Рекомбинантный лектин омелы белой (rml)

Рекомбинантный лектин омелы белой (rml)

Реферат

 

Изобретение относится к генетической инженерии и может быть использовано в терапевтических целях, в частности в терапии опухолевых процессов. Использование молекул нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды и димеры полипептидов-лектинов омелы белой, позволяет диагностировать наличие соответствующих генов в организме, а сами полипептиды и их димеры могут быть использованы в составе лекарственных средств, обладающих иммуностимулирующей и цитотоксической активностью. 12 c. и 9 з.п. ф-лы, 15 ил.

Настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновых кислот, кодирующим препропротеины, которые после созревания проявляют биологическую активность димера лектина омелы белой, к векторам, содержащим эти молекулы нуклеиновых кислот, к трансформированным этими векторами организмам-хозяевам и к полипептидам или димерам полипептидов, кодируемым этими молекулами нуклеиновых кислот. Полипептиды согласно изобретению или соответственно димеры полипептидов применяются в разнообразных терапевтических целях. Следовательно, изобретение далее относится к иммунотоксинам, а также к лекарственным средствам, содержащим полипептиды или димеры полипептидов согласно изобретению. Изобретение также относится к композициям для диагностики, содержащим молекулы нуклеиновых кислот согласно изобретению, полипептиды или димеры полипептидов согласно изобретению и/или праймеры, которые специфически гибридизуются с молекулами нуклеиновых кислот по изобретению. Кроме того, изобретение относится к средствам защиты растений, содержащим полипептиды и/или димеры полипептидов согласно изобретению.

Экстракты омелы белой на протяжении многих столетий используются в терапевтических целях. С начала этого столетия препараты омелы белой с тем или иным успехом применяют в терапии рака (Bocci, 1993; Gabius и др., 1993; Gabius и Gabius, 1994; Ganguly и Das, 1994). Hajto и др. (1989, 1990) смогли показать терапевтические эффекты при использовании, в частности, так называемых лектинов омелы белой (вискумин, агглютинин Viscum album, VAA). В настоящее время помимо их цитотоксического действия обсуждается, в частности, неспецифическая стимуляция иммунного ответа, положительные эффекты которого используют для сопутствующей терапии и для долечивания больных с опухолями. Увеличение выживаемости таких больных, вероятно, происходит за счет выделения гомологичного эндорфина (Heiny и Beuth, 1994).

Многочисленные исследования in vitro (Hajto и др., 1990; Mannel и др., 1991; Beuth и др., 1993) и in vivo (Hajto, 1986; Hajto и др., 1989; Beuth и др., 1991; Beuth и др., 1992), а также клинические исследования (Beuth и др., 1992) подтверждают увеличенное выделение воспалительных цитокинов (фактор- некроза опухоли (TNF-), интерлейкин-1 (IL-1), интерлейкин-6 (IL-6)), а также активацию клеточных компонентов иммунной системы (Т_H-клетки, натуральные клетки-киллеры (NK-клетки)).

В качестве активного начала экстракта омелы белой в настоящее время рассматривают протеин лектина омелы белой (ML) массой 60 кДа, который может быть получен биохимическим путем из экстрактов (Franz и др., 1977; Gabius и др., 1992). Протеин ML состоит из двух ковалентно соединенных дисульфидным мостиком субъединиц, чья А-цепь ответственна за ферментативную инактивацию рибосом (Endo и др., 1988), а В-цепь ответственна за связывание углеводов. Биологическая активность согласно известным к настоящему времени данным сводится в основном к лектиновой активности В-цепи (Hajto и др., 1990).

Однако на настоящий момент имеется недостаточно сведений о связи между структурой и активностью лектина омелы белой (ML). Так, например, неясен вклад отдельных цепей и присущей им различной биохимической и ферментативной активности в наблюдаемое действие или терапевтические эффекты ML-1. Анализ связи между структурой и активностью затруднен из-за загрязнения препаратов другими растительными веществами, входящими в состав омелы белой (Stein и Berg, 1994). В литературе описана зависимость активности препаратов экстракта от различных составов экстрактов, что, в свою очередь, зависит от вида дерева, из которого выделен экстракт (например, яблоня, сосна, тополь) ( и др., 1986). Вискотоксины (Garcia-Olmedo и др., 1983; Mendez и др., 1990), равно как и другие вискумины (например, ML-2, ML-3) обладают схожим действием (Еifler и др., 1994). Даже биохимически очищенные (аффинная хроматография) до высокой степени чистоты препараты ML обнаруживают значительную гетерогенность (фиг.8). Эта гетерогенность относится к биохимической активности цепей и связанных с ней эффектов, проявляющихся in vitro и in vivo, а также и самой структуры протеинов. В литературе описаны также структурные варианты гликозилирования А- и В-цепей ML, а также вариации последовательностей. У Gabius и др. (1992) и Dietrich и др. (1992) описана изменчивость последовательностей А1- и А2-цепей ML-1.

