот белка PsA (расщепление лидерного пептида имеет место после остатка 19), соединенных со второй аминокислотой дискоидина 1а (позиция аминокислот 3ТR). Таким образом, отщепление сигнального пептида в течение процессинга белка приводит к образованию гибридного белка, который всего на 1 аминокислоту длиннее, чем белок, полученный в результате экспрессии конструкции Dis-PyCter.

Укороченную форму Dis-Pf150, (74-229)Dis-Pf150, конструируют путем амплификации области ДНК, кодирующей остатки от Val₇₄ до Аsp₂₂₉ дискоидина Ia в Dis-Pf150, методом PCR, используя следующие олигонуклеотиды (3’ и 5’ амплимеры соответственно):

5’AATCTAGAGTTGCTGCTCTCCAAGGTCGTGGT3’

5’AGGGATCCATATCGAAACCMGGTGGAATGTT3’.

Продукт PCR вставляют после промотора актина 6 по способу, подобному способу конструирования Dis-Pf150, тогда как сигнальный пептид заменяют на укороченный дискоидин I.

3. Клеточная культура и трансфекция

Клетки D. discoideum аксенического штамма АХ2 трансфицировали методом электропорации с плазмидами, как описано в Anjard et al. (1992). Клональные трансформанты выбирают путем выращивания в селекционной среде G418 на "газонах" Micrococcus luteus PRF3 (Wilczynska and Fisher, 1994). Стабильные клеточные линии отбирают путем выращивания клеток при 22°С в среде HL5 (Sussman, 1987) в присутствии концентраций G418, увеличивающихся до 50-100 мкг/мл.

4. Очистка рекомбинантных белков

Культуры выращивают в HL5 до плотности приблизительно 7×10 ⁶ клеток/мл. Клетки собирают путем центрифугирования в течение 5 мин при 300 g, после чего осадки ресуспендируют в соотношении 2×10⁸ клеток/мл в лизирующем растворе, содержащем 1% тритона Х-100, 5 мМ бензамидина, 0,1 ед./мл апротинина, 50 мкг/мл ингибитора трипсина и 2 мкг/мл антипаина в TBS (25 мM Трис, рН 7,4, 137 мМ NaCl, 2,7 мМ КСl). После 1 цикла замораживания и оттаивания лизаты центрифугируют в течение 15 мин при 10000 g при 5°С. CaCl₂ доводят до концентрации 10 мМ в супернатантах, которые затем загружают на колонки с сефарозой 4В, предварительно уравновешенные в лизирующем растворе с добавлением 10 мМ CaCl₂. Для 4×10⁸ клеток используют общий объем, равный 1 мл. Колонки промывают 20 общими объемами TBS, 10 мМ CaCl₂, содержащего ингибиторы протеаз. Белок элюировали 0,3 М раствором галактозы в TBS, 0,7 общего объема на фракцию. Приблизительно 90% гибридного белка элюируется во фракциях 2-4.

5. Гельэлектрофорез и иммуноблоттинг

Образцы очищенных фракций объемом 15 мкл или растворимой фракции начальных лизатов (общая фракция) объемом 2 мкл получают с использованием 3х буфера Лаэмли для образцов (Laemmli, 1970), содержащего 200 мМ DTT, при нагревании в течение 10 мин при 80°С. Для задерживаемых на сефарозе фракций загружаемый объем доводят так, чтобы получить такое же количество белка, как в общей фракции. Белок обнаруживают либо с помощью окрашивания Кумасси синим/Бисмарк коричневым R (Choi et al., 1996), либо окрашиванием серебром (Morrissey, 1981). Вестерн-блоттинг проводят путем полусухого электропереноса на нитроцеллюлозу. После выдерживания в PBS, содержащем 4% снятого молока, мембраны инкубируют в присутствии различных типов сыворотки или mAbs, таких как Sp3E9 mАb, который был получен против синтетического (NANP)⁵⁰ - повтора, как показано в фигурах.

После 3 промываний в PBS, 0,02% твин, мембрану инкубируют в течение 1 часа в присутствии либо конъюгированной с пероксидазой анти-мышиной сыворотки козла, разбавленной 1/2000 в PBS-молоке, либо конъюгированного с пероксидазой протеина А. После промывания мембраны иммуноокрашивание обнаруживают с использованием набора ECL в соответствии с инструкциями производителя.

РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Экспрессия и очистка внутриклеточных белков, меченных дискоидином

Потенциальное применение дискоидина I в качестве маркера для очистки белков оценивали путем гибридизации его с фрагментом карбокси-концевого белка CSP P. falciparum (PfCter), включающему фрагменты аминокислот 282-382 (фиг.1). Область, кодирующую дискоидин I, амплифицировали методом PCR из геномной ДНК и добавляли подходящие сайты рестрикции для получения фрагмента, совместимого с экспрессирующим вектором D. discoideum (см. материалы и методы). Полученный вектор, рАС6-Dis-PfCter, использовали для трансформации аксенических клеток Ах2 D. discoideum методом электропорации.

После отбора стабильных трансформантов с G418 при концентрации до 50 мкг/мл экспрессию гибридного белка анализировали методом иммуноблоттинга и сравнивали с клетками, трансфицированными вектором, несущим только отбираемый маркер (DP4) (Anjard et al., 1992).

Мышиная сыворотка (IV-4), полученная против С-концевого пептида P.falciparum (Roggero et al., 1995) детектирует белок массой 44 кДа по Вестерн-блоттингу, предположительно, такой размер должен быть у белка Dis-PfCter, который отсутствует в контрольном штамме DP4 (фигура 2А). Наличие сниженной полосы показывает, что имеет место либо частичная деградация, либо неполный синтез этого белка. Накопление Dis-PfCter варьирует в зависимости от клеточной плотности и максимально составляет приблизительно 7×10⁶ клеток/мл.

Методика очистки для дискоидина I и II с использованием хроматографии на сефарозе 4В (Simpson et al., 1974) делает возможной частичную очистку Dis-PfCter (фигура 2А и С). Белок массой 44 кДа (стрелка) элюируется со смолы во второй и третьей фракциях при добавлении 0,3 М галактозы вместе с эндогенными дискоидинами (25 и 28 кДа). В Вестерн-блоттинге также обнаруживается промежуточная полоска, соответствующая 35 кДа. Отсутствие белков массой как 44, так и 35 кДа в фракциях DP4 (фигура 2В) показывает, что полоски, окрашенные Кумасси синим, действительно соответствуют Dis-PfCter или его производным. Кроме того, элюирование с использованием градиента вместо 0,3 М раствора галактозы показало, что и дискоидин I, и рекомбинантный белок элюируются совместно между 200 и 220 мМ растворами галактозы, тогда как элюирование дискоидина II было слегка сдвинуто в сторону более высоких концентраций галактозы (данные не показаны). С помощью такой процедуры выделяли приблизительно 1-2 мг гибридного белка на литр культуры, что определяли по анализу Брэдфорда (Bradford, 1976) и денситометрическому анализу гелей, окрашенных Кумасси (Choi et al., 1996). Рассчитанный фактор очистки является приблизительно 30-кратным. Эффективность извлечения варьирует между 50 и 70%, как определено методом Вестерн-блоттинга, в основном в зависимости от использующегося в эксперименте соотношения сефароза/белок. Взяв вместе эти результаты, можно оценить, что Dis-PfCter составляет по меньшей мере 1% от растворимых белков D. discoideum.

Далее анализировали, могут ли другие белки связываться с Dis-маркером, не влияя неблагоприятным образом на его способность связываться с сефарозой. С-концевая область CSP из Р. yoelii (PyCter) имеет аминокислотный состав, отличающийся от аминокислотного состава PfCter (de la Cruz et al., 1988). ДНК, кодирующую остатки 277-344 CSP P. yoelii, клонировали в рамке считывания с последовательностью, кодирующей дискоидин I, и полученный ген помещали под контроль промотора актина 6. Мышиная сыворотка (J-III), полученная против карбоксильного конца CSP P. yoelii (см. материалы и методы) определяла полосу, соответствующую приблизительно 35 кДа в клетках D. discoideum, трансформированных плазмидой рАС6-Dis-PyCter (фигура 3А). Связывание гибридного белка Dis-PyCter с сефарозой 4В и элюирование галактозой, как в случае с Dis-PfCter (фигура 3А), позволяет детектировать белок с массой приблизительно 35 кДа методом окрашивания Кумасси синим. Белок Dis-PfCter накапливается приблизительно до 0,2 мг на литр культуры. Таким образом, эти результаты подтверждают возможность применения дискоидина I в качестве маркера для очистки рекомбинантных полипептидов.

