Модифицированная молекула фно человека, способная индуцировать образование нейтрализующих антител к человеческому фно, днк, ее кодирующая, вектор (варианты), способ получения, вакцина против фно (варианты), способ тестирования на присутствие фно, способ тестирования жидкостей тела человека, способ диагностики, способ лечения и профилактики, медикамент для лечения

Модифицированная молекула фно человека, способная индуцировать образование нейтрализующих антител к человеческому фно, днк, ее кодирующая, вектор (варианты), способ получения, вакцина против фно (варианты), способ тестирования на присутствие фно, способ тестирования жидкостей тела человека, способ диагностики, способ лечения и профилактики, медикамент для лечения

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии, генной инженерии и медицине и может быть использовано для получения модифицированной молекулы ФНО человека, способной индуцировать образование нейтрализующих антител. Модифицированную молекулу ФНО человека, способную увеличивать количество нейтрализующих антител к человеческому ФНО дикого типа после введения человеку-реципиенту модифицированной молекулы ФНО, получают путем замены по меньшей мере одного пептидного фрагмента молекулы ФНО человека на по меньшей мере один пептид, содержащий иммунодоминантный эпитоп для Т-клетки, или создания усеченной формы вышеуказанной молекулы, содержащей иммунодоминантный эпитоп и одну или обе фланговых области молекулы ФНО человека, содержащие по меньшей мере один ФНО эпитоп для В-клетки, причем замена приводит к существенному изменению аминокислотной последовательности переднего -слоя в любой из соединительных петель и/или в любой из В, I или D цепей заднего -слоя. Модифицированные молекулы ФНО человека или ДНК, кодирующие их, используют в рецептурах в качестве вакцин против ФНО по выбору с фармацевтически приемлемыми веществами, повышающими иммуногенность антител, для предотвращения или лечения хронических воспалительных заболеваний, таких как ревматоидный артрит и воспалительные заболевания кишечника, рак, рассеянный склероз, диабет, псориаз, остеопороз или астма. Жидкости тела человека исследуют на присутствие ФНО при контакте с составом, содержащим модифицированный ФНО. Изобретение позволяет разрабатывать средства для лечения хронических воспалительных заболеваний. 12 с. и 25 з.п. ф-лы, 16 ил., 3 табл.

Область техники

Данное изобретение относится к молекулам цитокина человека - Фактора Некроза Опухолей (ФНО), которые были модифицированы так, что они оказались способны повышать содержание нейтрализующих антител к человеческому ФНО дикого типа после введения модифицированной молекулы ФНО человеку-реципиенту. Изобретение также относится к вакцинам против ФНО человека на основе вышеуказанных модифицированных молекул ФНО. Прочие аспекты изобретения станут ясны из нижеследующего описания.

Уровень техники

Физиологически иммунная система позвоночных служит в качестве защитного механизма против инвазии организма инфекционными объектами, такими как микроорганизмы. Чужеродные белки эффективно удаляются при посредстве ретикулоэндотелиальной системы с помощью высокоспецифичных циркулирующих антител, а вирусы и бактерии разрушаются при помощи сложной группы клеточных и гуморальных механизмов, включающих антитела, цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ), клетки - натуральные киллеры (НК), комплемент и т.п. Лидером в этой борьбе является лимфоцит Т-хелпер (Т _х), который вместе с Антиген-Представляющими Клетками (АПК) регулирует иммунную защиту через сложную систему цитокинов.

Т_х-лимфоциты распознают белковые антигены, представленные на поверхности АПК. Однако они не распознают нативные антигены как таковые. Вместо этого они, по-видимому, распознают комплексный лиганд, состоящий из двух компонентов, “обработанного” (фрагментированного) белкового антигена (так называемого эпитопа для Т-клетки) и молекулы класса II Основного Комплекса Гистосовместимости (ОКГ) (О.Werdelin et al., Imm. Rev. 106, 181 (1988)). Это распознавание, в конечном счете, позволяет Т_х-лимфоцитам специфически помогать В-лимфоцитам продуцировать специфические антитела к интактному белковому антигену (Werdelin et al., см. выше). Определенная Т-клетка распознает только определенную комбинацию антигена-ОКГ и не будет распознавать тот же или другой антиген, представленный продуктом другой аллели гена ОКГ. Этот феномен называется ограниченностью ОКГ.

