Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая белок, обладающий дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью (варианты), белок из arabidopsis thaliana, обладающий указанной активностью (варианты), вектор экспрессии, способ клонирования нуклеиновой кислоты, диагностический зонд, способ получения белка, способы восстановления стерина (варианты), способ получения прегненолона (варианты), трансформированный дрожжевой штамм и способ выявления недостаточности дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазы

Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая белок, обладающий дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью (варианты), белок из arabidopsis thaliana, обладающий указанной активностью (варианты), вектор экспрессии, способ клонирования нуклеиновой кислоты, диагностический зонд, способ получения белка, способы восстановления стерина (варианты), способ получения прегненолона (варианты), трансформированный дрожжевой штамм и способ выявления недостаточности дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазы

Реферат

 

Изобретение относится к генной инженерии. Клонирование нуклеотидной последовательности в дрожжах позволяет получить белок, обладающий дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью. Восстановление стерина в положении С-7 может быть использовано для получения прегненолона и гидрокортизона, а использование соответствующего гибридизационного зонда - для выявления недостаточности в организме человека дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазы, например его врожденной недостаточности, а также у пациентов, страдающих разнообразными заболеваниями, например с клиническим проявлением синдрома RSH/SLO. 21 н. и 10 з.п. ф-лы, 30 ил., 2 табл.

Настоящее изобретение относится к последовательности ДНК, кодирующей белок А. талианы, обладающий дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью, белок дельта-7 Ред, к способу их получения, к трансформированным дрожжевым штаммам и к видам их применения.

Дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктаза (Е.С.1.3.1.21) представляет собой микросомальный фермент, присутствие которого было обнаружено благодаря его действию в гомогенатах печени крысы (М.Е.Dempsey с соавторами. Methods Enzymol., 15, 501-514, 1969 г.), а также в препаратах растений Zea mays (М. Taton с соавторами, Biochem. Biophys. Res. Commun., 181, 465-473, 1991 г.). Указанная редуктаза зависима от НАДФН и обеспечивает in vitro восстановление 7-дигидрохолестерина в холестерин.

Стерины являются основными компонентами мембран у эукариотов, однако, в зависимости от вида, они имеют различную структуру. В клетках эукариотов, таких как дрожжи, основным стерином является эргостерин, который содержит двойную ненасыщенную связь в положении С-5 и С-7, разветвленную боковую цепь в положении С-24 и ненасыщенную связь в положении С-22, в то время как у млекопитающих холестерин отличается ненасыщенной связью в положении С-5 и насыщенной боковой цепью. Ситостерин, стигмастерин и кампестерин, которые представляют собой наиболее распространенные у растений стерины, обладают разветвленной, но насыщенной боковой цепью и так, же как и стерины позвоночных, не имеют ненасыщенной связи в положении С-7. Ферментом, вызывающим указанное различие структуры стеринового ядра, является дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктаза.

Дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктаза никогда не очищалась до состояния гомогенности, и в специальной литературе встречается лишь описание частичной очистки (указанные выше М.Е.Dempsey с соавторами, М.Taton с соавторами). При этом белок не рассматривался с точки зрения его физико-химических свойств. Никакой информации относительно последовательности белка не приводилось, так же как не встречается описаний каких бы то ни было антител к нему. Кроме того, очевидная нехватка 7-дегидрохолестеринредуктазы у человека была описана в связи с синдромом RSH/Смита-Лемли-Опитца (SLO) (J.М.Opitz с соавторами. Am. J. Med. Genet., 50, 326-338, 1994 г.).

Таким образом, клонирование кДНК, кодирующей дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазу, которое может позволить идентифицировать соответствующую последовательность белка, а также характеризовать ген человека или выявить их врожденную недостаточность, не может производиться обычными методами, использующими, например, методы гибридизации и/или иммунологического обнаружения. Поэтому особенно важное значение имеет поиск новых методов скрининга, позволяющих выполнять клонирование, в частности, при отсутствии информации о белке.