С целью подробно исследовать терапевтическое действие лектина омелы белой желательно получить его в чистом виде как структурно гомогенное вещество. Далее для специалистов представляет интерес возможность получения ML или его составных частей в больших количествах в чистом виде, чтобы их, например, можно было использовать в качестве активной составной части лекарственных средств при промышленном получении последних. До настоящего времени с помощью известных способов, известных из уровня техники, в принципе не удавалось решить эти проблемы. При выделении из растительного источника при существующем уровне техники всегда получают гетерогенную смесь веществ.

Гетерогенность растительных препаратов лектина омелы белой является среди прочего результатом посттрансляционной обработки ML-1 в изоформы ML-2 и ML-3, так что в препаратах ML в зависимости от методики выделения или продолжительности ферментации обнаруживают разное содержание ML-1, ML-2 и ML-3 ( и др., 1995). Каждая из названных изоформ, кроме того, обладает микрогетерогенностью, которая представлена на фиг.8 на примере ML-1 с помощью изоэлектрической хроматофокусировки.

В основу настоящего изобретения, таким образом, была положена задача получить лектин омелы белой в чистом виде и в таких количествах, которые обеспечивают промышленное использование. Эта задача решается с помощью различных вариантов выполнения, представленных в формуле изобретения изобретения.

Таким образом, изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая (а) кодирует препропротеин, который после созревания проявляет биологическую функцию, свойственную димеру лектина омелы белой, и характеризуется представленной на фиг.4в нуклеотидной последовательностью; (б) кодирует фрагмент препропротеина согласно пункту (а), причем фрагмент является биологически активной составной частью димера лектина омелы белой; (в) отличается от молекулы нуклеиновой кислоты согласно пунктам (а) или (б) вследствие вырожденности генетического кода или (г) в строгих условиях гибридизуется с молекулой нуклеиновой кислоты согласно пунктам (а), (б) или (в) и кодирует полипептид с указанной в пункте (а) или (б) биологической функцией, соответственно активностью.

Исходя из последовательностей гена лектина омелы белой, сначала могут быть получены рекомбинантные высокочистые отдельные цепи (rMLA, rMLB), которые могут быть реассоциированы in vitro, что тем самым приведет к получению голопротеина rML, являющемуся химически, ферментативно и структурно гомогенным. Реассоциированный рекомбинантный протеин не проявляет изменчивости и микрогетерогенности, прежде всего в отношении первичной структуры и посттрансляционных модификаций (гликозилирования, фосфорилирования), и наиболее пригоден для терапевтических целей как в виде голопротеина, так и в виде части цепи и в виде субфрагментов.

Под понятием "фрагмент" препротеина лектина омелы белой подразумевается каждый фрагмент согласно изобретению (не только естественного происхождения), который является биологически активной составной частью димера лектина омелы белой. Для специалиста в данной области техники очевидно, что под подобной биологически активной составной частью димера лектина омелы белой подразумеваются такие составные части, которые являются составными частями отдельных цепей димера. При этом очевидно также, что отдельные цепи или их фрагменты, которые являются составной частью представленной на фиг.4в последовательности, являются объектом изобретения.

Термин "естественный" в сочетании с выражением "составная часть лектина омелы белой" в контексте настоящего изобретения означает, что таким образом обозначенный фрагмент либо представляет собой цепь димера лектина омелы белой, либо является субфрагментом цепи, который естественным образом присутствует в цепи. Эти фрагменты преимущественно являются биологически активными.

Под термином "биологически активный" согласно изобретению подразумевается, что эти фрагменты обладают по меньшей мере одной биологической функцией, присущей цепям или димеру, как это представлено в данном описании, или любой другой биологической функцией отдельных цепей или димера. Кроме того, под термином "биологически активный" подразумевается также фармакологическая и/или иммунологическая активность.

