Способ определения микроорганизма с пониженной адаптацией к конкретной окружающей среде, днк (варианты), ген вирулентности, полипептид, способ определения соединения, антисмысловая нуклеиновая кислота, способ лечения хозяина и фармацевтическая композиция

Способ определения микроорганизма с пониженной адаптацией к конкретной окружающей среде, днк (варианты), ген вирулентности, полипептид, способ определения соединения, антисмысловая нуклеиновая кислота, способ лечения хозяина и фармацевтическая композиция

Реферат

 

Изобретение относится к генетической инженерии, а в частности способу идентификации генов, участвующих в адаптации организма в среде его обитания. Предложен способ идентификации микроорганизма с пониженной адаптацией к конкретной окружающей среде. Способ предусматривает получение множества микроорганизмов, каждый из которых независимо мутирован инсерционной инактивацией гена нуклеиновой кислотой, содержащей уникальную маркерную последовательность, так, что каждый мутант содержит различные маркерные последовательности, или клонов указанного микроорганизма, стадия (1). Индивидуально хранение образца каждого мутанта, полученного на стадии (1), и индивидуально накопленной нуклеиновой кислоты, содержащей уникальную маркерную последовательность из каждого индивидуального мутанта, стадия (2). Введение множества мутантов, полученных на стадии (1), в указанную конкретную окружающую среду и обеспечение тем микроорганизмам, которые способны к этому, возможности расти в указанной окружающей среде, стадия (3). Извлечение микроорганизмов из указанной окружающей среды или ее выбранной части и выделение нуклеиновой кислоты из этих микроорганизмов, стадия (4). Сравнение любых маркерных последовательностей в нуклеиновой кислоте, выделенной на стадии (4), с уникальной маркерной последовательностью каждого индивидуального мутанта, накопленного на стадии (2), стадия (5). Отбор индивидуального мутанта, который не содержит какой-либо из маркерных последовательностей, выделенных на стадии (4), стадия (6). Предложены также ДНК (варианты), ответственные за снижение адаптации микроорганизма к окружающей среде, выделенные из генома Salmonella, ген вирулентности, содержащий эту ДНК, и полипептид, кодируемый этим геном. Кроме того, предложен способ определения соединения, снижающего адаптацию микроорганизма к окружающей среде. Предложенный способ предусматривает отбор такого соединения, которое препятствует функционированию гена, содержащего ДНК, ответственную за снижение адаптации микроорганизма к окружающей среде. Также предложена антисмысловая нуклеиновая кислота, полученная вышеуказанным способом. Предложенная антисмысловая нуклеиновая кислота используется в способе лечения хозяина, инфицированного или чувствительного к инфицированию микроорганизмом, и входит в фармацевтическую композицию, подавляющую патогенный микроорганизм. 10 н. и 50 з.п.ф-лы, 14 ил., 2 табл.

Настоящее изобретение относится к способам идентификации генов, участвующих в адаптации микроорганизма в среде его обитания, особенно к способам идентификации генов, ответственных за вирулентность патогенного микроорганизма.

Область техники, к которой относится изобретение

Антибиотическая резистентность бактериальных и других патогенов становится все более важной проблемой. В связи с этим важны новые терапевтические подходы к борьбе с патогенными микроорганизмами.

Патогенные микроорганизмы способны избегать воздействия защитных механизмов хозяина и могут расти в плохой питательной среде, вызывая заражение. Для этого микроорганизм должен содержать ряд "вирулентных" генов.

Вирулентные гены могут быть определены с использованием приемов классической генетики. С помощью транспозонного мутагенеза осуществляют идентификацию бактериальных вирулентных генов. Так, например, мутанты подвергали скринингу на определенные физиологические дефекты, такие как потеря железорегулируемых белков (Holland с сотр., 1992), или использовали в анализах для изучения пенетрации эпителиальных клеток (Finlay с сотр., 1988) и выживания в макрофагах (Fields с сотр., 1989; Miller с сотр., 1989а; Groisman с сотр., 1989). Транспозонные мутанты также тестировали на измененную вирулентность живых животных инфицированных моделей (Miller с сотр., 1989b). Такой подход имеет преимущество в том, что могут идентифицироваться гены, играющие важную роль на различных стадиях заражения, но имеет ограничения, связанные с необходимостью индивидуального тестирования большого числа мутантов на изменения вирулентности. Miller с сотр. (1989b) использовали группы из 8-10 мышей и инфицировали орально 95 отдельных групп различными мутантами, вследствие чего использовали 760-950 мышей. В связи с тем, что требуется чрезвычайно большое количество животных, полный скрининг бактериального генома на вирулентные гены не представляется возможным.

