Штамм а (грузия) 1999/№1721 вируса ящура типа а для изготовления диагностических и вакцинных препаратов

Штамм а (грузия) 1999/№1721 вируса ящура типа а для изготовления диагностических и вакцинных препаратов

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии. Исходный вирус для получения штамма А(Грузия)1999/№1721 выделен в 1999 г. от больных коров в частном секторе села Уде Адигенского района Республики Грузия. Производственный штамм А(Грузия)1999/№1721 получен путем многократных последовательных пассажей на чувствительных гетеро- и гомологичных культурах клеток. Штамм депонирован в коллекции микроорганизмов ВГНКИ под регистрационным номером А(Грузия)1999/№1721. Вирус штамма А(Грузия)1999/№1721-ДЕП репродуцируется в чувствительных культурах клеток. В течение 18-24 часов инкубирования накапливается до 6,0-8,0 Ig ТЦД₅₀/мл. При массированном заражении вызывает ЦПД через 4 часа. Сохраняет исходные характеристики при пассировании в культурах клеток в течение 10 пассажей. Штамм А(Грузия)1999/№1721-ДЕП обладает высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации и пригоден для изготовления средств специфической профилактики и диагностики ящура типа А, гомологичных эпизоотическому вирусу, циркулирующему в странах Закавказья и Ближнего Востока. 7 табл., 3 ил.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при изготовлении средства для специфической профилактикой диагностики ящура типа А.

Ящур - это острое контагиозное вирусное заболевание парнокопытных животных, проявляющееся лихорадкой, везикулярными (афтозными) поражениями слизистой оболочки ротовой полости, бесшерстных участков кожи головы, вымени, венчика, межкопытной щели и сопровождающееся нарушением движения. Для него характерна тенденция к широкому распространению и эпизоотическому течению. Болезнь сопровождается большими потерями молока, мяса и других видов животноводческой продукции, затрудняет коммерческие операции и хозяйственную деятельность.

Многолетний опыт показывает, что наличие эндемичного ящура снижает доходы в молочном и мясном животноводстве на 30-40%.

Вирус ящура относится к роду афтовирусов, семейству пикорнавирусов. Он включает 7 иммунологических типов и большое количество подтипов.

Хорошо известной особенностью возбудителя ящура является антигенная изменчивость штаммов в пределах одного серотипа, происходящая в различные временные промежутки, на разных территориях, зависящая от видового состава восприимчивого поголовья, его иммунного статуса и множества других факторов. Считается, что основной причиной антигенной изменчивости является изменение аминокислотной последовательности в полипептидах вирусных белков, составляющих капсид вириона. Практически такие антигенные изменения могут выражаться от незначительных отличий между штаммами, улавливаемых только с помощью тонких методов молекулярного анализа, до появления совершенно отличающихся штаммов, требующих использования новых средств для серологической диагностика и специфической профилактики болезни, вызываемой этими штаммами.

Известны штаммы вируса ящура типа А, использовавшиеся в качестве производственных на территории СССР в течение последних 40 лет.

К ним относятся следующие штаммы: А₇ №103, выделенный в 1962 году в Куйбышевской области; А₇ №2, выделенный в 1965 году в Таджикской ССР; А №717/73, выделенный в 1973 году в Ставропольском крае.

Указанные штаммы использовались для получения диагностикумов и противоящурных вакцин, применявшихся в различных регионах страны.

Однако после ликвидации ящура, вызываемого близкими в антигенном отношении штаммами вируса, они были сняты с производства и в настоящее время поддерживаются лишь в музее штаммов ФГУ ВНИИ защиты животных (1, 2, 4, 5).

Известен штамм №550 вируса ящура А₂₂ , выделенный в 1964 году в Азербайджане и используемый в Российской Федерации в качестве производственного при изготовлении средств специфической профилактики и диагностики, применяемых на всей территории России и в странах-членах СНГ (6).

Недостатки данного штамма состоят в его низкой биологической, антигенной и иммуногенной активности.