АПК также представляют фрагменты собственных белков, но в норме такие фрагменты игнорируются или не распознаются лимфоцитами-Т-хелперами. Это основная причина, по которой у индивидуумов в сыворотке обычно не накапливаются аутоантитела, в конечном итоге, приводящие к повреждению собственных белков индивидуума (так называемые собственные или аутобелки). Однако в редких случаях процесс идет неправильно, и иммунная система обращается против собственных компонентов индивидуума, что может приводить к аутоиммунному заболеванию.

Присутствие некоторых собственных белков невыгодно в ситуациях, в которых они при повышенных концентрациях вызывают симптомы заболевания. Так, известно, что фактор некроза опухолей (ФНО) может вызывать кахексию у больных раком и больных, страдающих другими хроническими заболеваниями (H.N.Langstein et al. Cancer Res. 51, 2302-2306, 1991). ФНО также играет важную роль в воспалительном процессе (W.P. Arend et al. Arthritis Rheum. 33, 305-315, 1990), и поэтому было продемонстрировано, что нейтрализация ФНО путем использования моноклональных антител полезна для больных с хроническими воспалительными заболеваниями, такими как ревматоидный артрит (Elliott et al., Lancet 194, 344:1105-10) и болезнь Крона (van Dullemen et al., Gastroenterology 109 (1): 129-135 (1995). Поэтому существует потребность в способе индукции образования нейтрализующих антител к таким белкам ФНО, и данное изобретение включает вакцину против ФНО, которая обладает этим свойством.

ФАКТОР НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ

1. Основные исходные данные

Фактор некроза опухолей (ФНО) является представителем регуляторных белков семейства цитокинов (см. Walsh, G. and Headon, D.E., Protein Biotechnology, 1994, John Wiley & Sons Ltd., England, p.257-267), которое также включает интерфероны и интерлейкины. В настоящее время известны две формы ФН, ФНО и ФНО соответственно. Хотя оба белка связываются с одними и теми же рецепторами и вызывают очень сходные биологические реакции, они являются различными молекулами и гомологичны менее чем на 30%. Исходный белок, названный фактором некроза опухолей, на который ссылаются как на ФНО, более правильно называть ФНО; он также известен как кахектин. На ФНО также ссылаются как на лимфотоксин.

В дополнение к клеткам мозга и печени, ФНО продуцируется многими типами клеток, в особенности активированными макрофагами, моноцитами, некоторыми Т-лимфоцитами и НК-клетками. Наиболее сильным из известных индукторов синтеза ФНО является сложная биомолекула, называемая липополисахаридом (ЛПС). Она содержит как липидный, так и полисахаридный компоненты и также упоминается в качестве эндотоксина. Сам по себе липополисахарид лишен противоопухолевой активности. Было обнаружено, что сыворотка животных, которым вводили липополисахарид содержит фактор, токсичный для раковых клеток, и этот фактор, продуцируемый специфическими клетками в ответ на липополисахарид, был назван фактором некроза опухолей. Многие другие агенты, такие как некоторые вирусы, грибки и паразиты, также стимулируют синтез и выделение этого цитокина. Более того, ФНО может действовать аутокринным образом, стимулируя свою собственную продукцию.

Нативный ФНО человека является гомотримером, состоящим из трех идентичных полипептидных субъединиц, плотно соединенных вокруг общей оси симметрии, как будет дополнительно разъяснено ниже. Эта конструкция напоминает сборку белковых субъединиц во многих белках вирусных капсидов. Отдельные полипептидные субъединицы ФНО человека не гликозилированы и состоят из 157 аминокислот. Молекула имеет молекулярную массу 17300 Да и содержит одну внутрицепочечную дисульфидную связь. ФНО человека синтезируется вначале из молекулы-предшественника, состоящей из 233 аминокислот. Протеолитическое отщепление предпоследовательности от -76 до -1, включающей сигнальную последовательность, освобождает нативный ФНО. ФНО может также существовать в мембраносвязанной форме с молекулярной массой 26000 Да. Три мономерных субъединицы ФНО соединяются нековалентно с образованием тримера, как объяснено ниже.

