Бициклические аналоги нуклеозидов, нуклеотидов и олигонуклеотидов

Бициклические аналоги нуклеозидов, нуклеотидов и олигонуклеотидов

Реферат

 

Изобретение относится к LNA-модифицированному олигонуклеотиду, включающему по крайней мере один нуклеозидный аналог (LNA) общей формулы I, где X - -О-; В - нуклеотидное основание; Р - место присоединения межнуклеозидного “мостика” или 5’-концевая группа, которую выбирают из гидроксила, монофосфата, дифосфата и трифосфата; R³ или R³* - межнуклеозидный мостик 3’-концевая группа; и R²* и R⁴* - бирадикал, выбираемый из -(CR*R*)_r-O-(CR*R*)_s-, -(CR*R*) _r-S-(CR*R*)_s-, -(CR*R*)_r-N(R*)-(CR*R*) _s-, при этом каждый из R¹*, R² , R³*, R³, R⁵* и R⁵ , не участвующих в образовании бирадикала или межнуклеозидного “мостика”, обозначает водород, галоген, гидрокси, меркапто, амино, азидо; или R² и R³ - бирадикал -(CR*R*) _r-O-(CR*R*)_S-, при этом R²* выбирают из водорода, гидрокси и необязательно замещенной С _1-6алкокси группы, a R¹*, R⁴*, R ⁵ и R⁵* - водород; где каждый из r и s равен 0 - 4, при условии, что сумма r+s равна 1 - 4, а каждый R* представляет собой водород или C_1-6алкил; или его основной соли или кислотно-аддитивной соли. Также предложен соответствующий нуклеозидный аналог (LNA) и материал твердой подложки с иммобиблизованным на нем LNA. LNA-модифицированные олигонуклеотиды обладают повышенным уровнем аффиности и специфичности в отношении комплементарных ДНК и РНК-олигомеров. 3 н. и 59 з.п. ф-лы, 41 ил., 14 табл.

Область изобретения

Изобретение относится к бициклическим и трициклическим нуклеозидным аналогам и синтезу таких нуклеозидных аналогов, которые применимы для получения синтетических олигонуклеотидов, способных образовывать специфичные по контексту дуплексы и триплексы с одноцепочечными и двухцепочечными нуклеиновыми кислотами. Такие комплексы проявляют более высокую термостабильность по сравнению с соответствующими комплексами, образуемыми обычными нуклеиновыми кислотами. Настоящее изобретение также относится к бициклическим и трициклическим нуклеозидным аналогам и синтезу таких нуклеозидов, которые бы могли быть использованы в качестве лекарственных средств и которые могли бы быть встроены в состав олигонуклеотидов с применением зависимых от матриц полимераз нуклеиновых кислот.

Предпосылки изобретения

Синтетические олигонуклеотиды являются соединениями, широко применяемыми в самых различных областях, таких как молекулярная биология и основанная на применении ДНК диагностика и терапия.

Лекарственные средства

В лекарственных средствах, например, успешно применяют олигонуклеотиды с целью блокирования трансляции in vivo конкретных мРНК, тем самым предотвращая синтез белков, которые являются нежелательными или вредными для клетки или организма. Данный подход опосредованного олигонуклеотидами блокирования трансляции известен как “антисмысловой метод”. С точки зрения кинетики процесса гибридизующийся олигонуклеотид, как считается, проявляет свой эффект либо путем индукции физического барьера на пути трансляции, либо путем активации клеточных ферментов, которые направленным образом разрушают мРНК-компонент дуплекса (таких как РНКаза-Н).

Недавно олигорибонуклеотиды и олигодезоксирибонуклеотиды, и их аналоги, которые сочетают РНКазную каталитическую активность со способностью к контекстно специфичному взаимодействию с комплементарной РНК-мишенью, (рибозимы) привлекли большое внимание в качестве антисмысловых зондов. Соответственно, для рибозимов была продемонстрирована эффективность и против вирусных мишеней, и против онкогенов при моделировании на культурах клеток.