Недавно была описана генетическая система (технология экспрессии in vivo (IVET)), которая позволяет осуществлять положительную селекцию специфически инфицированных генов Salmonella (Mahan с сотр., 1993). Такая техника позволяет идентифицировать гены, которые экспрессируются на конкретной стадии процесса инфицирования. Однако эта техника не позволяет идентифицировать вирулентные гены, которые регулируются посттранскрипционно и, что более важно, не обеспечивает информацией о том, действительно ли идентифицированные гены требуются для процесса инфицирования или способствуют ему.

Lee и Falkow (1994) в Methods Enzymol. 236, 531-545 описывают способ идентификации факторов, влияющих на инвазию Salmonella в клетки млекопитающих in vitro, путем выделения гиперинвазивных мутантов.

Walsh и Серко (1992) Science 255, 434-440 описывают способ отслеживания пространственного расположения недифференцированных клеток коры головного мозга в ходе развития коры головного мозга крыс. В методе Walsh и Серко используется метка, содержащая уникальную последовательность нуклеиновой кислоты и IacZ ген, однако не имеется указаний о возможности детекции этим методом ценных мутантов или генов.

В WO 94/26933 и в статье Smith с сотр., (1995) Proc.Natl. Acad.Sci.USA 92, 6479-6483 описываются методы, нацеленные на идентификацию функциональных участков известного гена или, по крайней мере, молекулы ДНК, о последовательности которой имеется некоторая информация.

Groisman с сотр. (1993) в Proc-Natl.Acad.Sci, США 90, 1033-1037 описывают молекулярный, функциональный и эволюционный анализ последовательностей специфичный на Salmonella.

Hensel с сотр. (1995) в Science 269, 400-403 описывают одновременную идентификацию бактериальных вирулентных генов путем негативного отбора. Эта статья была опубликована в июле 1995 г.

Slauch с сотр. (1994) в Methods in Enzymol. 235, 481-492 описывают технологию экспрессии in vivo для селекции бактериальных генов специфически индуцированных в тканях хозяина.

Pascopella с сотр. (1994) в Inf. Immun. 62, 1313-1319 описывают использование in vivo комплементации в Mycobacterium tuberculosis для идентификации геномного фрагмента, связанного с вирулентностью.

В патенте США 5397697 описывается идентификация растительно-чувствительных генов бактерий.

Некоторые вирулентные гены уже известны для таких патогенных микроорганизмов, как Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Salmonella typhi, Vibrio cholerae, Clostridium botulinum, Versinia pestis, Shigella flexneri и Listeria monocytogenes, однако во всех случаях идентифицировано лишь небольшое их число.

Заболевание, которое Salmonella typhimurium вызывает у мышей, обеспечивает хорошую экспериментальную модель тифоидной лихорадки (Carter и Collins, 1974). К настоящему времени идентифицировано примерно сорок два гена, влияющих на вирулентность Salmonella (Groisman и Ochman, 1994). Это составляет примерно одну треть от общего числа предсказанных вирулентных генов (Groisman и Saier, 1990).

Цель настоящего изобретения заключается в идентификации генов, принимающих участие в адаптации микроорганизма к среде его обитания, особенно в идентификации дополнительных вирулентных генов в патогенных микроорганизмах, с повышенной эффективностью. Другая цель изобретения состоит в уменьшении числа экспериментальных животных, используемых для идентификации генов. Другие цели настоящего изобретения состоят в разработке вакцин и методов скрининга лекарственных средств, уменьшающих вирулентность.

Краткое изложение сущности изобретения

Первый аспект изобретения относится к разработке способа идентификации микроорганизма с пониженной адаптацией к конкретной среде, включающему стадии:

(1) обеспечения множества микроорганизмов, каждый из которых независимо мутирован инсерционной инактивацией гена с помощью нуклеиновой кислоты, включающей уникальную маркерную последовательность так, что каждый мутант содержит различную маркерную последовательность, или клонов, указанных микроорганизмов;

(2) индивидуального получения хранимого образца каждого мутанта, полученного на стадии (1) и обеспечения индивидуально накопленной нуклеиновой кислоты, включающей особую маркерную последовательность от каждого индивидуального мутанта;

(3) введения множества мутантов, полученных на стадии (1), в указанную конкретную среду и культивирования микроорганизмов в указанной среде;

(4) извлечение микроорганизмов из указанной среды или ее выбранной части и выделение нуклеиновой кислоты из извлеченных микроорганизмов;

(5) сравнения любой маркерной последовательности нуклеиновой кислоты, выделенной на стадии (4), с особой маркерной последовательностью каждого индивидуального мутанта, полученного на стадии (2) и

(6) отбора индивидуального мутанта, не содержащего какую-либо из маркерных последовательностей, выделенных на стадии (4).