ФНО вызывает свои биологические эффекты при связывании со специфическими рецепторами, присутствующими на поверхности восприимчивых клеток. Идентифицированы два различных типа рецепторов для ФНО. Один рецептор (ФНО-R55) имеет молекулярную массу 55000 Да, тогда как второй рецептор (ФНО-R75) имеет молекулярную массу примерно 75000 Да. Эти два различных типа рецепторов обнаруживают гомологию последовательностей, не превышающую 25%. ФНО-R55 присутствует в широком диапазоне клеток, тогда как распространенность ФНО-R75 рецепторов более ограниченная. Оба рецептора являются трансмембранными гликопротеинами с экстраклеточным связывающим доменом, гидрофобным трансмембранным доменом и внутриклеточным эффекторным доменом.

Точные молекулярные механизмы, при помощи которых ФНО индуцирует свои биологические эффекты, еще предстоит определить. Связывание ФНО с его рецепторами, по-видимому, запускает, помимо активации аденилатциклазы, фосфолипазы А и протеинкиназ, разнообразные явления, опосредуемые G-белками. Точные биологические эффекты, вызываемые ФНО, могут варьировать у разных типов клеток. Другие факторы, такие как присутствие других цитокинов, дополнительно модулируют наблюдаемые молекулярные эффекты, объясняемые действием ФНО на чувствительные клетки.

Ген ФНО был клонирован и внедрен в различные рекомбинантные системы экспрессии, как бактериальные, так и эукариотические. Доступность в результате этого больших количеств очищенного, биологически активного ФНО облегчила клиническое исследование многих заболеваний, особенно рака. Однако многие из этих исследований с использованием ФНО, отдельно или в комбинации с интерферонами, дали весьма противоречивые результаты. Большие количества ФНО нельзя вводить больным из-за их токсических - если не летальных - побочных эффектов.

Как указано выше, продолжительная продукция неблагоприятно повышенных концентраций ФНО также участвует в развитии кахексии, синдрома истощения, часто связанного с хроническими паразитарными или прочими инфекциями и с раком. ФНО также участвует в метастазировании и росте некоторых опухолей, а также в индукции анемии. Более того, ФНО непосредственно участвует в развитии некоторых хронических воспалительных заболеваний у людей, включая ревматоидный артрит и болезнь Крона, при которых была показана полезность введения моноклональных антител к ФНО. ФНО также участвует в развитии остеопороза и псориаза. Кроме того, в модельных опытах на животных было показано, что введение антител к ФНО может снижать или предотвращать отторжение пересаженных или трансплантированных тканей.

Структура ФНО

1. Введение

Пространственная структура фактора некроза опухолей человека (ФНО) была установлена (см. монографию "Tumor Necrosis Factors, Structure, Function and Mechanism of Action", изданную Bharat B. Aggarwal и Jan Vilcek, 1992 Marcel Dekker, Ind., New York, Глава 5 “Кристаллическая структура ФНО", авторы Jones, E.Y., Stuart, D.I. и Walker N.P.C.). Биологическое действие ФНО зависит от его взаимодействия с его рецепторами. Эти взаимодействия регулируются точной конструкцией корректно сложенной третичной структуры. Таким образом, чтобы понять, как молекула ФНО выполняет свою биологическую функцию на уровне взаимодействий аминокислот, необходимо не только знать последовательность аминокислот, но и пространственную структуру.

II. Пространственная структура

При помощи аналитического ультрацентрифугирования, рассеяния рентгеновского излучения под малым углом и гель-электрофореза было показано, что биологически активный ФНО находится в растворе в тримерной конформации, а исследования с перекрестным связыванием показали, что это активная форма белка (Smith and Baglioni, 1987, J.Biol. Chemistry 252, 6951-6954). Опыты со связыванием показали, что тример минимум в 8 раз более активен, чем мономер. Экспериментальные доказательства свидетельствуют, что и натуральный, и рекомбинантный ФНО при физиологических условиях существуют преимущественно в форме тримера. Анализ спектров кругового дихроизма поместил ФНО в класс белков со слоистой структурой (см. статью Davis et al., Biochemistry 1987, 26, 1322-1326, где описаны результаты структурного анализа очищенного рекомбинантного ФНО при помощи титрования сульфгидридных групп, гельфильтрации и кругового 20 дихроизма). Несколько различных кристаллических форм было описано для рекомбинантного ФНО человека. Все описанные кристаллические формы обнаруживают кристаллографическую и некристаллографическую тройную симметрию, являющуюся показателем присутствия ФНО в кристалле в виде тримера. Тримеры ФНО лежат в свободно упакованном порядке, перфорированном каналами, заполненными растворителем, диаметром 10 нм. Только небольшая доля поверхности молекулы участвует в контактах кристаллической упаковки. Такие контакты могут слегка изменять положение некоторых боковых цепей и, возможно, даже коротких участков, по существу гибкой, основной цепи по сравнению с предпочитаемыми ими конформациями в растворе.