Для полного подавления синтеза конкретного белка с помощью “антисмыслового метода” необходимым является блокирование/разрушение всех мРНК, которые кодируют такой белок, а во многих случаях количество таких мРНК очень велико. Обычно мРНК, которые кодируют конкретный белок, транскрибируются с одного или с нескольких генов. Следовательно, путем маркирования такого гена (“антигенный метод”), а не образующегося с него мРНК-продукта, будет возможным либо блокировать выработку кодируемого им белка с более высокой эффективностью, либо достичь существенного снижения количества олигонуклеотидов, необходимого для достижения желаемого эффекта. Для блокирования транскрипции олигонуклеотид должен быть способным гибридизоваться с двухцепочечной ДНК, проявляя специфичность в отношении контекста нуклеотидной последовательности. В 1953 году Уотсон и Крик показали, что дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) состоит из двух цепей (Watson & Crick, 1953, Nature, 171, 737), которые удерживаются вместе в спиральной кон-формации за счет водородных связей, образуемых между расположенными напротив друг друга комплементарными основаниями двух таких цепей. Четыре основания, обычно находящиеся в составе ДНК, - это гуанин (G), аденин (А), тимин (Т) и цитозин (С): при этом основание G комплементарно С, а основание А - комплементарно Т. В РНК основание тимин заменено на основание урацил (U), который, как и Т, комплементарен основанию А. Химические группы оснований, которые участвуют в образовании стандартного дуплекса, представляют “поверхность” модели Уотсона-Крика. В 1959 г. Хугстен (Ноogseen) показал, что пуриновые основания (G и А) в дополнение к участию их поверхности в модели Уотсона-Крика, характеризуются еще и “поверхностью Хугстена”, которая может быть распознана со внешней стороны дуплекса, и использовал их для связывания пиримидиновых олигонуклеотидов по водородным связям, формируя тем самым тройную спираль. Хотя разработка “антигенного подхода” в принципе возможна с точки зрения практического применения в формировании трехцепочечных олигомеров, в настоящее время она ограничена рядом факторов, включая потребность в наличии гомопуриновых мотивов в составе последовательности гена-мишени и необходимость создания являющихся нефизиологичными высокой ионной силы и низкого значения рН с целью стабилизации трехцепочечного комплекса.

Использование олигонуклеотидов, известных как “аптамеры”, также активно исследуется. Этот перспективный для терапевтического применения новый класс олигонуклеотидов выбирают in vitro для специфического связывания на конкретной мишени с высоким уровнем аффинности к ней, таких как, например, рецепторы лигандов. Их характеристики связывания являются, по-видимому, отражением способности олигонуклеотидов формировать трехмерные структуры, поддерживаемые внутримолекулярным взаимодействием нуклеотидов.

Также нуклеозиды и нуклеозидные аналоги, как подтверждалось, эффективны в химиотерапии разнообразных вирусных инфекций и злокачественных опухолей.

Также различные типы двухцепочечных РНК, как было показано, эффективно подавляют рост некоторых типов злокачественных опухолей.

Диагностика

В молекулярной биологии олигонуклеотиды, как правило, используют в различных целях, таких как, например, (1) применение в качестве гибридизационных зондов при поиске, идентификации и количественном анализе нуклеиновых кислот-мишеней, (2) в качестве аффинных зондов в очистке нуклеиновых кислот-мишеней, (3) в качестве затравок для реакций секвенирования и процессах амплификации мишеней, таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР), (4) для клонирования и мутирования нуклеиновых кислот и (5) в качестве строительных блоков для сборки макромолекулярных структур.

В диагностике применяются многие из упоминавшихся выше методик, основывающиеся на использовании олигонуклеотидов, в частности, те, которые поддаются простой автоматизации и обеспечивают воспроизводимые результаты при высокой чувствительности. Предметом данной области анализа является применение основанных на олигонуклеотидах методик, например, для (1) тестирования людей, животных и пищевых продуктов на присутствие патогенных микроорганизмов, (2) тестирования генетической предрасположенности к заболеванию, (3) идентификации наследственных и приобретенных генетических патологий, (4) поиска связи между биологическими объектами и подозреваемыми в следственной практике и (5) проверки присутствия микроорганизмов, участвующих в выработке пищевых продуктов и напитков.

Основные соображения

Для того чтобы их можно было применять для решения широкого круга задач, обозначенных выше, олигонуклеотиды должны удовлетворять значительному числу различных условий. В “антисмысловой терапии”, например, применяемый олигонуклеотид должен быть способен проникать внутрь клетки через ее мембрану, обладать существенной резистентностью к действию вне- и внутриклеточных ферментов и предпочтительно обладать способностью рекрутировать эндогенные ферменты, такие как РНКаза-Н. В диагностике и в разделах молекулярной биологии, основанных на использовании ДНК, важными оказываются иные свойства, такие как, например, способность олигонуклеотидов действовать в качестве эффективных субстратов для широкого круга различных ферментов, ассоциированных с природными нуклеиновыми кислотами, такими как, например, полимеразы, киназы, лигазы и фосфатазы. Однако фундаментальным свойством олигонуклеотидов, которое необходимо при всех их применениях, является способность распознавать и гибридизовать специфично по контексту последовательности с комплементарными одноцепочечными нуклеиновыми кислотами с участием либо водородных связей в соответствии с моделью Уотсона-Крика (А-Т и C-G), либо других вариантов водородных связей, таких как вариант Хугстена. Имеется два важных термина - “аффинность” и “специфичность”, - которые обычно используются для охарактеризования параметров гибридизуемости конкретного олигонуклеотида. Под аффинностью понимается мера силы связывания олигонуклеотида с комплементарной ему последовательностью-мишенью (выражается в величине термостабильности дуплекса - Т_m). Каждая пара оснований в дуплексе вносит вклад в величину термостабильности и таким образом аффинность возрастает при увеличении размера (количества оснований) в составе олигонуклеотида. Под специфичностью понимается мера способности данного олигонуклеотида различать полностью комплементарную и неправильную последовательность-мишень. Другими словами, специфичность - это мера потери аффинности вследствие присутствия неправильных оснований в составе мишени. При постоянном размере олигонуклеотида специфичность возрастает параллельно увеличению количества несоответствий между олигонуклеотидом и его мишенями (т.е. при возрастании доли ошибок). С другой стороны, специфичность снижается тогда, когда размер данного олигонуклеотида увеличивается при постоянном числе несоответствий (т.е. доля ошибок уменьшается). Формулируя по-другому, увеличение аффинности олигонуклеотида происходит “за счет” специфичности, и наоборот.