С помощью рекомбинантных протеинов ML впервые стало возможным дополнительное экспериментальное изучение вклада отдельных доменов или субдоменов. Рекомбинантные протеины ML и рекомбинантные субъединицы/части цепей составляют основу соответствующих определенных препаратов, содержащих одно из этих веществ, в качестве замены препаратам, представляющим собой экстракты, и стандартизированным экстрактам.

Неожиданно было обнаружено, что клонирование гена, кодирующего лектин омелы белой, может быть осуществлено на основе новой стратегии клонирования, после того, как общепринятые стратегии клонирования не привели к успеху.

Известен целый ряд данных о химических свойствах протеина лектина омелы белой ML-1. К ним наряду с молекулярным весом и строением субъединиц относятся, в частности, короткие N-концевые пептиды, аминокислотные последовательности которых независимо описаны Dietrich и др. (1992) и Gabius и др. (1992) [см. также патент Германии 4221836]. Исходя из N-концевых пептидов А- или В-цепи, на основании их аминокислотного состава из-за высокой степени врожденности производных последовательностей нуклеиновых кислот практически невозможно получить синтетические олигонуклеотиды, степень вырожденности которых достаточно низка, чтобы при скрининге геномных библиотек обеспечить идентификацию фрагментов гена ML. Это также относилось и к банку генов кДНК, полученных с помощью поли-(А+)-РНК из Viscum album.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) позволяет осуществлять амплификацию участков ДНК, расположенных между известными участками (Erlich и др., 1988). С помощью смыслового олигонуклеотида для N-конца MLA и антисмыслового олигонуклеотида для N-конца MLB стала возможной амплификация расположенного между ними участка гена ML, не содержащего интрон (фиг.1а). Однако на практике анализ N-концевой последовательности В-цепи показывает, что степень вырожденности (количество возможных комбинаций олигонуклеотидов) при этом все еще слишком высока для успешного проведения этого процесса. Это, в частности, связано с тем, что последовательности N-конца В-цепей непригодны для построения олигонуклеотида, вследствие чего амплификация последовательностей гена ML, исходя из известных участков аминокислотных последовательностей, не практикуется (фиг.1б).

Для клонирования гена ML с помощью измененной стратегии ПЦР исследовали возможность использования для построения амплифицированных олигонуклеотидов дополнительных данных о протеинах, в частности, основанных на родстве лектина омелы белой с классом инактивирующих рибосомы протеинов типа I и типа II (ПИР) (Stirpe и др., 1992). Основываясь на многочисленных структурах, присущих (а) ПИР типа I и А-цепям рицина, а также (б) В-цепям абрина и рицина, было идентифицировано в целом 8 консервативных участков последовательности. Исходя из этих участков последовательностей с учетом кодонов, используемых в родственных видах, был построен 21 олигонуклеотид, и все эти олигонуклетиды использовали в различных комбинациях в более чем 200 экспериментах по амплификации. Однако ни в одном из случаев не были получены специфические продукты амплификации даже несмотря на то, что условия ПЦР, относящиеся к температуре отжига, содержанию Mg²⁺, а также к параметрам цикла, варьировали в широких пределах.

Ни скрининг геномных банков и банков кДНК, ни применение техники ПЦР не позволили с учетом приведенных выше рассуждении определить последовательности, специфичные для ДНК ML.

Поэтому был начат поиск новых путей использования дополнительных данных о структуре рицина и абрина для построения олигонуклеотидов в результате амплификации.

Поскольку ферментативный механизм, присущий ПИР, в частности, ПИР типа II рицина, подобен механизму ML (Endo и др., 1988а + 19886), нельзя было исключить того, что между ними также имеется структурное подобие в области функционально активных участков первичной и третичной структур. Исходя из кристаллической структуры рицина (Katzin и др., 1991; Rutenberg и Robertus, 1991; Weston и др., 1994), анализ пластичности А-цепи рицина свидетельствовал о малой мобильности Arg180, который находится внутри консервативного участка последовательности. Далее был проведен анализ возможных в данном случае замещений аминокислот на этом участке активного центра на основании стерического расположения основного участка цепи, принимая во внимание взаимодействие с субстратом. Указанные результаты были получены только при оценке всевозможных достраиваний последовательности А-цепи рицина и других последовательностей, относящихся к ПИР типа I.

