Терапевтические композиции (ii)

Терапевтические композиции (ii)

Реферат

 

Изобретение относится к области медицины и касается применения циклического эфира (R)-3-гидроксибутирата формулы (1) для лечения болезненных состояний, опосредованных свободными радикалами, токсическими агентами, такими как пептиды и белки, и генетическими дефектами, вредными для метаболизма клетки, устойчивостью к инсулину или другими дефектами обмена глюкозы или состояниями, вызывающими дефект, ишемии, травмы головы, и/или повышения эффективности работы клетки. Соединение формулы (1) обладает повышенной эффективностью в повышении уровня (R)-3-гидроксимасляной кислоты, поддержании повышенного уровня в течение нескольких часов, возможностью введения без противоиона и простотой получения. 9 н. и 7 з.п. ф-лы, 1 табл., 1 ил.

Настоящее изобретение относится к композициям, которые подходят для введения человеку и животным и которые характеризуются свойством повышать уровень (R)-3-гидроксибутират ((R)-3-гидроксимасляная кислота или D--гидроксибутират) при их введении, особенно, когда вводятся перорально, местно, подкожно или парентерально, но наиболее успешно - перорально.

Введение (R)-3-гидроксимасляной кислоты характеризуется рядом благоприятных воздействий на организм человека и животных. Среди прочего это включает повышение активности сердечной мышцы, например, при сердечной недостаточности, обеспечение альтернативного глюкозе источника энергии, например, при диабете и состояниях устойчивости к инсулину, и лечение нарушений, вызываемых повреждением нервных клеток, например клеток ЦНС, в частности, путем замедления или предотвращения поражения мозга, такого как наблюдаемое при болезни Альцгеймера и паркинсонизме, а также сходных заболеваний и состояний.

Установлено, что гидроксибутират натрия усиливает мозговое кровообращение и местные вазомоторные рефлексы на 40% включительно (Biull. Eksp. Biol. Med Vol 88 11, pp.555-557).

В патенте ЕР 0780123 А1 описано далее применение ацетоацетата, -гидроксибутирата, их эфиров с одноатомными, двухатомными и трехатомными спиртами, или линейных олигомеров, содержащих от 2 до 10 единиц -гидроксибутирата для подавления отека мозга, защиты мозговой деятельности, коррекции энергетического метаболизма мозга и уменьшения степени церебрального инфаркта.

Внутривенное вливание натриевых солей (R)-3-гидроксибутирата проводили здоровым людям и пациентам с рядом заболеваний, например, которых лечили от тяжелого сепсиса в палате интенсивной терапии, и было обнаружено, что оно не токсично и способно снижать концентрацию глюкозы, свободных жирных кислот и глицерина, но не эффективно в отношении снижения окисления лейцина.

В настоящем изобретении дополнительно установлено, что соединения и композиции, которые увеличивают уровень (R)-3-гидроксимасляной кислоты и/или ацетоацетата в крови также обладают полезностью для уменьшения свободных радикалов in vivo и, таким образом, имеют значение при лечении заболеваний, ассоциированных со свободнорадикальными процессами.

(R)-3-Гидроксибутират и ацетоацетат, обычно называемые кетоновыми телами, создают нормальную физиологическую альтернативу обычным веществам, продуцирующим энергию, глюкозе и жирным кислотам. При длительном голодании у человека жирные кислоты превращаются в печени в (R)-3-гидроксимасляную кислоту и ацетоацетат, которые могут использоваться большинством главных тканей организма за исключением печени. В таких условиях общее количество кетоновых тел крови увеличивается до приблизительно 7 мМ. Когда они увеличиваются в крови умеренно, внепеченочные ткани, такие как мозг, сердце и скелетные мышцы используют эти кетоновые тела в митохондриях для обеспечения восстановительной энергии в форме НАДН, который является первичным субстратом системы транспорта электронов и генератором энергии, требуемой для синтеза АТФ. В свою очередь, генерация кетонами НАДН митохондрий снижает соотношение свободных митохондриальных [НАД⁺]/[НАДН] и соотношение цитозольных [НАДФ⁺]/[НАДФН], с которым связано соотношение митохондриальных [НАД⁺]/[НАДН]. В то же время катаболизм кетонов смещает соотношение митохондриальных [НАД⁺]/[НАДН] в сторону восстановленной формы и он смещает соотношение митохондриальных [убихинона]/[убихинола], [Q]/[QH₂] в сторону окисленной формы. Семихинонная форма убихинола представляет собой главный источник образования перекиси, O₂ митохондриями. Путем снижения восстановленной формы QH₂ и его семихинона можно снижать образование свободных радикалов митохондриями, при этом увеличивая в то же время ловушки для свободных радикалов, связанные с системой НАДФ, такие как глутатион.

