Изолированный tie-лиганд-4 и его изолированный фибриногеноподобный домен; изолированная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая указанный лиганд; вектор, содержащий указанную нуклеиновую кислоту; способ получения клетки-хозяина, трансформированной указанным вектором; способ получения tie-лиганда-4; конъюгат, содержащий указанный лиганд; лиганд-тело, содержащее указанный фибриногеноподобный домен

Патент 2242514

Авторы

Классы МПК

Реферат

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в медицине. Установлена нуклеотидная последовательность, кодирующая новый полипептид (TIE-лиганд-4), который относится к семейству TIE-лигандов, и определен ее фрагмент, относящийся к фибриногеноподобному домену (ФПД) нового полипептида. Сконструированы векторы, содержащие фрагмент нуклеиновой кислоты с кодирующей TIE-лиганд-4 или его ФПД последовательностью, которые использованы для трансформации клеток-хозяев и получения соответствующих рекомбинантных полипептидов. Предложено применение TIE-лиганда-4 в составе конъюгата с цитотоксическим агентом, а его ФПД - для образования “лиганд-тела”. 10 с. и 4 з.п. ф-лы, 10 ил.

Приоритет этой формулы изобретения Международной заявки РСТ принадлежит США №08/665,926, зарегистрирована 19 июня 1996, США Предварительная заявка 60/021,087 зарегистрирована 2 июля 1996, и США Предварительная заявка 60/022,999 зарегистрирована 2 августа 1996. В этой заявке заключены ссылки на различные публикации. Содержание этих публикаций в полноте раскрывается с помощью ссылки, приведенной в данной заявке.

Введение

Настоящее изобретение относится в основном к области генной инженерии и особенно к области генов для рецепторных тирозинкиназ и родственных им лигандов, их введению в рекомбинантные ДНК-векторы и продукции кодированных белков в реципиентных штаммах микроорганизмов и реципиентных эукариотических клетках. Точнее, настоящее изобретение связано с новыми лигандами, известными как TIE-лиганд-3 и ТIЕ-лиганд-4, которые связывают TIE-2-рецептор, а также способами получения и использования новых лигандов. Кроме того, изобретение связано с последовательностями нуклеиновой кислоты, кодирующими TIE-лиганд-3 и ТIЕ-лиганд-4, способами получения нуклеиновых кислот и генных продуктов. Новые TIE-лиганды, а также нуклеиновые кислоты, кодирующие их, могут быть полезны в диагностике и лечении определенных заболеваний, затрагивающих эндотелиальные клетки и связанные TIE-рецепторы, таких как неопластические заболевания, включающие опухолевый ангиогенез, заживление ран, тромбоэмболические заболевания, атеросклероз и воспалительные процессы. Кроме того, лиганды могут быть использованы для стимуляции пролиферации и/или дифференцировки гематопоэтических стволовых клеток.

Биологически активные лиганды согласно изобретению могут быть использованы для стимуляции роста, выживания клеток, миграции, и/или дифференцировки, и/или стабилизации или дестабилизации клеток, экспрессирующих TIE-рецептор. Биологически активные TIE-лиганды могут быть использованы in vitro для поддержания экспрессирующих TIE-рецептор клеток в культуре. Клетки и ткани, экспрессирующие TIE-рецептор, включают, например, сердечные и сосудистые эндотелиальные клетки, эпителий хрусталика глаза и сердечный эпикард и ранние гематопоэтические клетки. С другой стороны, подобные лиганды могут быть использованы, чтобы способствовать клеткам, полученным генно-инженерной техникой в экспрессии TIE-рецептора. Далее лиганды и родственные им рецепторы могут быть использованы в аналитических системах для идентификации агонистов или антагонистов рецептора.

Предпосылки к созданию изобретения

Поведение клетки, отвечающее за развитие, сохранение и восстановление дифференцированных клеток и тканей, регулируется, по большей части, с помощью межклеточных сигналов, передаваемых посредством факторов роста и подобных лигандов и их рецепторов. Рецепторы расположены на клеточной поверхности отвечающих клеток, и они связывают пептиды или полипептиды, известные как факторы роста, а также другие подобные гормонам лиганды. Результатом этого взаимодействия являются быстрые биохимические изменения в отвечающих клетках, а также быстрая и продолжительная регуляция клеточной экспрессии генов. Несколько рецепторов, связанных с различными клеточными поверхностями, могут связывать специфические факторы роста.