Эргостерин, являющийся основным стерином грибковых мембран, включает пару двойных сопряженных связей в положении С-5,7, благодаря чему соединения из семейства полиенов, такие как нистатин, обладают антимикотичным действием (R.Bittman с соавторами, J.Biol. Chem., 260, 2884-2889, 1985 г.). Сильная зависимость действия нистатина на мембранную концентрацию ненасыщенных стеринов в положении С-5,7 позволила отобрать в S. cerevisiae мутантные штаммы относительно накопленных стеринов (S.W.Molzahn с соавторами, J. Gen. Microbiol., 72, 339-348, 1972 г.). Так, мутанты еrg2 и еrg3 накапливают стерины, не имеющие двойных сопряженных связей в положении С-5,7 вследствие недостаточности соответственно стерин дельта-8,7 изомеразы (W.Ashman с соавторами, Lippids, 26, 628, 1991 г.) и стерин дельта-5 дегидрогеназы (В.Arthinton с соавторами. Gene, 102, 39, 1991 г.). Подобные мутанты жизнеспособны, поскольку эргостерин, являющийся основным природным стерином дрожжей, может при некоторых условиях быть заменен различными стеринами-заменителями, включающими холестерин.

Преимущество повышения устойчивости к нистатину дрожжевых штаммов, обогащенных стеринами, не имеющими двойной ненасыщенной связи в положении С-5,7, было использовано изобретателями для клонирования кДНК, кодирующей гетерологичный белок, обладающий дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью, методом скрининга, использующим метаболическую интерференцию в S.Cerevisiae. Тем не менее, на успех подобного подхода, преимуществом которого является его независимость от знания последовательностей ДНК или белка, а также от обнаружения, основывающегося исключительно на ферментативной активности, рассчитывать нельзя из-за многочисленных трудностей технического характера, с которыми он связан.

Первое ограничение вызвано тем фактом, что действие нистатина не полностью изучено (L.W.Parks с соавторами, CRC Critical Reviews in Microbiology, 301-304, 1978 г.). Например, можно предвидеть слабую специфичность нистатинного отбора вследствие его косвенного характера, что приводит у дрожжей к выбору геномных спонтанных мутаций, таких как мутанты erg (указанный выше S.W.Molzahn с соавторами), или геномных мутаций, ведущих к устойчивости, не зависящей от метаболических путей стеринов. Так же и клетки, трансформированные банком, могут выражать гетерологичные гены, обеспечивающие устойчивость к нистатину, не зависящую от метаболического пути стеринов.

Другой пример ожидаемого ограничения относится к тому факту, что гетерологичный белок может иметь слабую активность в клетке, ведущую к отсутствию или ослаблению устойчивости к нистатину, например, по одной из нижеследующих причин: 1) слабая экспрессия гена, кодирующего дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазу; 2) слабая активность или полное отсутствие активности белка вследствие плохой свернутости или вследствие ошибочной субклеточной адресации; 3) белок растения не признает стерины дрожжей в качестве субстратов или 4) стерины, которые могут быть субстратами, присутствуют в этерифицированном виде или скапливаются в пузырьках и не находятся в контакте с ферментом. Таким образом, можно предвидеть, что накопленные таким образом стерины не подвергаются воздействию дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазы, которая, в случае эукариотов, считается локализованной в микросомах.

Настоящее изобретение относится к клонированию кДНК А. талианы, кодирующей белок, обладающий дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью, обозначаемый как дельта-7 Ред, по методу клонирования, выполняемого в дрожжах за счет метаболической интерференции, основывающейся на устойчивости к нистатину. Белок дельта-7 Ред обеспечивает восстановление стеринов, содержащих ненасыщенную связь в положении С-7, методом биологического восстановления, которое, кроме того, используется как удачное решение проблемы селективного восстановления в положении С-7 стеринов или стероидов, обладающих двойной ненасыщенной связью в положении С-5,7, что невозможно при использовании методов химического восстановления.

Настоящее изобретение относится также к трансформированным клеткам дрожжей, экспрессирующим дельта-7 Ред, которые удивительным образом накапливают продукты, насыщенные в положении С-7, и, возможно, насыщенные в положении С-22, которые, в отличие от эргостерина, являются субстратами фермента расщепления боковой цепи холестерина, то есть цитохром P₄₅₀SCC.