Таким образом, авторы настоящего изобретения установили, что свободнорадикальное поражение, возникающее из-за избытка восстановленного Q или торможения НАДН-дегидрогеназы, такое как возникающее при токсичности, индуцированной МРР, может быть снижено путем введения агентов, которые увеличивают уровень кетоновых тел in vivo.

Свободнорадикальные поражения задействованы в большом числе заболеваний, среди которых находятся неврологические заболевания: болезнь Паркинсона, амиотрофический латеральный склероз, болезнь Альцгеймера и ишемия мозга. Кроме того, чрезмерные свободнорадикальные поражения вовлечены как играющие определенную роль при коронарной реперфузии, диабетической ангиопатии, воспалительном заболевании кишечника и панкреатите.

В параллельной заявке на патент WO 98/41201 описано введение линейных эфиров (R)-3-гидроксимасляной кислоты и/или ацетоацетата для продукции повышенного уровня свободных соединений in vivo. Было показано, что пероральное введение 4 мМ раствора олигомерного тетра-(R)-3-гидроксибутирата или его ацетоуксуного эфира повышает уровень кетоновых тел в крови, в результате чего этот измеренный уровень (R)-3-гидроксибутирата увеличивался от 1 до 2 мМ в течение периода, превышающего 2 часа.

В настоящее время авторы настоящей заявки обнаружили, что введение компонента (R)-3-гидроксимасляной кислоты такой композиции в виде циклического олигомера обеспечивает неожиданные преимущества. Эти преимущества могут включать среди прочего (а) повышенную эффективность в повышении уровня (R)-3-гидроксимасляной кислоты, в результате чего этот уровень может возрастать на более чем 2 мМ, включая достижение уровня, почти соответствующего уровню голодных и выше, (b) поддержание повышенного уровня в течение нескольких часов, (с) возможность введения без противоиона, такого как натрий или метилглюкамин, когда нежелательно увеличивать солевую нагрузку больному или когда предусматривают значительную дозировку и (d) относительную простоту производства чистого соединения из полимерных исходных материалов, получаемых с помощью биокультуры.

Настоящая заявка, в частности, касается проблемы нейродегенеративных заболеваний, в частности такого заболевания, когда нейроны подвергаются нейротоксическому действию патогенных агентов, таких как белковые бляшки и окислительное повреждение, и дополнительно относится к композиции для применения в лечении этих и указанных выше заболеваний.

В предпочтительных осуществлениях настоящее изобретение относится к повышению кетонов крови, необходимому для коррекции дефектов, описанных выше, и которое может достигаться с помощью парентерального или энтерального введения. В частности оно не требует введения потенциально токсичных фармакологических агентов. Улучшенная эффективность по настоящему изобретению в отношении повышения уровня, в особенности уровня в крови, кетоновых тел, обеспечивает терапевтические эффекты классической кетогенной диеты, которая, как обнаружено, сама по себе не является токсичной у детей, а у взрослых не вызывает побочных эффектов по сравнению с теми, кто не подвергается лечению. Более того, авторы настоящего изобретения обнаружили, что параллельно с коррекцией указанных выше метаболических и токсических дефектов должно происходить снижение ответа цитокинов и повышение пептидов апоптоза в дегенерирующих клетках благодаря повышению энергетического статуса нейрональной клетки и повышению трофической стимуляции в результате повышения синтеза нейромедиатора, например ацетилхолина.

Предлагаемое в настоящем изобретении лечение выходит за пределы действия кетоновых тел на циркуляцию, поскольку предлагается лечение клеток, не способных функционировать из-за нейродегенерации и/или метаболических дефектов, в частности, в метаболизме глюкозы, например, вызванных нейротоксичными агентами, такими как пептиды, белки, повреждение свободными радикалами или результат генетической аномалии. Лечение включает действие самих кетоновых тел на клетки, а не на приток к ним крови.

Таким образом, в первом варианте настоящее изобретение относится к циклическому эфиру (R)-3-гидроксибутирата формулы (I)

где n равно целому числу от 1 или более,

или его комплексу с одним или несколькими катионами или его соли для применения в терапии или питании.

