Молекула днк, кодирующая полипептид, способный связываться с внутриклеточным доменом рецептора лиганда fas(fas-ic), полипептид, способ его получения, вектор, способ модуляции действия лиганда fas-r на клетки (варианты), фармацевтическая композиция (варианты), спрособ выделения и идентификации белка

Молекула днк, кодирующая полипептид, способный связываться с внутриклеточным доменом рецептора лиганда fas(fas-ic), полипептид, способ его получения, вектор, способ модуляции действия лиганда fas-r на клетки (варианты), фармацевтическая композиция (варианты), спрособ выделения и идентификации белка

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генной инженерии, и может быть использовано для получения белка, способного модулировать функцию Fas-рецептора. Полипептид, способный связываться с внутриклеточным доменом Fas-R, получают путем культивирования клеток, трансформированных вектором, содержащим последовательность ДНК, кодирующую указанный полипептид. Модуляцию действия лиганда Fas-R осуществляют с помощью полипептида или мРНК, кодирующей полипептид. Фармацевтическая композиция для модуляции действия лиганда Fas-R на клетки содержит указанный полипептид или вирусный вектор, его кодирующий. Изобретение позволяет разрабатывать терапевтические средства для модуляции цитотоксической активности Fas-R. 9 н. и 3 з.п. ф-лы, 8 ил., 1 табл.

Область изобретения

Данное изобретение вообще относится к области рецепторов, принадлежащих суперсемейству рецепторов TNF/NGF, и контролю их биологических функций. Суперсемейство рецепторов TNF/NGF включает такие рецепторы как р55 и р75 фактора некроза опухоли (TNF-R) и рецептор лиганда FAS (названный также FAS/APOI или FAS-R, далее будет называться FAS-R) и другие. Конкретно данное изобретение касается нового белка, обозначенного здесь MORT-I (названный также HF-I), который соединяется с внутриклеточным доменом (IC) FAS-R (этот внутриклеточный домен получил обозначение FAS-IC). Этот новый белок способен модулировать функцию FAS-R. Кроме того, MORT-I способен к самоассоциации и может активировать собственную цитотоксичность клетки. Данное изобретение касается также получения и использования MORT-I.

Следует отметить, что названия HF-I (первоначальное обозначение) и MORT-I (обозначение, используемое в настоящее время) оба используются повсюду и обозначают один и тот же белок.

Предпосылки изобретения и исходные данные

Фактор некроза опухоли (TNF- и Лимфотоксин (TNF-) (далее TNF- и TNF- оба будут обозначаться TNF) являются многофункциональными цитокинами, провоцирующими воспалительные процессы, синтезируемыми главным образом моноядерными фагоцитами, и оказывающими разнообразные эффекты на клетки (Wallach, D. (1986) in: Interferon 7 (Ion Grosser, ed.), pp.83-122, Academic Press, London; and Beutler and Cerami (1987)). TNF- и TNF- проявляют свои эффекты путем связывания с рецепторами клеточной поверхности. Некоторые эти эффекты полезны для организма: например, они могут убивать опухолевые клетки или клетки, инфицированные вирусом, и усиливать противобактериальную активность гранулоцитов. Таким способом TNF участвует в защитных реакциях организма против опухолей и инфекционных агентов и в залечивании ран. Так, TNF можно использовать как противоопухолевое средство. В этом случае он связывается с рецепторами на поверхности опухолевых клеток и таким образом инициирует процессы, ведущие к гибели опухолевой клетки. TNF можно также использовать в качестве противоинфекционного средства.

Однако как TNF-, так и TNF- оказывают также вредные эффекты. Имеются данные, что чрезмерная продукция TNF- может играть основную патогенную роль в ряде заболеваний. Так, сейчас известно, что действие TNF- прежде всего на сосудистую систему является основной причиной симптомов септического шока (Tracey et al., 1986). При некоторых заболеваниях TNF может вызвать чрезмерную потерю веса (кахексию), подавляя активность адипоцитов и вызывая анорексию, и поэтому он был назван кахетином. Он был также описан как посредник повреждения тканей при ревматических заболеваниях (Beutler and Cerami, 1987) и как основной посредник наблюдаемого нарушения реакций трансплантант - против хозяина (Piquet et al., 1987). Кроме того, известно, что TNF участвует в процессе воспаления и во многих других заболеваниях.