Фосфорилирование тирозированных остатков в белках с помощью тирозинкиназ является одним из ключевых путей, с помощью которого сигналы передаются через плазматическую мембрану. Несколько известных в настоящее время генов белка тирозинкиназы кодируют трансмембранные рецепторы для полипептидных факторов роста и гормонов, таких как эпидермальный фактор роста (EGF), инсулин, инсулиноподобный фактор-1 роста (IGF-1), полученные из тромбоцитов, факторы роста (PDGF-A и - В) и факторы роста фибробластов (FGF) (Heldin et al., Cell Regulation, 1, 555-566, 1990; Ulrich, et al., Cell, 61, 243-254, 1990). В каждом примере эти факторы проявляют присущее им действие путем связывания с внеклеточной частью родственных им рецепторов, которое приводит к активации той части тирозинкиназы, которая находится на цитоплазматическом участке рецептора. Рецепторы факторов роста эндотелиальных клеток представляют особый интерес благодаря возможному вовлечению факторов роста в некоторые важные физиологические и патологические процессы, такие как образование и развитие сосудов, ангиогенез, атеросклероз и воспалительные процессы (Folkmann, et al., Science, 235, 442-447, 1987). Также рецепторы некоторых гематопоэтических факторов роста являются тирозинкиназами; они включают c-fms, который является рецептором колониестимулирующего фактора 1 (Sherr, et al., Cell, 41, 665-676, 1985) и с-kit, незрелый рецептор гематопоэтического фактора роста, о котором сообщено в публикации (Huang, et al., Cell, 63, 225-233, 1990).

Рецепторные тирозинкиназы подразделяются на эволюционные подсемейства, основанные на характерной структуре их эктодоменов (Ulrich, et al., Cell, 61, 243-254, 1990). Подобные подсемейства включают киназу, подобную рецептору EGF (подкласс I) и киназу, подобную рецептору инсулина (подкласс II), каждая из которых содержит повторяющиеся гомологичные богатые цистеином последовательности во внеклеточных доменах. Единственная богатая цистеином область также найдена во внеклеточных доменах eph-подобных киназ (Hirai, et al., Science, 238, 1717-1720, 1987. Lindberg, et al., Mol. Cell. Biol, 10, 6316-6324, 1990; Lhotak, et al., Mol, Cell. Biol., 11, 2496-2502, 1991). PDGF-рецепторы, а также с-fms и c-kit-рецепторные тирозинкиназы можно сгруппировать в подкласс III, в то время как FGF-рецепторы образуют подкласс IV. Типичными для членов обоих этих подклассов являются внеклеточные скрученные части, стабилизированные дисульфидными связями внутри цепей. Эти так называемые иммуноглобулино-подобные сгибы найдены в белках суперсемейства иммуноглобулинов (Ig), которое содержит широкое разнообразие других клеточных поверхностных рецепторов, имеющих либо связанные с клеткой, либо растворимые лиганды (Williams, et al., Ann. Rev. ImmunoL, 6, 381-405, 1988).

Рецепторные тирозинкиназы отличаются по их специфичности и сродству. Вообще рецепторные тирозинкиназы являются гликопротеинами, которые состоят из (1) внеклеточного домена, способного связывать специфические факторы роста; (2) трансмембранного домена, который обычно является -спиральной частью белка; (3) домена, расположенного рядом с мембранной, где рецептор может регулироваться с помощью, например, белкового фосфорилирования; (4) тирозинкиназного домена, который является ферментативным компонентом рецептора; и (5) карбоксильного концевого хвоста, который у многих рецепторов вовлекается в распознавание и субстратов для тирозинкиназ.

Процессы, такие как альтернативный сплайсинг и альтернативный выбор генного промотора или участков полиаденилирования, как сообщают, способствуют продуцированию некоторых различных полипептидов от одного и того же гена. Эти полипептиды содержат или не содержат различные домены, перечисленные выше. Как следствие, некоторые внеклеточные домены могут быть экспрессированы как отдельные, секретируемые белки, а некоторые формы рецептора могут не иметь тирозинкиназного домена и содержать только внеклеточный домен, включенный в плазматическую мембрану посредством трансмембранного домена плюс короткого карбоксильного концевого хвоста.

Ген, кодирующий трансмембранную тирозинкиназу эндотелиальных клеток, первоначально идентифицирован с помощью RT-ПЦР как неизвестный гомологичный тирозинкиназе кДНК-фрагмент из человеческих лейкемических клеток, описанный в публикации Partanen, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 8913-8917, 1990. Этот ген и кодированный им белок названы “TIE”, что означает “тирозинкиназа с Ig и EGF-гомологичными доменами” (Partanen, et al., Mol. Cell. Biol., 12, 1698-1707, 1992).

Сообщалось, что tie-мРНК присутствует во всех эмбриональных тканях человека и мыши. При проверке оказалось, tie-мРНК локализована в эндотелиальных клетках сердца и сосудов. В частности, tie-мРНК локализована на эндотелии кровеносных сосудов и эндокардиальных клетках 9,5-18,5-дневных мышиных эмбрионов. Повышенная tie-экспрессия обнаружена в процессе неоваскуляризации, связанной с развитием фолликулов яичников и грануляцией тканей в кожных ранах. Таким образом, полагают, что TIE играют роль в ангиогенезе, который является важным моментом при разработке лечения твердых опухолей и некоторых других ангиогенез-зависимых заболеваний, таких как диабетическая ретинопатия, псориаз, атеросклероз и артрит.