Указанные неожиданные свойства позволяют использовать трансформированные дрожжи, являющиеся предметом настоящего изобретения, в способе получения стеринов или стероидов, представляющем промышленный и/или фармакологический интерес, в частности для получения прегненолона путем биологического окисления эндогенных стеринов дрожжей, восстановленных в положении С-7, с помощью цитохрома P₄₅₀SCC (P ₄₅₀SCC) в присутствии адренодоксинредуктазы (ADR) и адренодоксина (ADX). Трансформированные дрожжи, являющиеся предметом настоящего изобретения, могут также использоваться в способе получения промежуточных стероидов пути метаболизации холестерина в гидрокортизон у млекопитающих и прочих позвоночных. Указанное использование обладает тем преимуществом, что оно позволяет получить гидрокортизон или его промежуточные продукты методом биологического окисления, не требующим использования в качестве исходного субстрата экзогенного стерина, такого как холестерин, что позволяет обойти проблему проникновения стерина в дрожжи, непроницаемость которых для экзогенных стеринов в условиях аэробиоза уже описывалась (R.Т.Lorentz с соавторами, J. Bacteriology, 981-985, 1986 г.).

Настоящее изобретение относится также к использованию нуклеотидных последовательностей, полученных с применением метода клонирования, являющегося предметом настоящего изобретения. Последовательность РНК или ДНК, кодирующая дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазу, может использоваться при диагностике или лечении заболеваний, связанных с продуктом гена дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазы. Например, считается, что нехватка дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазы, которая преобразует 7-дегидрохолестерин в холестерин, приводит к синдрому RSH/SLO. Таким образом, последовательность ДНК человека может использоваться в качестве зонда при диагностике недостаточности дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазы, а также в генной терапии для корректировки указанной недостаточности.

Таким образом, предметом настоящего изобретения является последовательность нуклеиновой кислоты, включающей последовательность, кодирующую белок, обладающий дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью, причем указанной нуклеиновой кислотой может быть ДНК или РНК и в первую очередь кДНК.

Дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазная активность может быть обнаружена, например, с помощью ферментативного теста in vitro (в пробирке), описание которого приводится ниже, в экспериментальной части.

Предметом настоящего изобретения в первую очередь является последовательность кДНК, в которой кодирующая последовательность кодирует белок А. талианы, обладающий дельта-5,7 стерин, дельта-5,7 редуктазной активностью, и обладающая последовательностью нуклеотидов последовательности SEQ ID №1 (см. в конце текста), а также аллельные варианты данной последовательности.

Вышеприведенная последовательность кДНК, кодирующая белок, состоящий из 430 аминокислот, соответственно последовательности, представленной на фиг.3 (SEQ ID №2), является последовательностью кДНК, которую можно получить, например, путем клонирования в дрожжах, на основе банка экспрессии А. thaliana с использованием метода скрининга, основанного на появлении устойчивости дрожжей к нистатину, с соблюдением условий выполнения, подробное описание которых приводится ниже.

Знание вышеприведенной последовательности нуклеотидов SEQ ID №1 позволяет воспроизвести настоящее изобретение обычными методами, хорошо известными специалистам, например, путем выполнения химического синтеза или скрининга геномного банка или банка кДНК с помощью синтезированных олигонуклеотидных зондов с использованием методов гибридизации или амплификации методом PCR (polymerase chain reaction).

Предметом настоящего изобретения также является последовательность ДНК, кодирующая белок, обладающий дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью, и гибридизирующаяся с последовательностью нуклеотидов SEQ ID №1 в условиях средней или повышенной температуры гибридизации, или обладающая с данной последовательностью идентичностью на 60 или более процентов.

Последовательности, гибридизирующиеся поддающимся обнаружению образом в последовательности SEQ ID №1, гибридизируют в обычных условиях средней температуры гибридизации, например, при температуре +42°С, в течение 12 ч в 50%-ном растворе формамида, SSCX6, с последующей промывкой, или при менее высокой температуре гибридизации, например, при температуре +42°С, в течение 24 ч в 20%-ном растворе формамида, SSCX6 с последующей промывкой в общеизвестных обычных условиях (Т.Maniatis с соавторами, Molecular cloning. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1969 г.).

Процент идентичности последовательности нуклеотидов может быть определен с использованием, например, программы BLAST (basic local alignment search tool) (S.F.Altschul с соавторами, J. Mol. Biol., 215, 403-410, 1990 г.) на сервере NCBI.

Настоящее изобретение относится также к последовательности ДНК, кодирующей белок, обладающий дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью, амплифицированной методом PCR, с использованием в качестве затравок олигонуклеотидов, кодирующих консенсусную последовательность, обладающую аминокислотной последовательностью SEQ ID №3:

в которой Хаа в положении 7 представляет собой аминокислоту Трп, или Тир, а Хаа в положении 12 представляет собой Гис или Лиз.

