Композиции полиэтиленимин: днк для аэрозольной доставки

Композиции полиэтиленимин: днк для аэрозольной доставки

Реферат

 

Изобретение относится к области молекулярной биологии. Изобретение демонстрирует, что поликатионные композиции не/липид:ДНК являются устойчивыми к индуцируемой распылением деградации и являются гораздо более специфическими и эффективными, чем композиции на основе липидов, в трансфекции тканей дыхательных путей in vivo. Сущность изобретения - композиции полиэтиленимина (PEI), они являются приблизительно в 10 раз более эффективными, чем прежние композиции на основе липидов, при доставке in vivo при помощи струйного распылителя. Технический результат - аэрозольные композиции на основе полиэтиленимина эффективны для генной терапии через дыхательные пути. 2 н. и 22 з.п. ф-лы, 17 ил.

Область изобретения

Данное изобретение относится в общем к области генной терапии и доставке фармацевтических лекарственных средств. Более конкретно, данное изобретение относится к доставке терапевтических генов аэрозолированным полиэтиленимином.

Описание известного уровня техники.

Серьезной проблемой, связанной с аэрозольной доставкой генов в легкие (в форме “голой” ДНК, вирусов или липосом), является заметное уменьшение эффективности, которое сопровождает процесс распыления (жидкости), в сравнении с результатами, получаемыми трансфекцией in vitro (Crook et al., 1996; Schwarz et al., 1996; Eastman et al., 1997a,b, 1998). Кроме того, было показано, что липиды и белки легочного сурфактанта (поверхностно-активного вещества, образующего мономолекулярный слой на альвеолярной поверхности легких) ингибируют опосредованную катионными липосомами трансфекцию (Duncan et al., 1997; Tsan et al., 1997). Эти эффекты, скорее всего, способствуют сообщению о низком уровне переноса генов in vivo аэрозолированными композициями на основе липидов и замедлили развитие систем, которые эффективно доставляют ДНК в легкие.

Недавно появилось сообщение, что композиция, содержащая один конкретный катионный липид (бис-гуанидиний-тренхолестерин; BGTC), была более стабильной во время процесса распыления, чем некоторые ранее испытанные липиды. Несмотря на это усовершенствование в трансфекции in vivo посредством аэрозоля, клинические применения такой терапии могут требовать еще более эффективных векторов доставки. В последние годы сообщалось, что поликатионы являются эффективными в трансфекции клеток in vitro и in vivo. Одним производным с заметной активностью является полиэтиленимин (PEI) (Boussif et al., 1995, 1996). Здесь сообщается, что композиции PEI-ДНК не только устойчивы к индуцируемому распылителем уменьшению эффективности трансфекции, но эта композиция является гораздо более эффективной, чем композиция на основе липидов, в трансфекции легочных тканей in vivo, так что композиции на основе полиэтиленимина являются приблизительно в 10 раз более эффективными, чем ранее оптимизированные композиции на основе липидов, при доставке in vivo при помощи струйного распылителя. Такие композиции на основе полиэтиленимина являются более эффективными в трансфекции легких, но производят относительно низкие уровни трансфекции в носовых ходах мышей. Композиции на основе полиэтиленимина являются, по-видимому, хорошими кандидатами для аэрозольной доставки генов для лечения разнообразных генетических легочных нарушений, в том числе легочных опухолей, и могут быть неинвазивным средством генетической иммунизации.

В известном уровне техники имеется недостаточно нелипидных носителей и композиций для аэрозольной доставки ДНК или терапевтических генов для применения в направленной генной терапии через дыхательные пути. Данное изобретение удовлетворяет эту давно существующую потребность и пожелание в данной области.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Аэрозольная доставка плазмидной ДНК в легкие предоставляет неинвазивное средство лечения разнообразных легочных нарушений. Однако процесс распыления часто приводит к быстрой потере эффективности трансфекции многих композиций вектор: ДНК. Вместе с конструированием аэрозольных систем доставки, пригодных для доставки ДНК, здесь сообщается, что композиции с использованием полиэтиленимина и макромолекул, таких как ДНК, приводят к высокому уровню легочной трансфекции и являются стабильными во время распыления. Композиции РЕI-ДНК обнаруживают также высокую степень специфичности в отношении легких и являются нетоксичными. Оптимальные соотношения и концентрации РЕI-ДНК были определены как для in vitro трансфекции, так и для in vivo трансфекции. Оказалось, что сывороточный фактор усиливает опосредованную PEI трансфекцию, тогда как поверхностно-активные вещества обладают минимальным ингибирующим действием.