Для пероральной доставки может быть предпочтителен свободный циклический олигомер. Когда в комплексе присутствуют катионы, предпочтительными катионами являются натрий, калий, магний и кальций, и они уравновешены в предлагаемом солевом комплексе с помощью физиологически приемлемого противоиона.

Примеры типичных физиологически приемлемых солей следует выбирать из натриевых, калийных, магниевых, L-лизиновых и L-аргининовых или, например, более сложных солей, таких как соли метилглюкамина.

Предпочтительно, n является целым числом от 1 до 200, более предпочтительно, от 1 до 20, наиболее предпочтительно, от 1 до 10 и особенно удобным является 1, т.е. (R,R,R)-4,8,12-триметил-1,5,9-триоксадодека-2,6,10-трион, 2, 3, 4 или 5.

Циклические эфиры по изобретению, предпочтительно, применяют для лечения болезненных состояний, опосредуемых свободными радикалами, токсическими агентами, такими как пептиды и белки, генетическими дефектами, вредными для метаболизма нервной клетки, устойчивостью к инсулину или другими дефектами метаболизма глюкозы, или состояниями, индуцирующими дефект, ишемией, травмой головы и/или для повышения эффективности деятельности клетки, например эффективности деятельности клетки сердца, например, при сердечной недостаточности.

Во втором варианте изобретение относится к способам лечения клеток, страдающих функциональной недостаточностью из-за действия свободных радикалов, токсических агентов, таких как пептиды и белки, генетических дефектов, вредных для метаболизма клетки, устойчивости к инсулину или других дефектов метаболизма глюкозы, или состояний, индуцирующих дефект, ишемии, травмы головы и/или для повышения эффективности деятельности клетки, характеризуемое тем, что они включают введение циклического олигомера формулы (I). Это может включать лечение таких болезненных состояний у человека и/или животных.

Этот вариант включает такое применение, как применение в качестве нейронального стимулятора, например, способного стимулировать рост аксона и/или дендритов и/или нервных клеток, например, в клетках гиппокампа или субстанции нигра, in vivo или in vitro, в частности, при условиях, когда нейродегенерация имеет серьезные клинические последствия, за счет повышения его эффекта на уровень (R)-3-гидроксибутирата и ацетоацетата в крови и плазме.

В третьем варианте изобретение относится к способу энтерального или парентерального питания, предпочтительно, пероральному способу питания, включающему введение циклического олигомера формулы (I).

В четвертом варианте изобретение относится к применению циклического эфира формулы I для получения лекарства для лечения болезненных состояний, опосредуемых свободными радикалами, токсическими агентами, такими как пептиды и белки, генетическими дефектами, вредными для метаболизма клетки, устойчивостью к инсулину или другими дефектами метаболизма глюкозы, или состояниями, индуцирующими дефект, ишемией, травмой головы и/или для повышения эффективности деятельности клетки.

В пятом варианте изобретение относится к композиции, характеризуемой тем, что она включает циклический олигомер формулы (I) в физиологически приемлемой форме, например, с физиологически приемлемым носителем.

В частности, композиция пригодна для парентерального или энтерального введения, в частности для перорального введения. Когда композиция предназначена для парентерального применения, она является стерильной и свободной от пирогенов. Композиция для перорального применения может включать пищевую основу и может находиться в форме эмульсии или простой смеси с твердой пищей.

В частности, циклический(ие) олигомер(ы) включает(ют) эффективное количество суммарной композиции, например, по меньшей мере, 2% или более, например, по меньшей мере, 5% композиции по весу, более предпочтительно 20% или более, и наиболее предпочтительно от 50% до 100%. Композиция может быть предназначена для пероральной, парентеральной или любой другой удобной формы введения.

В предпочтительных формах всех вариантов изобретения соединение формулы (I) вводят совместно с ацетоацетатом или метаболическим предшественником ацетоацетата в физиологическом соотношении. Термин его метаболический предшественник, в частности, относится к соединениям, которые включают ацетоацетильные части, такие как ацетоацетил-1,3-бутандиол, предпочтительно ацетоацетил-(R)-1,3-бутандиол, ацетоацетил-(R)-3-гидроксибутират и ацетоацетилглицерол. Имеются в виду также эфиры любых таких соединений с одноатомными, двухатомными или трехатомными или высшими, например, гликозильными, спиртами.

