Улучшенное анти-ige антитело (варианты) и способ улучшения полипептидов

Улучшенное анти-ige антитело (варианты) и способ улучшения полипептидов

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к иммуноглобулину Е (IgE), IgE-антагонистам, анти-IgE антителам, способным к связыванию с IgE человека, и к способу улучшения полипептидов, включая анти-IgE антитела. Данное изобретение позволяет получить улучшенные полипептиды, включая антитела, которые не только не проявляют “дезактивирования” при изомеризации аспартила, но также проявляют сродство к молекуле-мишени, например антигену. 11 н. и 5 з.п. ф-лы, 15 ил., 19 табл.

Предпосылки изобретения

Данное изобретение относится к иммуноглобулину Е (IgЕ), IgЕ антагонистам, анти-IgЕ антителам, способным к связыванию с IgЕ человека, и к способу улучшения полипептидов, включая анти-IgЕ антитела.

IgЕ является членом семейства иммуноглобулина, который переносит аллергические реакции, такие как астму, пищевые аллергии, гиперчувствительность и широко распространенное обычное синус воспаление. IgЕ секретируется В-клетками и В-лимфоцитами и экспрессируется на их поверхности. IgЕ связывается с В-клетками (а также с моноцитами, эозинофилами и тромбоцитами) через его Fc область с IgЕ рецептором низкой аффинности, известного как FcRII. Подвергая млекопитающего воздействию аллергена, В-клетки, создающие поверхностно-связанное IgЕ антитело, специфичное для антигена, “активируются” и обнаруживаются в IgE-секретируемых плазматических клетках (плазмоцитах). Полученный аллерген-специфический IgЕ далее циркулирует по кровяному руслу и связывается с поверхностью тучных клеток в тканях и базофилами в крови посредством рецептора высокого сродства (аффинности), также известного как FcRI. Таким образом, тучные клетки и базофилы становятся чувствительными к аллергену. Последующее воздействие на аллерген вызывает перекрестное связывание базофильных и тучных клеточных FcRI, которое приводит к выделению гистамина, лейкотриенов и факторов активации тромбоцитов, эозинофильных и нейтрофильных хемотоксических факторов и цитокинов IL-3, IL-4, IL-5 и GM- CSF, которые ответственны за клиническую гиперчувствительность и анафилаксию.

Патологическое состояние гиперчувствительности характеризуется чрезмерной иммунной реакцией к аллергену(ам), приводящей к изменениям тучных тканей, если аллерген присутствует в относительно больших количествах или если гуморальное и клеточное иммунное состояние находится на повышенном уровне.

Физиологические изменения при анафилактической гиперчувствительности могут включать интенсивное сокращение (сужение) бронхиол и бронхов легких, сокращение гладкой мышцы и дилатацию (расширение) капилляров. Предрасположенность к данному состоянию, по-видимому, происходит в результате взаимодействия между генетическими факторами и факторами, относящимися к окружающей среде. Обычные аллергены, относящиеся к окружающей среде, которые индуцируют анафилактическую гиперчувствительность, встречаются в пыльце, пище, клещах бытовой пыли, перхоти животных, грибковых спорах и ядах насекомых. Атопическая аллергия связана с анафилактической гиперчувствительностью и включает расстройства, например астму, аллергические риниты и конъюнктивиты (сенную лихорадку), экзему, крапивницу и пищевую аллергию. Однако анафилактический шок, опасное для жизни состояние анафилаксии, обычно провоцируется укусами насекомых или источником лекарственной терапии.

Недавно была продолжена стратегия лечения гиперчувствительности 1 типа или анафилактической гиперчувствительности, которая пытается блокировать IgЕ от связывания с рецептором (FcRI) высокого сродства (аффинности), находящегося на базофилах и тучных клетках, и тем самым препятствуют выделению гистамина и других анафилактических факторов, приводящих к патологическим состояниям.

WO 93/04173, опубликованная 4 марта 1993 года, описывает IgE/lgGI химеры, относящиеся к человеку, где IgGI остатки замещены на аналогичные IgE остатки. Заявители родственной заявки USSN 08/405617 описывают облагороженные анти-IgE антитела, где антитело, относящееся к мышам или крысам, направленное против IgE (МаЕII) человека, применяли для обеспечения CDR, областей, которые замещали на IgGI структуру иммуноглобулина (rhuMaE25). Методика облагораживания описана в работах Reichman, L. et al., Nature 332:323 (1988) и Jones. P.T. et al., Nature 321:522 (1986).