Одной целью данного изобретения является представление катионных, нелипидных носителей и композиций для использования в аэрозольной доставке ДНК или терапевтических генов для направленной генной терапии через дыхательные пути.

В одном варианте данного изобретения обеспечен способ направленной генной терапии через дыхательные пути, предусматривающий стадию: доставки водных дисперсий через аэрозоль мелких частиц терапевтического гена, находящегося в комплексе с полиэтиленимином, через дыхательные пути индивидуума, нуждающегося в таком лечении.

В другом варианте данного изобретения представлена композиция поликатион-ДНК для доставки терапевтического гена через аэрозоль мелких частиц, содержащая полиэтиленимин и ДНК, кодирующую терапевтический ген.

Еще в одном варианте данного изобретения представлена композиция полиэтиленимин-ДНК для доставки терапевтического гена через аэрозоль мелких частиц, получаемая по способу, предусматривающему стадии: растворения ДНК, кодирующей терапевтический ген, в подходящем растворе; растворения полиэтиленимина в подходящем растворе; комплексообразования растворенной ДНК и растворенного полиэтиленимина с получением композиции полиэтиленимин-ДНК; и помещения композиции полиэтиленимин-ДНК в устройство для распыления с получением композиции полиэтиленимин-ДНК для доставки терапевтического гена посредством аэрозоля мелких частиц.

Другие и дополнительные аспекты, признаки и преимущества данного изобретения будут очевидными из следующего описания предпочтительных в настоящее время вариантов данного изобретения. Эти варианты даются для цели описания.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Прилагаемые чертежи были включены здесь таким образом, что вышеописываемые признаки, преимущества и цели данного изобретения будут ясными и могут быть поняты в деталях. Эти чертежи образуют часть описания. Однако следует отметить, что прилагаемые чертежи иллюстрируют предпочтительные варианты данного изобретения и не должны рассматриваться как ограничивающие объем данного изобретения.

Фиг.1 показывает клетки А549 с РЕI-ДНК при различных соотношениях N:P в отсутствие сыворотки. Композиции PEI-pCMV и PEI-люциферазы с увеличивающимся соотношением N:P получали, как описано. Во всем эксперименте использовали постоянную концентрацию ДНК, за исключением варианта “0”, который не трансфицировали, но который подвергали воздействию в остальном идентичным изменениям среды. Клетки А549 трансфицировали в течение 6 ч и экстрагировали для определения -галактозидазной или люциферазной активности через 48 часов после инициации трансфекции. Фиг. 1А иллюстрирует уровни -галактозидазы, детектируемые для каждого состояния, а фиг. 1В иллюстрирует уровни люциферазы, определенные для каждого состояния. Фиг. 1С иллюстрирует уровни белка (приблизительное измерение плотности клеток и, следовательно, цитотоксичности), определенные для клеток, трансфицированных PEI-pCMV (из того же самого эксперимента, иллюстрированного на фиг. 1А). N=3 для всех групп. Вертикальные черточки указывают стандартную ошибку.

Фиг. 2 показывает трансфекцию клеток А549 увеличивающимися концентрациями РЕI-ДНК при различных соотношениях N:P в присутствии сыворотки. Готовили композиции PEI-люциферазы увеличивающейся концентрации при указанных соотношениях N:P. Клетки А549 трансфицировали в течение 6 ч и экстрагировали для определения люциферазной активности через 24 ч после инициации трансфекции. N=3 для всех групп.

Фиг. 3 показывает действия сыворотки на эффективность трансфекции PEI-pCMV in vitro. Клетки А549 трансфицировали постоянной концентрацией ДНК (1 мкг на лунку) и PEI (15 нмоль на лунку) при постоянном соотношении N:P 20 с указанными добавлениями в течение 6 ч и экстрагировали для определения -галактозидазы спустя 48 ч после инициации трансфекции. N=3 для всех групп. Вертикальные черточки указывают стандартную ошибку.

Фиг. 4 показывает действия сурфактанта и BAL-жидкости на эффективность трансфекции PEI-pCMV in vitro. Клетки А549 трансфицировали постоянной концентрацией ДНК (1 мкг на лунку) и PEI (15 нмоль на лунку) при постоянном соотношении N:P 20 с указанными добавлениями в течение 6 ч и затем тестировали на -галактозидазу спустя 48 ч после инициации трансфекции. N=3 для всех групп. Вертикальные черточки указывают стандартную ошибку.