Инициация и/или модуляция вышеуказанных биологических эффектов TNF осуществляется двумя различными, независимо экспрессируемыми, рецепторами р55 и р75 TNF-R, которые специфически связывают как TNF-, так и TNF-. Эти два рецептора имеют структурно различающиеся внутриклеточные домены, что указывает на различие идущих от них сигналов (см. Hohmann et al.; 1989; Engelmann et al., 1990; Brockhaus et al., 1990; Leotscher et al., 1990; Schall et al., 1990; Nophar et al., 1990; Smith et al., 1990; and Heller et ai., 1990). Однако еще необходимо выяснить клеточные механизмы, например различные белки и возможные другие факторы, которые участвуют в передаче внутриклеточных сигналов от р55 и р75 TNF-R (в PCT/US95/05854 и приводимом ниже в данной работе материале описаны новые белки, способные связываться с р75IС и p55IC). Именно внутриклеточные сигналы, которые обычно имеют место после связывания лиганда, то есть TNF ( или ), с рецептором, ответственны за начало каскада реакций, которые в конечном счете приводят к наблюдаемой реакции клетки на TNF.

Что касается цитотоксического действия TNF, то у большинства изученных в настоящее время клеток это действие запускается главным образом рецептором р55 TNF-R. Антитела против внеклеточного домена (домена, связывающего лиганд) р55 TNF-R сами по себе могут запускать цитотоксическое действие (см. ЕР 412486), что коррелирует с эффективностью связывания рецептора антителами. Полагают, что это является первым этапом генерации процессов выработки внутриклеточных сигналов. Исследование мутаций (Brakebusch et al., 1992; Tartaglia et al., 1993) показало, что биологическая функция р55 TNF-R зависит от целостности его внутриклеточного домена, и в соответствии с этим предположили, что инициация внутриклеточного сигнала, ведущего к цитотоксическому эффекту TNF, осуществляется как следствие соединения двух или более внутриклеточных доменов р55 TNF-R. Кроме того, TNF ( и ) обнаруживается как гомотример и, как предположили, индуцирует внутриклеточный сигнал через р55 TNF-R благодаря его способности связываться и образовывать поперечные связи между молекулами рецептора, т.е. осуществлять аггрегацию рецептора. В PCT/US95/05854, а также в данной работе ниже описывается, как p55IC и p55DD могут самоассоциироваться и индуцировать независящие от лиганда такие эффекты на клетку, какие оказывает TNF.

Другим членом суперсемейства рецепторов TNF/NGF является рецептор FAS (FAS-R), который назван также антиген FAS, белок поверхности клетки, эксперссируемый в различных тканях и обнаруживающий гомологию с рядом рецепторов поверхности клетки, включая TNF-R и NGF-R. FAS-R опосредует гибель клетки путем апоптоза (Itoh et al., 1991) и, по-видимому, служит в качестве фактора негативной селекции аутореактивных Т-клеток, т.е. в процессе созревания Т-клеток FAS-R опосредует апоптоз Т-клеток, распознающих собственные антигены. Обнаружено также, что мутации в гене FAS-R (lpr) вызывают лимфопролиферативное расстройство у мышей, которое соответствует аутоиммунному заболеванию человека - системной красной волчанке (Watanabe-Fukunaga et al., 1992). Лигандом FAS-R, по-видимому, является молекула поверхности клетки, которую наряду с другими клетками несут Т-клетки киллеры (или цитотоксические Т-лимфоциты - CTL). Поэтому, когда такие CTL приходят в контакт с клетками, несущими FAS-R, они способны индуцировать апоптоз клеток, несущих FAS-R. Далее, были получены моноклональные антитела против FAS-R и эти моноклональные антитела обладали способностью индуцировать апоптоз клеток, несущих FAS-R, включая мышиные клетки, трансформированные кДНК, кодирующей FAS-R человека (Itoh et al., 1991).

Было обнаружено также, что различные другие нормальные клетки наряду с Т-лимфоцитами экспрессируют FAS-R на поверхности и могут быть убиты путем запуска этого рецептора. Предпологают, что неконтролируемая индукция такого процесса гибели клеток вносит вклад в повреждение ткани при определенных заболеваниях, например деструкции клеток печени при острых гепатитах. Поэтому поиск путей ограничения цитотоксической активности FAS-R может иметь терапевтическое значение.

Напротив, так как было обнаружено, что определенные малигнизированные клетки и клетки, инфицированные вирусом HIV, несут на поверхности FAS-R, антитела против FAS-R или лиганд FAS-R могут быть использованы для запуска опосредованных рецептором FAS-R цитотоксических эффектов у этих клеток и таким образом служить в качестве средства борьбы с такими малигнизированными клетками или клетками, инфицированными вирусом HIV (см. Itoh et al., 1991). Поэтому поиск других путей увеличения цитотоксической активности FAS-R также может иметь терапевтическое значение.