У больных диабетом данное применение циклических олигомеров позволяет поддерживать низкий уровень сахара крови без опасения осложнений гипогликемии. У здоровых, не страдающих диабетом субъектов, сахар крови с величины натощак от 80 до 90 мг % (4,4-5 мМ) возрастает до 130 мг % (7,2 мМ) после еды. У больных диабетом "тщательный контроль" диабета предлагался в течение длительного времени в качестве способа задержки сосудистых осложнений, но на практике врачи обнаружили, что трудно поддерживать сахар крови жестко контролируемым ниже 150 мг % (8,3 мМ) после еды из-за гипогликемических эпизодов. У здоровых субъектов регулярно наблюдается гипогликемическая кома при падении сахара до 2 мМ. Как обсуждалось ранее (62, 63), в присутствии 5 мМ кетоновых тел не наблюдается неврологических симптомов при падении сахара крови ниже 1 мМ.

В настоящем изобретении обнаружено, что получение больными диабетом типа II циклических олигомеров изобретения позволяет обеспечить лучший контроль сахара крови, тем самым предотвращая сосудистые изменения в глазах и почках, которые в настоящее время наблюдаются через 20 лет развития диабета и которые являются главной причиной тяжелого течения болезни и смертности при диабете.

Когда терапия предназначена для заболеваний, связанных с припадками, такими как не поддающаяся лечению эпилепсия, поскольку их лечат кетогенной диетой, терапия улучшается с помощью применения циклических олигомеров, благодаря снижению или исключению высокого содержания как липидов, так и углеводов. К таким больным относятся те, которые имеют генетические нарушения в системе транспорта глюкозы в мозг, в гликолизе или в самой ПДГ (пируватдегидрогеназе), такие как страдающие синдромом Лея, эндотоксическим шоком или состояниями тяжелого стресса.

Конкретные нарушения, которые лечат с применением этих лекарств, относятся ко всем состояниям, включающим блокаду ПДГ, включая состояния, имеющие место после травмы головы или включающие снижение или исключение обеспечения митохондрий ацетил-КоА, такие как инсулиновая кома и гипогликемия, дефекты транспорта глюкозы в мозг или куда-нибудь еще (80) или на стадиях ферментов гликолиза.

Когда лекарство или пищевая добавка включает ацетоацетат, предпочтительно, чтобы они не хранились в течение долгого времени или не подвергались действию температур, превышающих 40°С. Ацетоацетат нестабилен при нагревании и интенсивно разлагается при 100°С на ацетон и CO₂. В таких условиях предпочтительно, чтобы ацетоацетат генерировался композицией при взаимодействии с метаболическими процессами организма. Предпочтительно, чтобы композиция включала эфирный предшественник ацетоацетата.

В шестом варианте изобретение относится к способу лечения нейрональной клетки человека или животного, например клеток мозга, подвергнутых заболеванию, связанному с повреждением клетки, в частности, которое ведет к гибели клетки, что указано для второго и четвертого вариантов, в особенности нейродегенеративному заболеванию, например, такому, которое относится к нейротоксическим состояниям, таким как присутствие амилоидного белка, например заболеванию, связанному с памятью или движением, такому как болезни Альцгеймера или Паркинсона, или эпилептические припадки, причем этот способ включает введение субъекту, по меньшей мере, одного из материалов для применения в вариантах изобретения с первого по пятый.

Авторы настоящего изобретения далее обнаружили, что кетоновые тела, обеспечиваемые путем введения циклических олигомеров (R)-3-гидроксимасляной кислоты в количествах, достаточных для повышения общей концентрации кетоновых тел крови до повышенного уровня, приводят к более чем простому поддержанию клеточной жизнеспособности, но и действительно улучшают функционирование и рост клеток свыше нормального, т.е. контролируемых уровней путем, не связанным с током крови или питанием. В этом варианте в изобретении далее относится к применению циклических олигомеров в качестве агентов, способных вызывать нейрональную стимуляцию, т.е. активность, подобную фактору роста нервов, повышать скорость метаболизма и увеличивать степень функциональных характеристик нейрона, таких как аксоны и дендриты. Этот вариант настоящего изобретения относится к механизму улучшения нейрональной функции, а также полной задержки деградации.