Фиг. 5 показывает действие полиэтиленимина и катионного липида на стабильность трансфекции во время распыления. Композиции PEI-pCMV и липид-pCMV распыляли в течение указанных периодов времени перед взятием проб из резервуара для распыления и подвергали количественному мониторингу в тесте трансфекции in vitro (CPRG) с использованием клеток А549 в культуре, как описано. N=3 для всех групп.

Фиг. 6 показывает интраназальную обработку in vitro мышей BALB/c. В этом эксперименте мышам вводили интраназально плазмиду pCMVHi-CAT (содержащую ген CAT), приготовленную либо с полиэтиленимином, либо с катионным липидом BGTC:DOPE (фигура 6А). Равные количества ДНК (24 мкг) вводили всем животным. Животных сначала анестезировали и раствор ДНК-вектор вводили интраназально. Животных умерщвляли спустя 48 ч после инстилляции, легкие удаляли и ткани экстрагировали и анализировали (при помощи ELISA) на экспрессию активности CAT. Идентичный эксперимент проводили с использованием экспрессионной плазмиды люциферазы (pGL3), приготовленной либо с полиэтиленимином, либо с BGTC:DOPE (фиг. 6В). Животных умерщвляли спустя 48 ч после инстилляции, легкие и носовые ткани удаляли и экстрагировали и анализировали на экспрессию люциферазы, как указано. Каждая группа обработки состояла из 6 животных. Вертикальные черточки указывают стандартную ошибку.

Фиг. 7 показывает аэрозольную обработку in vivo мышей BALB/c. В этом эксперименте животных подвергали воздействию либо РЕI-ДНК (ген хлорамфениколацетилтрансферазы), липид-ДНК (той же самой плавмиды, с той же самой концентрацией ДНК) либо не подвергали воздействию аэрозоля (контроль). Подвергание воздействию выполняли помещением животных в герметизированную камеру, соединенную с одним струйным распылителем Puritan Bennett 1600, и обеспечением 1-минутной аэрозольной обработки с последующей 9-минутной задержкой, чтобы позволить животным вдохнуть аэрозоль перед началом последующего цикла. Это повторяли до тех пор, пока не истощалась жидкость распылителя (всего 40 мл) (приблизительно 16 ч). Животных умерщвляли спустя 48 ч после окончания аэрозольной обработки, легкие удаляли и ткани экстрагировали и анализировали (при помощи ELISA) на экспрессию активности CAT. Каждая группа обработки состояла из 6 животных. Вертикальные черточки указывают стандартную ошибку.

Фиг. 8 показывает индукцию антител посредством генетической иммунизации PEI-pCMV-hGH. Группы из 5 мышей подвергали воздействию препаратом PEI-pCMV-hGH с использованием аэрозоля или интраназальной инсталляцией и результаты сравнивали с результатами, полученными с “голой” ДНК, предоставляемой внутримышечной инъекцией. Пробы сыворотки получали при 2-недельных интервалах и присутствие анти-hGH антител измеряли при помощи ELISA. Средние оптические плотности и стандартное отклонение для каждой группы показаны при разведении 1:500. Фоновая OD сывороток из неиммунизированных мышей была 0,1 в данном анализе. Вертикальные черточки представляют стандартное отклонение.

Фиг. 9 показывает сравнение между экспрессией CAT в легком под действием аэрозоля РЕI-ДНК, генерируемого с использованием воздуха или воздуха, содержащего 5% СO₂ . 1 мг САТ-плазмиды использовали для образования комплекса с PEI при соотношении N:P 10:1 и полученный комплекс аэрозолировали в мышей в течение 30 мин. Легкие извлекали после 24 ч и анализ CAT проводили, как описано. Величины представляют собой среднее ± SD (n=6 мышей на группу, р=0,001).

Фиг. 10 показывает, что экспрессия гена в легком аэрозолем РЕI-ДНК является зависимой от дозы. Увеличивающиеся дозы САТ-плаэмиды аэрозолировали с использованием 5% СO₂ в воздухе при фиксированном соотношении N:P 10:1. Имеется увеличение как в общем количестве доставляемой ДНК, так и в концентрации доставленного РЕI-ДНК. Мышей умерщвляли после 24 ч, легкие собирали и белок CAT анализировали. Величины представляют собой среднее ± SD (n=5 мышей на группу).

Фиг. 11 показывает действие соотношений N:P на эффективность переноса РЕI-ДНК в легкие аэрозолем. Использовали различные соотношения РЕI-ДНК (N:P) с фиксированным количеством САТ-плазмиды (2 мг). Комплекс аэрозолировали с использованием 5% CO₂ в воздухе. Мышей умерщвляли после 24 ч, легкие собирали и белок CAT анализировали. Величины представляют собой среднее ± SD (n=5 мышей на группу).