Для того, чтобы проверить, действительно ли более крупные белки могут быть экспрессированы с использованием дискоидин I гибридного вектора, CS150, форма PfFCSP, утратившая только последние 23 аминокислоты (Reymond et al., 1995), была подвергнута гибридизации с дискоидином I и экспрессирована в D.discoideum. Хотя экспрессия проходила на более низком уровне, чем в случае с Dis-PfCter (приблизительно 0,1 мг на литр), детектировали полосу, соответствующую приблизительно 84 кДа, в иммуноблоттинге клеточных лизатов с окрашиванием либо SP3E9 моноклональными антителами против (NANP)₃ повтора (Boulanger et al., 1988) (фигура 4А), либо мышиной сывороткой против CSP_282-382 (данные не показаны). Этот белок может быть очищен методом аффинной хроматографии на сефарозе в условиях, подобных описанным для Dis-PfCter и Dis-PyCter.

Для дополнительного подтверждения специфичности связывания гибридных белков с сефарозой первые 73 аминокислоты дискоидина I были удалены и полученный пептид был подвергнут гибридизации с Р. falciparum CS 150 ((74-229)Dis-Pf150). (74-229)Dis-Pf150 не обладал способностью связываться с сефарозой 4В, это показывает, что остатки 1-73 амино-конца дискоидина I являются необходимыми для проявления его связывающей активности (фиг.4В).

2. Экспрессия и очистка внеклеточных дискоидин-меченных белков

Так как было показано, что D. discoideum выделяет дискоидины (Barondes et al., 1983; Barondes et al., 1985), исследовали присутствие Dis-меченных белков во внеклеточной среде и оценивали их сродство к сефарозе 4В. И Dis-PfCter, и Dis-Pf150 могли детектироваться в культуральной среде методом Вестерн-блоттинга, достигая уровней между 20 и 50% от общего количества продуцируемого гибридного белка (фиг.4С и не показанные данные). Затем возник вопрос, действительно ли дискоидиновый фрагмент требуется для секреции посредством делеционного мутанта с пропущенными первыми 72 аминокислотами дискоидина. Хотя (73-229)Dis-Pf150 накапливался внутри клетки на уровне, подобном уровню Dis-Pf150 с полной цепью, во внеклеточной среде гибридного белка не детектировали (фиг.4С). Эти результаты позволяют предположить, что для того, чтобы секреция имела место, требуется целостность дискоидинового маркера.

3. Добавление ER сигнального пептида приводит к N-гликозилированию Dis-PyCter

Путь, используемый дискоидинами I и II для достижения внеклеточного пространства, не был до конца исследован. Аминокислотная последовательность дискоидина I содержит 4 потенциальных Asn-X-Ser/Thr-X сайта N-гликозилирования. Однако отсутствие сигнального пептида, а также отсутствие публикаций по гликозилированию дискоидинов показывает, что этот белок достигает внеклеточного пространства с помощью пути, который, возможно, не включает эндоплазматический ретикулум (ER) и аппарат Гольджи.

Для того, чтобы специфично направить гибридный белок к секреторному пути ER/Гольджи, сигнальный пептид из клеточного поверхностного антигена D. discoideum PsA (Early et al., 1988) подвергали гибридизации с N-концом Dis-PyCter. Белок SP-Dis-PyCter не секретировался (данные не показаны). Кроме того, SP-Dis-PyCter был не способен связываться с сефарозой 4В (данные не показаны). Белок SP-Dis-PyCter экспрессировался на уровне, подобном уровню Dis-PyCter, что было показано методом Вестерн-блоттинга, но был приблизительно на 15 кДа больше, чем последний (см. фиг.5).

Различие в 15 кДа, наблюдаемое между SP-Dis-PyCter и Dis-PyCter в клеточных лизатах, является больше, чем 19 аминокислот самого сигнального пептида. Так как в дискоидине I существует 4 потенциальных сайта N-гликозилирования (39-42 NGTN, 97-100 NLSW, 212-215 NQTR, 222-225 NITT) плюс один дополнительный сайт на экспрессирующей последовательности CSP P. yoelii (328-331 NLTL), увеличение размера может являться следствием гликозилирования SP-Dis-PyCter.

Действительно, обработка глюконазой F приводит к сдвигу полосы SP-Dis-PyCter по размеру вниз приб