Установлено, что хотя при облагораживании антител мышей или крыс получают анти-IgE молекулы, которые предусматривают подобную аффинность к IgE, как МаЕII мышей или крыс, без иммуногенной реакции, выявленной последними (Shields et al., Int. Arch. Allergy Immunol. 107: 308-213 (1995)), это до сих пор не привело к созданию анти-IgE с аффинностью для IgE, которая несомненно лучше, чем МаЕII или анти-IgE мышей или крыс.

Рекомбинантные моноклональные антитела подвергают реакциям деградации, которые затрагивают все полипептиды или протеины, как, например, изомеризация аспарагиновой кислоты или остатков аспарагина. Как показано ниже, остатки аспартата (I) в -Asp-Gly-последовательностях могут изомеризоваться в изоаспартат (III) через циклическое имидное производное (II) (Geiger and Clarke. J. Вiоl, Chem. 262:785-794 (1987)). Боковая цепь карбоновой кислоты (аспарагиновой кислоты (I)) реагирует с амидным азотом соседнего глицина с образованием циклического производного аспарагиновой кислоты (II), которое далее образует - изоаспарагиновая кислота - глициновый остаток (III). Равновесие, скорость и рН-зависимость данной реакции изучали на модельных пептидах, выделенных с помощью жидкостной хроматографии высокого разрешения с обращенной фазой (Oliyai and Borchardt, Pharm. Res. 10:95-102 (1993)). Считают, что тенденция претерпевать изомеризацию также зависит от локальной жесткости части молекулы, содержащей -Asp-Gly-последовательность (Geiger and Clarke, supra).

Примером известного антитела, которое претерпевает изомеризацию аспарагиновой кислоты, является сильное анти-IgE антитело, известное как rhuMabE-25 (E-25). Данное превращение может происходить спонтанно, но может индуцироваться для прохождения, если E-25 инкубируют при 37°С в течение 21 дня. Конечным результатом является введение дополнительной метильной группы в полипептидный скелет антитела, которая может привести к конформационным изменениям - уменьшению связывающей аффинности. Исследование E-25 с помощью -c-Asp-Gly- и изо-Asp-Gly вариантов в положении VL 32-33 показывало, что хотя изомеризационное превращение можно свести к минимуму замещением аланина или глутаминовой кислоты на остаток VL32, само превращение приводит к трехкратному уменьшению связывания Cacia et al., supra.

Таким образом, существует острая необходимость в создании улучшенных полипептидов, включая антитела, которые не только не проявляют “дезактивирования” при изомеризации аспартила, но также демонстрируют сродство к молекуле-мишени (например, антигену), равное или большее, чем сродство неулучшенного полипептида.

Сущность изобретения

Данное изобретение относится к способу улучшения полипептида, обладающего сродством (аффинностью) к молекуле-мишени, путем комбинирования стадий, включающих: (1) определение остатков аспаратила, которые склонны к изомеризации; (2) замещение альтернативных остатков и проверка полученных мутантов, что касается сродства (аффинности) к молекуле-мишени. В предпочтительном варианте способ замещения остатков представляет собой “созревание аффинности” с фаговым отображением (AMPD). В другом предпочтительном варианте полипептид представляет собой антитело и молекула-мишень является антигеном. В другом предпочтительном варианте антитело является анти-IgE и молекула-мишень - IgE.

В более предпочтительном варианте изобретение относится к способу улучшения аффинности анти-IgE антитела Е-25 путем замещения остатка 32 Asp VL CDR-L1 на Glu, наряду с модификацией остатков 27 Gln, 28 Ser и 31 Туr VL CDR-L1 на Lys, Pro и Gly соответственно. Еще в другом более предпочтительном варианте Е-25 анти-IgE антитело имеет дополнительные модификации в остатках VH CDR2: 53 Thr на Lys, 55Asp на Ser, 57 Ser на Glu и 59 Asn на Lys.

В другом варианте изобретение относится к анти-IgE антителу, обладающему улучшенной аффинностью к IgE.

В предпочтительном варианте анти-IgE антитело включает остатки тяжелой и легкой цепи, содержащей фрагменты последовательности, обозначенные “е27” и “е26” на фиг.2. Наоборот, анти-IgE антитело включает полной длины последовательности тяжелой и легкой цепи, обозначенные “Е27” и “Е26” на фиг.12.