Фиг. 12 показывает действие соотношений N:P на экспрессию гена люциферазы в легком. Фиксированное количество люциферазной плазмиды (2 мг) доставляли при различных соотношениях N:P. Комплексы аэрозолировали с использованием 5% СО₂ в воздухе. Мышей умерщвляли через 24 ч после доставки аэрозоля, легкие собирали и определяли активность люциферазы. Величины представляют собой среднее ± SD (n=5 мышей на группу).

Фиг. 13 показывает временной ход экспрессии трансгена после единственного подвергания воздействию аэрозолем PEI-ДНК. Фиг. 13А: мышей аэрозолировали 2 мг САТ-плазмиды при соотношении N:P 15:1 с использованием 5% СO₂ в воздухе. Мышей умерщвляли через 24 ч, легкие собирали и немедленно замораживали. Анализ CAT выполняли после последней временной точки. Величины представляют собой среднее ± SD (n=5 мышей на временную точку). Фиг. 13В: устойчивость экспрессии CAT с использованием двух различных соотношений N:P. Обе группы мышей (n=5 мышей в каждой временной точке на группу) получали 2 мг САТ-плазмиды при соотношениях N:P 15:1 или 10:1 с использованием 5% СО₂ в воздухе. Временными точками для соотношения 10:1 являются 1, 2, 3 и 6 дней после воздействия аэрозолем, а для 15:1 являются 1, 3, 7 и 10 дней после воздействия аэрозолем.

Фиг. 14 показывает тканевое распределение трансгена после единственного подвергания воздействию РЕI-ДНК. Использовали те же самые группы мышей, что и в фиг. 13 (из группы 10:1). Различные ткани собирали и немедленно замораживали. Белок CAT анализировали после последней временной точки. Величины представляют собой среднее ± SD (n=5 мышей на временную точку).

Фиг. 15 показывает опухолевый индекс для аэрозольной генной терапии меланомы B16-F10. Опухолевые клетки инъецировали в день 0 и обработку начинали в день 1. PEI-р53 и PEI-RB доставляли дважды в неделю аэрозолем в течение 3 недель. В день 24 после инъекции опухолевых клеток мышей умерщвляли и легкие взвешивали. Метастазирование легких оценивали по шкале 1-4 точки. Опухолевый индекс рассчитывали с учетом метастазирования и веса легкого (р<0,01 против контроля как для группы р53, так и для группы Rb).

Фиг. 16 показывает действия аэрозольной комбинационной терапии в отношении аденокарциномы M109. Опухолевые клетки инъецировали в день 0 и обработку начинали в день 1. PEI-р53 доставляли дважды в неделю и лекарственное средство, 9NC, также доставляли дважды в неделю в течение 4 недель. Спустя 4 недели мышей умерщвляли, легкие взвешивали и опухолевые очаги подсчитывали. Опухолевый индекс рассчитывали с учетом веса легкого, числа опухолевых очагов и размера опухолевых очагов (р<0,0001 против контроля как для группы р53, так и для группы p53+9NC).

Фиг. 17 показывает действия композиций PEI и гена р53 на рост опухоли в модели голой мыши легочного метастазирования остеосаркомы человека.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Аэрозольная доставка плазмидной ДНК в легкие предоставляет возможность прямого нанесения препаратов генов на легочные поверхности как средства лечения различных генетических легочных нарушений. Однако процесс струйного распыления быстро разрушает “голую” ДНК, вирусные векторы и многие композиции на основе липидов. Хотя было показано, что комплексообразование ДНК с катионными липидами значимо стабилизирует плазмидную ДНК, потери активности имеют место во время распыления, серьезным образом ограничивая аэрозольную доставку многих подобных комплексов. Вместе с конструированием систем аэрозольной доставки, пригодных для доставки ДНК, были разработаны композиции с использованием полиэтиленимина (PEI, поликатионного полимера) и макромолекул, таких как ДНК, которые приводят к высокому уровню легочной трансфекции (в 10-100 раз более высокому, чем в случае катионных липидов) и проявляют высокую степень стабильности во время процедур распыления. Кроме того, эти композиции на основе полиэтиленимина проявляют высокую степень специфичности в отношении легких в сравнении с ДНК-липосомным комплексом и являются нетоксичными. Оптимальные композиции полиэтиленимина и соотношения и концентрации комплекса полиэтиленимин-ДНК были определены как для in vitro, так и для in vivo трансфекции. Были исследованы свойства композиций на основе полиэтиленимина, которые делают их устойчивыми к распылению и эффективными в качестве векторов доставки ДНК для легочных участков. Термолабильный фактор в сыворотке, по-видимому, усиливает опосредованную полиэтиленимином трансфекцию, тогда как сурфактанты оказывают минимальное ингибирующее действие. Потенциальные применения этого способа включают в себя применение аэрозолированного комплекса полиэтиленимин-ДНК для генетической иммунизации.