А. Укладка основной цепи мономера ФНО

Общая форма отдельной субъединицы тримера ФНО, состоящей из 157 аминокислот, напоминает клин с высотой примерно 5,5 нм и максимальной шириной в 3,5 нм вблизи основания. Топология основной цепи иллюстрируется фиг.1а-с; она по существу является структурой типа -сандвича, образованной двумя антипараллельными -складчатыми слоями. Укладка основной цепи соответствует классическому мотиву “рулета с начинкой” (фиг.1с) (обычному для белка вирусного капсида). Номенклатура, принятая на фиг.1 для маркировки блоков вторичной структуры, соответствует установленному порядку для вирусных структур. Присутствуют все восемь стандартных -цепей (от В до I), но со вставкой между В и С, которая добавляет короткую цепь на краю обоих -слоев и обрезает N-терминальную половину С, так что каждый -складчатый слой содержит пять антипараллельных -цепей, задний -слой включает -цепи В, В, I, D и G и передний слой включает -цепи С, С, Н, Е и F.

N-конец очень гибок. Эта область, вплоть до остатка 10 (см. фиг.1b), является довольно независимой от остальной молекулы, и несколько первых остатков свободно принимают различные конформации в растворителе. В противоположность этому С-конец погружен в основание заднего -слоя и образует неотъемлемую часть этого относительно плоского блока вторичной структуры. Чередование -цепей разной длины и вставка между -цепями В и С совместно образуют переднюю поверхность, образованную почти полностью из петель, и это та “замаскированная” сторона -сандвича, которая в тримере обращена к растворителю. Кристаллографические данные позволили измерить относительную гибкость различных частей структуры, -цепи образуют довольно негибкую конструкцию; в частности, задний -слой расположен в ядре тримера и вследствие этого особенно жесток. Как и следовало ожидать, петли, которые украшают наружную, доступную для растворителя поверхность молекулы, обнаруживают высокие уровни гибкости/подвижности. В целом, происходит общее снижение ригидности, по мере того как ядро становится более свободно упакованным в верхней половине молекулы.

Б. Общая топология тримера ФНО

Три мономерных субъединицы ФНО соединяются нековалентно с образованием компактного, конической формы тримера, имеющего длину примерно 5,5 нм и максимальную ширину 5 нм. -цепи трех отдельных -сандвичей лежат приблизительно параллельно (наклон равен примерно 30°) общей оси тримера. Взаимодействие между субъединицами, относящееся к общей оси, осуществляется путем простой упаковки -сандвича типа “край-к-грани”; край -сандвича, состоящий из цепей F и G одной субъединицы, лежит поперек заднего -слоя [GDIBB] одной из трех родственных субъединиц (см. фиг.2). Карбоксильные концы лежат близко к общей оси. Способ упаковки “край-к-грани” обеспечивает исключительно плотное соединение субъединиц. Поэтому ядро тримера абсолютно недоступно для растворителя.

С. Распределение различных типов аминокислот

Общее распределение типов остатков в пространственной структуре ФНО подчиняется общему правилу для белков: а именно гидрофобные остатки группируются в ядре молекулы, тогда как заряженные остатки декорируют поверхность. Поэтому ядро сандвича ФНО, как и ожидалось, заполнено плотно упакованными крупными неполярными остатками.

Энергетика системы не благоприятствует существованию ФНО в виде мономера. Для большой поверхности раздела, состоящей из комплементарных остатков (т.е. полярных остатков, образующих пару с полярными остатками), отсутствие поверхности, доступной для растворителя, обеспечивает значительную энергетическую выгодность образования олигомера (например, тримера). Обнажение для растворителя большой зоны высокогидрофобных остатков, в норме погруженных в нижний участок поверхности раздела тримера, также действовало бы дестабилизирующе на мономер ФНО.