Две структурно сходных TIE-рецепторных белка крысы, как сообщают, кодируются различными генами со сходными профилями экспрессии. Один ген, названный tie-1, представляет крысиный гомолог человеческого tie (Maisonpierre, et al., Oncogene, 8, 1631-1637, 1993). Другой ген, tie-2, может быть крысиным гомологом мышиного tek-гена, который, как сообщают, подобно tie, эрепрессируется у мыши исключительно в эндотелиальных клетках и их предполагаемых предшественниках (Dumont et al., Oncogene, 8, 1293-1301, 1993). Человеческий гомолог tie-2 описан в документе Ziegler, U.S. Patent № 5.447,860, который вышел 5 сентября 1995 г., где он обозначен как “ork”. Этот документ во всей его полноте включен в настоящее описание.

Было найдено, что оба гена широко экспрессируются в эндотелиальных клетках эмбриональной и послеродовой тканей. Существенные уровни транскриптов tie-2 также находятся в других эмбриональных клеточных популяциях, включая эпителий хрусталика, эпикард сердца и области мезенхимы (Maisonpierre, et al., Oncogene, 8, 1631-1637, 1993).

Преобладающая экспрессия TIE-рецептора в сосудистом эндотелии предполагает, что TIE играет роль в развитии и сохранении сосудистой системы. Его участие отмечено в детерминации, пролиферации, дифференцировке эндотельных клеток и клеточной миграции и превращении в сосудистые элементы. Анализ мышиных эмбрионов, характеризующихся недостаточностью в TIE-2, иллюстрирует его важное значение в ангиогенезе, особенно в образовании сосудистой сети в эндотелиальных клетках. В зрелой сосудистой системе TIE могут функционировать в процессах выживания сохранения эндотелиальных клеток и в ответе на патогенные воздействия.

TIE-рецепторы также экспрессируются в незрелых гематопоэтических стволовых клетках, В-клетках и субпопуляции мегакариотических клеток, таким образом предполагая роль лигандов, которые связывают эти рецепторы на ранних стадиях гематопоэза, в дифференцировки мегакариоцитов (Iwama et al., Biochem. Biophys. Res. Communications, 195, 301-309, 1993; Hashiyama et al.,, Blood, 87, 93-101, 1996; Batard et al., Blood, 87, 2212-2220, 1996).

Заявители ранее индетифицировали ангиогенный фактор, который первоначально был назван лиганд-1 TIE-2 (TL1), но также на него ссылаются как ангиопоэтин-1 (Ang1), который передает сигналы через TIE-2-рецептор и является существенным для нормального развития сосудистой системы у мыши. С помощью гомологичного скрининга заявители также идентифицировали Ang1, названный лиганд-2 TIE-2 (TL2), или ангиопоэтин-2 (Ang2), который существует как антагонист Ang1 и TIE-2-рецептора. Для описания клонирования и секвенирования TL1 (Ang1) и TL2 (Ang2), а также для способов их получения и использования здесь дается ссылка на Международную заявку РСТ № WO 96/11269, опубликованную 18 апреля 1996 г., и Международную заявку РСТ № WO 96/31598, опубликованную 10 октября 1996 г., обе в Regeneron Pharmaceuticals, Inc.; и S. Davis et al., Cell, 87, 1161-1169, 1969, каждая из которых здесь представлена ссылкой. Отсутствие Ang1 вызывает серьезные сосудистые нарушения в развивающемся мышином эмбрионе. Ang1 и Ang2 обеспечивают естественно возникающие положительные и отрицательные регуляторы ангиогенеза. Положительная или отрицательная регуляция TIE-2, вероятно, приводит к различным результатам, в зависимости от комбинации одновременно действующих ангиогенных сигналов.

Краткое содержание изобретения

Настоящее изобретение обеспечивает композицию, содержащую TIЕ-лиганд-3 или ТIЕ-лиганд-4, в основном свободную от других белков. Изобретение также обеспечивает выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую TIE-лиганд-2, и выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую ТIЕ-лиганд-4. Выделенная нуклеиновая кислота может быть ДНК, кДНК или РНК. Изобретение также обеспечивает вектор, содержащий выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую TIE-лиганд-3 или ТIЕ-лиганд-4. Далее изобретение представляет систему хозяин-вектор для продукции в соответствующей хозяйской клетке полипептида, обладающего биологической активностью TIE-лиганда-3 или ТIЕ-лиганда-4. Подходящая хозяйская клетка может быть бактериальной, дрожжевой, клеткой насекомого или млекопитающего. Изобретение также раскрывает способ получения полипептида, обладающего биологической активностью TIE-лиганда-3 или TIE-лиганда-4, который включает растущие клетки системы хозяин-вектор в условиях, позволяющих получать полипептиды и выделять их этим способом.