Данное изобретение относится к доставке посредством распылителя. Ряд струйных распылителей являются доступными для доставки одной дозы или для доставки низкой дозы водной суспензии. Композиции полиэтиленимин:ДНК данного изобретения могут также доставляться посредством ультразвукового распыления. Кроме того, смеси полиэтиленимина и ДНК могут быть также выдаваться сжатым воздухом или газом в “ингаляторе с измеренными дозами”.

Конкретно, данное изобретение относится к способу нацеливающей терапии, такой как генная терапия через дыхательные пути, предусматривающему стадию доставки водных дисперсий генетической макромолекулы, такой как терапевтический ген, находящейся в комплексе с полиэтиленимином, через аэрозоль мелких частиц через дыхательные пути индивидуума, нуждающегося в таком лечении. Репрезентативные примеры генетических макромолекул, которые могут доставляться в соответствии со способами данного изобретения, включают ДНК, РНК, каталитически активные нуклеиновые кислоты, такие как рибозимы, антисмысловые олигонуклеотиды, а также другие типы модифицированных нуклеиновых кислот. Этот способ данного изобретения может быть использован для лечения индивидуума, имеющего заболевание, такое как муковисцидоз, астма, рак легкого, рак пищевода, рак ободочной кишки, лейкоз, рак молочной железы, саркома или меланома. Кроме того, генетическая макромолекула в комплексе с полиэтиленимином в водных дисперсиях может вводиться в воздушной смеси, содержащей до 10% газообразного диоксида углерода, чтобы потенциировать действия полиэтиленимина, как описано подробно ниже.

Данное изобретение относится также к композиции поликатион-генетическая макромолекула для доставки генетической макромолекулы, такой как терапевтический ген, посредством аэрозоля мелких частиц, содержащей полиэтиленимин и генетическую макромолекулу. Репрезентативные примеры генетических макромолекул, которые могут содержаться в таких композициях данного изобретения, включают в себя ДНК, РНК, каталитически активные нуклеиновые кислоты, такие как рибозимы, антисмысловые олигонуклеотиды, а также другие типы модифицированных нуклеиновых кислот.

Далее, данное изобретение относится к композиции, содержащей комплекс поликатион-генетическая макромолекула, для доставки терапевтического гена через аэрозоль мелких частиц, причем эту композицию получают по способу, предусматривающему стадии: растворения генетической макромолекулы в подходящем растворе; растворения полиэтиленимина в подходящем растворе; комплексообразования растворенной генетической макромолекулы и растворенного полиэтиленимина с образованием композиции полиэтиленимин-генетическая макромолекула; и помещения композиции полиэтиленимин-генетическая макромолекула в устройство для распыления с получением композиции полиэтиленимин-генетическая макромолекула для доставки генетической макромолекулы через аэрозоль мелких частиц. Репрезентативные примеры генетических макромолекул, которые могут содержаться в таких композициях данного изобретения, включают в себя ДНК, РНК, каталитически активные нуклеиновые кислоты, такие как рибозимы, антисмысловые олигонуклеотиды, а также другие типы модифицированных нуклеиновых кислот.

Способы доставки для вышеописываемых способов и композиций включают в себя пероральную ингаляцию и назальную ингаляцию при помощи лицевой маски или трубок для рта и при помощи кислородных боксов для детей, в ином случае используемых для подачи кислорода. Обычно, аэрозоль мелких частиц создают процессом распыления. Предпочтительно, процесс распыления проводят с использованием струйного распылителя. Кроме того, желательно, чтобы терапевтический ген содержал функционально связанные элементы, необходимые для экспрессии, и репрезентативные терапевтические гены включают в себя регуляторный ген трансмембранной проводимости муковисцидоза, ген, кодирующий супрессор опухоли, такой как р53, или ген ретинобластомы, или сконструированные варианты этих генов, гены цитокинов, таких как интерлейкин-2 или интерлейкин-12, и гены, которые могут быть использованы в качестве ДНК-вакцин, которые будут стимулировать прямую иммунную реакцию против опухолей или других инфекционных агентов. Еще одним репрезентативным терапевтическим геном является ген тимидинкиназы HSV. Обычно конечная концентрация терапевтического гена в полиэтиленимине не больше чем около 10 мкг ДНК/50 нмоль азота полиэтиленимина/мл и не меньше чем около 0,1 мкг ДНК/50 нмоль азота полиэтиленимина/мл. Кроме того, к вышеописываемой композиции может быть добавлена сыворотка. Далее, клеткоспецифический лиганд может быть ковалентно конъюгирован с полиэтиленимином, и репрезентативным клеткоспецифическим лигандом является трансферрин.