В последней работе Hoshi с соавторами (77, 78) убедительно показали, что часть амилоидного белка, A _1-42, накопление которой является отличительной особенностью болезни Альцгеймера, действует в качестве стимулятора митохондриальной гистидин-протеинкиназы, которая фосфорилилирует и инактивирует мультиферментный комплекс пируват-дегидрогеназы. Комплекс ПДГ представляет собой митохондриальный фермент, обеспечивающий образование ацетил-КоА и НАДН из пирувата, образующегося при гликолизе в цитоплазме. Образованный в митохондриях ацетил-КоА вовлекается оксалоацетатом в цикл ТКК (трикарбоновых кислот) Кребса, полностью сжигающий пируват до СO₂ и обеспечивающий митохондрию восстановительной энергией, которая становится субстратом для системы транспорта электронов, благодаря которой производится энергия, необходимая для синтеза АТФ в митохондриях.

Утилизация кетоновых тел ограничена транспортом с меньшей утилизацией, происходящей в базальном ганглии при уровне в крови ниже 1 мМ (76). Однако при уровне 7,5 мМ, достигаемом у здорового человека в результате продолжительного голодания, скорость поступления кетоновых тел в мозг достаточна для обеспечения основных потребностей мозга в энергии и для предотвращения симптомов гипогликемии даже в случае уровня сахара в крови, который в нормальных условиях вызывает судороги или кому (63).

В параллельной заявке WO 98/41201 "Терапевтические композиции" описана гипотеза изобретателя о том, что при болезни Альцгеймера, когда имеется блок ПДГ, который предотвращает нормальное образование энергии из глюкозы, если можно обеспечить повышенный, например нормальный для голодания уровень кетонов, можно обойти блокаду ПДГ, имеющуюся у этих больных, и тем самым предотвратить гибель клеток из-за исчерпания энергии или отсутствия холинэргической стимуляции и тем самым замедлить развитие потери памяти и деменции. Более того, применяя ростовые/стимулирующие эффекты кетоновых тел в отношении нервов, в особенности, (R)-3-гидроксибутирата или его физиологического соотношения с ацетоацетатом, можно вызвать улучшение состояния все еще живых клеток за пределы состояния, до которого они дегенерировали, и соответственно у больных должно наблюдаться некоторое улучшение функций.

У животных и человека после еды содержание ацетоацетата в печени, которое по существу соответствует содержанию в крови, очень низко, например 0,09 мМ, а содержание (R)-3-гидроксибутирата равно 0,123 мМ, но оно увеличивается через 48 часов голодания до, например, 0,65 мМ ацетоацетата и 1,8 мМ (R)-3-гидроксибутирата (84).

Кетоновые тела растут при голодании из-за вызванного снижением инсулина снижения реэтерификации жирных кислот до триглицеридов в жировой ткани, что вызывает выделение свободных жирных кислот в кровяное русло. Выделенные жирные кислоты могут быть затем захвачены и использованы в качестве источника энергии мышцей, сердцем, почками и печенью в процессе -окисления. Печень, однако, обладает способностью превращать свободные жирные кислоты в метаболический источник энергии, кетоны для использования органами, отличными от печени, включая мозг, в качестве альтернативы глюкозе во время периодов голодания. Синтез кетоновых тел в печени осуществляется из митохондриального ацетил-КоА, образующегося в процессе -окисления жирных кислот в печени.

Кетоновые тела поступают в ткани, отличные от печени, с помощью одного и того же переносчика, причем другие монокарбоксилаты могут действовать в качестве конкурентных ингибиторов. Неприродные изомеры, такие как D-лактат или (S)-тригидроксибутират, также могут действовать в качестве конкурентных ингибиторов транспорта кетоновых тел. Поскольку транспорт кетоновых тел через гематоэнцефалический барьер является лимитирующим фактором утилизации кетоновых тел в мозге (76), следует предпринять все усилия для сохранения концентрации этих нефизиологических энантиомеров в крови на низком уровне в процессе кетогенной терапии. Когда концентрация кетоновых тел в крови повышается до уровня, обнаруживаемого при голодании, сердце, мышцы, почки и мозг используют кетоновые тела в качестве предпочтительного энергетического субстрата.

В настоящем изобретении, таким образом, определено, что митохондриальный ацетил-КоА, возникающий из кетоновых тел, образованных из циклических олигомеров, указанных в настоящем изобретении, может, таким образом, возмещать недостаточность ацетил-КоА, которая имеет место при ингибировании многоферментного комплекса ПДГ в тканях, зависимых от метаболизма глюкозы, для обеспечения их метаболической энергией. Образующийся в митохондриях цитрат может также транспортироваться в цитоплазму транспортером три- или дикарбоновых кислот, где он может быть превращен в цитоплазматический ацетил-КоА, необходимый для синтеза ацетилхолина. Реакции цикла Кребса показаны на схеме 1 для дополнительной помощи в иллюстрации этих концепций.