Долгое время считали необходимым найти путь модуляции реакции клетки на TNF ( или ) и лиганд FAS, например, в таких паталогических случаях, которые упомянуты выше, где имеет место повышенная экспрессия TNF и лиганда FAS, желательно подавить цитотоксические эффекты, индуцируемые TNF или лигандом FAS-R. В других случаях, например при залечивании ран, желательно увеличить эффект TNF, или в случае FAS-R желательно увеличить эффекты, опосредуемые FAS-R, в опухолевых клетках или клетках, инфицированных вирусом HIV.

Авторами данного изобретения был использован ряд подходов (см., например, Европейские Заявки ЕР 186833, ЕР 308378, ЕР 398327 и ЕР 412486) для регуляции вредных эффектов TNF путем подавления связывания TNF с его рецепторами антителами против TNF или с использованием растворимых рецепторов TNF (по существу в основном растворимых внутриклеточных доменов рецепторов), конкурирующих с рецепторами TNF-R на поверхности клетки за связывания TNF. Далее, учитывая, что связывание TNF с рецепторами необходимо для индукции эффектов TNF на клетку, авторы данного изобретения применили подход для модуляции эффектов TNF, основанный на модуляции активности TNF-Rs. Кратко ЕР 568925 (IL 101769) касается метода модуляции переноса сигнала и/или расщепления внутри TNF-Rs, в результате чего пептиды или другие молекулы могут взаимодействовать с самим рецептором или с эффекторными белками, участвующими во взаимодействии с рецептором, модулируя таким образом нормальное функционирование TNF-R. В ЕР 568925 описаны конструкции и свойства различных мутантов р55 TNF-R, имеющих мутации в экстраклеточном, трансмембранном и внутриклеточном доменах р55 TNF-R. Таким способом в указанных выше доменах были идентифицированы области, которые являются существенными для функционирования рецептора, т.е. для связывания лиганда (TNF) и последующей передачи сигнала и внутриклеточного переноса сигнала, что в конечном итоге приводит к наблюдаемому эффекту TNF на клетку. Далее, описан также ряд подходов для выделения и идентификации белков, пептидов или других факторов, которые способны связываться с различными областями вышеуказанных доменов TNF-R. Эти белки, пептиды и другие факторы могут участвовать в регуляции или модуляции активности TNF-R. В ЕР 568925 был изложен также ряд подходов для выделения и клонирования последовательностей ДНК, кодирующих такие белки и пептиды; конструирования векторов экспрессии для синтеза этих белков и пептидов; получения антител или их фрагментов, которые взаимодействуют с TNF-R или с вышеуказанными белками и пептидами, связывающими различные области TNF-R. Однако в ЕР 568925 не указаны фактически существующие белки и пептиды, которые связываются с внутриклеточными доменами TNF-R (например, р55 TNF-R), не описан подход с использованием системы дрожжевых дигибридов для выделения и идентификации таких белков и пептидов, связывающихся с внутриклеточными доменами TNF-R. Ранее также не были обнаружены белки или пептиды, способные связывать внутриклеточные домены FAS-R.

Таким образом, когда хотят подавить эффект TNF или лиганда FAS-R, желательно уменьшить количество TNF-R или FAS-P на поверхности клетки или их активность, в то время как при попытках увеличить эффект TNF или лиганда FAS-P желательно увеличить количество TNF-R или FAS-R или их активность. С этой целью была определена и проанализирована нуклеотидная последовательность промоторов р55 TNF-R и р75 TNF-R и был обнаружен ряд ключевых последовательностей, характерных для различных факторов регуляции транскрипции, в том числе и таких, которые могут контролировать экспрессию TNF-R на уровне промотора, т.е. подавления считывания с промотора для уменьшения количества рецепторов и усиления считывания с промоторов для увеличения количества рецепторов (см. IL 104355 и IL 109633). Соответствующие исследования, относящиеся к контролю FAS-R на уровне промотора гена FAS-R, пока еще не опубликованы.