Данное изобретение также относится к композициям анти-IgE улучшенной аффинности или его функциональным фрагментам, имеющим фармацевтическое применение. Данное изобретение относится также к производственному изделию, содержащему анти-IgE антитело улучшенной аффинности.

Еще в другом варианте данное изобретение относится к способу уменьшения или ингибирования IgE-опосредованного продуцирования гистамина.

Еще в другом варианте данное изобретение относится к способу лечения и IgE-опосредованных нарушений путем введения антител, описанных в изобретении, или их функциональных фрагментов.

Другие аспекты изобретения будут ясны из следующего детального описания и представленной формулы изобретения.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 сравнивают VH и VL области MAEII антитела мыши или крысы, “консенсус”-последовательностей подгруппы III (hum III) тяжелой цепи и подгруппы I (humk1) легкой цепи и фрагмента F(ab)-2, принадлежащего человеческому роду; модифицированный фрагмент антитела человека с CDR остатками и определенные остатки остовной области (остова), модифицированные на мышиные или крысиные.

На фиг.2 сравнивают отличия последовательностей CDR областей легкой цепи и тяжелой цепи для rhuMabe 25, е426 и последовательности е26 и е27. Нумерация остатка - последовательная, в противоположность Кэботу с сотр. Также заметьте, что данные последовательности представляют собой только фрагменты и не являются фактическими остатками полной длины тяжелой и легкой цепи.

Фиг.3 представляет собой график FACS-анализа, показывающего способность исследуемого антитела ингибировать ПТС-конъюгированное IgЕ связывание с а-цепью высокоаффинного FcRI рецептора, экспрессируемого на СНО 3D10 клетках. Показан процент ингибирования mAb MaEII мышей или крыс (а), отрицательный контроль облагороженного mAb4D5 ( ), F(ab)-2 (о), F(ab)-9 (), F(ab)-11 (), F(ab)-12 ( ). Данные являются средними трех экспериментов, за исключением mAb4D5, которые представляют единственно полученную экспериментальную величину. Результаты указывают, что MaEII и исследуемые F(ab)s блокируют FITC - IgE связывание с СНО 3D10 клетками, экспрессирующими FcRI -цепь.

Фиг.4 представляет собой график FACS-анализа, определяющего связывание исследуемого антитела с IgE-нагруженного -субъединицей высокоаффинного FcRI рецептора, экспрессируемого на СНО 3D10 клетках. Связывание в процентах с mAb MaEII мыши или крысы (о), облагороженного варианта 12 ( ), положительного контроля mAb MaEI мыши или крысы (), отрицательного контроля МОРС21 мыши или крысы () и отрицательного контроля облагороженного mAb4D5 ( ). На арифметической линейной шкале средние величины проточной флуоресценции при 0,1 мкг/мл составляли для МОРС21 - 7,3, MaEI - 32,1, MaEII - 6,4 hu4D5 - 4,7 и huMaEII - 4,6. Все три mAbs мыши или крысы являлись изотипом lgG1 мыши или крысы, и оба облагороженных mAbs являлись изотипом lgG1 человека. Данные представляют собой средние трех экспериментов. Результаты указывают, что MaEII и F(ab)-12 не связываются с IgE, нагруженным СНО 3D10 клетками, экспрессирующими FcRI -цепь.

Фиг.5 представляет собой кривые зависимости молярного отношения анти-IgE от ингибирования выделения гистамина, индуцируемого пыльцевой аллергией (в процентах). Приведены Е-25 () и Е-26 (о). Результаты указывают на то, что F(ab) форма е26 обладает лучшим ингибированием пыльцевой аллергии при дозозависимом методе с половиной максимального ингибирования при молярном соотношении 44:1 (анти-IgE: RsIgEI).

Фиг.6 представляет собой графическое изображение увеличения аффинности после различных циклов селекции по аффинности, описанной в разделе II примера 4. Показано отношение связывающего обогащения (увеличения) для каждого пула к таковому для дикого типа (Emut/Ewt). Результаты указывают, что VL библиотеки (обозначенные “а” и “в”), показывающие последовательно улучшенные относительные обогащения, вплоть до ~10-кратного улучшения по сравнению с диким типом после 5-6 циклов обогащения. Кроме того, VH библиотеки (“с” и “d”), показывающие ~3-кратное улучшение после -3 циклов. Следует иметь в виду, что “а” относится к Fab-фаговой библиотеке, подвергаемой мутации в остатках 27, 28, 30 и 31 CDR-1 VL, в то время как “b” относится к мутациям в 30, 31, 32 и 34, а “с” и “d” являются независимыми F(ab) библиотеками с мутациями в остатках 101, 102, 103, 105 и 107.