Вышеуказанная последовательность SEQ ID №3 соответствует новой консенсусной последовательности, которая была определена в результате сопоставления аминокислотных последовательностей между новой последовательностью SEQ ID №2, выведенной из последовательности нуклеотидов SEQ ID №1, и известных последовательностей либо других стеринредуктаз, обладающих специфическим действием в положении, ином чем положение С-7, либо рецепторов для ламина В, как это подробно описано ниже, в экспериментальной части. На основе информации, полученной из аминокислотной последовательности SEQ ID №3, может быть определена и синтезирована затравка, состоящая не более чем из 45 нуклеотидов, которая в сочетании со второй затравкой олиго-dT (17 нуклеотидов) в качестве противоположной последовательности позволит, благодаря использованию готового набора PCR (например, набора Stratagene), амплифицировать ДНК, кодирующую белок, обладающий дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью.

Настоящее изобретение относится также к белку A. thaliana, обладающему дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью и аминокислотной последовательностью SEQ ID №2 (см. в конце текста), а также аллельные варианты и аналоги данной последовательности.

Под аллелями и аналогами понимают последовательности, модифицированные путем замещения, делеции или прибавления одной или нескольких аминокислот, при условии, что эти продукты сохранят ту же функцию. Модифицированные последовательности могут, например, быть получены с использованием метода направленного мутагенеза, хорошо известного специалистам.

Предметом настоящего изобретения в первую очередь является белок A. thaliana, обладающий дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью, и вышеуказанной аминокислотной последовательностью SEQ ID №2, обозначаемый как дельта-7 Ред.

Настоящее изобретение относится также к белку, обладающему дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью, и аминокислотной последовательностью, идентичной с последовательностью SEQ ID №2 примерно на 60 и более процентов.

Процент идентичности может быть определен с использованием, например, указанной выше программы BLAST.

Настоящее изобретение относится также к белку, обладающему дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью и перекрестной иммунореактивностью с белком A. thaliana вышеуказанного белка дельта-7 Ред.

Белок может быть обнаружен, например, путем иммуноосаждения с помощью антисыворотки, направленной против белка дельта-7 Ред, полученной общеизвестными методами.

Один из аспектов настоящего изобретения касается белка, обладающего дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью, такого как полученный экспрессией в клетке-хозяине, содержащей определенную выше последовательность ДНК и, в первую очередь, белка A. thaliana, такого, как полученный экспрессией в клетке-хозяине, включающей последовательность ДНК, кодирующую вышеуказанную аминокислотную последовательность SEQ ID №2.

Когда белок, являющийся предметом настоящего изобретения, получают экспрессией в клетке-хозяине, это осуществляется с использованием методов генной инженерии и культур клеток, хорошо известных специалистам.

Экспрессия может осуществляться в прокариотических клетках-хозяевах, например в Е. coli, или в эукариотических клетках-хозяевах, например, в клетке млекопитающего, клетке насекомого или в дрожжах, включающих последовательность, кодирующую белок дельта-7 Ред, являющийся предметом настоящего изобретения, которой предшествует соответствующий промотор.

Полученный рекомбинантный белок может быть как гликолизированным, так и негликолизированным.

Настоящее изобретение относится, в частности, к белку, являющемуся предметом изобретения, такому, как полученный экспрессией в дрожжах.

Настоящее изобретение относится также к антителу, направленному против белка, обладающего определенной выше дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью. Указанным антителом может быть поликлональное антитело или моноклональное антитело, полученное методами, хорошо известными специалистам.

Настоящее изобретение относится также к вектору экспрессии, содержащему определенную выше последовательность ДНК, а также клетке-хозяину, трансформированной указанным вектором.

Векторами экспрессии являются хорошо известные векторы, обеспечивающие экспрессию белка под контролем соответствующего промотора. В случае прокариотических клеток промотором может быть, например, промотор lac, промотор trp промотор tac; промотор -лактамазы или промотор PL. В клетках млекопитающих промотором может быть промотор SV40 или промоторы аденовируса. Бакуловирусные векторы могут также использоваться для экспрессии в клетках насекомых. В случае дрожжевых клеток промотором может быть, например, промотор PGK, промотор ADH, промотор СУС1 или промотор GAL10/CYC1.