2. Иcследования структуры функции

А. Взаимодействия ФНО/антитела

Наблюдалось, что антитела, накопленные к ФНО у одного вида (например, человека), не вступают в перекрестную реакцию с ФНО другого вида животных (например, мыши), несмотря на идентичность последовательностей, превышающую 80%, и способность ФНО связываться с ФНО-рецепторами других видов. Если степень вариации последовательности картировать на пространственной структуре, сразу же становится ясно, что зоны молекулы с наиболее вариабельными последовательностями соответствуют поверхностным петлям, доступным для антител. Области высококонсервативных остатков внутри сандвича или на поверхности раздела тримера эффективно не видимы для антител. Поэтому эпитоп для антитела к ФНО всегда будет содержать несколько остатков, которые будут варьировать у разных видов, устраняя таким образом связывание антител. Это означает, что характеристики взаимодействия между ФНО и его рецептором должны как-то отличаться от характеристик, необходимых для связывания антитела с ФНО.

Б. Сайт-нaправленный мутагенез

Роль различных специфических остатков и областей молекулы ФНО по отношению к ее биологической (цитотоксической) активности и связыванию с рецептором была исследована путем замены этих остатков на различные аминокислоты или удалением части последовательности с использованием методик целенаправленного мутагенеза (Jones et al, op. Cit. P.113-119).

Удаления до восьми остатков с N-конца без какого-либо вредного эффекта на биологическую активность достаточно для того, чтобы подчеркнуть несущественность этой области для общей стабильности молекулы. N-концевые остатки, по-видимому, оказывают непрямое, вторичное влияние на биологическую эффективность тримера ФНО.

Неконсервативные замены в норме высококонсервативных остатков, которые образуют плотно упакованную сердцевину -сандвича, нарушают структуру и, следовательно, уничтожают биологическую активность ФНО (Yamagishi et al., Protein Engeneering, Vol.3, N 8, p.713-719 (1989)). Многие из таких мутантных белков (мутеинов) не могут образовывать стабильную, правильно сложенную молекулу. Некоторые консервативные замены допустимы внутри гидрофобной зоны у основания общей оси; однако, по-видимому, значительно большие вариации существуют в более свободно упакованной области вблизи вершины тримера. В частности, Цистеин 69 и Цистеин 101, которые образуют дисульфидный мостик между двумя соединительными петлями на свободно упакованной вершине молекулы, относительно нечувствительны к изменениям (см. фиг.1а). Тем не менее, в целом, чтобы сохранить определенную биологическую активность ФНО, мутации вблизи центральной оси ФНО должны быть высококонсервативными, сохраняющими общую форму ФНО.

Остатки на поверхности молекулы имеют значительно большую свободу для мутаций без губительных для структуры последствий, что подтверждается увеличением числа вариаций остатков в этой категории у разных видов. Поэтому резкое снижение биологической активности ФНО из-за замен в этой области указывает на прямое участие этих остатков в функциональном взаимодействии тримера ФНО с его рецептором. Такими остатками, по-видимому, являются остатки, включающие Аргинин 31, Аргинин 32 и Аланин 33, расположенные в соединительной петле между В и В-цепями заднего -слоя, Серин 86 и Тирозин 87, расположенные в соединительной петле между Е и F нитями переднего -слоя, и Глутаминовая кислота 146, расположенная в соединительной петле между Н-нитью переднего -слоя и I-нитью заднего -слоя (см. фиг.3). Они, по-видимому, приходятся на две разные “горячие зоны” на передней и задней сторонах мономера ФНО. Распределение всех вредных мутаций безотносительно к структурной категории еще более подкрепляет эту картину. Существование таких “горячих областей” для чувствительности биологической функции к мутациям было описано Yamagishi et al., op. cit., и Goh et al. Protein Engeneering, Vol.4, № 4, p. 385-389 (1991).

Исследования мутаций полипептидов ФНО человека были описаны во многих патентных публикациях.

Так, в документе ЕП 251037 описаны многочисленные сайт-специфически мутировавшие молекулы ФНО, которые были растворимыми и обладали цитотоксической и противоопухолевой активностью, характерной для ФНО человека, in vitro и/или in vivo.