Фиг.7 представляет собой зависимость наблюдаемой оптической плотности от концентрации IgE конкурентного антитела при фаг ELISA конкурентном изучении конечных вариантов от комбинаций VL CDR1 мутаций в е26 с VH с CDR2 мутациями в клонах 235-5,1; 235-5,2; 235-5,3 и 235-5,4, соответственно переименованные в е27, е695, е696 и е697 и описанные в разделе V примера 4.

Фиг.8 представляет собой зависимость абсорбции при 490 нм от различных концентраций е25, е26 и е27 анти-IgE антитела в методе анализа биотина на бактериологических чашках, описанного в разделе VI примера 4.

Фиг.9 демонстрирует F(ab) кажущуюся связывающую аффинность (сродство) е25, е26 и е27, измеренную с помощью BIAcore TM-2000 резонансной системы поверхностного плазмона. 1,5-Серийные разбавления F(ab) фрагментов антитела вводили через IgE чип в PBS/Tween буфере (0,05% Tween-20 в фосфатном забуференном физиологическом растворе) при 25°С, используя скорость потока 20 мкл/мин. Приведенные равновесные константы диссоциации (Kd) вычислены из отношения наблюдаемых k_on/k_off для каждого Fab варианта.

Фиг.10 демонстрирует последовательность плазмиды р426, которую использовали в качестве темплаты (матрицы) для создания библиотеки специфических “стоп” темплат в примере 4.

Фиг.11А. Диаграмы вставки плазмиды pDH188, содержащей ДНК, которая кодирует легкую и тяжелую цепь (вариабельной и константной области

1) Fab облагороженного антитела, направленного к HER-2 рецептору. VL и VH являются вариабельными областями легкой и тяжелой цепей соответственно. C_k-константная область “каппа” () легкой цепи человека, CH1_G1-первая константная область “гамма” () цепи I человека. Обе кодирующие области начинаются с бактериальной stII сигнальной последовательности.

В. Схематическая диаграмма целой плазмиды pDH188, содержащей вставку, описанную в 11А. После трансформации плазмиды в Е. coli SR101 клетках и прибавления фаг-помощника, плазмида упаковывается в фаговые корпускулы. Некоторые из этих частиц (корпускул) обнаруживают Fab-p III слияние (где pIII представляет собой протеин, кодируемый М13 геном III ДНК).

Фиг.12 изображает полную длину остатков тяжелой и легкой цепи анти-IgE антител Е25, Е26 и Е27.

Фиг.13 представляет F(ab) фрагменты анти-IgE антител е26 и е27.

Фиг.14 представляет sFV фрагменты анти-IgE антител е26 и е27.

Фиг.15 представляет F(ab)'2 фрагменты анти-IgE антител е26 и е27.

SEQ ID No.1 представляет последовательность экспрессирующей плазмиды е426, используемой в изобретении, также приведенной на фиг.10.

SEQ ID No.2 представляет последовательность вариабельной области тяжелой цепи МаЕII, приведенной на фиг.1.

SEQ ID No.3 представляет последовательность вариабельной области тяжелой цепи F(ab)-2, приведенной на фиг.1.

SEQ ID No.4 представляет последовательность вариабельной области тяжелой цепи hum11, приведенной на фиг.1.

SEQ ID No.5 представляет последовательность вариабельной области легкой цепи МаЕII, приведенной на фиг.1.

SEQ ID No.6 представляет последовательность вариабельной области легкой цепи F(ab)-2, приведенной на фиг.1.

SEQ ID No.7 представляет последовательность вариабельной области легкой цепи hum11, приведенной на фиг.1.

SEQ ID No.8 представляет последовательность вариабельной области легкой цепи е26 и е27, приведенной на фиг.2.

SEQ ID No.9 представляет последовательность вариабельной области легкой цепи е426, приведенной на фиг.2.

SEQ ID No.10 представляет последовательность вариабельной легкой цепи е25, приведенной на фиг.2.

SEQ ID No.11 представляет последовательность вариабельной области тяжелой цепи е27, приведенной на фиг.2.