Клетками-хозяевами могут быть прокариотические клетки или эукариотические клетки. Прокариотическими клетками являются, например, Е. coll. Bacillus или Streptomyces. Эукариотические клетки-хозяева включают дрожжи и филаментные грибки, а также клетки высших организмов, например клетки млекопитающих или клетки насекомых. Клетками млекопитающих могут быть клетки СНО хомяка или клетки Cos обезьяны. Клетками насекомых являются, например, клетки SF9. Клетками дрожжей могут быть, например, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe или Kluyveromyces lactis.

Предметом настоящего изобретения также является метод клонирования нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, обладающий дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью, в микроорганизме, включающий метод скрининга, выбранный среди:

- устойчивости микроорганизма к нистатину или к аналогичному соединению, токсичность которого зависит от присутствия стеринов, содержащих ненасыщенную связь в положении С-7,

гибридизации нуклеиновой кислоты с последовательностью нуклеотидов указанной выше последовательности SEQ ID №1,

- идентификации нуклеиновой кислоты информационным путем среди последовательностей ДНК, изолированных произвольно,

- прямой экспрессии белка с последующим иммунологическим обнаружением с помощью антител, направленных против белка, обладающего указанной выше аминокислотной последовательностью SEQ ID №2.

Под микроорганизмом понимают дрожжи, такие как, например, S. cerevisiae, S. pombe или К. lactis.

Соединения, аналогичные нистатину, содержат, например, амфотерицин В или филипин.

Под гибридизацией понимают гибридизацию при средней или повышенной температуре гибридизации в обычных условиях, хорошо известных специалистам (указанный выше Т.Maniatis с соавторами).

Идентификация информационным путем может осуществляться, например, с использованием указанной выше программы BLAST.

Описание примера указанного выше метода клонирования, при котором метод скрининга использует устойчивость к нистатину в дрожжах, приводится ниже, в экспериментальной части.

Предметом настоящего изобретения также является последовательность нуклеиновой кислоты, ДНК или РНК, такой, как полученная указанным выше методом клонирования. Последовательность нуклеиновой кислоты может быть прокариотического или эукариотического происхождения, в зависимости от материала, на основе которого производилось клонирование, например, человеческого происхождения.

Предметом настоящего изобретения также является клетка-хозяин, трансформированная вектором, содержащим последовательность ДНК, полученной с использованием описанного выше метода клонирования. Клеткой-хозяином может быть прокариотическая клетка или эукариотическая клетка. Примеры клеток-хозяев и векторов приводились выше.

Предметом настоящего изобретения в первую очередь является клетка-хозяин, выбранная среди дрожжей или филаментного грибка, трансформированная вектором, содержащим последовательность ДНК, являющуюся предметом настоящего изобретения, определенную выше, или последовательность ДНК, такую, как полученная описанным выше методом клонирования.

Один из предметов настоящего изобретения относится также к способу получения белка, обладающего дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью, в котором культивируют трансформированную клетку-хозяина, являющуюся предметом настоящего изобретения, и выделяют экспрессированный белок и, в первую очередь, к способу, в котором клеткой-хозяином являются трансформированные дрожжи, в которых кодирующая последовательность ДНК находится под контролем промотора дрожжей.

Один из предметов настоящего изобретения относится также к способу восстановления in vitro стерина, ненасыщенного в положении С-7, в котором инкубируют стерин, подлежащий восстановлению, с белком, полученным описанным выше способом, после чего полученный восстановленный стерин может быть выделен.

Один из предметов настоящего изобретения относится также к способу восстановления in vitro экзогенного стерина, ненасыщенного в положении С-7, в котором инкубируют стерин с трансформированной клеткой-хозяином, являющейся предметом настоящего изобретения, с возможностью выделения полученного восстановленного стерина. Клеткой-хозяином может быть прокариотическая клетка или эукариотическая клетка, в частности дрожжи или филаментный грибок.

Один из предметов настоящего изобретения относится также к способу восстановления in vivo эндогенного ненасыщенного в положении С-7 стерина, в котором культивируется трансформированный штамм-хозяин, являющийся предметом настоящего изобретения, выбранный среди дрожжей или филаментного грибка, с возможностью последующего выделения накопленного восстановленного стерина.