Изобретение, описывающее выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую TIE-лиганд-3 или TIE-лиганд-4, далее раскрывает конструкцию лиганда, фрагмента или его производного, или другой молекулы, которая является агонистом или антагонистом рецептора в качестве терапевтического средства для лечения больных, страдающих нарушениями, вовлекающими клетки, ткани и органы, которые экспрессируют TIE-рецептор. Настоящее изобретение также обеспечивает антитело, которое специфическим образом связывает подобную терапевтическую молекулу. Антитело может быть моноклональным или поликлональным. Изобретение также раскрывает способ применения подобного моноклонального или поликлонального антитела для определения количества терапевтической молекулы в пробе, взятой от больного с целью контроля курса терапии.

Настоящее изобретение также обеспечивает антитело, которое специфически связывает TIE-лиганд-3 или TIE-лиганд-4. Антитело может быть моноклональным или поликлональным. Таким образом, изобретение раскрывает терапевтические композиции, содержащих антитело, которое специфически связывает TIE-лиганд-3 или ТIЕ-лиганд-4, и фармацевтически приемлемый носитель. Изобретение также раскрывает способ торможения роста кровеносного сосуда у млекопитающего путем введения эффективного количества терапевтической композиции, содержащей антитело, которое специфически связывает TIE-лиганд-3 или ТIЕ-лиганд-4, в фармацевтически приемлемом носителе.

Изобретение далее раскрывает терапевтическую композицию, содержащую TIE-лиганд-3 или ТIЕ-лиганд-4 в фармацевтически приемлемом носителе. Изобретение также раскрывает способ стимулирования неоваскуляризации у больного путем введения эффективного количества терапевтической композиции, содержащей TIE-лиганд-3 или TIE-лиганд-4 в фармацевтически приемлемом носителе. В одном варианте способ можно использовать для стимулирования заживления ран. В другом варианте способ можно использовать для лечения ишемии. В следующем варианте TIE-лиганд-3 или ТТЕ-лиганд-4 используется либо отдельно, либо в комбинации с другими гематопоэтическими факторами для стимуляции пролиферации или дифференцировки гематопоэтических стволовых клеток, В-клеток или мегакариоцитов.

Альтернативно, в изобретении представлено, что TIE-лиганд-3 или ТIЕ-лиганд-4 можно сочетать с цитотоксическим агентом и терапевтической композицией, приготовленной из них. Изобретение далее относится к телу рецептора, которое специфически связывает TIE-лиганд-3 или ТIЕ-лиганд-4. Изобретение далее раскрывает терапевтические композиции, содержащие тело рецептора, которое специфически связывает TIE-лиганд-3 или ТIЕ-лиганд-4 в фармацевтически приемлемом носителе. Изобретение также раскрывает способ торможения роста кровеносного сосуда у млекопитающего путем введения эффективного количества терапевтической композицией, содержащей тело рецептора, которое специфически связывает TIE-лиганд-3 или TIЕ-лиганд-4 в фармацевтически приемлемом носителе.

Изобретение также относится к антагонисту TIE-рецептора, а также способу ингибирования биологической активности TIE-лиганд-3 или ТIЕ-лиганд-4 у млекопитающего, включающему введение млекопитающему эффективного количества антагониста TIE. Согласно изобретению, антагонистом может быть TIE-лиганд-3 или ТIЕ-лиганд-4, как описано здесь, антитело или другая молекула, способная к специфическому связыванию рецептора TIE-лиганд-3 или ТIЕ-лиганд-4, или TIE-рецептора, или тела лиганда, содержащего фибриногеноподобный домен TIE-лиганд-3 или ТIЕ-лиганд-4.

Краткое описание фигур

Фигуры 1А и 1В - тело рецептора TIE-2 (TP TIE-2 тормозит развитие кровеносных сосудов в хориоаллантоидной мембране куриного эмбриона (ХАМ). Один кусочек поглощающей желатиновой пленки (Gelfoam), вымоченный с 6 мкг TP, помещают немедленно под ХАМ 1-дневного куриного эмбриона. После дальнейших 3 дней инкубации 4-дневные эмбрионы и окружающие ХАМ удаляют и изучают. Фигура 1А: эмбрионы, обработанные ЕНК-1-ТР (rЕНК-1 ecto/hIgGl Fc), были жизнеспособны и обладали нормально развитыми кровеносными сосудами в окружающей их ХАМ. Фигура 1В: все эмбрионы, обработанные TIE-2-TP (rTIE-2 ecto/h IgG1 Fc), погибли, уменьшились в размере и были почти полностью лишены окружающих кровеносных сосудов.

Фигура 2 - схематическое представление гипотетической роли TIE-2/TIE-лигандов в ангиогенезе. TL1 отмечен в виде (), TL2 - в виде (*), TIE-2 - в виде (Т), VEGF - в виде ([]), и fik-1 (VEGF рецептор) - в виде (Y).