Об этом свидетельствует тот факт, что в 1998 году в Республике Армения и в 1999 г. в Республике Грузия были отмечены очаги заболевания ящуром типа А крупного рогатого скота, иммунизированного бивалентной вакциной АО, в состав которой входил антиген из производственного штамма А ₂₂ №550. Однако вакцина не обеспечила удовлетворительной защиты иммунизированных животных. Лабораторными исследованиями в ФГУ ВНИИЗЖ афтозного материала, выделенного от больных животных, был установлен вирус ящура типа А, имеющий антигенные отличия от штамма А₂₂ №550 в реакции связывания комплемента и в реакции серонейтрализации вируса. Это свидетельствовало о несоответствии используемых средств специфической профилактики и диагностики ящура типа А, используемых Россией и странами СНГ, эпизоотическому вирусу, циркулировавшему в 1996-1999 гг. в странах Закавказья и Ближнего Востока (Турция, Иран).

Наиболее близким к предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является штамм №1707/Армения/98 вируса ящура типа А, выделенный 01.08.98 г. от больных коров в хозяйстве Охчик Амассийского района Республики Армения. Производственный штамм №1707/Армения/98 вируса ящура типа А получен путем многократных последовательных пассажей на чувствительных гетеро- и гомологичных культурах клеток. Указанный штамм используется для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (7).

Недостатки данного штамма состоят в его антигенных отличиях от изолятов вируса ящура, выделенных на территории Закавказья в различные временные промежутки.

В задачу создания настоящего изобретения входило получение нового производственного штамма вируса ящура типа А, обладающего высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации и обеспечивающего изготовление диагностических и вакцинных препаратов, гомологичных эпизоотическому вирусу, появившемуся в странах Закавказья и Ближнего Востока.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала производственных штаммов вируса ящура серологического типа А, обладающих высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью и пригодных для изготовления средств специфической профилактики и диагностики ящура типа А, гомологичных эпизоотическому вирусу, циркулирующему в странах Закавказья и Ближнего Востока.

Указанный технический результат достигнут получением штамма А (Грузия) 1999/№1721 вируса ящура типа А. Штамм А (Грузия) 1999/№1721 является новым, ранее не известным. Исходный вирус для получения штамма А (Грузия) 1999/№1721 выделен в 1999 году от больных коров в частном секторе села Уде Адигенского района Республики Грузия. Производственный штамм А (Грузия) 1999/№1721 серологического типа А получен путем последовательных пассажей на чувствительных гетеро- и гомологичных культурах клеток.

Полученный штамм депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, ФГУ "Всероссийский государственный научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов - центр качества ветеринарных препаратов и кормов" (ФГУ ВГНКИ) Министерства сельского хозяйства РФ 19 августа 2003 года под регистрационным номером А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП.

Штамм А (Грузия) 1999/№1721 - ДЕП обладает высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации.

Экспериментально подтверждена возможность его использования для приготовления диагностических препаратов и инактивированной вакцины. Штамм А (Грузия)/1999/№1721-ДЕП вируса ящура типа А обеспечивает получение диагностических препаратов, позволяющих серологическую диагностику изолятов вируса ящура типа А, вызывающего вспышки заболевания в последние годы в странах Закавказья и Ближнего Востока, и противоящурной инактивированной вакцины, создающей защиту восприимчивых животных против указанного возбудителя заболевания.

Сущность изобретения пояснена на графических материалах, где на:

фиг.1 представлена аминокислотная последовательность белка VP1 штамма А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП вируса ящура серологического типа А;

фиг.2 изображена дендрограмма, отражающая филогенетические взаимоотношения штамма А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП вируса ящура серологического типа А с эпизоотическими и вакцинными штаммами вируса ящура типа А. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена VP1;

фиг.3 приведено выравнивание аминокислотных последовательностей белка VP1 штаммов №1707/Армения/98-ДЕП и А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП.