Это свойство олигонуклеотидов создает ряд проблем при их практическом применении. В случае с очень длинными диагностическими процедурами, например, необходимо, чтобы олигонуклеотид характеризовался и высокой аффинностью с точки зрения обеспечения адекватной чувствительности на протяжении теста, и высоким уровнем специфичности с целью предотвращения получения ложно-позитивных результатов. Также олигонуклеотид, используемый в качестве антисмыслового зонда, должен характеризоваться и высокой аффинностью по отношению к соответствующей мРНК-мишени с целью эффективного подавления ее трансляции, и высоким уровнем специфичности с целью предотвращения непреднамеренного блокирования экспрессии других белков. При ферментативных процессах, таких как, например, амплификация с помощью ПЦР, аффинность олигонуклеотидной затравки должна быть достаточно высока для того, чтобы дуплекс “затравка-мишень” был стабильным в том температурном режиме, в котором активен данный фермент, а специфичность должна быть достаточно высокой для того, чтобы быть уверенным в амплификации именно последовательности-мишени.

Принимая во внимание ограничения, характерные для использования нативных олигонуклеотидов, новые подходы к увеличению уровней специфичности и аффинности должны разрабатываться в связи с применением основывающихся на ДНК методик в терапии, диагностике и молекулярной биологии в целом.

Конформационно ограниченные нуклеозиды

Известно, что олигонуклеотиды претерпевают конформационное превращение в процессе гибридизации с последовательностью-мишенью от относительно свободной спиральной структуры, характерной для одноцепочечного состояния, к упорядоченной структуре, характерной для двухцепочечного состояния.

Ряд конформационно ограниченных олигонуклеотидов, включающих бициклические и трициклические нуклеозидные аналоги (фиг.1А и 1В, на которых В = нуклеотидное основание), были синтезированы, встроены в олигонуклеотид и олигонуклеотидные аналоги и протестированы по их гибридизуемости и другим параметрам.

Бицикло[3.3.0]нуклеозиды (бцДНК) с дополнительными С-3’,С-5’-двухуглеродными “мостиками” (А и В) были синтезированы для всех пяти оснований (G, А, Т, С и U), в то время как (С) был синтезирован только с основаниями Т и А (M.Tarkoy, M.Bolli, B.Schweizer & C.Leumann, 1993, Helv. Chim. Acta, 76, 481; M.Tarkoy & C.Leumann, 1993, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 32, 1432; M.Egli, P.Lubini, M.Dobler & C.Leumann, 1993, J. Amer. Chem. Soc., 115, 5855; M.Tarkoy, M.Bolli & C.Leumann, 1994, Helv. Chim. Acta, 77, 716; M.Bolli & C.Leumann, 1995, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 34, 694; M.Bolli, P.Lubini & C.Leumann, 1995, Helv. Chim. Acta, 78, 2077; J.C.Litten, C.Epple & C.Leumann, 1995, Bioorg. Med. Chem. Lett., 5, 1231; J.C.Litten & C.Leumann, 1996, Helv. Chim. Acta, 79, 129; M.Bolli, J.C.Litten, R.Schultz & C.Leumann, 1996, Chem. Biol., 3, 197; M.Bolli, H.U.Trafelet & C.Leumann, 1996, Nucl. Acids Res., 24, 4660). ДНК-олигонуклеотиды, включающие несколько таких аналогов или полностью состоящие из них, в большинстве случаев способны формировать дуплексы согласно модели Уотсона-Крика с комплементарными им ДНК- и РНК-олигонуклеотидами. Термостабильность образующихся дуплексов, однако, либо существенно уступает (С), либо в некоторой степени ниже (А), либо сопоставима (В) с таковой у естественных вариантов ДНК и РНК. Все бцДНК-олигомеры характеризуются отчетливо более высокой чувствительностью к ионной силе среды гибридизации по сравнению с нативными вариантами. -бц-ДНК (В) характеризуется большей стабильностью в отношении 3’-экзонуклеазной активности фосфодиэстеразы змеиного яда по сравнению с -бцДНК, которая лишь ненамного превосходит по такой стабильности по сравнению с немодифицированными олигонуклеотидами.