В соответствии с данным изобретением в нем могут применяться общепринятые способы молекулярной биологии, микробиологии и рекомбинантных ДНК, известные специалистам в данной области. Такие способы исчерпывающим образом описаны в литературе. См., например, Sambrook, Fritsch & Maniatis, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); "DNA Cloning: A Practical Approach", Volumes I ana II (D.N.Glover ed. 1985); "Oligonucleotide Synthesis" (M.J.Gait ed. 1984); "Nucleic Acid Hybridization" [B.D.Hames & S.J.Higgins eds. (1985)]; "Transcription and Translation" [B.D.Hames & S.J.Higgins eds. (1984)]; "Animal Cell Culture" [R.I.Freshney, ed. (1986)]; "Immobilized Cell And Enzymes" [IRL Press, (1986)]; В.Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984). Таким образом, в данном описании следующие термины будут иметь приведенные ниже значения.

“Молекула ДНК” относится к полимерной форме дезоксирибонуклеотидов (аденина, гуанина, тимина или цитозина) либо в ее одноцепочечной форме, либо в двухцепочечной спирали. Этот термин относится только к первичной и вторичной структуре этой молекулы и не ограничивает ее в отношении любых конкретных третичных форм. Так, этот термин включает в себя двухцепочечную ДНК, обнаруживаемую, inter alia, в линейных молекулах ДНК (например, рестрикционных фрагментах), вирусах, плазмидах и хромосомах.

“Генетическая молекула” будет включать ДНК, в том числе терапевтические гены, РНК, каталитически активные нуклеиновые кислоты, такие как рибозимы, антисмысловые олигонуклеотиды, а также другие типы модифицированных нуклеиновых кислот.

“Промоторная последовательность” представляет собой регуляторный участок ДНК, способный связывать РНК-полимеразу в клетке и инициировать транскрипцию кодирующей последовательности в прямом направлении (в 3"-направлении). Для целей определения данного изобретения промоторная последовательность связана с ее 3'-концом сайтом инициации транскрипции и простирается в обратном направлении транскрипции (в 5'-направлении) для включения минимального числа оснований или элементов, необходимых для инициации транскрипции при уровнях, детектируемых выше фона. В этой промоторной последовательности находится сайт инициации транскрипции, а также белоксвязывающие домены (консенсусные последовательности), ответственные за связывание РНК-полимеразы. Эукариотические промоторы часто, но не всегда, содержат “ТАТА”-боксы и “САТ”-боксы. Прокариотические промоторы содержат последовательности Шайна-Далгарно, кроме -10 и -35 консенсусных последовательностей.

“Кодирующая последовательность” ДНК является двухцепочечной ДНК-последовательностью, которая транскрибируется и транслируется в полипептид in vivo при помещении под контроль подходящих регуляторных последовательностей. Границы кодирующей последовательности определяются старт-кодоном на 5' (амино)-конце и стоп-кодоном трансляции на 3' (карбоксил)-конце. Кодирующая последовательность может включать в себя, но не ограничивается ими, прокариотические последовательности, кДНК из эукариотических мРНК, геномные последовательности ДНК эукариот (например, млекопитающих) и даже синтетические последовательности ДНК.

Регуляторными последовательностями транскрипции и трансляции являются регуляторные последовательности ДНК, такие как промоторы, энхансеры, сигналы полиаденилирования, терминаторы и т.п., которые обеспечивают экспрессию кодирующей последовательности в клетке-хозяине. “Цис-элемент” представляет собой нуклеотидную последовательность, называемую также “консенсусной последовательностью” или “мотивом”, которая взаимодействует с другими белками, которые регулируют экспрессию специфического генного локуса в прямом или обратном направлении. В кодирующую последовательность может быть также включена “сигнальная последовательность”. Эта последовательность кодирует сигнальный пептид, находящийся с N-конца данного полипептида, который взаимодействует с клеткой-хозяином и направляет этот полипептид в подходящее клеточное местоположение. Сигнальные последовательности могут быть обнаружены в связи с различными белками, нативными для прокариот и эукариот. Сигнал полиаденилирования и последовательность терминации транскрипции обычно будут локализованы с 3' стороны кодирующей последовательности.