Таким образом, в таком способе используется негативная селекция для идентификации микроорганизмов с пониженной способностью к пролиферации в окружающей среде.

Микроорганизм может жить в различных средах и известно, что конкретные гены и их продукты позволяют микроорганизму адаптироваться к окружающей среде обитания. Так, например, для выживания таких патогенных микроорганизмов, как патогенные бактерии или патогенные грибки, в их хозяине требуется продукт одного или более вирулентных генов. Таким образом, в предпочтительном техническом решении изобретения ген микроорганизма, позволяющий ему адаптироваться к конкретной окружающей среде, представляет собой вирулентный ген.

Предпочтительная конкретная окружающая среда представляет собой дифференцированный многоклеточный организм, такой как растение или животное. Известно, что многие бактерии и грибки инфецируют растения, они способны выживать в нем и вызывать заболевание из-за наличия вирулентных генов или их экспрессии. Подходящие микроорганизмы в том случае, когда конкретная окружающая среда представляет собой растение, включают бактерии Agrobacterium tumefaciens, которые образуют опухоли (галлы) особенно на винограде; Erwina amylovara; Pseudomonas solanacearum, которая вызывает увядание большого числа растений; Rhizobium leguminosarum, которая вызывает заболевание бобов; Xanthomonos campestris p.у. citri, которая вызывает язву цитрусовых фруктов; и включают грибок Magnaporthe grisea, который вызывает пирикуляриоз риса; Fusarium spp., который вызывает множество болезней растений; Erisyphe spp., Colletotrichum gloeosporiodes; Gaeumannomyces qraminis, который вызывает заболевания корневой системы и кроны хлебных злаков и трав; Glomus spp., Laccaria spp.; Leptosphaeria maculans; Phoma tracheiphila; Phytophthora spp., Pyrenophora teres; Verticillium alboatrum и V.dahliae; а также Mycosphaerella musicola и M.fijiensis. Как будет подробно описано ниже, в том случае, когда микроорганизм представляет собой грибок, для его жизненного цикла требуется гаплоидная фаза.

Так известно, что многие микроорганизмы, включающие бактерии, грибы, простейшие животные и трипаносомы, инфецируют животных, особенно млекопитающих, включая людей. Выживание микроорганизмов в организме животного и его способность вызывать заболевания в основном связаны с наличием вирулентных генов и их экспрессии. Такие бактерии включают Bordetella spp., особенно В.pertussis, Campylobacter, особенно C.jejuni, Clostridium spp., особенно C.botulinum, Enterococcus spp., особенно E.faecalis, Escherichia spp., особенно E.coli, Haemophilus spp., особенно H.ducreyi и H.influenzae, Helicobacter spp., особенно H.pylori, Klebsiella spp., особенно К.pneumoniae, Legionella spp., особенно L.pneumophila, Listeria spp., особенно L.monocytogenes, Mycobacterium spp., особенно М.smegmatis и M.tuberculosis, Neisseria spp., особенно N.gonorrhoeae и N.meningitidis, Pseudomonas spp., особенно Ps.aeruginosa, Salmonella spp., Shigella spp., Staphylococcus spp., особенно S. aureus, Streptococcus spp., особенно S.pyogenes и pneumoniae, Vibrio spp. и Yersinia spp., особенно Y.pestis. Все такие бактерии вызывают болезни людей и животных. В случае применения бактерий в способе изобретения, конкретной окружающей средой является животное, которое они способны инфицировать и у которого они вызывают болезнь. Так, например, в случае инфицирования мышей Salmonella typhimurium у мышей развивается заболевание, служащее моделью тифоидной лихорадки людей. Staphylococcus aureus вызывает бактериемию и образование ренального абсцесса у мышей (Albus с сотр. (1991) Infect.Immun. 59, 1008-1014) и эндокардиты у кроликов (Perlmann и Freedman (1971) Уа1е J.Biol.Med.44, 206-213).