SEQ ID No.12 представляет последовательности вариабельной области тяжелой цепи е25, е26 и е426, приведенные на фиг.2.

SEQ ID No.13 представляет последовательность полной длины вариабельной области легкой цепи е25, как показано на фиг.12.

SEQ ID No.14 представляет последовательность полной длины вариабельной области тяжелой цепи е25, как показано на фиг.12.

SEQ ID No.15 представляет последовательность полной длины вариабельной области легкой цепи е26, как показано на фиг.12.

SEQ ID No.16 представляет последовательность полной длины вариабельной области тяжелой цепи е26, как показано на фиг.12.

SEQ ID No.17 представляет последовательность полной длины вариабельной области легкой цепи е27, как показано на фиг.12.

SEQ ID No.18 представляет последовательность полной длины вариабельной области тяжелой цепи е27, как показано на фиг.12.

SEQ ID No.19 представляет вариабельную область легкой цепи Fab фрагмента е26 и е27, как показано на фиг.13.

SEQ ID No.20 представляет вариабельную область Fab фрагмента тяжелой цепи е26, как показано на фиг.13.

SEQ ID No.21 представляет вариабельную область Fab фрагмента тяжелой цепи е27, как показано на фиг.13.

SEQ ID No.22 представляет sFv фрагмент е26, как показано на фиг.14.

SEQ ID No.23 представляет sFv фрагмент е27, как показано на фиг.14.

SEQ ID No.24 представляет вариабельную область легкой цепи F(ab)'2 фрагмента для е26 и е27, как показано на фиг.15.

SEQ ID No.25 представляет вариабельную область тяжелой цепи F(ab)'2 фрагмента для е26, как показано на фиг.15.

SEQ ID No.26 представляет вариабельную область тяжелой цепи F(ab)'2 фрагмента для е27, как показано на фиг.15.

Подробное описание предпочтительных вариантов

Упомянутые в изобретении отдельные ссылки, патентные заявки и патенты следует рассматривать как литературные ссылки, приведенные в тексте описания.

Определения

Термины, используемые в данной заявке, следует толковать в обычном и типичном смысле, обычно используемом в данной области. Однако заявители желают, чтобы следующим терминам были даны определения, которые приводятся ниже.

Термины “протеин” или “полипептид” предполагается использовать взаимозаменяемо. Они относятся к цепи двух (2) или более аминокислот, которые связаны вместе пептидной или амидной связями, независимо от посттрансляционной модификации (например, гликозилирования или фосфорилирования). Предполагается, в частности, чтобы антитела охватывались данным определением.

Полипептиды данного изобретения могут включать более одной субъединицы, где каждая субъединица кодируется отдельной ДНК последовательностью.

Фразу “практически идентичный”, что касается полипептидной последовательности антитела, следует толковать как антитело, проявляющее по крайней мере, 70%-ную, предпочтительно 80%-ную, более предпочтительно 90%-ную и наиболее предпочтительно 95%-ную идентичность последовательности относительно полипептидной последовательности. Термин в отношении последовательности нуклеиновой кислоты следует толковать как последовательность нуклеотидов, проявляющих, по крайней мере, 85%-ную, предпочтительно 90%-ную, более предпочтительно 95%-ную и наиболее предпочтительно 97%-ную идентичность последовательности относительно последовательности нуклеиновой кислоты. Для полипептидов длина последовательностей сравнения обычно составляет, по крайней мере, 25 аминокислот. Для нуклеиновых кислот длина должна обычно составить по крайней мере 75 нуклеотидов.

Понятие “идентичность” или “гомологичность” следует толковать как означающее процентное содержание остатков аминокислот в кандидатной последовательности, которые идентичны остаткам соответствующей последовательности, с которой ее сравнивают, после сравнения последовательностей и введения “брешей”, если необходимо достичь максимального процента идентичности для полной последовательности и не учитывая любые консервативные замещения как часть идентичности последовательности. Ни N- или С-концевой удлиняющей, ни инсерционные сегменты не следует толковать как уменьшающие идентичность или гомологичность. Методы и компьютерные программы для сравнения хорошо известны. Идентичность последовательности можно определить, используя программное обеспечение для анализа последовательности (например, Sequence Analysis Software Package, Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Ave., Madison, WI 53705). Данное программное обеспечение подходит для подобных последовательностей путем определения степени гомологичности для разнообразных замещений, делеций (элиминирований) и других модификаций.