Фигура 3 - схематическое представление TIE-2-лигандов, показывающее суперскрученный и фибриногеноподобный домены и конструирование мультимеров фибриногеноподобных доменов с использованием антител против myc в качестве меток, а также мечение Fc.

Фигура 4 - типичная кривая связывания TIE-2IgG с иммобилизованным TL1 в количественном анализе связывания в бесклеточной среде.

Фигура 5 - типичная кривая, показывающая связывание тела-лиганда 1 TIE-2, содержащего фибриногеноподобный домен лиганда, связанного с доменом Fc иммуноглобулина IgG (TLl-fFc), с иммобилизованным TIE-2-эктодоменом в количественном анализе связывания в бесклеточной среде.

Фигура 6А-6В - нуклеотидные и соответствующие им аминокислотные (однобуквенный код) последовательности ТIЕ-лиганда-3. Кодирующие последовательности начинаются с положения 47. Фибриногеноподобный домен начинается с положения 929.

Фигура 7 - сравнение аминокислотных последовательностей семейства лигандов TIE. mAng3=mTL3=мышиный TIE-лиганд-3; hAng4=hTL4=человеческий ТIЕ-лиганд-4; hAngl=hTLl=человеческий TIE-2-лиганд 1; mAngl=mTLl=мышиный TIE-2-лиганд 1; mAng2=mTL2=мышиный TIE-2-лиганд; hAng2=mTL2=человеческий TIE-2-лиганд 2. Подчеркнутые области указывают консервативные участки гомологии среди членов семейства.

Фигура 8Ф-8С - нуклеотидные и соответствующие им аминокислотные (однобуквенный код) последовательности TIE-лиганда-4. Стрелка указывает положение нуклеотида 569.

Фигура 9 - BIAcore-анализ для оценки связывания ангиопоэтина-4 с TIE1- и TIE2-рецепторами. Анализы связывания с BIAcore указанных ангиопоэтинов или химерных ангиопоэтинов, включая ангиопоэтин-4 или Ang4Chim, с BIAcore-чипами, покрытыми иммобилизованными TIE1- и ТIЕ2-рецепторами, осуществляли при наличии конкуренции с избыточными количествами либо нерелевантного растворимого рецептора (TrkB), либо растворимых TIE1- или ТIЕ2-рецепторов.

Фигура 10 - Активация ТIЕ2-рецептора с помощью Ang4Chim. Три клеточных линии (EAhy926, bEND и MG 3Т3) подвергали воздействию Ang4Chim, и определяли фосфорилирование TIE2.

Подробное изложение сущности изобретения

Как в деталях ниже описано, заявители выделили и идентифицировали новые лиганды, родственные TIE-2-лигандам, которые связывают TIE-2-рецептор. Новые лиганды, которые могут быть очищены из природного материала или сделаны рекомбинантным способом, называются здесь TIE-лиганд-3 (TL3) и TIE-лиганд-4 (TL4). Другие члены семейства TIE-лиганда называются здесь TIE-лиганд I (TL1), также известный как ангиопоэтин-1 (Ang1) и TIE-2-лиганд 2 (TL2), также известный как ангиопоэтин-2 (Ang2). 3аявители здесь описывают семейство TIE-лигандов и идентифицируют консервативные области гомологии среди членов семейства. Новые лиганды TL3 и TL4 должны быть проверены, чтобы определить, имеют ли они функции и применение, подобные тем, которые имеют известные лиганды TLI (Ang1) и TL2 (Ang2) в ангиогенезе и гематопоэзе.

Настоящее изобретение включает новые лиганды и их аминокислотные последовательности, а также их функционально эквивалентные варианты, содержащие природно встречающиеся аллельные вариации, а также белки или пептиды, содержащие заместители, делении или включенные мутаций описанных последовательностей, которые связывают TIE-рецептор и действуют как их агонисты или антагонисты. Подобные варианты включают такие, в которых аминокислотные остатки замещены на остатки в последовательности, приводящие к незаметному изменению. Например, один или более аминокислотных остатков в последовательности может быть заменен другой аминокислотой (аминокислотами) подобной полярности, который действует как функциональный эквивалент, приводящий к незаметному изменению. 3аместители аминокислоты в последовательности могут быть выбраны из других членов группы, к которой принадлежит аминокислота. Например, группа неполярных (гидрофобных) аминокислот включает аланин, лейцин, изолейцин, валин, пролин, фенилаланин, тоиптофан и метионин, Полярные нейтральные аминокислоты включают глицин, серин, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин и глутамин. Положительно заряженные (основные) аминокислоты включают аргинии, лизин и гистидин. Отрицательно заряженные (кислые) аминокислоты включают аспарагиновую и глутаминовую кислоты.