Необходимо, чтобы грибы или высший эукариотный паразит представляли собой гаплоиды в отдельные периоды его жизненного цикла (например, роста в окружающей среде). Предпочтительно, чтобы имелась ДНК-опосредованная интегрированная трансформационная система, в том случае, когда микроорганизм представляет собой человеческий патоген, удобно, чтобы была доступна животная модель заболевания человека. Грибы, патогенные в отношении людей, включают некоторые Aspergillus spp. (например, A.fumigatus), Cryptococcus neoformans и Histoplasma capsulatum. Очевидно, что указанные выше грибы имеют гаплоидную фазу, и для них имеется в распоряжении ДНК-опосредованная интегрированная трансформационная система. Может также использоваться Тохоplasma, представляющая собой паразит с гаплоидной фазой в ходе инфицирования. Бактерии имеют гаплоидный геном.

Наиболее доступными животными моделями человеческих заболеваний, является мышь, крыса, кролик, собака или обезьяна. Предпочтительно, когда такое животное представляет собой мышь. Вирулентные гены, детектируемые способом настоящего изобретения с использованием животной модели человеческого заболевания, являются генами, определяющими вирулентность микроорганизма в организме человека.

Особенно предпочтительными микроорганизмами для применения в способах настоящего изобретения являются Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa и Aspergillus fumigatus.

Далее описывается предпочтительное техническое решение настоящего изобретения.

Нуклеиновую кислоту, содержащую уникальную маркерную последовательность, получают следующим образом. Комплексный пул последовательности двунитевой ДНК "меток" создают с использованием олигонуклеотидного синтеза и полимеразной реакции синтеза цепи (PCR). Каждая ДНК метки" имеет последовательность размером в 20-80 п.о., предпочтительно 40 п.о., которая фланкирована последовательностями, "плечами" размером примерно 15-30 п.о., предпочтительно около 20 п.о., которые являются общими для всех "меток". Число пар основания п.о. последовательности является достаточным для создания большого количества (например, > 10¹⁰) уникальных последовательностей в ходе беспорядочного олигонуклеотидного синтеза, но не достаточным для образования вторичных структур, которые могут препятствовать PCR. Аналогично, длина последовательности плечей должна быть достаточной для обеспечения эффективного примирования олигонуклеотидов в PCR.

Хорошо известно, что последовательность на 5’-окончании олигонуклеотида не нуждается в совместимости с последовательностью-мишенью для амплифицирования.

Обычно PCR праймеры не содержат каких-либо комплементарных структур, каждая из которых была бы длиннее 2 пар оснований, особенно на их 3’-концах, поскольку это может способствовать образованию искусственных продуктов, называемых "праймерные димеры". В случае гибридизации 3’-концов двух таких праймеров образуется "примированный матричный" комплекс, и праймерная инсерция приводит в результате к образованию короткого дуплексного продукта, называемого "праймерным димером".

Следует избегать образования в праймерах внутренней вторичной структуры. Для симметричной PCR, рекомендуется для обоих праймеров содержание G+C-40-60% с короткой длиной любого основания. Классические расчеты температуры плавления, используемые совместно с исследованиями гибридизации зонда ДНК, часто позволяют предсказать, что данный праймер должен ренатурироваться при конкретной температуре, или, что при повышении температуры до 72°С будет происходить преждевременная диссоциация гибрида праймер/матрица. На практике такие гибриды оказываются более эффективными в PCR процессе, чем это обычно предсказывается простыми расчетами Тm.

Оптимальные температуры отжига могут быть определены эмпирически и могут превышать предположительные значения. При 37-55°С Taq ДНК полимераза является активной, при этом появляется праймерная вставка в ходе стадии отжига и происходит стабилизация гибрида. Концентрации праймеров равны в типичной (симметричной) PCR и, как правило, составляют 0,1-1 мкМ.