Бикарбоцикло[3.1.0]нуклеозиды с дополнительным С-1’, С-6’- или С-6’, С-4’-одноуглеродным “мостиком” в циклопентановом кольце (соответственно, D и Е) были синтезированы для всех пяти оснований (Т, A, G, С и U). Однако только аналоги Т были включены в состав олигомеров. Внесение 1-10 мономеров D в смешанный полипиримидин-ДНК-олигонуклеотид обусловливало существенное снижение аффинности в отношении и ДНК-, и РНК-олигонуклеотидов по сравнению с немодифицированным контрольным олигонуклеотидом. Такое уменьшение было более выраженным в отношении одноцепочечной ДНК по сравнению с одноцепочечной РНК. Внесение одного мономера Е в два разных полипиримидин-ДНК-олигонуклеотида приводило к некоторому увеличению температуры плавления (на 0,8° С и 2,1° С) для дуплексов в отношении оцРНК по сравнению с немодифицированными контрольными дуплексами. Когда в состав 15-мерного олигонуклеотида, характеризующегося исключительно фосфотиоатными связями между нуклеозидами, были включены 10 аналогов Т величина Т_m по отношению к комплементарному РНК-олигонуклеотиду увеличивалась приблизительно на 1,3° С на каждую модификацию по сравнению с такой же немодифицированной фосфотиоатной последовательностью. В отличие от контрольной последовательности, олигонуклеотид, включающий бициклический нуклеозид Е, не обеспечивал расщепление, опосредуемое РНКазой-Н. О параметрах гибридизации олигонуклеотидов, включающих аналоги G, А, С и U по формуле Е, ранее не сообщалось. Кроме того, собственно химия этих аналогов сама по себе не послужила поводом для дальнейших исследований полностью модифицированных олигонуклеотидов (К.-H.Altmann, R.Kesselring, E.Francotte & G.Rihs, 1994, Tetrahedron Lett., 35, 2331; K.-H.Altmann, R.Imwinkelried, R.Kesselring & G.Rihs, 1994, Tetrahedron Lett., 35, 7625; V.E.Marquez, M.A.Siddiqui, A.Ezzitouni, P.Russ, J.Wang, R.W.Wagner & M.D.Matteucci, 1996, J. Med. Chem., 39, 3739; A.Ezzitouni & V.E.Marquez, 1997, J. Chem. Soc., Perkin Trans., 1, 1073).

Бицикло[3.3.0]нуклеозид, включающий дополнительное С-2’, С-3’-диоксалановое кольцо, был синтезирован в виде димера с немодифицированным нуклеозидом, в котором дополнительное кольцо является частью межнуклеозидного “мостика”, заменяющего обычную фосфодиэфирную связь (F). Этот аналог был синтезирован только в вариантах димеров “тимин-тимин” или “тимин-5-метилцитозин”. 15-мерная полипиримидиновая последовательность, включающая семь таких димерных “блоков” и характеризующаяся перемежающимися фосфодиэфирными и рибоацетальными “мостиками”, проявляла существенно сниженную величину Т_m по отношению к комплементарной одноцепочечной РНК по сравнению с контрольной последовательностью, характеризующейся исключительно нативными фосфодиэфирными связями между нуклеозидами (R.J.Jones, S.Swaminathan, J.F.Millagan, S.Wad-wani, B.S.Froehler & M.Matteucci, 1993, J. Amer. Chem. Soc., 115, 9816).

Два димера (G и Н) с дополнительными С-2’, С-3’-диоксановыми кольцами, образующими бицикло[4.3.0]системы в составе межнуклеозидных “мостиков” ацетального типа, были синтезированы в виде дитиминовых димеров и включены в среднюю часть 12-мерных полипиримидиновых олигонуклеотидов. Олигонуклеотиды, включавшие либо G, либо Н, образовывали существенно менее стабильные дуплексы с комплементарными им одноцепочечными РНК и ДНК по сравнению с немодифицированным контрольным олигонуклеотидом (J.Wang & М.D.Matteucci, 1997, Bioorg. Med. Chem. Lett., 7, 229).

Димеры, включающие бицикло[3.1.0]нуклеозиды с С-2’, С-3’-одноуглеродным “мостиком”, являющимся частью межнуклеозидных “мостиков” амидного и сульфонамидного типов (I и J), были синтезированы и включены в состав олигонуклеотидов. Олигонуклеотиды, включающие один или большее число таких аналогов, показали существенное снижение Т_m по сравнению с немодифицированным нативным олигонуклеотидом (C.G.Yannopoulos, W.Q.Zhou, P.Nower, D.Peoch, Y.S.Sanghvi & G.Just, 1997, Synlett., 378).

Тример, имеющий формацетальные связи между нуклеозидами и включающий в середине бицикло[3.3.0]глюкозопроизводный аналог нуклеозида (К), был синтезирован и присоединен к 3’-концу олигонуклеотида. Величина Т_m в отношении комплементарной одноцепочечной РНК уменьшалась на 4° С по сравнению с контрольной последовательностью и на 1,5° С по сравнению с последовательностью, включающей две 2’,5’-формацетальные связи в составе 3’-конца (C.G.Yannopoulos, W.Q.Zhou, P.Nower, D.Peoch, Y.S.Sanghvi & G.Just, 1997, Synlett., 378).