Кетоновые тела в отличие от свободных жирных кислот не могут давать ацетил-КоА в печени. Поскольку ацетил-КоА является важным предшественником жирных кислот, он не может возникать в печени при повышенном синтезе либо жирных кислот, либо холестерина, что обычно обеспечивает более половины синтеза в организме этих двух потенциально патогенных материалов. Печень чувствительна к предоставляемому ей соотношению ацетоацетат/(R)-3-гидроксибутират и должна реагировать изменением соотношения свободных [НАД ⁺]/[НАДН] в митохондриях благодаря почти равновесному состоянию, устанавливаемому -гидроксибутиратдегидрогеназой (ЕС 1.1.1.30) (31).

Среди прочего, указанное выше также указывает на то, что можно предложить способ повышения эффективности образования энергии в митохондриях у человека или животного, которые не страдают хроническим или острым метаболическим заболеванием, который включает введение человеку или животному такого количества циклического олигомера формулы (I), которое достаточно для повышения уровня (R)-3-гидроксибутирата крови до уровня от 0,5 до 20 мМ.

Наиболее простым способом повышения кетонов в крови является голодание. При продолжительном голодании уровень кетонов в крови достигает 7,5 мМ (62, 63). Однако эта возможность не реальна на долговременной основе из-за смерти, обычно наступающей после 60 дней голодания.

Кетогенная диета, составленная преимущественно из липидов, применялась с 1921 года для лечения эпилепсии у детей, в особенности миоклонических и акинезических припадков (109), и была показана ее эффективность в случаях устойчивости к обычным фармакологическим средствам (71). Пероральное или парентеральное введение свободных жирных кислот или триглицеридов может повышать кетоны крови, обеспечивая тем самым низкий уровень углеводов и инсулина для предотвращения реэтерификации в жировой ткани. У крыс, которых кормили диетами, включающими 70% кукурузного масла, 20% гидролизата казеина, 5% целлюлозы, 5% солевой смеси МакКоллума, кетоновые тела в крови достигали уровня приблизительно 2 мМ. Замена свиного сала на кукурузное масло повышает кетоны крови до приблизительно 5 мМ (Veech, неопубликованное).

Обычно уровень кетоновых тел, достигаемый при таких диетах, составляет приблизительно 2 мМ (R)-3-гидроксибутирата и 1 мМ ацетоацетата, тогда как уровень свободных жирных кислот составляет приблизительно 1 мМ. Были опробованы другие варианты композиции, включая триглицериды со средней длиной цепей. В целом реакция на такие ограниченные диеты была плохой из-за их неаппетитности (56). Диеты с высоким содержанием липидов и низким содержанием углеводов также пытались применять в качестве терапевтических агентов у больных раком для снижения доступности глюкозы для опухолей (88), а также в качестве диет, снижающих вес у больных, страдающих или не страдающих от диабета (74, 112), и для улучшения устойчивости к тренировкам (83).

Многочисленными являются ограничения диет, которые относятся к липидам, для повышения кетонов крови до нейрологически эффективного уровня. Во-первых, уровень кетоновых тел при использовании основанных на липидах диет имеет тенденцию быть ниже 3 мМ, что значительно ниже уровня 7,5 мМ, достигаемого у тучных людей в процессе продолжительного голодания. Во-вторых, неоправданное кормление углеводами повышает секрецию инсулина и вызывает быстрое снижение превращения в печени свободных жирных кислот в кетоны с последующим падением уровня кетонов крови и направление липидов на этерификацию до триглицеридов жировой тканью. Многие анекдотические сообщения относятся к восстановлению судорог у детей, "диета которых уничтожалась именинным тортом". В-третьих, низкие вкусовые качества и необходимость избегать углеводов для поддержания высокого уровня кетоновых тел делает такие диеты с высоким содержанием липидов трудными для применения у взрослых и у больных вне стационара, в особенности в обществе, где потребляют традиционно много рафинированного сахара, хлеба, макарон, риса и картофеля. На практике традиционную высококетоновую диету нельзя навязать больным, кроме детей, за пределами возраста, когда всю пищу готовят дома под строгим наблюдением. В-четвертых, кормление такими большими количествами липидов взрослого населения должно было бы приводить к значительной гипертриглицеридемии и гиперхолестеринемии с патологическими осложнениями в виде повышенного поражения сосудов и спорадических заболеваний печени и поджелудочной железы и, следовательно, не могли быть предписаны с точки зрения медицины. Кормление диетами с высоким содержанием липидов и низким содержанием углеводов было популярным в 1970-х годах для снижения веса вопреки потреблению высококалорийной пищи, предлагаемой так, чтобы потребление углеводов было низким. Однако из-за роста понимания связи повышенного уровня липидов крови и атеросклероза популярность этой диеты резко упала.