"Метки" лигируются в транспозон или транспозон-подобный элемент с образованием нуклеиновой кислоты, содержащей особую маркерную последовательность. В целях удобства транспозон переносится на вектор-"самоубийцу", который сохраняется в виде плазмиды в организме "помощника", но теряется после переноса на микроорганизм, используемый в способе настоящего изобретения. Так, например, организм-"помощник" может представлять собой штамм Escherichia coli, микроорганизм способа может представлять собой Salmonella, а передача происходит в ходе конъюгации. Хотя транспозон может теряться после переноса в определенной части клеток он претерпевает транспозицию даже, если он интегрируется рандомизированно, совместно с его уникальной меткой в геном микроорганизма, используемого в способе изобретения. Наиболее предпочтительно, чтобы транспозон или транспозон-подобный элемент, мог быть подвергнут селекции. Так, например, в случае Salmonella, канамицин-устойчивый ген может присутствовать в транспозоне, при этом эксконъюганты подвергают отбору на среде, содержащей канамицин. Существует также возможность комплементации ауксотрофного маркера в клетке-реципиенте функциональным геном в нуклеиновой кислоте, содержащей уникальный маркер. Такой способ особенно удобен при использовании грибков в способе изобретения.

Предпочтительно, чтобы комплементирующий функциональный ген не был получен из тех же видов микроорганизмов, что и реципиентный микроорганизм иначе могут произойти неслучайные интеграционные события. Так же является предпочтительным перенос транспозона или транспозон-подобного элемента на вектор, который эписомально сохраняется (т.е. не является частью хромосомы) в микроорганизме, используемом в способе по первому аспекту изобретения в начальном заданном состоянии, принимая во внимание, что при его изменении эписом не удерживается в состоянии, при котором возможно осуществлять селекцию клетки, в которой транспозон или транспозон-подобный элемент подвергаются транспозиции, даже если они интегрируются случайным образом, совместно с уникальной меткой, в геном микроорганизма, используемого в способе изобретения. Такое техническое решение является выгодным, поскольку после получения микроорганизма, несущего эписомальный вектор, транспозиционное событие каждый раз отбирается или индуцируется изменением состояния микроорганизма (или его клона) от первого данного состояния во второе данное состояние, и транспозон может интегрироваться на различных сайтах генома микроорганизма. Так, после получения основной коллекции микроорганизмов, каждый член которой содержит особую меченую последовательность в транспозоне или транспозон-подобном элементе, переносимых на эписомальный вектор (в первом данном состоянии), такая коллекция может использоваться повторно для образования пулов рандомизированных инсерционных мутантов, каждый из которых содержит различные меченые последовательности (т.е. особые последовательности в рамках пула). Такое техническое решение особенно полезно поскольку (а) оно уменьшает число и сложность манипуляций, требуемых для создания множества ("пула") независимо мутированных микроорганизмов на стадии (1) настоящего способа; и (б) требуется лишь то же число меток, что и число микроорганизмов во множестве микроорганизмов на стадии (1) способа изобретения. Пункт (а) упрощает такой способ при его использовании в организмах, в которых наиболее трудно осуществить транспозонный мутагенез (например, Staphylococcus aureus), а пункт (б) означает, что могут отбираться меченые последовательности с особенно хорошими гибридизационными характеристиками, в связи с чем облегчается контроль их качества. Как подробно описано ниже, размер "пула" обычно составляет 100 или 200 независимо мутированных микроорганизмов, и поэтому основную коллекцию микроорганизмов удобно хранить на одном или двух 96-луночных титрационных микропланшетах.

В соответствии с особенно предпочтительным техническим решением первое заданное состояние представляет собой первую конкретную температуру или такой температурный интервал, как 25-32°С, наиболее предпочтительно около 30°С, а второе заданное состояние представляет собой вторую конкретную температуру или такой температурный интервал, как 35-45°С, наиболее предпочтительно 42°С. В дополнительных предпочтительных технических решениях первое заданное состояние представляет собой наличие такого антибиотика, как стрептомицин, а второе заданное состояние представляет собой отсутствие указанного антибиотика; либо первое заданное условие представляет собой отсутствие антибиотика, а второе заданное состояние - присутствие указанного антибиотика.

Транспозоны, подходящие для интеграции в геном грамотрицательной бактерии включают Тn5, Тn10 и их производные. Транспозоны, подходящие для интеграции в геном грамположительных бактерий включают Тn916, его производные или аналоги. Транспозоны, особенно подходящие для использования с Staphylococcus aureus, включают Tn917 (Cheung с сотр.) 1992, Proc.Natl.Acad. Sci. США, 89, 6462-6466 (и Tn918) Albus с сотр. (1991) Infect. Immun., 59, 1008-1014).

Особенно предпочтительно, если транспозоны обладают свойствами Tn917 производных, описанных Camilli с сотр. (1990) J.Bacteriol. 172, 3738-3744 и переносятся термочувствительными векторами, такими как рЕ194Т (Villafane с сотр. (1978) J. Bacteriol, 169, 4822-4829).