Другие мутеины с активностью ФНО описаны в документе WO 90/07579. Мутеины с более высокой аффинностью к рецептору р75-ФНО человека, чем к рецептору р55-ФНО человека, описаны в документе ЕР-А-619 372.

Ни одна из этих процитированных публикаций, включенных в данное описание посредством ссылок на них, не раскрывает сущности модификации молекулы ФНО, имеющей целью уничтожить биологическую активность ФНО и обеспечить способность индуцировать образование антител к человеческому ФНО дикого типа.

Тем не менее, они дают полезную основополагающую информацию относительно ФНО и его биологического действия. Кроме того, в них раскрыты сущность получения и экспрессии аналогов ФНО и их формулы; описаны также анализы связывания с рецепторами.

3. Резюме

В настоящее время можно привести многообразныее данные, относящиеся к специфическому взаимоотношению структуры и функции ФНО. Все имеющиеся доказательства указывают на важность тримера как стабильной природной единицы. Очевидно, что две “горячих” области, расположенные на разных сторонах мономера ФНО, тесно сближены друг с другом у соседних субъединиц тримера. Поэтому функционально значимая область, состоящая из остатков 31-35, 84-87 и 143-148, по-видимому, расположена на поверхности раздела между двумя субъединицами на нижней половине тримера. Yamagishi et al. op. cit. сообщил об отсутствии способности к связыванию с рецептором и цитотоксичности при мутации с заменой Аспарагиновой кислоты в положении 143 на Тирозин, a Tsujimoto et al., J.Biochem. 101, р. 919-925 (1987) описал сходный эффект для замены Аргинина 31 и Аргинина 32 на Аспарагин и Треонин. Таким образом, этот сайт может быть непосредственно связан со связыванием с рецептором и цитотоксичностью. Интересно, что область связывания с рецептором ФНО, по-видимому, лежит на поверхности раздела между двумя субъединицами.

В целом, подробное описание трехмерной структуры ФНО служит для объяснения широкого спектра наблюдений относительно связывания антител, олигомеризации и целенаправленного мутагенеза. Если рассматривать структуру совместно с недавно полученными, многочисленными целенаправленными мутантами, область, имеющая биологическое значение в отношении связывания с рецептором, по-видимому, расположена на субъединицах в нижней половине тримера.

Характеристика аналогов

Согласно изобретению, раскрытому в документе WO 95/05849, авторами которого являются некоторые из авторов настоящего изобретения, предложен способ модификации собственных белков таким образом, чтобы индуцировать реакцию антител против немодифицированного собственного белка, где аналог собственного белка обеспечивается средствами молекулярной биологии. В частности, один или несколько пептидных фрагментов собственного белка замещают одним или несколькими пептидными фрагментами, содержащими иммунодоминантные, чужеродные эпитопы для Т-клеток.

До изобретения, описанного в WO 95/05849, была известна конъюгация пептидов или белков, включая собственные белки, с белками-носителями, включающими эпитоп для Т-клетки. Документ WO 92/19746 раскрывает сущность рекомбинантного полипептида, включающего последовательность LHRH, один или несколько эпитопов для Т-клеток и сайт стерилизации, который пригоден для использования в вакцинах для иммунокастрации животных.

В WO 95/05849 признано предпочтительным, чтобы иммунодоминантный эпитоп для Т-клетки был встроен так, чтобы на каждой стороне встроенного эпитопа были сохранены фланговые области исходного белка, включающие, по меньшей мере, 4 аминокислоты. Другими словами, эпитоп не должен быть конъюгирован с собственным белком как белок слияния. Предпочтительно замещение должно быть произведено так, чтобы по существу сохранить третичную структуру исходного белка. Кроме этого, не дано специфических указаний относительно внутримолекулярного положения встроенного эпитопа, оптимального для обеспечения наиболее мощной реакции антител против немодифицированного собственного белка. Предположительно, оно будет разным для разных собственных белков, но на основании общего принципа спецификации наиболее подходящее положение(я) может быть определено без чрезмерного экспериментирования путем селекции пептидов, включающих соответствующие иммунодоминантные эпитопы, замены пептидных последовательностей по существу одинаковой длины в различных частях молекулы собственного белка и оценки повышенной реакции антител при помощи подходящих методик анализа.