Замещение глюкозы в липидной диете, когда глюкоза обеспечивала 47% содержания калорий, рацемическим 1,3-бутандиолом вызывала приблизительно 10-кратный рост концентрации кетонов крови до 0,98 мМ (R)-3-гидроксибутирата и 0,33 мМ ацетоацетата (107). Эти величины были немного ниже получаемых обычно после 48-часового голодания и были значительно ниже величины 7,5 мМ, полученной у голодающего человека. Рацемический 1,3-бутандиол превращается печенью в ацетоацетат, а также в неприродный L-- и природный D--гидроксибутират (соответственно, (S)-3-гидроксибутаноат и (R)-3-гидроксибутират). Хотя рацемический 1,3-бутандиол интенсивно исследовали в качестве дешевого источника калорий для корма животных и, даже хотя он был экспериментально применен в диетах для человека (81, 101), образование неприродного L-изомера, по-видимому, ведет, в конце концов, к индукции значительной токсичности, как это было показано для потребления человеком неприродного D-лактата (64). Одной из слабых сторон введения неприродного L-изомера является то, что он конкурирует с природным (R)-3-гидроксибутиратом за транспорт. Таким образом, кормление (R)-1,3-бутандиолом в качестве предшественника кетоновых тел является одной из возможностей, при которой нет необходимости введения или получения неприродного изомера.

Моно- и диацетоацетиловые эфиры рацемического 1,3-бутандиола являются, как было предположено, источником калорий и их тестировали на свиньях (67). Пероральное введение брикетированной диеты, содержащей 30% калорий в виде эфиров, вызывало кратковременный рост кетонов крови до 5 мМ, однако применение рацемического 1,3-бутандиола с образованием из него неестественного (S)-3-гидроксибутаноата не рекомендуется по причинам, указанным выше.

В то время, как рацемический 1,3-бутандиол в таких составах не рекомендуется, эфиры (R) 1,3-бутандиола могут применяться либо как таковые, либо в виде эфира с ацетоацетатом. Исследования на крысах показали, что скармливание рацемического 1,3-бутандиола вызывает снижение соотношения [НАД']/[НАДН] в цитозоле печени с 1500 до приблизительно 1000 (87). Для сравнения: введение этанола снижает [НАД-]/[НАДН] в печени до приблизительно 200 (106).

Свежеприготовленный ацетоацетат может быть применен в растворах для инфузии, в которых он может быть введен в физиологически нормальных соотношениях с (R)-3-гидроксибутиратом для достижения оптимального действия (95). Из-за требований производства, для которого в настоящее время необходимы длительный срок хранения и температурно-стерилизованные жидкости, ацетоацетат часто давали в форме эфира. Это делали для повышения срока хранения и стабильности к прогреванию в процессе стерилизации. Было установлено, что эстеразная активность в кровяном русле составляет приблизительно 0,1 ммоль/мин/мл, а в печени приблизительно 15 ммоль/мин/г (68). Кроме эфиров, объединяющих 1,3-бутандиол и ацетоацетат, проводилось также интенсивное изучение глицероловых эфиров ацетоацетата при парентеральном (59) и энтеральном кормлении (82). Сообщалось, что такие препараты снижают дистрофию кишечника благодаря высокому потреблению клетками кишечника ацетоацетата и могут быть использованы для лечения ожогов (85).