Термин “антитело” используется в самом широком смысле и, в частности, охватывает моноклональные антитела (включая моноклональные тела полной длины), поликлональные, мультиспецифические (например, биспецифические антитела) и фрагменты антител (например, Fab, F(ab')₂ и Fv), до тех пор пока они проявляют требуемую биологическую активность. Антитела (Abs) и иммуноглобулины (Igs) являются гликопротеинами, имеющими одинаковые структурные характеристики. В то время как антитела проявляют связывающую специфичность к специфическому антигену, иммуноглобулины включают и антитела и другие подобные антителам молекулы, которые не обладают антигенной специфичностью. Полипептиды последнего типа, например, продуцируются с низкой концентрацией лимфатической системой и с увеличенной концентрацией миеломами.

Нативные антитела и иммуноглобулины обычно представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины с молекулярным весом около 150000 дальтон, состоящие из двух идентичных легких (L) и двух идентичных тяжелых (Н) цепей. Каждая легкая цепь связана с тяжелой цепью одной ковалентной дисульфидной связью, в то время как количество дисульфидных связей изменяется между тяжелыми цепями различных изотипов иммуноглобулина. Каждая тяжелая и легкая цепь также имеет регулярно расположенные дисульфидные мостики внутри цепи. Каждая тяжелая цепь имеет на одном конце вариабельную область (VH), за которой следует ряд константных областей. Каждая легкая цепь имеет вариабельную область на одном конце (VL) и константную область на ее другом конце. Константную область легкой цепи сравнивают с первой константной областью тяжелой цепи, и вариабельную область легкой цепи сравнивают с вариабельной областью тяжелой цепи. Полагают, что определенные остатки аминокислот образуют поверхность раздела между вариабельными областями легкой и тяжелой цепей (Clothia et al., J. Mol. Вiоl. 186, 651-660 (1985); Novothny, Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 4592-4596 (1985)).

“Изолированное” антитело является антителом, которое было идентифицировано и отделено и/или выделено из компонента окружающей среды, в которой его продуцировали. Контаминантные (примесные) компоненты при его продуцировании являются вещества, которые будут мешать диагностическим или терапевтическим применениям антитела и могут включать ферменты, гормоны и другие напоминающие протеин и протеин не напоминающие подобные растворенные вещества. В предпочтительных вариантах антитело будут очищать, измеряя чистоту с помощью, по крайней мере, трех разных методов: 1) до более чем 95 мас.% антитела, как определено по методу Лоури, и наиболее предпочтительно более 99 мас.%;

2) до степени, достаточной для получения, по крайней мере, 15 остатков N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности с использованием быстровращающегося чашечного секвенатора; или 3) до однородности с помощью SDS-PAGE в восстанавливающих или невосстанавливающих условиях, применяя Кумасси синий или предпочтительно краситель из серебра. Изолированное антитело включает антитело in situ внутри рекомбинантных клеток, до тех пор пока будет присутствовать, по крайней мере, один компонент природного окружения антитела. Однако обычно изолированное антитело должно получаться с помощью, по крайней мере, одной стадии очистки.

“Видозависимое антитело”, например, антитело млекопитающего против IgE человека представляет собой антитело, которое обладает более сильным связывающим сродством к антигену из первого вида млекопитающего, чем оно имеет для гомологии данного антигена из второго вида млекопитающего. Обычно видозависимое антитело “связывается специфично” с антигеном, человека (т.е. имеет величину связывающего сродства (аффинности) (Kd) не более чем ~1×10^-7 М, предпочтительно не более чем 1×10^-8 М и наиболее предпочтительно не более чем ~1×10^-9М), но имеет связывающее сродство к гомологии антигена из второго вида млекопитающего, но не человека, которое составляет, по крайней мере, в 50 раз, или, по крайней мере, в 500 раз, или, по крайней мере, в 1000 раз слабее, чем связывающее сродство к антигену человека. Видозависимое антитело может быть любым из разных типов антител, как указано выше, но предпочтительно является облагороженным антителом или антителом человека.