Штамм А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП вируса ящура типа А характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические свойства

Штамм А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП относится к семейству Picornaviridae, роду Aphtovirus, серотипу А и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона икосаэдрическая, размер 23-25 нм. Вирион состоит из молекулы РНК, заключенной в белковую оболочку. Белковая оболочка состоит из 32 капсомеров, расположенных в кубической симметрии.

Антигенные свойства

По своим антигенным свойствам штамм А (Грузия)1999/№1721-ДЕП вируса ящура относится к серотипу A.

Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности. У переболевших животных в сыворотке крови образуются антитела, выявляемые в РДП, ИФА и РН. При вакцинации КРС вакциной из инактивированного вируса индуцирует образование специфических антител, выявляемых в ИФА, РДП и РН. При гипериммунизации морских свинок концентрированным инактивированным вирусом индуцирует образование вирусспецифических антител, выявляемых в РСК в разведении 1:128-1:512 и в ИФА в разведении 1:6000-1:10000.

При определении антигенного соответствия штамма А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП с производственными штаммами и полевыми изолятами вируса ящура типа А, выделенными на протяжении 1962-1999 гг. на территории стран СНГ и ряда других государств мира, было проведено сравнительное исследование первичной структуры гена и белка VP1 (фиг.1).

Сравнительный анализ установленных структур штамма А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП и эпизоотических изолятов, выделенных в последние годы в Турции, Иране и Республике Армения (А/Иран/96, А/Турция/97, А/Турция/98, А/Армения/98), показал, что изолят А/№1721/Грузия/99 отличается от изолятов А/Турция/97, А/Турция/98, А/Иран/96 и А/№1707/Армения/98.

Филогенетические взаимоотношения исследованных изолятов с ранее изученными штаммами, выделенными в разных странах мира за три последних десятилетия, указаны на дендрограмме (фиг.2). Установлено, что исследованные изоляты существенно отличаются от всех выделенных ранее изолятов, в том числе и от штаммов А ₂₂ №550 и А/№1707/Армения/98 вируса ящура, используемых в настоящее время для производства средств диагностики и специфической профилактики.

Антигенное родство штамма А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП с соответствующими производственными и ранее выделенными штаммами на территории Турции и Ирана изучено в РСК. Полученные результаты представлены в таблице 1.

Как свидетельствуют данные, представленные в таблице 1, штамм А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП вируса ящура типа А отличается как от производственных, так и от ранее выделенных эпизоотических штаммов.

По антигенным свойствам новый штамм А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП вируса ящура типа А также отличается от ранее изученного производственного штамма А№1707/Армения/98-ДЕП. Двухстороннее родство (R) в РСК между ними составляет 20%.

Аналогичное изучение антигенного родства выделенного штамма было проведено в РН, где в качестве иммунных использовались сыворотки реконвалесцентов КРС на вирусы штаммов А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП, А/№1707/Армения/98, А/Иран/87 и А₂₂ №550. Результаты этих исследований представлены в таблице 2.

Приведенные в таблице 2 данные подтверждают антигенное отличие выделенного штамма от производственного штамма А₂₂ №550 и эпизоотических штаммов, выделенных в Иране в 1987 году и Узбекистане в 1989 году.

Биотехнологические характеристики

Штамм А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП вируса ящура типа А проявляет высокую биологическую, антигенную и иммуногенную активность как в нативном виде, так и после инактивации. Штамм предназначен для получения диагностических сывороток и антигенных препаратов, а также для изготовления инактивированной противоящурной вакцины. Штамм А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП репродуцируется в монослойных культурах первично-трипсинизированной культуры клеток почки свиньи (СП), перевиваемых культурах клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), IB-RS-2, ВНК-21 и в течение 18-24 часов инкубирования накапливается до 6,0-8,0 Ig ТЦД ₅₀/мл. При массированном заражении (1-100 ТЦД/клетку) вызывает ЦПД через 4 часа.

После 3-4 пассажей инкубирования накапливается до 6,0-8,0 Ig ТЦД₅₀/мл. Сохраняет исходные характеристики при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 10 пассажей.