За счет дополнения результатов сравнения последовательностей сведениями о структуре получили данные о вероятном включении определенных остатков аминокислот в определенные положения. Благодаря этому стало возможным определить ряд теоретических аминокислотных последовательностей для этой области ML и с помощью этого построить соответствующий, чрезвычайно мало вырожденный олигонуклеотид (RMLA2) (фиг.1в).

Другие фрагменты могли быть получены только при комбинации RMLA1 (вырожденный олигонуклеотид, полученный на базе N-концевой аминокислотной последовательности А-цепи ML; ср. фиг.1б) и построенного на основании вышеупомянутых рассуждении при определенных параметрах ПЦР олигонуклеотида "активного сайта" RMLA2, исходя из комплексной геномной ДНК ML, после того, как все относящиеся к этому альтернативные подходы, как описано выше, были безрезультатными.

Дополнительную информацию о последовательности гена получили только с использованием специфического невырожденного олигонуклеотидного праймера, полученного на основании частично определенной последовательности гена MLA в результате клонирования и секвенирования фрагмента "a" (фиг.3), и вырожденных олигонуклеотидов, полученных в результате достраиваний последовательностей ПИР типа I и рицина/абрина при дальнейших ПЦР-амплификациях. Для построения вырожденных олигонуклеотидов для В-цепей использовали достраивания последовательностей В-цепей рицина и абрина, где также были найдены отдельные участки более высокой инвариантности.

Для получения 5’- и 3’-концов голопротеина путем обратной транскрипции были синтезированы фрагменты В-цепей, а также 5’- и 3’-концевые нетранслируемые участки, исходя из выделенной РНК омелы белой, аналогичной кДНК, и с помощью методики быстрой амплификации мРНК и кДНК с использованием ПЦР (RACE-метод) (Frohman и др., 1988) получали соответствующие участки гена. После получения в каждом случае большого числа перекрывающихся фрагментов гена (фиг.3) затем с помощью специфической ПЦР были получены полные участки генов, кодирующих А-цепи и В-цепи, исходя в каждом случае из комплексной геномной ДНК омелы белой. Последовательности генов rMLA и rMLB с концевыми модификациями представлены на фиг.4а и фиг.4б. На фиг.4в представлены как 5’- и 3’-нетранслируемые участки, так и полная последовательность гена ML, охватывающая участки гена, кодирующие эндопептид и сигнальный пептид.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты является фрагментом А-цепи лектина омелы белой, которая кодируется представленной на фиг.4а (MLA) нуклеотидной последовательностью.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты является фрагментом В-цепи лектина омелы белой, которая кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной на фиг.4б (MLB).

Другой предпочтительный вариант осуществления изобретения относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая является молекулой ДНК.

Согласно изобретению под понятием "молекула ДНК" подразумевают как геномную, так и молекулу кДНК или полусинтетическую молекулу ДНК. Способы получения этих различных молекул ДНК известны специалистам в данной области техники.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения молекулой нуклеиновой кислоты является молекула РНК.

Далее изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая является антисмысловой нитью к вышеописанной молекуле нуклеиновой кислоты по изобретению. Такая антисмысловая нить может быть, например, использована для ингибирования транскрипции в случае проведения исследований по экспрессии или регуляции в растении.

Изобретение далее относится к вектору, который содержит по меньшей мере одну молекулу нуклеиновой кислоты по изобретению.

Вектор согласно изобретению может, например, содержать одну единственную молекулу нуклеиновой кислоты согласно изобретению, которая кодирует весь препропротеин лектина омелы белой. Поскольку этот вектор является вектором, экспрессирующим препропротеин, он может быть получен в пригодном для этой цели трансформированном хозяине, а мономерные фрагменты могут соединяться in vivo или in vitro в димер лектина омелы белой. В другом варианте осуществления изобретения предлагаемый вектор является вектором, который предназначен исключительно для воспроизведения нуклеиновой кислоты согласно изобретению.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения предлагаемый вектор содержит не только молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует А-цепь лектина омелы белой или ее фрагмент, но также молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую В-цепь или ее фрагмент. Фрагменты мономеров являются преимущественно биологически активными.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения вектор по изобретению является вектором экспрессии. Специалистам в данной области техники известно, каким образом можно получить приемлемые векторы экспрессии для различных организмов-хозяев.