Также включены в сферу изобретения белки или их фрагменты или их производные, которые проявляют такую же биологическую активность, что и TIE-лиганд-3 или TIE-лиганд-4, описанные здесь, и производные, которые по-разному модифицированы в прогрессе трансляции или после нее, протеолитического расщепления, связывания с молекулой антитела или другим клеточным лигандом и т.д. Функционально эквивалентные молекулы также включают молекулы, которые содержат модификации, включающие N-концевые модификации, являющиеся результатом экспрессии в отдельном рекомбинантном хозяине, такие, например, как N-концевое метилирование, которое имеет место в определенных бактериальных (например, Е.Coli) экспрессирующих системах. Функциональные эквиваленты также включают мутанты, в которых заменяемой аминокислотой является цистеин, чтобы повысить стабильность молекул и предотвратить образование нежелательных поперечных связей.

Настоящее изобретение также включает нуклеотидную последовательность, которая кодирует белок, описанный здесь как TIE-лиганд-3, нуклеотидную последовательность, которая кодирует белок, описанный здесь как ТIЕ-лиганд-4, а также хозяйские клетки, включающие дрожжевые, бактериальные, вирусные клетки и клетки млекопитающих, которых с помощью генно-инженерного способа продуцируют белок путем трансфекции, трансдукции, заражения, электропорации или микроинъекции нуклеиновой кислоты, кодирующей TIE-лиганд-3 или ТIЕ-лиганд-4, описанные здесь, в подходящий зкспрессирующий вектор. Настоящее изобретение также включает введение нуклеиновой кислоты, кодирующей TIE-лиганд-3 или ТIЕ-лиганд-4, методами генной терапии, как описано, например в публикации Finkel and Epstein FASEB J., 9, 843-851, 1995; Guzman et al., PNAS, USA, 91, 10732-10736, 1994.

Специалистам данной области должно быть понятно, что настоящее изобретение включает последовательности ДНК и РНК, которые гибридизуются с соответствующей полученной последовательностью, кодирующей TIE-лиганд-3 или TIE-лиганд-4 с умеренной точностью, как описано, например у Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ed. Vol. 1, pp. 101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. Таким образом, молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению включает одну последовательность, полученную из аминокислотной последовательности, кодирующей TIE-лиганд-3 или ТIЕ-лиганд-4, полученной, как описано здесь, а также молекулу с последовательностью нуклеиновых кислот, которая гибридизуется с подобной последовательностью нуклеиновой кислоты, а также последовательность нуклеиновой кислоты, которая производится из вышеуказанных последовательностей с применением генетического кода, но которая кодирует лиганд, связывающий TIE-рецептор и имеющий аминокислотную последовательность и другие первичные, вторичные и третичные характеристики, которые достаточно воспроизводят лиганд, описанный здесь, таким образом, чтобы придать молекуле такую же биологическую активность, какую имеют TIE-лиганд-3 или ТIЕ-лиганд-4, описанные здесь.

Таким образом, настоящее изобретение включает выделенную и очищенную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую TIE-лиганд-3 млекопитающих, где нуклеотидная последовательность выбирается из группы, состоящей из:

a) нуклеотидной последовательности, содержащей кодирующую область TIE-лиганд-3 млекопитающих, как показано на фиг.6А-6В;

b) нуклеотидной последовательности, содержащей кодирующую область фибриногеноподобного домена TIE-лиганда-3, как показано на фиг.6А-6В;

c) нуклеотидной последовательности, которая умеренно строго гибридизуется с нуклеотидной последовательостью (а) или (b) и которая кодирует лиганд, связывающий TIE-рецептор;

d) нуклеотидной последовательности, которая, если бы не вырожденность генетического кода, должна гибридизоваться с) нуклеотидной последовательностью (а), (b) или (с) и которая кодирует лиганд, связывающий TIE-рецептор.

Далее настоящее изобретение включает выделенный и очищенный TIE-лиганда-3, кодируем выделенной молекулой нуклеиновой кислоты согласно изобретению. Изобретение также раскрывает вектор, который включает выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую последовательность, кодирующую TIE-лиганда-3 млекопитающих.

Настоящее изобретение также включает выделенную и очищенную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую человеческий ТIЕ-лиганда-4, где нуклеотидная последовательность выбирается из группы, состоящей из:

(а) нуклеотидной последовательности, содержащей кодирующую область человеческого ТIЕ-лиганда-4, включенную в вектор и обозначенную как hTL-4, депонированной 2 июля 1996 (АТСС Accession № 98095);

(b) нуклеотидной последовательности, содержащей кодирующую область фибриногеноподобного домена ТIЕ-лиганда-4, включенную в вектор и обозначенную как hTL-4, депонированной 2 июля 1996 (АТСС Accession № 98095);

(c) нуклеотидной последовательности, которая гибридизуется при умеренно строгих условиях до нуклеотидной последовательности (а) или (b) и которая кодирует лиганд, связывающий TIE-рецептор; и

(d) нуклеотидной последовательности, которая, если бы не вырожденность генетического кода, должна гибридизоваться с нуклеотидной последовательностью (а), (b) или (с), которая кодирует лиганд, связывающий TIE-рецептор.