Далее, следует упомянуть следующее. Известно, что рецепторы фактора некроза опухоли (TNF) и структурно родственные рецепторы FAS-R запускают в клетках при стимуляции их лигандами, синтезируемыми лейкоцитами, деструктивные активности, которые ведут к гибели этих клеток, но механизмы этого запуска еще мало понятны. Исследования мутаций показывают, что в выработке сигналов цитотоксичности рецепторами FAS-R и р55 TNF (p55-R) участвуют различные области их внутриклеточных доменов (Brakebusch et al., 1992; Tartaglia et al., 1993; Itoh and Nagata, 1993). Эти области ("домены гибели") имеют сходные последовательности. "Домены гибели" как FAS-R, так и p55-R имеют тенденцию к самоассоциации. Их самоассоциация, по-видимому, стимулирует аггрегацию рецепторов, которая необходима для инициации сигналов (см. PCT/US95/05854, а также Song et al., 1994; Wallach et al., 1994; Boldin et al., 1995), и высокий уровень экспрессии рецепторов может приводить к запуску сигналов, не зависящему от лиганда (PCT/US95/05854 и Boldin et al., 1995).

Таким образом, до появления PCT/US95/05854 и данного изобретения не были известны белки, которые могут регулировать действие лигандов, принадлежащих к суперсемейству TNF/NGF, такое действие, какое оказывает TNF или лиганд FAS-R на клетку, опосредуя процессы выработки внутриклеточных сигналов. Эти процессы, по-видимому, управляются в значительной степени внутриклеточными доменами (ICs) рецепторов из суперсемейства рецепторов TNF/NGF, например TNF-Rs, т.е. внутриклеточных доменов р55 и р75 TNF-R (р551С и р751С соответственно), а также FAS-IC.

В соответствии с этим целью данного изобретения является получение белков, именно MORT-I, его аналогов, фрагментов и производных, которые способны связываться с внутриклеточным доменом FAS-R. Предполагают, что эти белки участвуют в процессах передачи внутриклеточных сигналов, инициируемых связыванием лиганда FAS с его рецептором. Белок MORT-I, его аналоги, фрагменты и производные данного изобретения отличаются от белков, связывающих FAS-IC, описанных в упомянутых ранее заявках.

Другой целью изобретения является получение антагонистов (например, антител) против этих молекул, связывающих FAS-IC, т.е. против белка MORT-I, его аналогов, фрагментов и производных. Эти антагонисты могут быть использованы с целью подавления процессов передачи сигналов, когда такие белки, связывающие FAS-IC, являются позитивными сигнальными эффекторами (т.е. индуцируют сигналы), или с целью усиления процесса передачи сигналов, когда такие белки, связывающие FAS-IC, являются негативными эффекторами (т.е. подавляют сигналы).

Еще одна цель изобретения состоит в использовании белка MORT-I, его аналогов, фрагментов и производных для выделения и характеристики других белков или факторов, которые могут, например, участвовать в конечных звеньях процесса передачи сигналов, и/или для выделения и идентификации других рецепторов, участвующих в начальных звеньях процесса передачи сигналов. Эти белки, факторы и рецепторы (например, другие FAS-R или родственные рецепторы) могли бы связываться с белком MORT-I, его аналогами, фрагментами и производными и таким образом принимать участие в их функционировании.

Кроме того, целью данного изобретения является использование вышеуказанного белка MORT-I, его аналогов, фрагментов и производных в качестве антигенов при получении поликлональных и/или моноклональных антител против них. Эти антитела в свою очередь могут быть использованы, например, для очистки нового белка MORT-I из других источников, например из клеточных экстрактов или линий трансформированных клеток.

Далее, эти антитела могут быть использованы для целей диагностики, например для идентификации расстройств, связанных с аномальным функционированием клеточных эффектов, опосредуемых рецептором FAS-R.

Другая цель изобретения состоит в получении фармацевтических составов, включающих белок MORT-I, его аналоги, фрагменты и производные, а также фармацевтических составов, включающих указанные выше антитела или другие антагонисты.

Краткое изложение изобретения

Согласно данному изобретению мы обнаружили новый белок, который способен связываться с внутриклеточным доменом FAS-R. Этот белок, связывающий FAS-IC, может действовать как посредник или модулятор действия лиганда FAS-R на клетки, опосредуя или модулируя процесс передачи сигналов, который обычно происходит после связывания лиганда FAS-R с клеточной оболочкой.

Этот новый белок обозначен как HFI или MORT-I (Mediator of Receptor Toxicity) и кроме его способности специфически связываться с FAS-IC имеет другие свойства (см. Пример 1), например, он имеет область, гомологичную областям "домена гибели" (DD) рецепторов p55-TNF-R и FAS-R (p55-DD и FAS-DD) и поэтому способен к самоассоциации. MORT-I способен также активировать в клетке собственную цитотоксичность, активность, которая возможно связана с его способностью к самоассоциации. Сейчас обнаружено также, что совместная экспрессия той области в MORT-I (HFI), которая содержит последовательность, гомологичную "домену гибели" (MORT-DD, присутствующую в С-концевой части MORT-I). Эта область сильно препятствует гибели клетки, индуцируемой FAS, как это и следовало ожидать на основании ее способности связываться с "доменом гибели" FAS-IC. Далее, в таких же условиях эксперимента было обнаружено, что совместная экспрессия того участка MORT-I, которая не содержит область MORT-IDD (N-концевая часть MORT-I, аминокислоты с 1 по 117, "головная часть MORT-I"), не приводит к подавлению гибели клетки, индуцируемой FAS, и ни в какой степени не увеличивает цитотоксичность клетки, индуцируемую FAS.