Совсем недавно было сообщено о том, что олигомеры, включающие трициклические аналоги нуклеозидов (L), обеспечивают более высокую стабильность дуплексов по сравнению с нативной ДНК (R.Steffens & C.Leumann [Poster SB-B4], 1997, Chimia, 51, 436).

Три бициклических ([4.3.0] и [3.3.0]) нуклеозида с дополнительными, присоединенными по С-2’, С-3’ шести- (М и N) или пятиатомными (O) кольцами, были синтезированы в виде аналогов тимина. Бициклические нуклеозиды М и N были включены по одному и по два в состав 14-мерных олиго-Т последовательностей. Величина Т_m по отношению к одноцепочечным РНК и ДНК уменьшалась на 6-10° С на одну модификацию по сравнению с немодифицированными контрольными последовательностями. Полностью модифицированные олигонуклеотиды аналога О характеризовались увеличением Т _m примерно на 1,0° С на одну модификацию по отношению к PНК-олигонуклеотиду по сравнению с контрольным ДНК-олигонуклеотидом. Также полностью модифицированная последовательность была существенно более резистентной к гидролизу фосфодиэстеразой змеиного яда по сравнению с немодифицированной контрольной последовательностью. Частично модифицированные олигонуклеотиды, в составе которых находится до четырех аналогов типа О включительно, однако, были менее термостабильны по сравнению с соответствующими немодифицированными олигонуклеотидами. Все олигонуклеотиды, включающие аналог О (как полностью, так и частично модифицированные), характеризовались существенно сниженной термостабильностью в отношении комплементарных ДНК-олигонуклеотидов по сравнению с немодифицированными олигонуклеотидами (P.Nielsen, H.M.Pfundheller & J.Wengel, 1997, Chem. Commun., 826; P.Nielsen, H.M.Pfundheller & J.Wengel, 1996, XII Intern. Roundtable: "Nucleosides, Nucleotides and Their Biological Applications", La Jolla, CA, Sept. 15-19, [Poster PPI-43]).

Попытка получить бициклические аналоги нуклеозида уридина (Q), которые по замыслу должны были включать дополнительное C-2’, С-4’-пятичленное кольцо, начинающееся с 4’-С-гидроксиметилнуклеозида (Р), оказалась неудачной (K.D.Nielsen, 1995, Specialerapport, Odense Univ., Denmark).

До сих пор работа с конформационно ограниченными нуклеозидами, применяемыми для конструирования синтетических олигонуклеотидов для придания им улучшенных гибридизационных характеристик, имела незначительный успех. В большинстве случаев олигонуклеотиды, включающие такие аналоги, образовывают менее стабильные дуплексы с комплементарными нуклеиновыми кислотами по сравнению с немодифицированными олигонуклеотидами. В других случаях, когда наблюдается некоторое улучшение стабильности дуплекса, это относится только либо к ДНК-, либо к РНК-мишени, или же это относится к полностью, но не частично модифицированным олигонуклеотидам, и наоборот. Дальнейший анализ большинства из описанных аналогов осложняется отсутствием данных об аналогах нуклеозидов G, А и С и отсутствием данных, характеризующих специфичность и тип гибридизации. Во многих случаях синтез описанных аналогов нуклеозидов очень сложен, в то время как в других случаях синтез полностью модифицированных олигонуклеотидов несовместим с широко применяемыми стандартными методами фосфорамидитного синтеза.

Сущность изобретения

С точки зрения преодоления ограничений, свойственных известным аналогам нуклеозидов, заявители представляют новые нуклеозидные аналоги (LNA) и олигонуклеотиды, в состав которых входят нуклеозиды LNA. Новые нуклеозидные аналоги LNA представляются для всех обычных оснований, что тем самым обеспечивает полный набор нуклеозидных аналогов, необходимых для включения в олигонуклеотиды. Как будет видно из нижеследующего, нуклеозидные аналоги LNA и LNA-модифицированные олигонуклеотиды открывают возможность для широкого круга вариантов улучшения олигонуклеотидов, применяемых в диагностике и терапии. Более того, нуклеозидные аналоги LNA и модифицированные ими олигонуклеотиды также представляют совершенно новые перспективы в диагностике и терапии, основывающихся на применении нуклеозидов и олигонуклеотидов.