Далее настоящее изобретение включает выделенную и очищенную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую человеческий ТIЕ-лиганд-4, где нуклеотидная последовательность выбирается из группы, состоящей из:

(a) нуклеотидной последовательности, содержащей кодирующую область человеческого ТIЕ-лиганда-4, как показано на фиг.8А-8С;

(b) нуклеотидной последовательности, содержащей кодирующую область фибриногеноподобного домена ТIЕ-лиганда-4, человека, как показано на фиг.8А-8С;

(c) нуклеотидной последовательности, которая гибридизуется в умеренно строгих условиях с нуклеотидной последовательностью (а) или (b) и которая кодирует лиганд, связывающий TIE-рецептор; и

(d) нуклеотидной последовательности, которая, в результате вырождения генетического кода, отличается от нуклеотидной последовательности (а), (b) или (с), которая кодирует TIE-2-лиганд, связывающий TIE-рецептор.

Далее настоящее изобретение обеспечивает выделенный и очищенный ТIЕ-лиганд-4, кодируем выделенной молекулой нуклеиновой кислоты согласно изобретению. Изобретение также относится к вектору, который включает выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую ТIЕ-лиганд-4 человека.

Любой из известных специалистам в данной области методов введения ДНК-фрагментов в вектор может быть использован для конструирования экспрессирующих векторов, кодирующих TIE-лиганд-3 или ТIЕ-лиганд-4, с применением соответствующих контрольных сигналов транскрипции/трансляции и кодирующих белок последовательностей. Эти методы могут включать рекомбинантную ДНК и способы синтеза и рекомбинации in vivo (генетические рекомбинации). Экспрессия нуклеотидной последовательности, кодирующей TIE-лиганд-3 или ТIЕ-лиганд-4 или их пептидные фрагменты, может регулироваться с помощью второй нуклеотидной последовательности, которая связана с последовательностью, кодирующей TIE-лиганд-3 или TIE-лиганд-4, такую, что белок или пептид TIE-лиганда-3 или TIE-лиганда-4 экспрессируется в клетках хозяина, трансформированных рекомбинантной молекулой ДНК. Например, экспрессия TIE-лиганда-3 или ТIЕ-лиганда-4, описанная здесь, может контролироваться любым элементом промотор/усилитель, известным в данной области. Промоторы, которые могут быть использованы для контроля экспрессии лиганда, включают в качестве неограничивающего примера длинный концевой повтор, как описано в публикации Squinto et al., Cell, 65, 1-20, 1991; раннюю промоторную область SV40 (Bernoist and Chambon, Nature, 290, 304-310), CMV-промотор, 5'-концевой повтор М-MulV, дромотор, заключенный в длинном 3'-концевом повторе вируса саркомы Рауса (Yamamoto et al., Cell, 22, 787-797, 1980) промотор тимидин киназы герпеса (Wagner et al., Proc. Natl. Acad, Sci. U.S.A., 78, 144-145, 1981), промотор аденовируса, регуляторные последовательности металлотионоинового гена (Brinster et al., Nature, 296, 39-42, 1982), экспрессирующие векторы прокариот, такие как промотор -лактамазы (Villa-Kamaroff et al., Proc. Natl. Acad, Sci. U.S.A., 75, 3727-3731, 1978), или tac-промотор (DeBoer et al., Proc. Natl. Acad, Sci. U.S.A., 80, 21-25, 1983), см. также “Полезные белки из рекомбинантных бактерий” в Scientific American, 242, 74-94, 1980; промоторные элементы из дрожжей или других грибов, такие как Gal 4-промотор, промотор ADH (алкогольдегидрогеназа), промотор PGK (фосфоглициринкиназа), промотор щелочной фосфатазы и следующие транскрипционные контрольные области животных, которые проявляют тканевую специфичность и используются в трансгенных животных; контрольная область гена эластазы I, которая активна в панкреатических ацинарных клетках (Swift et al., Cell, 38, 639-646, 1984; Ornitz et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 50, 399-409, 1986; MacDonald, Hepatology, 7, 425-515, 1987); контрольная область гена инсулина, которая активна в панкреатических бета-клетках (Hanahan, Nature, 315, 115-122, 1985); контрольная область гена иммуноглобулина, которая активна в лимфоидных клетках (Grosscheld et al., Cell, 38, 647-658, 1984; Adames et al., Nature, 318, 533-538, 1985; Alexander et al., Mol. Cell. Biol., 7, 1436-1444, 1987); контрольная область вируса опухоли молочной железы мыши, которая активна в тестикулярных клетках, клетках молочной железы, лимфоидных и тучных клетках (Leder et al.. Cell, 45, 485-495, 1986); контрольная область гена альбумина, который активен в печени (Pinkert et al., Genes and Devel, 1, 268-276, 1987), контрольная область гена альфа-фетопротеина, который активен в печени (Krumlauf et al., Mol. Cell. Biol., 5, 1639-1648, 1985; Hammer et al., Science, 235, 53-58, 1987); контрольная область гена альфа 1-антитрипсина, которая активна в печени (Kelsey et al., Genes and DeveL, 1, 161-171, 1987), контрольная область гена бета-глобина, которая активна в миелоидных клетках (Mogram et al., Nature, 315, 338-340, 1985; Kollias et al., Cell, 46, 89-94, 1986); контрольная область гена миелинового основного белка, которая активна в олигодендроцитах в мозге (Readhead et al., Cell, 48, 703-712, 1987); контрольная область гена легкой цепи-2 миозина, которая активна в скелетных мышцах (Shani, Nature, 314, 283-286, 1985), и контрольная область гонадотропного рилизинг гормона, которая активна в гипоталамусе (Mason et al., Science, 234, 1372-1378, 1986). Далее изобретение включает получение соединений антисенсов, которые проявляют способность специфически гибридизоваться с последовательностью РНК, кодирующей TIE-лиганд-3 или TIE-лиганд-4, для модуляции его экспрессии (Ecker, U.S. Патент № 5,166,195, вышедший 24 ноября 1992 г.).