Хемо- и генотаксономическая характеристика

Штамм А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП является РНК-содержащим вирусом с молекулярной массой 7×10⁶ Д.

Нуклеиновая кислота представлена одноцепочечной линейной молекулой молекулярной массой 2,8×10 МД. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех основных белков VP1, VP2, VP3 и VP4. Липопротеидная оболочка отсутствует.

Основным антигенным белком является VP1. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирионная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Из 6 неструктурных полипептидов, накапливающихся в инфицированных клетках, один (VP3D) является РНК-зависимой РНК-полимеразой, участвующей в репликации РНК новых вирионов.

Проведено определение первичной структуры участка генома вируса с помощью ПЦР и сиквенса. Результаты исследований представлены на фиг.1.

Установлено, что штамм А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП имеет наибольшую степень гомологии первичной структуры гена и белка VP1 с изолятами Турция/99, А/Иран/99 и А/№1707/Армения/98.

Исследуемый изолят существенно отличается от производственных штаммов. А₂₂ №550 (18% различий) и А/№1707/Армения/98 (20% различий), а также других вариантов и штаммов вируса ящура A₅, А₁₀, A₁₂ , А/№1540/Узбекистан/89 и др. (фиг.2).

Проведено выравнивания аминокислотных последовательностей белка VP1 штаммов А/№1707/Армения/98-ДЕП и А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП вируса ящура типа А. Результаты исследований представлены на фиг.3.

Сравнительный анализ показывает, что штаммы отличаются друг от друга по семи аминокислотным остаткам. Две замены (G на R в позиции 141 и R на Н в позиции 142) расположены в непосредственной близости от RGD-сайта, ответственного за связывание с клеточными рецепторами. Многочисленные исследования свидетельствуют о том, что у вируса ящура типа А даже единичные замены в структуре белка VP1 могут приводить к существенным изменениям в антигенным свойствах.

Физические свойства

Масса вириона составляет 8,4×10 ^-18 г. Коэффициент седиментации 146S в градиенте сахарозы. Плавучая плотность 1,45 г/мл.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП вируса ящура типа А устойчив к эфиру, хлороформу, фреону, ацетону и др. органическим растворителям и детергентам. Наиболее стабилен при рН 7,0-7,6. Сдвиги рН как в кислую, так и в щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, -облучению, высоким температурам.

Дополнительные признаки и свойства

Иммуногенная активность - иммуногенен в составе инактивированной вакцины.

Реактогенность - реактргенными свойствами не обладает.

Патогенность - патогенен для парнокопытных животных, новорожденных мышат, морских свинок.

Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентальном заражении.

Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 10 пассажей.

Исходя из полученных данных, можно утверждать, что штамм А (Грузия)1999/№1721-ДЕП по антигенному и иммунологическому спектрам является оригинальным, в таксономическом отношении новым, ранее не известным вариантом вируса ящура типа А.

Для снижения его эпизоотической опасности необходимо обеспечить своевременную лабораторную диагностику и вакцинопрофилактику вновь возникающих очагов болезни, для чего необходимы высокоактивные и специфичные антительные и антигенные диагностикумы и вакцина, полученные с использованием данного штамма в качестве производственного.

По мнению заявителя, предлагаемый штамм соответствует условиям патентоспособности "новизна" и "изобретательский уровень".

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования.

Пример 1

Получение штамма

Штамм А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП вируса ящура типа А был изолирован из полевого материала, поступившего во ВНИИЗЖ в виде эпителия афт от КРС, подозреваемого в заболевании ящуром, при проведении лабораторной диагностики этого заболевания и дифференциации его от других везикулярных болезней. При изоляции вируса использован комплекс биологических, вирусологических и биохимических методов.