В соответствии с этим в данном изобретении дается последовательность ДНК, кодирующая белок, который обозначен здесь как MORT-I, его аналоги или фрагменты, каждый из которых способен связываться и взаимодействовать с внутриклеточным доменом лиганда рецептора FAS (FAS-IC).

В частности, в данном изобретении дается последовательность ДНК из группы, включающей:

(a) последовательность кДНК из области, кодирующей белок MORT-I;

(b) последовательность ДНК, способную гибридизоваться с кДНК пункта (а) в умеренных условиях. Эта последовательность кодирует биологически активный белок, связывающий внутриклеточный домен FAS-R; и

(c) последовательность ДНК, которая получается из ДНК (а) и (b) в результате вырожденности генетического кода. Эта последовательность кодирует биологически активный белок, связывающий внутриклеточный домен FAS-R.

Характерным примером вышеуказанной последовательности является последовательность ДНК, кодирующая белок MORT-I, которая содержит последовательность, изображенную на Фиг.4.

В данном изобретении дается также белок MORT-I, его аналоги, фрагменты или производные, кодируемые вышеуказанными последовательностями этого изобретения, причем указанные белки, его аналоги, фрагменты и производные способны связываться или взаимодействовать с внутриклеточным доменом FAS-R.

Характерным примером вышеуказанного белка этого изобретения является белок MORT-I, имеющий полученную из последовательности нуклеотидов аминокислотную последовательность, изображенную на Фиг.4.

В данном изобретении даны также векторы, кодирующие белок MORT-I, его аналоги, фрагменты или производные этого изобретения, которые содержат вышеуказанные последовательности ДНК этого изобретения, причем эти векторы способны экспрессироваться в соответствующих эукариотических или прокариотических клетках-хозяина; трансформированные эукариотические или прокариотические клетки-хозяина, содержащие такие веторы; и метод получения белка MORT-I, его аналогов; соответствующие условия для экспрессии указанных белков, его аналогов, фрагментов или производных; проведение посттранскрипционной модификации вышеуказанного белка, необходимой для получения указанных белков, и выделение вышеуказанных экспрессированных белков, его аналогов, фрагментов или производных из культуральной среды от вышеуказанных трансформированных клеток или из клеточных экстрактов вышеуказанных трансформированных клеток.

В другом разделе данного изобретения даются также антитела, или активные производные, или фрагменты этих антител против белка MORT-I, его аналогов, фрагментов и производных данного изобретения.

В еще одном разделе изобретения даются различные примеры использования вышеуказанных последовательностей ДНК или кодируемых ими белков согласно данному изобретению. Среди них имеются следующие примеры:

(i) метод модуляции действия лиганда FAS-R на клетки, несущие FAS-R, включающий обработку вышеуказанных клеток белком MORT-I, его аналогами, фрагментами или производными, или их комбинациями согласно данному изобретению, каждый из которых способен связываться с внутриклеточным доменом и модулировать активность FAS-R. В этом методе обработка клеток включает введение в указанную клетку белка MORT-I, его аналогов, фрагментов или производных, или их комбинаций в форме, удобной для внутриклеточного введения, или введение в вышеуказанную клетку последовательностей ДНК, кодирующих вышеуказанные белки, аналоги, фрагменты или производные, или их комбинации в составе соответствующего вектора экспрессии, несущего вышеуказанные последовательности, при этом вышеуказанный вектор способен эффективно встраиваться в последовательности ДНК вышеуказанной клетки таким образом, что указанная последовательность экспрессируется в указанной клетке;

(ii) метод модуляции действия лиганда FAS-R на клетки, включающий обработку указанных клеток белком MORT-I, его аналогами, фрагментами или производными, каждый из которых способен связываться с внутриклеточным доменом и модифицировать активность FAS-R. Вышеуказанная обработка клеток включает введение в указанную клетку указанного белка MORT-I, его аналогов, фрагментов или производных в виде, приемлемом для их введения внутрь клетки, или введение в указанную клетку последовательности ДНК, кодирующей указанный белок MORT-I, его аналоги, фрагменты или производные в составе соответствующего вектора, несущего указанные последовательности, при этом указанный вектор способен эффективно встраивать указанную последовательность в указанную клетку таким образом, что указанная последовательность экспрессируется в указанной клетке;