Термин “мутант антитела” относится к аминокислотной последовательности варианта антитела, в котором модифицированы один или несколько аминокислотных остатков. Такие мутанты имеют идентичность последовательности менее 100% или сходство с аминокислотной последовательностью, составляющей, по крайней мере, 75% идентичности аминокислотной последовательности или сходство с аминокислотной последовательностью или вариабельной области тяжелой или легкой цепи антитела, более предпочтительно, по крайней мере, 80%, более предпочтительно, по крайней мере, 85%, более предпочтительно, по крайней мере, 90% и наиболее предпочтительно, по крайней мере, 95%. Так как способ изобретения равно применим к полипептидам, антителам и их фрагментам, данные термины иногда применяются взаимозаменяемо.

Термин “вариабельная” в контексте вариабельная область антитела относится к факту, что некоторые (определенные) части вариабельных областей широко отличаются среди антител по последовательности и применяются в связывании и специфичности каждого отдельного антитела к ее отдельному антигену. Однако разнообразие не распределяется равномерно по вариабельным областям антител. Оно концентрируется в трех сегментах, называемых гипервариабельными участками (complementarity determining regions, CDRs) известные так же, как гипервариабельные участки в легкой и тяжелой цепи вариабельных областей. Имеются, по крайней мере, две методики для определения CDRs:

(1) подход, основанный на разнообразии последовательности перекрестных видов (т.е. Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health, Bethesda, MD 1987); и

(2) подход, основанный на кристаллографических исследованиях комплексов антиген-антитело (Chothia, С. et al., Nature 342:877 (1989)). Что касается антитела заявителя -анти-IgE, некоторые CDRs определяли комбинированием подходов Kabat et al., и Chothia et al. Более высоко сохраненные части вариабельных областей называются остовной областью (framework, FR). Вариабельные области нативных тяжелой и легкой цепей, включают четыре FR области, в значительной степени принимающих -складчатую конфигурацию, связанную с тремя CDRs, которые образуют петли, и в некоторых случаях, образуя часть -складчатой конфигурации. CDRs в каждой цепи держатся вместе в непосредственной близости от FR областей и с CDRs от другой цепи способствуют образованию антигенсвязывающего центра антител (см. Kabat et al.). Константные области непосредственно не вовлекаются в связывание антитела с антигеном, но проявляют различную эффекторную функцию, например участие антитела в антителозависимой клеточной токсичности.

Термин “фрагмент антитела” относится к части антитела полной длины, обычно к антигенсвязывающей или вариабельной области. Примеры фрагментов антитела включают Fab, Fab', F(ab') ₂ и Fv-фрагменты. Папаиновый гидролизат антитела продуцирует два идентичных антигенсвязывающих фрагмента, называемые Fab-фрагментом, каждый с единственным антигенсвязывающим центром и остаточный (осадочный) “Fc” фрагмент, называемый так за его способность легко кристаллизоваться. Обработка пепсином дает F(ab') ₂ фрагмент, который имеет два антигенсвязывающих фрагмента, которые способны перекрестно связывать антиген и другой остаточный фрагмент (который называется pFc'). Дополнительные фрагменты могут включать диатела, линейные антитела, молекулы антител с одной цепью и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антитела. “Функциональный фрагмент”, что касается антител, относится к Fv, F(ab) и F(ab')₂ фрагментам.

“Fv” фрагмент является минимальным фрагментом антитела, который содержит полный (законченный) сайт узнавания антигена и связывающий сайт. Данная область содержит димер одной тяжелой и одной легкой цепи вариабельной области в устойчивой нековалентной ассоциации (V_H-V _L димер). Она находится в такой конфигурации, что три CDRs каждой вариабельной области взаимодействуют для определения антигенсвязывающего центра на поверхности V _H-V _L димера. Совместно шесть CDRs придают антигенсвязывающую специфичность антителу. Однако даже отдельная вариабельная область (или половина Fv, включающая только три CDRs, специфичных к антигену) обладает способностью узнавать и связывать антиген, хотя и с низшей аффинностью, чем полный связывающий сайт.

Fab фрагмент [также обозначенный как F(ab)] также содержит константную область легкой цепи и первичную константную область (СH1) тяжелой цепи. Fab' фрагменты отличаются от Fab фрагментов добавлением нескольких остатков на карбоксильном конце тяжелой цепи СН1 области, включая один или несколько цистеинов из шарнирной области антитела. Fab'-SH является обозначением в данном изобретении Fаb'-фрагмента, в котором остаток(ки) цистеина константных областей имеет свободную тиольную группу. F(аb')-фрагмент продуцируют расщеплением дисульфидной связи у цистеинов шарнирной области F(ab') ₂ продукта пепсинового гидролизата. Специалистам известны дополнительные химические соединения фрагментов антитела.