Настоящее изобретение относится, в первую очередь, к определенному выше способу восстановления in vitro или in vivo, в котором полученным восстановленным стерином является субстрат фермента расщепления боковой цепи холестерина (P₄₅₀SCC), и, в первую очередь, относится к способу восстановления in vivo, в котором эндогенным стерином, подлежащим восстановлению, является эргоста 5,7 диен 3-ол, эргоста 5,7,24(28) триен 3-ол или эргоста 5,7,22 триен 3-ол или их смесь.

Предметом настоящего изобретения также является способ получения прегненолона, в котором культивируют трансформированные клетки-хозяева, являющиеся предметом настоящего изобретения, выбранные среди дрожжей или филаментного грибка, с возможностью последующего выделения накопленного восстановленного эндогенного стерина (накопленных восстановленных эндогенных стеринов) в положении С-7, после чего инкубируют восстановленные стерины в присутствии P₄₅₀SCC и, возможно, в присутствии адренодоксинредуктазы (ADR) и адренодоксина (ADX), с возможностью последующего выделения полученного прегненолона.

Предметом настоящего изобретения в первую очередь является способ получения определенного выше прегненолона, в котором клеткой-хозяином являются дрожжи.

Настоящее изобретение относится также к способу получения прегненолона, в котором культивируют дрожжи, трансформированные одним или несколькими векторами, обеспечивающими коэкспрессию белка, обладающего дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью, и P₄₅₀SCC, и, возможно, ADR и ADX, с возможностью последующего выделения свободного или эстерифицированного прегненолона.

Настоящее изобретение относится, в частности, к описанному выше способу, в котором культивируют трансформированные дрожжи, коэкспрессирующие белок, обладающий дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью, P₄₅₀SCC, ADR и ADX, и, главным образом, к вышеописанному способу, в котором белком, обладающим дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью, является белок А. талианы, дельта-7 Ред, и, в первую очередь, к вышеописанному способу, в котором дрожжевым штаммом является штамм EC01/pCD63.

Примеры получения прегненолона в соответствии с настоящим изобретением приводятся ниже, в экспериментальной части.

Трансформированными дрожжами, используемыми для осуществления указанного выше способа получения прегненолона, могут быть, например, дрожжи, котрансформированные вектором экспрессии, являющимся предметом настоящего изобретения, содержащим последовательность ДНК, кодирующую белок, обладающий дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью, и вектором экспрессии цитохрома P ₄₅₀SCC и, возможно, ADX и ADR. Описание известных векторов экспрессии цитохрома P₄₅₀SСС и/или ADX приводится, например, в патентной заявке ЕЭС ЕР 0340878, а также ниже, в экспериментальной части.

Используемыми трансформированными дрожжами могут также быть дрожжи, в которых последовательность ДНК, кодирующая белок, обладающий дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью, интегрирована в частный локус гена, например в локус ADE2, и в которых эргостерином является уже не основной стерин в условиях экспрессии дельта-7 редуктазы. Полученные “интегрированные” дрожжи могут быть затем трансформированы с помощью интегрирующих кассет экспрессии или векторов экспрессии, содержащих последовательность ДНК, кодирующую цитохром P ₄₅₀SCC и, возможно, ADX и ADR.

Пример конструирования дрожжевых штаммов, продуцирующих in vivo прегненолон или его сложный уксусноэтиловый эфир приводится ниже, в экспериментальной части.

Таким образом, предметом настоящего изобретения является также штамм трансформированных дрожжей, коэкспрессирующих белок, обладающий дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью, P₄₅₀SCC, ADR и АОХ, и накапливающий прегненолон, свободный или эстерифицированный, в частности указанный выше дрожжевой штамм, в котором белком, обладающим дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью, является белок A. thaliana, дельта-7 Ред и, в первую очередь, дрожжевой штамм, обозначаемый как EC01/рСD63, детальное конструирование которых приводится ниже, в экспериментальной части.

Настоящее изобретение распространяется также на последовательность ДНК человека, такую как полученная по описанному выше способу клонирования, используемую в качестве зонда для диагностики врожденной нехватки дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазы. Нехватка дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазы включает, например, нехватку 7-дегидрохолестеринредуктазы, вызывающую ненормально низкое содержание холестерина в плазме.

Настоящее изобретение относится также к способу выявления нехватки дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазы, включающему инкубацию пробы, содержащей геномную ДНК человека, с помощью зонда, указанного выше, в условиях стандартной гибридизации и выявление фиксации или отсутствия фиксации зонда на геномной ДНК, отсутствие фиксации или его восстановление, указывающее на врожденную нехватку дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазы.