Следует иметь в виду, что хотя транопозоны и удобны для инсерционной инактивации гена, но также возможно применение любых других способов. Другим удобным способом инсерционной инактивации гена, особенно в некоторых бактериях, таких как Streptococcus, является инсерционно-дупликационный мутагенез, подобный тому, что описан в статье Morrison с сотр. (1984) J.Bacteriol 159, 870 в отношении S.pneumoniae. Общий метод может применяться на других микроорганизмах, особенно на бактериях.

В случае грибков инсерционные мутации создают путем трансформации с использованием фрагментов ДНК или плазмид, несущих "метки" и предпочтительно селектируемый маркер, кодирующий, например, устойчивость к гигромицину В или флеомицину (см. Smith с сотр. (1994) Infect. Immunol. 62, 5247-5254). Неупорядоченная, единичная интеграция фрагментов ДНК, кодирующих устойчивость к гигромицину В, в геном гифомицеты с использованием интеграции под действием рестриктазы (REMI; Schiestl и Petes (1991); Lu с сотр. (1994) Proc.Natl.Acad.Sci. CШA, 91, 12649-12653) является известным явлением.

Простая методика инсерционного мутагенеза гриба описана Schiestl и Petes (1994), на которых ссылаются в настоящем изобретении, и она включает, например, использование Тy элементов и рибосомной ДНК в дрожжах.

Неупорядоченная интеграция транспозона или других последовательностей ДНК позволяет выделить множество независимо мутированных микроорганизмов, в которых различные гены инсерционно инактивированы в каждом мутанте, и каждый мутант содержит маркерную последовательность.

Библиотека таких инсерционных мутантов ранжируется в микротитрационных планшетах так, что каждая лунка содержит различные мутантные микроорганизмы. Аккумулируют ДНК, содержащую уникальную маркерную последовательность от каждого индивидуального мутантного микроорганизма (удобно использовать общую ДНК из клона). Такую операцию удобно проводить путем удаления образца микроорганизма из микротитрационного планшета, нанесения его штрихами на мембрану для гибридизации нуклеиновой кислоты (например, на нитроцеллюлозную или найлоновую мембраны), лизирования микроорганизма в щелочи и фиксации нуклеиновой кислоты на мембране. Таким способом получают копию содержимого лунок.

Из полученных на микротитрационных планшетах пулов микроорганизмов выделяют ДНК. Такую ДНК используют в качестве мишени для PCR с применением праймеров, которые осуществляют ренатурацию с общими участками, фланкирующими "метки", амплифицированную ДНК метят, например, с помощью ³² Р. Продукт такой PCR используют для зондирования ДНК, полученной из каждого индивидуального мутанта, с целью обеспечения эталонной гибридизационной карты для реплик микротитрационных планшетов. Такую операцию проводят с целью определения, действительно каждый из индивидуальных микроорганизмов фактически содержит маркерную последовательность и может ли маркерная последовательность быть эффективно амплифицирована и мечена.

Получают пулы транспозонных мутантов для введения в определенную среду. Удобно использовать 96-луночные планшеты для микротитрования, при этом пул содержит 96 транспозонных мутантов. Однако нижний предел размера пула составляет два мутанта; не имеется теоретического верхнего предела размера пула, однако, как обсуждается ниже, верхний предел может быть определен с учетом окружающей среды, в которую введены мутанты.

При введении микроорганизмов в указанную конкретную окружающую среду микроорганизмам создают условия для их роста. Период нахождения микроорганизмов определяется его природой и средой его обитания. По истечении надлежащего времени пребывания микроорганизмы выводят из окружающей среды, выделяют ДНК и такую ДНК используют в качестве матрицы для PCR с применением праймеров, которые осуществляют ренатурацию с "плечами", фланкирующими "метки". Продукт PCR метят, например, с помощью ³²Р и используют для зондирования ДНК, запасенной от каждого индивидуального мутанта, реплицированного из микротитрационного планшета. Идентифицировали аккумулированную ДНК, которая слабо гибридизируется или совсем не гибридизируется с зондом, полученным из ДНК, выделенной из микроорганизмов, извлеченных из окружающей среды. Негибридизирующиеся ДНК соответствуют мутантам, адаптация которых в конкретной окружающей среде ослаблена инсерцией транспозона или другой последовательности ДНК.

Наиболее предпочтительно, когда "плечи" не содержат или содержат очень мало меченых атомов по сравнению с "метками".