При использовании современных средств моделирования, вероятно, очень трудно предсказать, приведет ли замена одного или нескольких пептидных фрагментов в белке к изменению третичной структуры исходного белка. Поэтому при поиске ключевых соединений в программах разработки лекарственных средств необходимо на ранней стадии разработки принять решение о проведении стандартной процедуры скрининга, чтобы оценить, сохранил ли модифицированный собственный белок третичную структуру исходного белка. Это может быть выполнено с использованием нескольких экспериментальных методик, которые были описаны в многочисленных руководствах по определению характеристик белков, например флуоресцентной спектроскопии, кругового дихроизма в ближнем УФ-диапазоне, инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье и многомерных ЯМР методик (Physical Methods to Characterize Pharmaceutical Proteins", Biotechnology Vol. 7 Eds. J.N. Herron, W. Jiskoot & D.J.A. Crommelin, Plenum Press, New York (1995)). В идеале, в процессе скрининга ключевых соединений следует комбинировать две или несколько экспериментальных методик, указанных выше, чтобы оценить, возникло или нет изменение третичной структуры.

Краткий перечень чертежей

Фиг.1(а) иллюстрирует кристаллическую структуру нативного мономера ФНО. Данная фигура представляет собой схематическое изображение укладки субъединицы, -цепи показаны в виде толстых стрелок в направлении от аминогруппы к карбоксигруппе, а соединительные петли изображены в виде тонких линий. Дисульфидный мостик обозначен молнией, а область высокой гибкости поперечно заштрихована. Для этой ориентации общая ось симметрии тримера будет вертикальной.

Фиг.1(b) является чертежом С цепи кристаллической структуры мономера ФНО. Это подробное изображение следует использовать вместе с фиг.1(а), чтобы получить точное сопоставление аминокислотной последовательности с более понятным, но стилизованным изображением укладки субъединицы.

Фиг.1(с) изображает структуру ФНО как мотив “рулета с начинкой”. Вставка между -цепями В и С показана в виде пунктирной линии; соединение между В и С идет прямо поперек вершины молекулы.

Фиг.2 изображает упаковку -сандвичей типа край-к-грани в тримере ФНО. Вид в направлении общей оси изображает узкий срез тримера с -цепями, изображенными как ленты, идущие в страницу и из нее.

Фиг.3(а) иллюстрирует нуклеотидную последовательность ДНК, кодирующую фактор некроза опухоли (ФНО), имеющий последовательность аминокислот, показанную на фиг.3(b).

Нуклеотидную последовательность ДНК можно получить в Банке Генов под инвентарным № М10988, SEQ ID №:339737.

Последовательность была описана Wang et al., Science 228, 149-154 (1985). Последовательность включает кодоны, кодирующие -76--1 предпоследовательность ФНО человека.

Полная последовательность нуклеотидов гена, включающая интроны, была описана Nedwin et al., Nucleic Acids, Res. 13 (17) 6361-6373 (1985), Shirai et al., Nature 313 (6005), 803-806 (1985) и Dennica et al., Nature 312 (5996), 724-729 (1984).

Фиг.3(b) показывает аминокислотную последовательность ФНО человека, включающую предпоследовательность -76--1.

Фиг.4(а) схематически иллюстрирует замены на иммунодоминантные эпитопы Р2 и Р30 в ФНО дикого типа (ДТ) с образованием аналогов ФНО от ФНO2-1 до 2-7 и от ФНО30-1 до 30-5.

Фиг.4(b) показывает точные положения замен в ДТ последовательности для отдельных аналогов ФНО.

Фигуры 5(а) и 5(b) показывают структуру аналогов на основе фиг.1(а), где отдельные замены на Р2 и Р31 в цепях -слоев и соединительных петлях, соответственно помечены черным цветом.

Фиг.6 показывает биологическую активность аналогов ФНО в пробе L929 (Meager, A., Leung, Н., & Wooley, J. Assays for Tumor Necrosis Factor b related cytokines., J. Immunol. Meth. 116, 1-17 (1989)) по сравнению с рекомбинантным ФНО.

Фиг.7 показывает реакцию антител к ФНО человека у кроликов при вакцинации кроликов молекулами модифицированного ФНО.

Фиг.8 показывает способность Р2/Р30-модифицированных молекул ФНО человека индуцировать образ