Согласно изобретению для гетерологичной экспрессии исходя из комплексной геномной ДНК омелы белой с помощью специфической ПЦР была получена последовательность, кодирующая А-цепь лектина омелы белой. При этом с помощью некомплементарных участков встроенных олигонуклеотидных праймеров вводили элементы, контролирующие трансляцию, а также последовательности, которые распознаются эндонуклеазами рестрикции, благодаря чему, исходя из рассматриваемого геномного гена препролектина омелы белой, были возможны клонирование и раздельная экспрессия А-цепи лектина омелы белой.

Участок на 5’-конце кодирующей rMLA последовательности, соответствующий аминокислотным остаткам тирозин¹-тирозин ¹⁷ (Dietrich и др., 1992; Gabius и др., 1992), был получен при встраивании перед кодоном, инициирующим трансляцию синтетического фрагмента гена, с помощью гибридизации и клонирования двойных олигонуклеотидов. Была осуществлена оптимизация последовательности гена относительно выбора кодона, как это описано для сильно экспрессирующегося в Escherichia coli гена (Gribskov и др., 1984). На 3’-конце синтетического генного фрагмента rMLA, а также на 5’-конце полученного с помощью ПЦР фрагмента гена rMLA с помощью целенаправленной замены кодона тирозина¹⁷ ТАС на ТАТ был введен сайт рестрикции, получаемый при расщеплении рестриктазой Ssp I, который делал возможным соединение обоих генных фрагментов rMLA при получении вектора pML14-17 (фиг.5). Была секвенирована кодирующая rMLA последовательность (фиг.4а). Для экспрессии rMLA в Escherichia coli последовательность гена выделяли из вектора pML14-17 и встраивали в экспрессирующий вектор рТ7-7 (Studier и Moffart, 1986) под контролем промотора Т7-РНК-полимеразы, а также терминатора транскрипции. С помощью полученного в результате экспрессирующего вектора pT7-MLA (фиг.5) трансформировали штамм E.coli BL21. Индукция экспрессии гена сопровождается появлением полосы протеина, соответствующей А-цепи негликозилированного рекомбинантного лектина омелы белой, имеющего относительную молекулярную массу 25 кДа. Обнаружение и идентификацию рекомбинантного продукта экспрессии осуществлял с помощью Вестерн-блоттинга с использованием антитела, специфичного к MLA (фиг.7).

Для гетерологичной экспрессии В-цепи лектина омелы белой полная кодирующая MLB последовательность из комплексной геномной ДНК Viscum album была амплифицирована с помощью специфической ПЦР, причем с помощью некомплементарных участков встроенных олигонуклеотидных праймеров были введены элементы, контролирующие трансляцию, а также последовательность, узнаваемая эндонуклеазой рестрикции (фиг.6). Полученный в результате ПЦР продукт длиной 0,8 т.п.н. после клонирования в ТА-клонирующем векторе pCRII был встроен в вектор экспрессии рТ7-7 под контролем элементов, контролирующих транскрипцию, и с помощью полученного в результате вектора экспрессии pT7-MLB был трансформирован штамм E.coli BL21.

Правильность кодирующей rMLB последовательности была подтверждена при ее секвенировании (фиг.4б). Экспрессию удалось подтвердить с помощью Вестерн-блоттинга при использовании антитела, специфичного к MLB (TB33, Tonevitsky и др., 1995), при этом через 2 часа после индукции экспрессии гена появлялся иммунореактивный протеин с относительной молекулярной массой 31 кДа, соответствующий В-цепи негликозилированного рекомбинантного лектина омелы белой (фиг.7б). Анализ клеточных фракций после соответствующей обработки клеток E.coli показал распределение синтезированной В-цепи rML в растворимой фракции в надосадочной жидкости, а также нерастворимой фракции в "тельцах включения", т.е. в осадке после обрабтки клеток E.coli, причем через 4 часа после индукции доля растворимой или нерастворимой фракции составляла соответственно 50% от общего выхода (фиг.7б).

Далее изобретение относится к организму-хозяину, который трансформирован по меньшей мере одним вектором согласно изобретению.

В зависимости от целей с помощью организма-хозяина согласно изобретению могут быть получены лишь один из обоих мономеров или комбинации обоих мономеров, преимущественно в виде ассоциированного димера. Организм-хозяин по изобретению может быть эукариотической или прокариотической клеткой, трансгенным растением или трансгенным животным.