“Регуляторная последовательность экспрессии” является последовательностью ДНК, которая контролирует и регулирует транскрипцию и трансляцию другой последовательности ДНК. Кодирующая последовательность “функционально связана” с транскрипционными и трансляционными регуляторными последовательностями и “находится под контролем” транскрипционных и трансляционных регуляторных последовательностей в клетке, когда РНК-полимераза транскрибирует кодирующую последовательность в мРНК, которая затем транслируется в белок, кодируемый данной кодирующей последовательностью.

“Ген” может включать интактный ген в том виде, в каком этот ген встречается в природе, т.е. кодирующую последовательность, запускаемую промотором и/или дополнительными последовательностями, обнаруживаемыми в природе. Альтернативно, ген может включать в себя кодирующую последовательность и гетерологичный промотор (с гетерологичными транскрипционными и/или трансляционными регуляторными последовательностями или без них) для запуска экспрессии этой кодирующей последовательности. В применении здесь, “терапевтический ген” является обычно геном, либо с его нативным промотором, либо с гетерологичным промотором, запускающим экспрессию, кодирующим белок, который обладает терапевтическим действием, например, геном, кодирующим требующийся фермент, в противном случае отсутствующий в клетке.

Обычно, экспрессирующие векторы, содержащие промоторные последовательности, которые облегчают эффективную транскрипцию и трансляцию встроенного ДНК-фрагмента, используют вместе с хозяином. Обычно экспрессирующий вектор содержит начало репликации, промотор (промоторы), терминатор (терминаторы), а также специфические гены, которые способны обеспечивать фенотипический отбор в трансформированных клетках. Трансформированные хозяева могут быть ферментированы и культивированы согласно способам, известным в данной области, для получения оптимального роста клеток.

“Гетерологичный” участок конструкции ДНК представляет собой идентифицируемый сегмент ДНК в большей ДНК-молекуле, который не обнаруживается в ассоциации с этой большей молекулой в природе. Таким образом, когда данный гетерологичный участок кодирует ген млекопитающего, этот ген будет обычно фланкирован ДНК, которая не фланкирует эту геномную ДНК млекопитающего в геноме организма-источника этой ДНК. В другом примере, кодирующая последовательность является конструкцией, где сама эта кодирующая последовательность не обнаруживается в природе (например, кДНК, где геномная кодирующая последовательность содержит интроны, или синтетические последовательности, имеющие кодоны, иные, чем кодоны нативного гена). Аллельные вариации природно встречающихся мутационных событий не приводят к появлению гетерологичного участок ДНК, определенного здесь.

“Вектор” представляет собой репликон, такой как плазмида, фаг или космида, к которому может быть присоединен другой ДНК-сегмент таким образом, чтобы вызвать репликацию присоединенного сегмента. “Репликон” представляет собой любой генетический элемент (например, плазмиду, хромосому, вирус), который функционирует в виде автономной единицы репликации ДНК in vivo; т.е. способен к репликации под его собственным контролем.

“Началом репликации” называют те последовательности ДНК, которые участвуют в синтезе ДНК.

В применении здесь, термин “аэрозоль” относится к дисперсиям в воздухе твердых или жидких частиц достаточно мелкого размера и в результате с низкими скоростями осаждения, приводящими к относительной стабильности нахождения в воздухе (Knight, V., Viral and Mycoplasmal Infections of Respiratory Tract, 1973, Lea and Febigar, Phila. PA, pp.2).

В применении здесь, термин “распыление” или “процесс распыления” относится к получению мелких аэрозолей из подачи жидкости, т.е. продукта обратного потока продуцирующего направленный распыленный туман устройства (May, 1973).

В применении здесь, термин “струйный распылитель” относится к устройству, в котором сжатый воздух расширяется в форсунку, приводя к снижению статического давления, которое засасывает жидкость из резервуара распылителя через присоединенную трубку. Эта жидкость разбивается воздушной струей в дисперсию капель с широким диапазоном размеров. Большая часть капель (около 99,92%) ударяется о стенку вмещающей их колбы и возвращаются в резервуар. Остальной небольшой процент (около 0,02%) избегает ударов и вытекает из распылителя, несомый сжатым потоком воздуха. Он и составляет мелкокапельный аэрозоль.

В применении здесь, “интраназальная инстилляция” обозначает процесс, при помощи которого жидкость вносят в нос анестезированного животного, которое является животным с искусственным носовым дыханием, так что это животное затем вдыхает эту жидкость в дыхательные пути или легкие.