Для предпочтительных осуществлений настоящего изобретения при оптимальных условиях должно образовываться физиологическое соотношение кетонов при введении циклических олигомеров и ацетоацетата. Если этого не происходит, печень целого животного должна установить соотношение кетонов в соответствии с собственным соотношением свободных [НАД ⁺]/[НАДН] в митохондриях. Если дается отличное от нормы соотношение кетонов, то печень должна изменить это соотношение при одновременном изменении соотношения [НАД⁺]/[НАДН] в печени. Перфузия работающего сердца ацетоацетатом в качестве единственного субстрата быстро вызывает сердечную недостаточность (99) в отличие от сердец крыс, перфузируемых смесью глюкозы, ацетоацетата и (R)-3-гидроксибутирата, когда сердечная эффективность увеличивалась физиологическим соотношением кетоновых тел (95).

Циклические олигомеры для применения в настоящем изобретении удобно синтезировать с помощью микроорганизмов, продуцирующих полиэфиры. Природные полиэфиры (R)-3-гидроксибутирата являются твердыми как параграфы торгового соглашения, например такие, как полимеры с м.в. 530000 из Alcaligenes eutrophus (Sigma Chemical Co. St. Louis) или как полимеры с м.в. 250000 сахарной свеклы (Fluka, Швейцария). Бактерии образуют полимер в качестве источника запасенной пищи. Ферментация этих полимеров бактериями была разработана в 1970-е годы ICI в Великобритании и Solvay et Cie в Бельгии в виде потенциально биодеградируемого пластика для покрытия тампонов и других целей. Система, обеспечивающая синтез поли (R)-3-гидроксибутирата, к настоящему времени клонирована, и на основе предоставляемых бактериям субстратов получены вариации в составе полимера. Гены, ответственные за синтез полиалканоатов, были клонированы и экспрессированы в ряде микроорганизмов (93, 102, 113), что дает возможность получать этот материал во множестве организмов при крайне вариабельных условиях.

Предпочтительными формами циклического олигомерного (R)-3-гидроксибутирата являются такие, которые, по меньшей мере, отчасти легко перевариваются и/или метаболизируются у человека или животных. Предпочтительны олигомеры, содержащие от 2 до 200 повторов, обычно от 2 до 20, и наиболее подходящие олигомеры длиной от 3 до 10 повторов, в особенности из 3 повторов, т.е. триолид. Следует понимать, что можно с выгодой использовать смеси таких олигомеров, поскольку может быть получено ранжирование характеристик их захвата. Сходным образом могут быть предложены смеси с мономером или линейными олигомерами или полимерами для модификации формирующегося профиля уровня в крови.

Циклические олигомеры для применения в изобретении могут быть получены, среди прочего, с помощью способов, описанных Seebach et al. Helvetia Chimica Acta Vol 71 (1988) pages 155-167 и Seebach et al. Helvetia Chimica Acta Vol 77 (1994) pages 2007-2033. В некоторых случаях такие циклические олигомеры, состоящие из от 5 до 7 или более единиц (R)-3-гидроксибутирата, могут быть предпочтительными, поскольку они, возможно, легче разбиваются in vivo. Описанные здесь способы синтеза соединений включены здесь в качестве ссылки.

Поскольку печень не способна метаболизировать кетоновые тела, а может только изменять соотношение (R)-3-гидроксибутират/ацетоацетат, оказавшиеся в кровяном русле мономеры кетоновых тел транспортируются к экстрагепатическим тканям, где они могут быть утилизированы. Достигаемый уровень кетонов не меняется при несанкционированном приеме углеводов, как это имеет место в случае существующей кетогенной диеты. Напротив, кетоны должны быть просто добавкой к обычной диете, даваемые в количестве, достаточном для продолжительного поддержания их уровня в крови, обычно от 0,3 до 20 мМ, более предпочтительно от 2 до 7,5 мМ, на протяжении 24 часового периода, в зависимости от состояния, подвергаемого лечению. В настоящее время полагают, что в случае устойчивой эпилепсии у детей достаточным является уровень в крови 2 мМ. В случае болезни Альцгеймера могли бы быть даже предприняты попытки сохранять уровень в 7,5 мМ или выше, достигаемый в исследованиях на голодающих людях, для обеспечения альтернативным источником энергии и снабжения ацетил-КоА ткани мозга больных болезнью Альцгеймера, когда нарушена активность ПДГ из-за избытка A _1-42 амилоидного пептида (77, 78).

Обнаруженный авторами данного изобретения факт, что (R)-3-гидроксибутират и его смеси с ацетоацетатом действует в качестве стимулятора нервной системы, например, стимулятора роста нервов и/или стимулятора роста аксонов и дендритов, открывает возможность повышать уровень кетоновых тел в меньшей степени, чем требуется при поступлении с пищей, для лечения нейродег