Преимущественно организм-хозяин по изобретению является клеткой млекопитающего, растительной клеткой, бактерией, клеткой гриба, клеткой дрожжей, клеткой насекомого или трансгенным растением.

В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения организмом-хозяином согласно изобретению является бактерия E.coli, клетка Aspergillus или клетка Spodoptera, предпочтительно клетка Spodoptera frugiperda.

Далее изобретение относится к полипептиду, который кодируется молекулой нуклеиновой кислоты согласно изобретению или вектором согласно изобретению и/или продуцируется организмом-хозяином согласно изобретению.

Полипептид согласно изобретению проявляет преимущественно биологическую активность, свойственную А-цепи или В-цепи лектина омелы белой. В других вариантах осуществления изобретения полипептид согласно изобретению может, однако, проявлять также часть биологической активности или совсем не проявлять биологической активности. Под термином "часть биологической активности" согласно изобретению подразумевают или пониженную активность или/и ряд видов активности из спектра биологической активности. Полипептид согласно изобретению может быть также фрагментом А- или В-цепи, который проявляет одно из названных выше свойств.

Исследование свойств rMLA, rMLB и голопротеина rML

(I) Относительные молекулярные массы и структура

Относительные молекулярные массы определяли с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ЭПААГ-ДСН) и в присутствии восстанавливающих агентов и последующего окрашивания протеина с помощью серебряного красителя или кумасси бриллиантового синего или иммунологического обнаружения в рамках Вестерн-блоттинга.

Неожиданно при этом было обнаружено, что рекомбинантная негликозилированная А-цепь лектина омелы белой имеет относительную молекулярную массу 25 кДа и, таким образом, существенно отличается от природных А-цепей лектина омелы белой А₁ (31 кДа) или А₂ (29 кДа). Это различие в относительной молекулярной массе является неожиданным прежде всего потому, что согласно уровню техники исходили из того, что А-цепь не гликозилирована. Рекомбинантная В-цепь лектина омелы белой имеет относительную молекулярную массу 31 кДа и поэтому существенно легче, чем гликозилированная природная В-цепь лектина омелы белой с относительной молекулярной массой 36 кДа (фиг.7).

Присущая природным протеинам ML гетерогенность по причине гликозилирования и/или вариаций последовательностей, которая проявляется в геле в присутствии ДСН в виде широкой полосы, не наблюдается ни в одном из исследуемых случаев для рекомбинантных видов.

Относительные молекулярные массы реассоциированного голопротеина rMLA/rMLB (rML) суммируются до 56 кДа по сравнению с тяжелым природным голопротеином (nML) с относительной молекулярной массой 65-67 кДа.

(II) Изоэлектрическая гомогенность

rMLA обнаруживается как изоэлектрически гомогенный протеин с изоэлектрической точкой 6,8 в отличие от высокочистых природных А-цепей лектина омелы белой, которые подразделяются на четыре вида с изоэлектрическими точками 5,2; 5,4; 5,7 и 6,2 (фиг.8).

rMLB обнаруживается как изоэлектрически гомогенный протеин с изоэлектрической точкой 5,1 в отличие от природной В-цепи лектина омелы белой, которая подразделяется по меньшей мере на 2 вида с изоэлектрическими точками 7,1 и 7,3 (фиг.8).

При этом природный голопротеин ML обнаруживает большое число вариантов молекул и комбинаций молекул (фиг.8 внизу), в то же время для рекомбинантных протеинов лектина омелы белой выявляется однородная подвижность при хроматофокусировке с изоэлектрофокусировкой, что свидетельствует о гомогенности rML в отличие от микрогетерогенности природных видов протеинов.

(III) Ферментативная активность rMLA

При включении очищенных с помощью иммуноафинной хроматографии препаратов rMLA в спаренный опыт по транскрипции/трансляции была обнаружена ингибирующая трансляцию активность rMLA (выделенной из растворимой фракции продукта экспрессии) и rMLA (выделенной из нерастворимой фракции в "тельцах включения").

rMLA при сравнении с природной цепью лектина омелы белой проявляет отличающуюся ингибиторную характеристику в отношении зависимости степени ингибирования трансляции от дозы, а также в отношении неингибируемой остаточной активности трансляции в используемом лизате ретикулопитов (фиг.9). Свойство фермента, лежащее в основе токсического действия голопротеинов ML, существенно меньше в рекомбинантных видах.