Биологические и вирусологические методы включали инокуляцию материала полевого изолята КРС и последующую адаптацию вируса к культурам первично-трипсинизированных и перевиваемых линий клеток. Были использованы культуры клеток СП, ПСГК-30, IB-RS-2 и ВНК-21. Первичные и перевиваемые культуры клеток для постановки биопробы выращивали на соответствующих питательных средах в стационарных условиях во флаконах емкостью 50-100 мл, отмывали от ростовой среды и заражали 10% суспензией афтозного материала (множественность заражения доставляла 1-10 ТЦД₅₀ на клетку), приготовленной в растворе Хенкса с 0,5% ГЛА, и антибиотиками по стандартной рецептуре. Для удаления микрофлоры и балластных клеточных компонентов суспензию обрабатывали хлороформом в отношении 1:10. После 30-минутного инкубирования при 37°С во флаконы вносили по 5-10 мл поддерживающей среды и инкубировали при 37°С до появления ЦПД вируса. При наличии ЦПД (округление клеток, повышение их оптической плотности, дегенерация и отделение клеток от стекла) флаконы подвергали замораживанию-оттаиванию, очистке клеточной взвеси хлороформом и центрифугированию при 3000 g в течение 15 минут. Полученный вируссодержащий материал использовали для последующих пассажей и исследования в РСК и ИФА на наличие вирусного антигена, при этом использовали набор коммерческих типоспецифических сывороток и сыворотки, хранящиеся в музее штаммов ВНИИЗЖ.

Результаты адаптации вируса к различным клеточным культурам представлены в таблице 3.

Данные, приведенные в таблице 3, свидетельствуют о хорошей адаптационной активности штамма А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП вируса ящура типа А к использованным клеточным культурам.

Изолированный с помощью перечисленных методов вирус был исследован в РСК с набором диагностикумов на все типы вируса ящура, везикулярного стоматита, везикулярной экзантемы и везикулярной болезни свиней с целью идентификации типовой принадлежности и контроля на чистоту. Результаты типирования вируса в РСК представлены в таблице 4.

Приведенные в таблице 4 результаты свидетельствуют о том, что выделенный вирус относится к типу А.

Пример 2

Получение и испытание гипериммунной сыворотки на морских свинках

Для гипериммунизаци морских свинок используют антиген из вируса ящура типа А штамма А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП, репродуцированного в суспензионной культуре клеток ВНК-21. Вируссодержащую суспензию очищают от балластных примесей добавлением 0,05% полигуанидина. Очищенный вирус концентрируют в 100 раз добавлением 10% полиэтиленгликоля (ПЭГ) м.м. 6000 и инактивируют аминоэтилэтиленимином (АЭЭИ) в концентрации 0,01-0,05%, рН 7,8-8,0.

Инактивированный концентрат антигена в смеси с равным объемом масляного адъюванта вводят морским свинкам в объеме 1,0 мл внутримышечно. Через 21 день иммунизацию повторяют и через 10 дней животных обескровливают. Индивидуальные пробы сыворотки крови проверяют на типовую специфичность и активность в РСК.

После этого готовят серию путем смешивания типоспецифических индивидуальных проб одинаковой активности. Штаммовую специфичность серийного препарата определяют в одно- и двусторонних реакциях с гомо- и гетерологичными антигенами.

После консервирования азидом натрия (1:5000) и выдерживания при +4°С в течение 30 дней полученную сыворотку фасуют в ампулы по 1,0 мл и подвергают лиофильной сушке.

Способом, описанным в примере 2, было приготовлено 2 серии гипериммунной сыворотки, характеристики которых представлены в таблице 5.

Данные таблицы 5 свидетельствуют, что способом, описанным в примере 2, получены диагностические сыворотки, по специфической активности отвечающие требованиям (8).

Пример 3

Получение и испытание диагностического антигена

Для получения антигена для иммунохимических реакций используют вирус ящура типа О штамма А (Грузия) 11999/№1721-ДЕП, адаптированный к культуре клеток перевиваемых линий ПСГК-30 и ВНК-21. Для адаптации используют вируссодержащий материал в виде 10% суспензии афт КРС. Адаптацию проводят в течение 3-5 последовательных пассажей. Полученную матричную расплодку вируса используют для наработки вирусного сырья. Заражение клеточных культур и сбор вирусного материала проводят по общепринятой методике. Полученную вируссодержащую жидкость концентрируют в 100 раз добавлением 8-10% ПЭГ. Полученный концентрат инактивируют прогреванием при 56°С в течение 40 минут, фасуют в ампулы и высушивает методом сублимации под вакуумом.