Так, например, праймеры PCR строят таким образом, чтобы они не содержали или содержали только единственный G-остаток, ³²Р-меченый нуклеотид представляет собой dCTP, и в этом случае ни одного или один радиомеченый С-остаток вводится в каждое "плечо", а основное количество радиомеченых С-остатков вводится в "метку". Предпочтительно, чтобы "метка" содержала, по крайней мере, в десять раз большее количество меченых атомов, чем соответствующее количество, введенное в "плечи"; предпочтительно такое количество должно быть больше в двадцать или более раз; более предпочтительно в пятьдесят и более раз. Удобно, чтобы "плечи" могли удаляться из "метки" с использованием соответствующей рестриктазы, сайт для которого может вводиться в праймерную конструкцию.

Как отмечалось выше, наиболее предпочтительно, когда микроорганизм представляет собой патогенный микроорганизм, а конкретная окружающая среда представляет собой животное. В соответствии с таким техническим решением размер пула мутантов, вводимого в животное, определяется (а) числом клеток каждого мутанта, которые вероятно выживают в животном (предполагая, что вирулентный ген не инактивируется), и (б) общим количеством инокулята микроорганизма. Если число по пункту (а) слишком низкое, то могут быть получены ложные положительные результаты, а если число по пункту (б) слишком велико, то животное может погибнуть до того, как достаточное количество мутантов получит возможность для нормального роста. Число клеток по пункту (а) может быть определено для каждого используемого микроорганизма, но предпочтительно оно имеет значение более 50, более предпочтительно выше 100.

Число различных мутантов, которые могут вводиться в одно животное, предпочтительно составляет 50-500, наиболее предпочтительно около 100. Предпочтительно, когда общее количество инокулята не превышает 10⁶ клеток (и предпочтительно, составляет 10⁵ клеток), хотя размер инокулята может быть выше или ниже указанного значения в зависимости от природы микроорганизма и животного.

В соответствии с наиболее удобным методом используют инокулят порядка 10⁵, содержащий 1000 клеток каждого из 100 различных мутантов, в расчете на одно животное. Следует отметить, что согласно такому способу может использоваться одно животное для скрининга 100 мутантов по сравнению с известными способами, в которых требуется, по крайней мере, 100 животных для отбора 100 мутантов.

Однако удобнее всего инокулировать трех животных одним и тем же пулом мутантов так, чтобы, по крайней мере, на двух из них можно было проводить исследования (одно из животных в этом случае служит копией для проверки достоверности способа), в то время как третье животное служит объектом обратного контроля. Несмотря на это, такой способ все еще обеспечивает более, чем 30-кратную экономию числа используемых животных.

Промежуток времени между введением пула мутантов в животное и извлечением микроорганизмов может изменяться в зависимости от природы используемого микроорганизма и животного. Так, например, если животное представляет собой мышь, а микроорганизм представляет собой Salmonella typhimurium, время между инокуляцией и выделением составляет примерно три дня.

Согласно одному из воплощений настоящего изобретения микроорганизмы извлекаются из среды обитания на стадии (5) на сайте, отдаленном от сайта введения на стадии (4) так, что подлежащие исследованию вирулентные гены включают те, что распространились между двумя такими сайтами.

Так, например, в случае растения микроорганизм может вводиться в повреждение на стебле или на один участок листа, а микроорганизм извлекается из другого участка листа, где обнаружено болезненное состояние.

В случае животного микроорганизм может вводиться орально, внутрибрюшинно, внутривенно или интраназально и с течением времени извлекаться из такого внутреннего органа, как селезенка. Может оказаться полезным сравнение вирулентных генов, идентифицированных при оральном применении и тех, что идентифицированы в результате внутрибрюшинного применения, поскольку некоторые гены вызывают заражение одним путем, но не другим. Предпочтительно, чтобы Salmonella вводилась внутрибрюшинно.

Другими предпочтительными окружающими средами, которые могут использоваться для идентификации вирулентных генов, являются животные клетки в культуре (особенно макрофаги и эпителиальные клетки) и растительные клетки в культуре. Хотя использование клеток в культуре полезно само по себе, оно может также дополнять применение целого животного или растения, как это имеет место в определенных случаях, в качестве окружающей среды.

Также предпочтительно, когда окружающая среда представляет собой часть тела животно. В рамках данного взаимодействия хозяин - паразит возможен ряд различных сред обитания, включающих различные органы и ткани, а также их части, например очаг Реуеr.