Легкие цепи антител (иммуноглобулина) из любого вида позвоночных можно приписать одному из двух несомненно различных типов, называемых каппа () и лямда () в зависимости от аминокислотных последовательностей их константной области.

В зависимости от аминокислотных последовательностей константной области их тяжелых цепей “иммуноглобулины” можно отнести к различным классам. Существуют, по крайней мере, пять основных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM и несколько из них можно дополнительно разделить на подклассы (изотипы), например IgG-1, lgG-2, IgG-3 и IgG-4; IgA-1 и IgA-2. Константные области тяжелых цепей, которые относятся к различным классам иммуноглобулинов, называются , , , и соответственно. Структуры субъединиц и трехмерные конфигурации различных классов иммуноглобулинов хорошо известны. Предпочтительным иммуноглобулином для применения в данном изобретении является иммуноглобулин Е.

Термин “моноклональное антитело”, как он используется в данном изобретении, относится к антителу, полученному из популяции, по-существу, гомогенных антител, т.е. индивидуальные антитела, содержащие популяцию, являются идентичными, за исключением возможных встречающихся в природе мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Моноклональные антитела высокоспецифичны, причем направлены к отдельной области детерминанты. Кроме того, в противоположность препаратам обычных (поликлональных) антител, которые обычно включают различные антитела, направленные к разным детерминантам (эпитопам), каждое моноклональное антитело направлено к отдельной детерминанте на антигене. В дополнение к их специфичности, моноклональные антитела выгодны тем, что они синтезируются гибридомной культурой, незагрязненной другими иммуноглобулинами. Определение “моноклональный” указывает на характер антитела, поскольку было получено из практически гомогенной популяции антител, и не следует истолковывать как требующие продуцирования антитела определенным способом. Например, моноклональные антитела, используемые в данном изобретении, можно получать гибридомным методом, впервые описанным Kohler и Milstein, Nature 256:495 (1975) или можно получать рекомбинантными методами, например, как описано в U.S. Pat. No. 4816567. Моноклональные антитела, используемые в данном изобретении, можно также отделять от фаговых библиотек антител, применяя методику, описанную Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991), а также Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991).

Моноклональные антитела, конкретно, включают “химерные” антитела (иммуноглобулины), в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных из отдельного вида или принадлежащих отдельному классу или подклассу антитела, в то время как остаток цепи(ей) идентичен или гомологичен соответствующим последовательностям в антителах, полученных из другого вида, или принадлежащих другому классу или подклассу антитела, а также фрагментам этих антител, до тех пор пока они проявляют требуемую биологическую активность (U.S. Pat. No. 4816567); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851-6855 (1984).

“Облагороженные” формы антител, не принадлежащих к человеческому роду (например, относящиеся к мышам или крысам), представляют собой гибридные иммуноглобулины, цепи иммуноглобулина или его фрагменты (такие как Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ или другие антигенсвязывающие последовательности антител), которые содержат минимальную последовательность, полученную из не принадлежащего человеческому роду иммуноглобулина. Большей частью облагороженные антитела являются иммуноглобулинами человека (реципиентное антитело), в которых остатки из гипервариабельного участка (CDR) реципиента замещены остатками из CDR, не принадлежащего человеческому роду (донорское антитело), например мыши, крысы или кролика, имеющих требуемую специфичность, сродство и емкость. В некоторых примерах остатки Fv остовной области иммуноглобулина человека замещены соответствующими не принадлежащими человеческому роду остатками. Кроме того, облагороженное антитело может включать остатки, которых нет ни в реципиентном антителе, ни в импортируемой CDR последовательности или последовательности остовной области. Данные модификации предприняты для дополнительной очистки и оптимизации характеристики антитела. Обычно облагороженное антитело должно содержать практически все, по крайней мере, одну или обычно две вариабельные области, в которых все или практически все CDR области соответствуют таковым для иммуноглобулина, не принадлежащего к человеческому роду, и все или практически все FR области являются “консенсус” (обобщающей типичной) последовательностью иммуноглобулина человека. Оптимально, если облагороженное антитело также будет включать, по крайней мере, часть константной области иммуноглобулина (Fc), обычно область иммуноглобулина человека. Более подробно см.: Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature 332: 323-329 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992).

Фрагменты “отдельной цепи Fv” или “sFv” антитела включают VH и VL области ант