Указанным способом было приготовлено 2 серии диагностического антигена, характеристики которых приведены в таблице 6.

Результаты исследований, приведенные в таблице 6, свидетельствуют, что способом, описанным в примере 3, получены диагностические антигены, специфическая активность которых соответствует требованиям (8).

Пример 4

Приготовление и испытание инактивированной адсорбат-вакцины

Инактивированную адфрбат-вакцину против ящура типа А готовят из вируса штамма А (Грузия) №199/№1721-ДЕП, выращенного в суспензионной культуре клеток ВНК-21.

Полученный вирус подвергают инактивации АЭЭИ в концентрации 0,025-0,05% при 36-37°С в течение 112-24 часов и рН 7,2-7,6. По окончании инактивации в суспензию добавляют полигексаметиленгуанидин до концентрации 0,005-0,007% для флокуляции балластных примесей и инактивации возможных контаминантов. Суспензию охлаждают до 4-8°С. После этого проводят седиментацию флокулированных белков и их удаление. Полученный антиген подвергают контролю на авирулентность, содержание вирусспецифического белка и 146S+75S компонентов вируса, стерильность. Необходимую концентрацию 146S+75S компонентов в прививной дозе адсорбированной вакцины получают путем концентрирования антигена гелем гидрата окиси алюминия (ГОА).

Для этого в охлажденную суспензию антигена добавляют расчетный объем геля ГОА 3% концентрации. После седиментации ГОА сливают расчетный объем надосадочной жидкости или измеряют объем оставшейся суспензии. Конечная концентрация ГОА должна быть в пределах 1,62±0,488 Р<0,01 мг/мл п=10, а концентрация 146S+75S компонентов вируса ящура по меньшей мере 6,0 мкг/мл. Затем добавляют 10% раствор сапонина до конечной концентрации 0,075%. Полученную вакцину расфасовывают в стеклянные флаконы и подвергают контролю на стерильность. Авирулентность и безвредность вакцины проверяют на 5 головах КРС, вводя вакцину сначала под слизистую языка в дозе 2,0 мл, а затем подкожно в дозе 10 мл. Наблюдение за клиническим состоянием животных ведут 10 суток. Авирулентную, безвредную и стерильную вакцину проверяют на иммуногенную активность на КРС или на морских свинках. Полученная адсорбат-вакцина против ящура типа А имеет оптимальный компонентный состав, мкг/мл:

Авирулентный и очищенный

антигенный материал из имуногенных

(146S+75S) компонентов вируса

ящура типа А

штамма А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП 6,0

Гель ГОА 1132,0-2108,0

Сапонин 750

Поддерживающая среда 997142,0-998112,0

Иммуногенная активность одной из производственных серий адсорбат-вакцины из вируса ящура типа А штамма А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП была проверена на КРС. Ее ИмД₅₀ была равна 0,15 мл, т.е. в одном мл вакцины содержалось 6,67 ИмД₅₀.

Для сравнения производственная серия адсорбат-вакцины из вируса ящура А₂₂ №550 имела ИмД₅₀ для КрС, равную 0,22±0,012 мл Р<0,001, т.е. в одном мл вакцина содержала 4,55 ИмД₅₀. Объем прививной дозы вакцины должен содержать не менее 7 ИмД₅₀ .

Пример 5

Приготовление и испытание инактивированной эмульсионной вакцины

Вирус ящура типа А штамма А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП выращивают, инактивируют, очищают от балластных примесей и возможных контаминантов, подвергают контролю на абирулентность, содержание вирусспецифического белка, иммуногенных компонентов (146S+75S) и стерильность так, как описано в примере 4. Необходимую концентрацию 146S+75S компонентов в прививной дозе эмульсионной вакцины получают путем концентрирования антигена проточной ультрафильтрацией или ПЭГ.