Число индивидуальных микроорганизмов (т.е. клеток), выделенных из окружающей среды, должно, по крайней мере, в два раза, предпочтительно, по крайней мере, в десять раз, более предпочтительно в 100 раз превышать число различных мутантов, введенных в окружающую среду. Так, например, при инокулировании животного 100 различными мутантами примерно 10000 индивидуальных микроорганизмов должно извлекаться и выделяться их маркерная ДНК.

Дополнительное предпочтительное техническое решение включает стадии:

(1А) удаления ауксотрофов из множества мутантов, продуцированных на стадии:

(1); или

(6А) определения ауксотрофной природы мутанта,отобранного на стадии (6); или

как (1А), так и (6А).

Необходимо различать ауксотрофы (представляющие собой мутантный микроорганизм, требующие наличия факторов роста, не являющихся необходимыми для дикого типа или для прототрофов) и мутантный микроорганизм, в котором ген, обеспечивающий адаптацию такого микроорганизма в конкретной окружающей среде, находится в инактивированном состоянии. Удобно осуществлять такую операцию между стадиями (1) и (2) или после стадии (6).

Предпочтительно, при идентификации вирулентных генов ауксотрофы не удалять.

В соответствии со вторым аспектом настоящего изобретения обеспечивается способ идентификации гена, позволяющего микроорганизму адаптироваться в конкретной окружающей среде, причем такой способ включает способ по первому аспекту изобретения, после которого проводят дополнительную стадию:

(7) выделения инсерционно-инактивированного гена или его части из индивидуального мутанта, отобранного на стадии (6).

Способы выделения гена, содержащего особый маркер, хорошо известны в области молекулярной биологии.

Еще одно предпочтительное техническое решение включает следующую дополнительную стадию:

(8) выделения из микроорганизма дикого типа соответствующего гена дикого типа с использованием инсерционно-инактивированного гена, выделенного на стадии (7) или его части в качестве зонда. Способы генного зондирования хорошо известны в области молекулярной биологии.

Методы молекулярной биологии, подходящие для использования на практике настоящего изобретения, описаны в работе Sambrook с сотр. (1989), на которую ссылаются в тексте.

В том случае, когда микроорганизм представляет собой микроорганизм, патогенный в отношении животного, а ген представляет собой вирулентный ген, транспозон применяют для инсерционной инактивации гена. Удобно клонировать вирулентные гены перевариванием геномной ДНК из индивидуального мутанта, отобранного на стадии (6), с рестриктазой, осуществляющей разрез вне транспозона, лигированием размерно-фракционированной ДНК, содержащей транспозон, в плазмиду. Селекцию плазмидных рекомбинантов осуществляют на основе антибиотической устойчивости, приобретенной от транспозона, а не от плазмиды. Геномную ДНК микроорганизма, примыкающую к транспозону, секвенируют с использованием двух праймеров, которые ренатурируются в терминальные области транспозона, и двух праймеров, которые отжигаются вблизи полилинкерных последовательностей плазмиды. Такие последовательности могут быть подвергнуты исследованию с использованием базы данных ДНК с целью установления влияния транспозона на известный вирулентный ген. Так, например, последовательность, полученную таким способом, сравнивают с последовательностями, присутствующими в таких общедоступных базах данных, как EMBL и GenBank. Наконец, если оказывается, что прерванная последовательность присутствует в новом вирулентном гене, мутацию переносят на новый генетический фон (например, с помощью фаг Р22-управляемой трансдукции в случае Salmonella) и определяют LД₅₀ мутантного штамма с целью подтверждения того, что невирулентный фенотип обусловлен транспозиционным событием, а не вторичной мутацией.

Число индивидуальных мутантов, подвергнутых скринингу для детекции всех вирулентных генов в микроорганизме, зависит от числа генов в геноме микроорганизма. Так, например, вероятно, что 3000-5000 мутантов Salmonella typhimurium необходимо подвергнуть скринингу для детекции основного количества вирулентных генов, тогда как для Aspergillus spp., которая имеет более крупный геном, чем Salmonella, скринингу подвергают около 20000 мутантов. Примерно 4% не являющихся незаменимыми генов S.typhimurium требуется для определения вирулентности (Grossman и Saier, 1990), в этом случае геном S.typhimurium содержит примерно 150 вирулентных генов. Однако способы настоящего изобретения предусматривают более быстрый, более удобный и гораздо более практичный путь идентификации вирулентных ге