(IV) Активность rMLB в отношении связывания углеводов

В-цепи rML, которые получают путем ренатурации и реокисления из первичных продуктов экспрессии, а также реассоциированные in vitro rMLA/rMLB, rMLA/MLB и голопротеины MLA/rMLB проявляют активность в отношении связывания углеводов, которая может быть обнаружена при анализе с помощью лектинсвязывающего фермента (ELLA) по связыванию с углеводными асиалофетуиновой или фетуиновой матрицами. Специфичность в отношении углеводов рекомбинантной В-цепи rML может быть определена и количественно оценена в ELLA-системе в условиях конкурентного связывания с галактозой, -лактозой, N-ацетилгалактозамином (Ga1NAc) и сиаловой кислотой (N-ацетилнейраминовой кислотой, NANA). При ELLA-тесте в конкурентных условиях неожиданно обнаруживают различную специфичность nMLB и rMLB в отношении углеводов. Сродство к связыванию описывают при этом с помощью специфических для системы значений ИК₅₀ для полумаксимального вытеснения протеинов с иммобилизованного асиалофетуинового лиганда галактозой (ИК₅₀ nMLB: 4,5 мМ; ИК₅₀ rMLB: вследствие незначительного взаимодействия определить невозвожно), -лактозой (ИК₅₀ nMLB: 4,9 мМ; ИК₅₀ rMLB: >70 мМ), N-ацетилгалактозамином (ИК₅₀ nMLB: 20,7 мМ; ИК ₅₀ rMLB: 109 мМ) или с иммобилизованного фетуинового лиганда сиаловой кислотой (ИК₅₀ nMLB: 49,8 мМ; ИК₅₀ rMLB: 47,1 мМ).

В то время как природная В-цепь nML, описанная как специфичный к галактозе лектин, как и ожидалось, может конкурировать с галактозой и -лактозой, полученная в E.coli рекомбинантная В-цепь rML не обнаруживает никакого выявляемого взаимодействия с галактозой и обнаруживает незначительное взаимодействие с -лактозой. Рекомбинантная rMLB обладает четким сродством к N-ацетилгалактозамину и сиаловой кислоте и при этом неожиданно обнаруживает при сравнении с растительной nMLB четкое смещение углеводной специфичности лектина к специфичности в отношении N-ацетилгалактозамина/сиаловой кислоты. Вследствие этого, принимая во внимание биологическую активность rMLB и rMLB-содержащих голопротеинов, можно использовать более широкий или разнообразный спектр лигандов, рецепторов или целевых клеток по сравнению с растительными протеинами лектина омелы белой.

В предпочтительном варианте полипептид согласно изобретению содержит по меньшей мере одну химическую или ферментативную модификацию.

Эта модификация при необходимости может привести к изменению известной биологической активности полипептида, понизить ее или повысить. Подобная модификация может, например, быть осуществлена после трансляции и выделения полипептида. С другой стороны, подобные модификации могут быть получены при химическом или полусинтетическом получении полипептида согласно изобретению. Эти модификации с помощью известных способов могут быть использованы с той целью, чтобы изменить, предпочтительно улучшить, фармакологическую активность лектина омелы белой.

В другом предпочтительном варианте полипептид согласно изобретению является слитым протеином. Слитый протеин проявляет преимущественно указанную выше определенную биологическую активность.

Этот вариант предлагаемого полипептида преимущественно предназначен для изменения или предпочтительно улучшения фармакологических свойств полипептида лектина омелы белой в отношении его направленного воздействия на клеточном уровне.

Далее изобретение относится к димеру полипептида с биологической активностью лектина омелы белой, причем оба мономера кодируются молекулами нуклеиновых кислот по изобретению.

Под термином "биологическая активность лектина омелы белой" подразумевается любая биологическая активность из спектра всех видов биологической активности, присущих лектину омелы белой. Подобной активностью является, например, фармакологическое действие лектина омелы белой.