Таким образом, согласно изобретению экспрессирующие векторы, способные к репликации в бактериальном или эукариотическом хозяине, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую TIE-лиганд-3 или ТIЕ-лиганд-4, описанные здесь, используются для того, чтобы трансформировать клетки хозяина, которые будут прямо экспрессировать такую нуклеиновую кислоту для продукции TIE-лиганд-3 или TIE-лиганд-4, который затем может быть превращен в биологически активную форму. Как подрузамевается здесь, биологически активная форма включает форму, способную связывать TIE-рецептор и вызывать биологический эффект, такой как функция дифференцировки, или влиять на фенотип клетки, экспрессирующей рецептор. Подобные биологически активные формы могут, например, вызывать фосфорилирование тирозинкиказного домена TIE-рецептора. Иначе, биологическая активность лигана может проявляться через действие лиганда как антагониста к TIE-рецептору. В альтернативных вариантах активная форма TIE-лиганд-3 или TIЕ-лиганд-4 является формой, которая может распознавать TIE-рецептор и тем самым действовать как мишень для рецептора, что используется как в диагностике, так и в терапии. В соответствии с подобными вариантами, активная форма не принуждает любую экспрессирующую ТIЕ-клетку осуществлять любые изменения в фенотипе.

Экспрессирующие векторы, содержащие генные вставки, могут быть идентифицированы с помощью 4 основных способов:

(а) ДНК-ДНК гибридизации; (b) наличие или отсутствия “маркера” генных функций; (с) экспрессии вставленных последовательностей и (d) выявления методом ПЦР. В первом способе присутствие чужеродного гена, вставленного в экспрессирующий вектор, может быть обнаружено с помощью ДНК-ДНК-гибридизации с использованием проб, содержащих последовательности, гомологичные вставленному гену, кодирующему TIE-лиганд-3 или ТIЕ-лиганд-4. Во втором способе рекомбинантный вектор в системе хозяина может быть идентифицирован и отобран на основании наличия или отсутствия определенных функций “маркерных” генов (например, тимидинкиназная активность, устойчивость к антибиотикам, трансформация фенотипа, нарушение телообразования в бакуловирусе и т.д), вызванных введением чужеродных генов в вектор. Например, если нуклеиновую кислоту, кодирующую TIE-лиганд-3 или ТIЕ-лиганд-4, вставить в маркерную генную последовательность вектора, то содержащие вставку рекомбинанты могут быть идентифицированы с помощью отсутствия маркерной генной функции. В третьем способе рекомбинантные экспрессирующие векторы могут быть идентифицированы при анализировании чужеродного генного продукта, экспрессированного рекомбинантом. Подобные анализы могут быть основаны, например, на физических или функциональных свойствах генного продукта TIE-лиганд-3 или ТIЕ-лиганд-4, например, на связывании лиганда с TIE-рецептором или его частью, причем рецептор может быть помечен, например, определяемым антителом или частью его, или с помощью связывания с антителами, полученными против белка TIE-лиганд-3 или ТIЕ-лиганд-4 или против его части. Клетки настоящего изобретения могут или транзитно, или, предпочтительно конститутивно или постоянно экспресировать описанные здесь TIE-лиганд-3 или ТIЕ-лиганд-4. В четвертом способе ДНК-нуклеотидные праймеры могут быть получены соответственно tie-специфической ДНК-последовательности. Эти праймеры можно затем использовать для ПЦР фрагмента гена tie (PCR Protocols: A Guide To Methoda and Applications, Edited by Michael A. Innis et al., Academic Press, 1990).

Рекомбинантный лиганд может быть очище