Для этого используют ультрафильтры БТУ 0,5-2. Фильтрование ведут под давлением 1,5 атм. Полученный концентрат антигена хранят при 4-6°С до момента использования в вакцине. Эмульсионную вакцину получают путем диспергирования на коллоидных мельницах концентрата антигена и масляного адъюванта в соотношении 3:7-1:1 соответственно.

В результате получают инактивированную эмульсионную вакцину против ящура типа А, которая представляет собой молокоподобную жидкость, не растворимую в воде.

Вакцина имеет жидкую консистенцию, легко рассасывается с места введения, не вызывает образования абсцессов, не вызывает общей реакции в виде подъема температуры и обладает выраженной иммуногенностью для свиней в дозе 1 мл через 1-21 день после вакцинации, для КРС в дозе 5 мл через 3-21 день после вакцинации и для овец в дозе 1 мл через 3-21 день после введения. Вакцину вводят свиньям внутримышечно, а КРС и овцам - подкожно. В прививном объеме должно содержаться не менее 2 мкг 146S+75S компонентов.

Полученная эмульсионная вакцина против ящура типа А имеет оптимальный компонентный состав, мкг/мл:

Авирулентный и очищенный

антигенный материал из иммуногенных

(146S+75S) компонентов вируса ящура

типа А штамма А (Грузия)

1999/№1721-ДЕП 2,0

Масляный адъювант 500000,0-700000,0

Поддерживающая среда 299998,0-499998,0

Иммуногенная активность эмульсионной вакцины проверена на свиньях массой 35-50 кг. Результаты исследований представлены в таблице 7.

В прививном объеме 1 мл вакцины содержится 7,1 ИмД₅₀ для свиней.

Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о выполнении при использовании предлагаемого изобретения следующей совокупности условий:

- штамм А (Грузия) 1999/№1721-ДЕП вируса ящура типа А, воплощающий предлагаемое изобретение, предназначен для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной вирусологии и биотехнологии;

- для предлагаемого изобретения в том виде, как оно охарактеризовано в независимом пункте формулы изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов;

- штамм А (Грузия) 1999№1721-ДЕП вируса ящура типа А, полученный в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой специфической, иммуногенной и антигенной активностью и пригоден для изготовления диагностикумов и инактивированной вакцины.

Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию патентоспособности "промышленная применимость".

Источники информации

1. Дарда П.И. и др. Антигенные свойства вируса ящура штамма А₂₂(А_и). Ветеринария. - 1966, 1, 20-22.

2. Bojko A.A. Declaration sur I'apparition en URSS d'un type virus aphteux different des soucfes de type A anterieurement etudies dans le Pays. BOIE, 1965, 64, 2, 1075-1077.

4. Бурдов А.Н., Дудников А.И., Малярец П.В. и др. Ящур/Под ред. А.Н.Бурдова. - М., Агропромиздат, 1990, 320 с.

5. Сюрин В.Н. и др. Вирусные болезни животных. - М., ВНИИТИБП, 1998, 532-548.

6. Инструкция по изготовлению и контролю вакцины моновалентной эмульсионной против ящура типа А, типа О, типа С, типа Азия-1 (из вируса, выращенного в клетках BHК-21). Утверждена ГУВ Госкомиссии СМ СССР по продовольствию и закупкам 24.01.91.

7. Патент РФ №2140452; МПК⁶ С 12 N 7/00, А 61 К 39/135, G 01 N 33/569, А 61 К 39/42, С 07 К 16/08; 27.10.99 г. (протитип).

8. Методические указания по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура. Владимир, 2002. 31 с.

Формула изобретения

Штамм вируса Apthae epizooticae, сем. Picomaviridae, род Aphtovirus, тип А, коллекция ВГНКИ А(Грузия)1999/№1721-ДЕП, для изготовления диагностических и вакцинных препаратов.

РИСУНКИ