Таким образом, настоящее изобретение касается олигомеров, включающих по крайней мере один нуклеозидный аналог

(здесь и далее обозначаемый как "LNA") основной формулы I:

где Х выбирают из -О-, -S-, -N(R^N* )-, -C(R⁶R^6*)-, -O-C(R⁷R ^7*)-, -С(R⁶R^6*)-О-, -S-C(R⁷ R^7*)-, -C(R⁶R^6*)-S-, -N(R ^N*)-C(R⁷R^7*)-, -C(R⁶R ^6*)-N(R^N*)- и –С(R⁶R^6* )-C(R⁷R^7*)-;

В выбирают из водорода, гидроксила, необязательно замещенной C_1-4-алкоксигруппы, необязательно замещенного C_1-4-алкила, необязательно замещенной C_1-4-ацилоксигруппы, нуклеотидных оснований, ДНК-интеркалирующих групп, фотохимически активных групп, термохимически активных групп, хелатирующих групп, репортерных групп и лигандов;

Р обозначает положение радикала для формирования межнуклеозидного “мостика” со следующим мономером или 5’-концевую группу, при том, что такая связь или 5’-концевая группа необязательно включает заместитель R⁵;

один из заместителей R² , R²*, R³ и R³* является группой Р*, которая образует межнуклеозидный “мостик” с предшествующим мономером или 3’-концевую группу;

одну или две пары негеминальных заместителей (т.е. “несдвоенных” у одного углеродного атома) выбирают из имеющихся заместителей R¹*, R⁴ *, R⁵, R⁵*, R⁶, R⁶ *, R⁷, R⁷*, R^N*, а каждый из заместителей R², R²*, R³ и R ³*, не вовлеченных в Р*, образует бирадикал из 1-8 групп/атомов, выбираемых из –C(R^aR^b)-, -C(R^a)=C(R^a)-, -C(R^a)=N-, -О-, -Si(R^a)₂-, -S-, -SO₂-, -N(R ^a) и >C=Z, где Z выбирают из -О-, -S- и –N(R^a )-, a R^a и R^b независимо друг от друга выбирают из водорода, необязательно замещенного C_1-12 -алкила, необязательно замещенного С_2-12-алкенила, необязательно замещенного С_2-12-алкинила, необязательно замещенного гидроксила, С_1-12-алкоксигруппы, С _2-12-алкенилоксигруппы, карбоксигруппы, С_1-12 -алкоксикарбонила, C_1-12-алкилкарбонила, формила, арила, арилоксикарбонила, арилоксигруппы, арилкарбонила, гетероарила, гетероарилоксикарбонила, гетероарилоксигруппы, гетероарилкарбонила, аминогруппы, моно- и ди-(C_1-6-амино)аминогруппы, карбамоила, моно- и ди-(C_1-6-алкил)-аминокарбонила, амино-C _1-6-алкил-аминокарбонила, моно- и ди-(C_1-6-алкил)-амино-C _1-6 -алкиламинокарбонила, C_1-6-алкилкарбониламиногруппы, карбамидо, C_1-6-алканоилоксигруппы, сульфоновой группы, C_1-6-алкилсульфонилоксигруппы, нитрогруппы, азидогруппы, сульфанила, C_1-6-алкилтиогруппы, галогена, ДНК-интеркалирующих групп, фотохимически активных групп, термохимически активных групп, хелатирующих групп, репортерных групп и лигандов, где арил и гетероарил могут быть необязательно замещенными и где два геминальных заместителя R^a и R^b вместе могут образовывать необязательно замещенный метилен (=CH ₂), и при том, что два геминальных или негеминальных заместителя, выбираемые из R^a, R^b и любого из заместителей R^1*, R², R^2*, R³, R^3*, R^4*, R⁵, R^5* , R⁶ и R^6*, R⁷ и R^7* , которые присутствуют и не вовлечены в Р, Р* или бирадикал (бирадикалы), вместе могут образовывать связанный бирадикал, выбираемый из бирадикалов того же типа, которые были. определены выше;

упомянутая пара (пары) негеминальных заместителей тем самым формируют моно- или бициклическую составляющую вместе с (i) атомами, к которым присоединены негеминальные заместители, и (ii) с любыми промежуточными атомами; и

каждый из заместителей R ^1*, R², R^2*, R³, R ^3*, R^4*, R⁵, R^5*, R ⁶ и R^6*, R⁷ и R^7*, которые присутствуют и не вовлечены в Р, Р* или бирадикал (бирадикалы), независимо выбирают из водорода, необязательно замещенного C _1-12-алкила, необязательно замещенного C_2-12 -алкенила, необязательно замещенного C_2-12-алкинила, необязательно замещенного гидроксила, C_1-12-алкоксигруппы, C_2-12-алкенилоксигруппы, карбоксигруппы, C_1-12 -алкоксикарбонила, C_1-12-алкилкарбонила, формила, арила, арилоксикарбонила, арилоксигруппы, арилкарбонила, гетероарила, гетероарилоксикарбонила, гетероарилоксигруппы, гетероарилкарбонила, аминогруппы, моно- и ди-(C_1-6-амино)аминогруппы, карбамоила, моно- и ди-(C_1-6-алкил)-аминокарбонила, амино-C _1-6-алкиламинокарбонила, моно- и ди-(C_1-6-алкил)-амино-С _1-6-алкиламинокарбонила, С_1-6-алкилкарбониламиногруппы, карбамидо, C_1-6-алканоилоксигруппы, сульфоновой группы, C_1-6-алкилсульфонилоксигруппы, нитрогруппы, азидогруппы, сульфанила, C_1-6-алкилтиогруппы, галогена, ДНК-интеркалирующих групп, фотохимически активных групп, термохимически активных групп, хелатирующих групп, репортерных групп и лигандов, где арил и гетероарил могут быть необязательно замещенными и где два геминальных заместителя вместе могут определять оксогруппу, тиоксогруппу, иминогруппу или необязательно замещенный метилен или вместе могут формировать спиробирадикал, включающий 1-5-углеродную алкиленовую цепь, которая необязательно прерывается и(или) терминируется одним или несколькими гетероатомами/группами, выбираемыми из -О-, -S- и -(NR^N)-, где R^N выбирают из Н и C_1-4-алкила и где два соседних (но геминальных) заместителя могут формировать дополнительную, двойную связь; и R^N*, когда присутствует и не входит к бирадикал, выбирают из Н и C_1-4-алкила;