Особо рассматривается, что фармацевтические композиции (PEI):ДНК данного изобретения могут быть приготовлены для аэрозольной доставки водных дисперсий в дыхательные пути индивидуума или животного. Специалист в данной области может легко определить, без чрезмерного экспериментирования, подходящие дозы аэрозольных композиций. При применении in vivo для нацеленной генной терапии композицию полиэтиленимин:ДНК данного изобретения вводят пациенту или животному в терапевтически эффективных количествах, т.е. количествах, которые эффективно экспрессируют терапевтический ген и тем самым элиминируют или ослабляют заболевание. Доза и схема приема лекарственного средства будет зависеть от характера заболевания, свойств конкретной композиции полиэтиленимин:ДНК, например ее терапевтического индекса, пациента, истории болезни пациента и других факторов. Вводимое количество композиции полиэтиленимин: ДНК будет обычно в диапазоне приблизительно 0,01-1,0 мг/кг веса тела пациента. Схема применения будет продолжаться для оптимизации эффективности по соотношению отрицательных эффектов лечения. См. Remington's Pharmaceutical Science, 17^th Ed. (1990) Mack Publishing Co., Easton, Penn.; и Goodman and Gilman's: The Pharmacological Basis of Therapeutics 8^th Ed (1990) Pergamon Press; которые включены здесь в качестве ссылки. Композиция или готовая форма может содержать минорные количества добавок, таких как вещества, которые усиливают изотоничность и химическую стабильность, например буферы и консерванты. Композицию полиэтиленимин:ДНК обычно готовят при концентрациях около 0,1 мкг ДНК/20 нмоль азота PEI/мл - 10 мкг ДНК/150 нмоль азота PEI/мл.

Следующие примеры приводятся для цели иллюстрации различных вариантов данного изобретения и не предназначены для ограничения каким-либо образом данного изобретения.

ПРИМЕР 1

Готовые формы PEI-ДНК

PEI (25 кД) получали из Aldrich Chemical (Milwaukee, WI). Исходный раствор PEI получали в концентрации 4,3 мг/мл (0,1 М по азоту) в забуференном фосфатом солевом растворе (ЗФР). ДНК содержит 3 нмоль фосфата на мкг и подходящие концентрации получали в ЗФР. Желаемое количество ДНК в ЗФР подвергали комплексообразованию с PEI медленным добавлением ДНК к PEI при интенсивном перемешивании вортексом этого раствора. Затем раствору давали инкубироваться при комнатной температуре в течение 15-20 мин перед использованием. Полученное соотношение реагирующих веществ выражают как азот PEI:фосфор ДНК (N:P).

ПРИМЕР 2

Плазмидная ДНК

Промотор цитомегаловируса (CMV) с репортерным геном -галактозидазы Е. coli (pCMV; CLONTECH, Palo Alto, CA) и ген зеленого флуоресцентного белка медузы (pEGFP; CLONTECH) использовали для оценки экспрессии клеток млекопитающих in vitro. Трансфекцию in vivo оценивали с геном хлорамфениколаце-тилтрансферазы (pCMVHiCAT) (подарок из Genzyme, Inc., Framingham, MA). Люциферазную плазмиду (pGL3, Promega, Madison, WI), модифицированную встраиванием промотора/энхансера CMV и последовательности полиаденилирования гормона роста человека (от Michael A. Barry из Baylor), использовали в качестве репортерного гена для трансфекции как in vitro, так и in vivo. Плазмида, используемая для исследований по иммунизации, pCMV-hGH, экспрессирует гормон роста человека и была также получена от Michael A. Barry. Бактериальные культуры трансформировали указанными выше плазмидами и получали достаточные по массе количества плазмидной ДНК и очищали их с использованием реагентов и колонок для не содержащей эндотоксинов ДНК (Qiagen, Valencia, СА) и затем растворяли в не содержащей эндотоксинов воде до желаемой концентрации.

ПРИМЕР 3

Синтез катионных липидов

Катионные липиды либо синтезировали, либо получали в подарок. DC-холестерин (3-([N-[(N',N'-диметиламино)этан]карбамоил] холестерин) синтезировали согласно способам Gao и Huang (1991). Гуанидинийхолестерин(бис-гуанидиний-трен-холестерин; BGTC) синтезировали согласно способам Vigneron et al. (1996). N-(2-гидроксиэтил)-N,N-диметил-2,3-бис(тетрадецитокси)-1-пропанаминийбромид (DMRIE) получали из Vical (San Diego, СА).

ПРИМЕР 4

Получение комплексов катионный лип