Способ согласно изобретению может позволить, например, выявление врожденной нехватки дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазы, дородовой или у новорожденного, а также у пациентов, страдающих разнообразными заболеваниями, в частности, у пациентов с клиническим проявлением синдрома RSH/SLO.

Прилагаемые чертежи иллюстрируют некоторые аспекты настоящего изобретения:

На фиг. 1 представлен профиль общих стеринов, экстрагированных из клона F22, устойчивого к нистатину, полученному скринингом банка A. thaliana в дрожжах FY 1679. Анализ производился методом RP-HPLC при 205 нм или 285 нм (фиг. 1а) или методом CPG путем сравнения с нетрансформированными дрожжами FY1679 (фиг 1в).

На фиг. 2 представлена карта рестрикции фрагмента Not I плазмиды pF22 и стратегия определения последовательности оснований в ДНК.

На фиг. 3 представлена последовательность нуклеотидов кДНК дельта-7 Ред (SEQ ID №1) и соответствующая аминокислотная последовательность (SEQ ID №2).

Фиг. 4 иллюстрирует измерение in vitro активности дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазы микросомной фракции FY1679, трансформированной индуцируемым вектором экспрессии “дельта-7/V8”. Анализ выполняется методом CPG и показывает трансформирование субстрата 7-дигидрохолестерина (Тr=16,528) в холестерин (TR=15,887) в присутствии эндогенных стеринов эргоста 5,22 диен 3-ол (TR=16,682); эргостерина (TR=17,249); эргоста 5-ен 3-ола (TR=17,664).

Фиг. 5 иллюстрирует получение прегненолона in vitro путем расщепления эргоста 5-ен 3-ола (фиг. 5а); эргоста 5,24 (28) диен 3-ола (5в) или эргоста 5,22 диен 3-ола (5С), очищенного на основе трансформированных дрожжей, экспрессирующим дельта-7 Ред, с последующей инкубацией в присутствии P₄₅₀SCC, ADX и ADR. Анализ производится методом CPG сравнением с контрольным расщеплением холестерина (сплошная линия).

На фиг. 6 показано конструирование интегративной плазмиды рАD7, позволяющей интегрировать кДHК, кодирующую дельта-7 Ред (стерин Д7 редуктаза), в локус ADE2.

Фиг. 7 представляет анализ методом CPG общих стеринов, экстрагированных омылением щелочью из штамма FY1679 и из интегрированного штамма ELR01, культивированного в присутствии галактозы.

На фиг. 8 схематически показано построение челночного вектора Е. coli-S. cerevisiae V13, содержащего специфический участок Sal I (Sa) в многоучастковом секторе клонирования.

На фиг. 9 представлены этапы построения интегративной плазмиды pCD62-1 и pCD62-2, позволяющие включить интегрирующую кассету экспрессии ADR в межгенную зону leu2 и sрl1.

SCM1 и SCM2: множественные участки клонирования.

На фиг. 10 показана стратегия построения штамма CDR01.

На фиг. 11 показаны этапы построения плазмиды экспрессии рСО63, содержащей обе кассеты экспрессии: ADX и P₄₅₀SCC.

На фиг. 12 представлен анализ методом CPG стеринов, экстрагированных из клеток (клеточный лизат) или из культуральной среды (среда), выделенных из штамма EC01/рСD63 после индукции галактозой в течение 9 ч (фиг. 12а) или 24 ч (фиг. 12б).

На фиг. 13 представлена структура плазмиды pTG 7457.

На фиг. 14 представлена структура плазмиды pTG 7453.

На фиг. 15 представлена структура плазмиды pTG 10014.

На фиг. 16 представлена структура плазмиды pTG 10004.

На фиг. 17 представлена структура плазмиды pTG 10031.

На фиг. 18 представлена структура плазмиды pTG 10033.

Приводимые далее примеры иллюстрируют настоящее изобретение, вместе с тем не ограничивая его.