и их основные соли и кислотно-аддитивные соли при условии что

(i) R² и R³ одновременно не означают бирадикал, выбираемый из -O-CH₂-CH₂- и -O-СН₂-СН ₂-СН₂-, где LNA является бициклическим нуклеозидным аналогом;

(ii) R³ и R⁴ одновременно не означают бирадикал, выбираемый из -СН₂-СН₂ - и -О-СН₂-, где LNA является бициклическим нуклеозидным аналогом;

(iii) R³, R⁵ и R^5* одновременно не означают трирадикал –СН ₂-СН(-)-СН₂-, где LNA является трициклическим нуклеозидным аналогом;

(iv) R^1* и R^6* одновременно не означают бирадикал –СН₂-, где LNA является бициклическим нуклеозидным аналогом; и

(v) R ^4* и R^6* одновременно не означают бирадикал –CH₂-, где LNA является бициклическим нуклеозидным аналогом.

Настоящее изобретение далее представляет нуклеозидные аналоги (здесь и далее LNA) общей формулы II:

где заместитель В выбирают из нуклеотидных оснований, ДНК-интеркалирующих групп, фотохимически активных групп, термохимически активных групп, хелатирующих групп, репортерных групп и лигандов;

Х выбирают из -О-, -S-, -N(R^N*)- и –C(R ⁶R^6*)-;

один из заместителей R² , R²*, R³ и R³* является группой Q^*;

каждую из Q и Q^* независимо выбирают из водорода, азидогруппы, галогена, цианогруппы, нитрогруппы, гидроксила, Prot-O-, Act-O-, меркаптогруппы, Prot-S-, Act-S-, C_1-6-алкилтиогруппы, аминогруппы, Prot-N(RH)-, Act-N(RH)-, моно- или ди-(С_1-6-алкил)аминогруппы, необязательно замещенной С_1-6-алкоксигруппы, необязательно замещенного С_1-6-алкила, необязательно замещенного C_2-6 -алкенила, необязательно замещенной C_2-6-алкенилоксигруппы, необязательно замещенного C_2-6-алкинила, необязательно замещенной C_2-6-алкинилоксигруппы, монофосфата, дифосфата, трифосфата, ДНК-интеркалирующих групп, фотохимически активных групп, термохимически активных групп, хелатирующих групп, репортерных групп, лигандов, карбоксила, сульфоновой группы, гидроксиметила, Prot-O-CH₂-, Act-O-СН₂-, аминометила, Prot-N(R ^H)-CH₂-, Act-N(R^H)-CH₂ -, карбоксиметила, сульфонометила, где “Prot” обозначает защитную группу для -ОН, -SH и –NH(R^H), ответственно, a “Act” обозначает активационную группу для -ОН, -SH и –NH(R^H ), ответственно, a R^H выбирают из Н и C_1-6 -алкила;

(i) R^2* и R^4* вместе обозначают бирадикал, выбранный из -О-, -(CR^*R^*) _R+S+1-, -(CR^*R^*)_R-O-(CR ^*R^*)_S-, (CR^*R ^*)_R-S-(CR^*R^*)_S -, -(CR^*R^*)_R-N(R^* )-(CR^*R^*)_S-, -O-(CR^* R^*)_R+S-O-, -S-O(CR^*R^* )_R+S-O-, -O-(CR^*R^*)_R+S -S-, -N(R^*)-(CR*R*)_R+S-O-, -O-(CR*R*) _R+S-N(R*)-, -S-(CR*R*)_R+S-S-, -N(R*)-(CR*R*) _R+S-N(R*)-, -N(R*)-(CR*R*)_R+S-S- и -S-(CR*R*) _R+S-N(R*)-;

(ii) R² и R³ одновременно означают бирадикал, выбираемый из -О-, -(CR*R*) _r+s-, -(CR*R*)_r-O-(CR*R*)_s-, (CR*R*)_r-S-(CR*R*)_s- и -(CR*R*)_r -N(R*)-(CR*R*)_s-;

(iii) R^2* и R ³ вместе образуют бирадикал, выбираемый из -О-, -(CR*R*) _r+s-, -(CR*R*)_r-O-(CR*R*)_s-, -(CR*R*)_r-S-(CR*R*)_s- и -(CR*R*)_r -N(R*)-(CR*R*)_s-;