(iii) метод, такой как в (ii), где указанная обработка указанных клеток состоит в трансфекции указанных клеток рекомбинантным вектором вируса животных, включающий следующие этапы:

(a) конструирование рекомбинантного вектора вируса животных, несущего последовательность, кодирующую белок оболочки вируса (лиганд), который способен связываться со специфическим рецептором на поверхности клетки, несущей FAS-R, и вторую последовательность, кодирующую белок из числа белков MORT-I, его аналогов, фрагментов и производных этого изобретения, которые при экспрессии в указанной клетке способны модулировать активность указанного FAS-R; и

(b) инфицирование указанной клетки указанным вектором (а);

(iv) метод модификации действия лиганда FAS-R на клетки, несущие FAS-R, включающий обработку указанных клеток антителами, или их активными производными, или фрагментами согласно этому изобретению, причем указанная обработка клеток проводится соответствующим составом, содержащим указанные антитела, их активные фрагменты или производные. Когда белок MORT-I или его часть находится на поверхности клетки, указанный состав готовится в форме для применения вне клетки, а когда указанный белок является внутриклеточным, указанный состав готовится в форме для введения внутрь клетки;

(v) метод модуляции эффекта лиганда на клетки, несущие FAS-R, включающий обработку указанных клеток олигонуклеотидной последовательностью, кодирующей антисмысловую последовательность по крайней мере части последовательности MORT-I этого изобретения, причем указанная олигонуклеотидная последовательность способна блокировать MORT-I;

(vi) метод, такой как в (v), где обработка клеток состоит в трансфекции указанных клеток рекомбинантным вектором вируса животных, включающий следующие этапы:

(a) конструирование рекомбинантного вектора вируса животных, несущего последовательность, кодирующую белок оболочки вируса (лиганд), который способен связываться со специфическим рецептором на поверхности клетки, несущей FAS-R, и вторую последовательность, которая является олигонуклеотидной последовательностью, кодирующей антисмысловую последовательность по крайней мере части последовательности MORT-I согласно данному изобретению, при этом указанная олигонуклеотидная последовательность способна блокировать экспрессию белка MORT-I при введении указанного вируса в указанную клетку; и

(b) инфицирование указанной клетки указанным вектором (а);

(vii) метод обработки опухолевых клеток или клеток, инфицированных вирусом HIV или других желаемых клеток, включающий:

(а) конструирование рекомбинантного вектора вируса животных, несущего последовательность, кодирующую белок оболочки вируса, который способен связываться с рецептором на поверхности опухолевой клетки, или с рецептором на поверхности клетки, инфицированной вирусом HIV, или с рецептором, который несут другие желаемые клетки, и вторую последовательность, кодирующую один из белков MORT-I, его аналоги, фрагменты и производные этого изобретения, которые при экспрессии в указанной опухолевой клетке, клетке, инфицированной вирусом HIV, или какой-то другой клетке способны убивать указанную клетку; и

(b) инфицирование указанной опухолевой клетки; клетки, инфицированной вирусом HIV; или какой-то другой клетки указанным вектором (а);

(viii) метод модификации действия лиганда FAS-R на клетки, включающий применение процедуры с использованием рибозима, в котором вектор, кодирующий последовательность рибозима, способного взаимодействовать с последовательностью клеточной мРНК, кодирующей белок MORT-I этого изобретения, вводится в указанную клетку в такой форме, которая обеспечивает экспрессию указанной последовательности рибозима в указанной клетке. В этом методе при экспрессии указанной последовательности рибозима она взаимодействует с указанной последовательностью клеточной мРНК и расщепляет указанную последовательность мРНК, приводя к подавлению экспрессии белка MORT-I в указанных клетках;

(ix) метод из числа перечисленных выше, где указанный белок MORT-I или последовательность, кодирующая указанный белок MORT-I, включает по крайней мере ту часть белка MORT-I, которая специфически связывается с FAS-IC, или по крайней мере ту часть последовательности, которая кодирует участок белка MORT-I, специфически связывающийся с FAS-IC;

(х) метод выделения и идентификации белка, способного связываться с внутриклеточным доменом FAS-R, включающий применение процедуры нестрогой Саузерн-гибридизации с последующим клонированием с помощью PCR, в котором последовательность или ее части согласно этому изобретению используются в качестве зондов, связывающихся с участками кДНК или участками ДНК из библиотеки генов, имеющими по крайней мере частичную гомологию с этими зондами. Указанные связанные последовательности затем амплифицировали и клонировали с помощью процедуры PCR. В результате получили клоны, кодирующие белок, имеющие по крайней мере частичную гомологию с указанными последовательностями согласно этому изобретению.