ПРИМЕР 1: Клонирование кДНК, кодирующей дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктаэу (дельта-7 Ред) А. талианы

А - Скрининг банка экспрессии А. талианы в дрожжах

Исходный банк экспрессии кДНК представляет собой банк, описание которого дано М. Minet с соавторами (Plant J., 2, 417-422, 1992 г.), который был приготовлен на основе мРНК A. thaliana на этапе прорастания на стадии двух листиков, кДНК которого, ограниченные участком Not I, были включены в участок Bst XI кассеты экспрессии челночного вектора Е. coli/S. cerevisiae pFL61. Указанная кассета содержит последовательности промотора и терминатора гена фосфоглицераткиназы (ФГК). Точка начала репликации дрожжевой последовательности 2 и маркер отбора URA3 обеспечивают репликацию вектора в дрожжах. Распространение вектора в Е. coli имеет в своей основе плазмиду pUC19.

Дрожжевой штамм FY 1679 (Мата), который представляет собой изогенный штамм штамма S288C и описание которого дано А. Thierry с соавторами (Yeast, 6, 521-534, 1990 г.), был трансформирован банком кДНК с применением метода, основанного на использовании литийацетата, описанного D. Gietz с соавторами (Nucleic Acids Res., 20, 1425, 1992 г.).

Клетки были нанесены на поверхность синтетической среды SGI, содержащей 7 г/л “дрожжевого азотистого основания” (Difco), 1 г/л бактоказаминокислот (Difco), 20 г/л глюкозы, 20 мг/л триптофана и лишенной урацила. Были получены 10⁵ прототрофных трансформантов по урацилу, которые были сгруппированы и вновь нанесены на поверхность той же синтетической среды, лишенной урацила и содержащей 2 или 5 мкг/мл нистатина из расчета 5×10⁴ клеток на чашку. Таким образом были перебраны 10⁶ клеток для каждой концентрации нистатина. После 3 суток инкубации при температуре +28°С было получено примерно 100 клонов, которые выросли при концентрации нистатина в 2 мкг/мл и составили группы из 5 клонов, стериновый состав которых был подвергнут анализу высокопроизводительным методом обратнофазовой жидкостной хроматографии (обозначаемым в дальнейшем RP-HPLC), в то время как был получен лишь один устойчивый клон, называемый F22, при концентрации нистатина 5 мкг/мл.

Б - Анализ стеринов, накопленных в клоне F22

Общие стерины дрожжей получают с использованием метода омыления щелочью, описанного L. Parks с соавторами (Methods in Enzymol, 111, 333-346, 1985 г.), после чего выполняется анализ с использованием RP-HPLC и/или газовой хроматографии (обозначаемым CPG).

Полученный стериновый остаток растворяют в смеси этанол – тетрагидрофуран - вода (65:10:25 по объему), после чего анализируют методом колоночной хроматографии RP-HPLC на двуокиси кремния С 18 Applied Biosystems (100×2,1 мм), с расходом 1 мл/мин и при температуре +55°С с помощью линейного градиента метанола в воде (от 50% до 100% за 18 мин) и фотометрического анализа при 205 нм и 285 нм в сравнении со стандартными значениями для эргостерина, кампестерина и холестерина.

Стериновый состав также анализируют методом CPG на капиллярной колонке SE-30 Alltech (30 м × 0,32 мм) с использованием гелия в качестве газа-носителя при температуре +280°С и +310°С соответственно для инжектора и для детектора, с исходным повышением температуры с +110°С до +245°С при скорости 45°С/мин, а затем 3°С/мин для достижения температуры +280°С.

Анализ методом RP-HPLC (фиг. 1а) и анализ методом CPG (фиг. 1в) показывают профиль стеринов, накопленных в полученном выше клоне F22, отличающемся почти полным исчезновением эргостерина, основным стерином в нетрансформированном штамме FY 1679 и его заменой двумя основными стеринами в аналогичном количестве, которые не поглощают при 285 нм и, следовательно, уже не обладают двойной сопряженной ненасыщенной связью согласно анализу методом RP-HPLC.

На фиг. 1а кампестерин (Сигма) (24-К-эргоста 5-ен 3-ол) содержит примерно 35% дигидробрассикастерина (24-3-эргоста 5-ен 3-ол).

В - Клонирование кДНК дельта-7 Ред

Плазмиды, происходящие из клона F22, были амплифицированы в Е. coli в соответствии с методом, описанным J.N.Strathern с соавторами (Methods in Enzymol., 194, 319-329, 1991 г.), и расщеплены Not I. Были получены фрагмент примерно из 600 пар оснований (п.о.)