В многочисленных линиях опухолевых клеток человека и животного растительный ML-1 вызывал гибель клеток с помощью механизмов апоптоза (Janssen, 1993). ML-1 или только его В-цепь индуцировали выделение цитокинов из периферических одноядерных клеток здоровых людей, служивших донорами крови (Hajto, 1990). У нейтрофильных гранулоцитов больных раком ML-1 индуцировал секрецию супероксидных ионов (Timoshenko, 1993). ML-1 индуцировал экспрессию А-цепи рецептора интерлейкина-2 (CD25) или антигена HLA-DQ у периферических лимфоцитов здоровых людей, служивших донорами крови (Beuth, 1992). После применения ML-1 у мышей было отмечено увеличение числа клеток тимуса, количества цитотоксичных Т-лимфоцитов (Lyt-2+) и Т-клеток-хелперов (L3T4+) в тимусе и число перитонеальных макрофагов, а именно тех, которые переносили маркер активации МАС-3 (Beuth, 1994). Кроме того, было повышено отношение L3N4+/Lyt2+ в тимусе исследуемых животных. В периферической крови мышей после обработки ML-1 в целом была повышена плотность лейкоцитов, лимфоцитов, моноцитов и именно лимфоцитов, которые экспрессируют рецептор интерлейкина-2 в качестве поверхностного маркера активации клетки, а также моноцитов, которые экспрессируют маркер активации МАС-3 (Beuth, 1994). В крови больных раком ML-1 повышал плотность Т-лимфоцитов (CD4+, CD8+), естественных клеток-киллеров и В-лимфоцитов (Beuth, 1992). Далее после применения ML-1 обнаруживали повышение эндогенного опиатного медиатора -эндорфина в плазме крови больных раком молочной железы (Heiny, 1994). Кроме того, было обнаружено, что ML-1 повышает цитотоксическое действие периферических клеток естественных киллеров против опухолевых клеток К-562 и плотность больших зернистых лимфоцитов (LGL) в периферической крови (Hajto, 1989). Была подтверждена антиметастатическая активность ML-1 в отношении клеток саркомы мышей (Beuth, 1991).

В другом предпочтительном варианте димер полипептида по изобретению обнаруживает такой же спектр биологической активности, что и природный димер лектина омелы белой.

(V) Биологическая активность рекомбинантного лектина омелы белой

Получение голопротеинов rML с использованием независимо синтезированных рекомбинантным путем отдельных цепей осуществляли, исходя из имеющих -структуру растворимых цепей или денатурированных А- и В-цепей rML в рамках совместного формирования -структуры, причем rMLB была преимущественно реассоциирована in vitro с молярным избытком rMLA в присутствии окислительно-восстановительной системы с глутатионом и частично в присутствии дисульфидизомеразы. Соответствующий гетеродимеру голопротеин rML выделяли из реассоциированной смеси и очищали с помощью аффинной хроматографии на N-ацетилгалактозамин-агарозе или лактозил-агарозе до получения свободной rMLA и rMLA димеров. При аналогичном подходе получали rMLA/rMLB (rML) и голопротеины гетеродимеров rMLA/nMLB.

Цитотоксическая активность

Цитотоксическое действие, как пример биологической активности реассоциированных голопротеинов, было изучено на линии клеток моноцитарного лейкоза (MOLT4). В-цепь (поверхностное связывание), равно как и А-цепь (ферментативная инактивация рибосом) вносят определенный вклад в наблюдаемый цитотоксический эффект. Реассоциированный in vitro голопротеин rMLA/rMLB и реассоциированный in vitro голопротеин rMLA/nMLB сравнивался с "двухзарядным" природным голопротеином nML. Рекомбинантные голопротеины rMLA/rMLB и rMLA/nMLB характеризуются сравнимыми высокими цитотоксическими свойствами со значениями ИК₅₀ около 10-30 пг/мл (фиг.11), что свидетельствует о функциональной целостности и биологической активности реассоциированных in vitro рекомбинантных цепей, входящих в голопротеины rML. Для достижения цитотоксической активности необходимо объдинить функционально активную В-цепь с ферментативно активной А-цепью, поскольку выделенная В-цепь rML сама по себе неожиданно не проявляет цитотоксической активности. Выявляемая до настоящего времени цитотоксическая активность растительных препаратов В-цепей лектина омелы белой, по-видимому, с большой вероятностью была обусловлена остаточным содержанием голопротеина nML. При получении отдельных цепей с помощью технологии рекомбинантных ДНК впервые, таким образом, достигается возможность независимого изучения и применения активности, присущей лектину омелы белой в отношении связывания углеводов и ее ферментативной активности.

Индукция апоптоза

Спосо