В данном изобретении дается также фармацевтический состав для модуляции действия лиганда FAS на клетку, включающий в качестве активного ингредиента одну из следующих добавок:

(i) белок MORT-I этого изобретения, его биологически активные фрагменты, аналоги, производные или их смеси; (ii) рекомбинантный вектор вируса животных, кодирующий белок, способный связывать рецептор на поверхности клетки, и кодирующий белок MORT-I или его биологически активные фрагменты или аналоги согласно этому изобретению; и (iii) олигонуклеотидную последовательность, кодирующую антисмысловую последовательность последовательности MORT-I этого изобретения, где указанная олигонуклеотидная последовательность может быть второй последовательностью указанного выше (ii) рекомбинантного вектора вируса животных.

Следует подчеркнуть, что MORT-I имеет особую область, которая связывается с FAS-IC, и другую обособленную область, которая участвует в самоассоциации MORT-I, и, в соответствии с этим, отдельные области или части MORT-I могут быть независимо использованы для идентификации других белков, рецепторов и т.п., которые способны связываться с MORT-I или с FAS-R и могут участвовать в процессах передачи внутриклеточных сигналов, обусловленных MORT-I или FAS-R. Далее, MORT-I может иметь другие типы активности, связанные либо с вышеуказанными, либо с другими областями MORT-I, либо с их комбинациями, например ферментативную активность, относящуюся к эффектам MORT-I на собственную цитотоксичность клетки. Таким образом, MORT-I может быть использован также для специфической идентификации других белков, пептидов и т.п., которые могут участвовать в проявлении такого рода дополнительных активностей у MORT-I.

В последующем детальном описании данного изобретения даются также другие его аспекты и приложения.

Следует отметить, что используемые здесь термины "Модуляция действия лиганда FAS на клетку" и "Модуляция действия MORT-I на клетку" обозначают обработку как ин витро, так и ин виво.

Краткое описание чертежей

Фиг.1 А и В воспроизводят авторадиограмму гелей SDS-PAGE (10% акриламида), показывающую взаимодействие между HFI (MORT-I) и FAS-IC ин витро. На Фиг. 1А показана контрольная авторадиограмма иммунопреципитата белков (из экстрактов клеток HeLa, трансфецированных слитым белком FLAG-NFI (FLAG-MORT-I) или кДНК люциферазы (контроль), причем иммунопреципитация выполнена с помощью антител против FLAG; и

на Фиг.1В показана авторадиограмма характерного геля, отражающая взаимодействие между HFI и FAS-IC ин витро с помощью авторадиографического анализа связывания метаболически меченного по /³⁵S/-метионину HFI, синтезированного в трансфецированных клетках HeLa, в виде белка, слитого с октапептидом FLAG (FLAG-MORT-I), с GST, слитым белком GST-FAS-IC человека и мыши (GST-huFAS-IC, GST-mFAS-IC) и слитыми белками GST-FAS-IC, в котором FAS-IC содержит мутацию замены Ile на Аlа в положении 225 (GST-mFAS-IC 1225A). Белки из клеток HeLa, меченые по /³⁵S/, включающие меченый слитый белок FLAG-MORT-I, сначала экстрагировали и затем им давали провзаимодействовать с различными белками GST и GST-FAS-IC (прикрепленными к бусам из глютатиона) и затем разделяли с помощью SDS-PAGE. Во всех контрольных экспериментах экстракты из клеток HeLa, трансфецированные люциферазой, взаимодействовали с GST и слитыми белками GST-FAS-IC и проводили SDS-PAGE. Фиг. 1А и 1В описаны также в Примере 1.

Фиг.2А, В и С воспроизводят авторадиограммы гелей SDS-PAGE (10% акриламида), в которых разделяли различные иммунопреципитаты из трасфецированных клеток HeLa. В них показано взаимодействие ин виво HF-I с FAS-IC. Клетки HeLa были трансфецированы конструкциями ДНК, кодирующими: только слитый белок HFI-FLAG (FLAG-MORT-I), слитый белок HFI-FLAG и FAS-R человека (FLAG-MORTI+FAS/APOI) или только FAS-R человека (FAS/APOI) (Фиг.2А); или слитый белок HFI-FLAG и p55-R человека (FLAG-MORTI+p55-R) (Фиг.2В); или слитый белок HFI-FLAG и химерный слитый белок из FAS-R и р55 человека, в котором экстраклеточный домен FAS-R был заменен на соответствующую область из p55-R (FLAG-MORTI+химера p55-FAS), или только химерный слитый белок FAS-R-p55-R (Фиг.2С). Во всех случаях трансфецированные клетки метаболически метили по /³⁵S/-цистеину (20 мкКю/мл) и /³⁵S/-метионину (40 мкКю/мл) и белок экстрагировали. Белковые экстракты из различных трансфецированных клеток затем иммунопреципитировали различными антителами: анти-FLAG, анти-FAS, анти-р75-R и анти-р55-R (FLAG, FAS, p75-R и p55-R на Фиг.2А-С) и разделяли SDS-PAGE. На Фиг.2А слева видны белковые полосы, соответствующие FAS-R (Fas/APOI) и HFI-FLAG (FLAG-MORTI); между Фиг.2А и В показаны относительные положения стандартных маркетов молекулярного веса (кD); и на Фиг.2С справа видны полосы белков, соответствующие p55R и химере p55-FAS. Фиг.2А-С описаны также в Примере 1.

Фиг.3 воспроизводит Нозерн-блоттинг, в котором поли А+PНК (0,3 мкг) из трансфецированных клеток HeLa выявляли с помощью зондов кДНК HF-I, как описано в Примере 1.

Фиг.4 дает схематическое изображение предварительной нуклеотидной последовательности и полученной из нее аминокислотной последовательности HF-I, как описано в Примере 1, в котором "домен гибели" подчеркнут как возможный сайт начала трансляции, т.е. подчеркнут остаток метионина в положении 49 (М, подчеркнутое жирной линией). Звездочкой помечен стоп-кодон трансляции (нуклеотиды 769-771). В начале и середине каждой строки даны два числа, обозначающие относительные положения нуклеотидов и аминокислот в этой последовательности, отсчитываемые от начала последовательности (5-конец), где первое число обозначает положение нуклеотида, а второе - аминокислоты.

Фиг.5 представляет результаты экспериментов по определению С-конца MORT-I, где на Фиг.5 воспроизводится радиоавтограф геля после SDS-PAGE (10% акриламид), с помощью которого разделяли различные слитые белковые продукты MORTI-FLAG, экспрессируемые в клетках HeLa и метаболически меченые по ³⁵S-цистеину и ³⁵S-метионину с последующей иммунопреципитацией или с помощью моноклональных антител анти-FLAG (М2) (дорожки 2, 4 и 6) или, в контроле, с помощью антител-р75 TNF-R (#9) (дорожки 1, 3 и 5), как описано в Примере 1.

Фиг.6 (А и В) графически изображает не зависящий от лиганда запуск цитотоксических эффектов в клетках, трансфецированных MORT-I, где жизнеспособность клетки определяли либо в тесте поглощения нейтрально-красного (Фиг.6A), либо в случае специфического определения жизнеспособности клеток, экспрессирующих трансфецирующую ДНК - путем измерения количества секретируемой в среду щелочной фосфатазы плаценты (Фиг. 6В). Клетки HeLa трансфецировали векторами, кодирующими HFI (MORTI), FAS-IC человека, р55-IС человека или люциферазу (контроль). Экспрессия этих векторов контролируется тетрациклином. Во всех случаях эти клетки трансфецировали также препаратом кДНК, кодирующим секретируемую щелочную фосфатазу, которая позволяет выявлять действие временной экспрессии этих белков на жизнеспособность клеток. На Фиг.6А и 6В светлые столбики представляют трансфецированные клетки, растущие в присутствии тетрациклина (1 мкг/мл, для блока экспрессии), а закрашенные столбики представляют трансфецированные клетки, растущие в отсутствие тетрациклина. Фиг.6А и В описаны в Примере 1.

Фиг.7 дает графическое изображение влияния различных участков белка MORT-I на цитотоксические эффекты клетки, опосредуемые рецептором FAS-R, как описано в Примере 1.

Детальное описание изобретения

Один из аспектов данного изобретения касается нового белка MORT-I (HFI), который способен связываться с внутриклеточным доменом рецептора FAS-R, принадлежащего суперсемейству TNF/NGF, и поэтому рассматривается как посредник или модулятор рецептора FAS-R, который функционирует, например, в процессе передачи сигналов, инициируемых при связывании лиганда FAS с FAS-R. Аминокислотные последовательности и последовательности ДНК для MORT-I согласно этому изобретению являются новыми последовательностями; они не содержатся в банке данных дл