(iv) R³ и R ⁴* одновременно означают бирадикал, выбираемый из -(CR*R*) _r-O-(CR*R*)_s-, -(CR*R*)_r-S-(CR*R*) _s- и -(CR*R*)_r-N(R*)-(CR*R*)_s -;

(v) R³ и R⁵ одновременно означают бирадикал, выбираемый из -(CR*R*)_r-O-(CR*R*)_s -, -(CR*R*)_r-S-(CR*R*)_s- и -(CR*R*) _r-N(R*)-(CR*R*)_s-; или

(vi) R ^1* и R^4* одновременно означают бирадикал, выбираемый из -(CR*R*)_r-O-(CR*R*)_s-, -(CR*R*) _r-S-(CR*R*)_s- и -(CR*R*)_r-N(R*)-(CR*R*) _s-;

(vii) R¹* и R²* одновременно означают бирадикал, выбираемый из (CR*R*)_r-O-(CR*R*) _s-, (CR*R*)_r-S-(CR*R*)_s- и -(CR*R*) _r-N(R*)-(CR*R*)_s-;

при том, что каждый R* независимо друг от друга выбирают из водорода, галогена, азидогруппы, цианогруппы, нитрогруппы, гидроксила, меркаптогруппы, аминогруппы, моно- или ди-(С_1-6-алкил) аминогруппы, произвольно замещенной C_1-6-алкоксигруппы, произвольно замещенного C_1-6-алкила, ДНК-интеркалирующих групп, фотохимически активных групп, термохимически активных групп, хелатирующих групп, репортерных групп и лигандов, а (или) два соседних (негеминальных) R* могут вместе образовывать двойную связь, а в каждом случае r и s составляют 0-3 при условии, что сумма r+s равна 1-4;

каждый из заместителей R¹*, R², R ²*, R³, R⁴*, R⁵ и R ⁵*, которые не вовлечены в Q, Q* или бирадикал, независимо выбирают из водорода, необязательно замещенного C_1-12 -алкила, необязательно замещенного С_2-12-алкенила, необязательно замещенного С_2-12-алкинила, необязательно замещенного гидроксила, С_1-12-алкоксигруппы, С _2-12-алкенилоксигруппы, карбоксигруппы, C_1-12 -алкоксикарбонила, C_1-12-алкилкарбонила, формила, арила, арилоксикарбонила, арилоксигруппы, арилкарбонила, гетероарила, гетероарилоксикарбонила, гетероарилоксигруппы, гетероарилкарбонила, аминогруппы, моно- и ди-(C_1-6-амино) аминогруппы, карбамоила, моно- и ди-(C_1-6-алкил)-аминокарбонила, амино-С_1-6-алкиламинокарбонила, моно- и ди(C_1-6 -алкил)-амино-C_1-6-алкиламинокарбонила, C _1-6-алкилкарбониламиногруппы, карбамидо, C_1-6 -алканоилоксигруппы, сульфоновой группы, C_1-6-алкилсульфонилоксигруппы, нитрогруппы, азидогруппы, сульфанила, С_1-6-алкилтиогруппы, галогена, ДНК-интеркалирующих групп, фотохимически активных групп, термохимически активных групп, хелатирующих групп, репортерных групп и лигандов, где арил и гетероарил могут быть необязательно замещенными и где два геминальных заместителя вместе могут определять оксогруппу, тиоксогруппу, иминогруппу или необязательно замещенный метилен или вместе могут формировать спиробирадикал, включающий 1-5-углеродную алкиленовую цепь, которая необязательно прерывается и(или) терминируется одним или несколькими гетероатомами/группами, выбираемыми из -О-, -S- и -(NR^N)-, где R^N выбирают из водорода и C_1-4-алкила и где два соседних (но геминальных) заместителя могут формировать дополнительную, двойную связь; и R^N*, когда присутствует и не входит к бирадикал, выбирают из водорода и C_1-4-алкила; и их основные соли и кислотно-аддитивные соли при первом условии, что

(i) R² и R³ вместе не образуют бирадикал, выбираемый из -О-СН₂-СН₂- и -О-СН₂-СН₂-СН₂-, где LNA является бициклическим нуклеозидным аналогом;

(ii) R³ и R⁵ вместе не образуют бирадикал, выбираемый из -СН₂-СН₂-, -O-СН₂- и -O-Si( ⁱPr)₂-O-Si(ⁱPr)₂-O-;

и при втором условии, что любая химическая группа (включая любые нуклеотидные основания), которая является реактивной в условиях, имеющих место в ходе синтеза олигонуклеотидов, необязательно должна быть защищена по своей функциональной составляющей.

Настоящее изобретение также представляет применение нуклеозидных аналогов (LNA) в конструировании олигомеров и применение таких олигомеров, равно как и нуклеозидных аналогов (LNA) в диагностике, молекулярно-биологических исследованиях и в терапии.

Краткое описание чертежей

На фигурах 1А и 1В показаны известные конформационно ограниченные нуклеотиды.

На фигуре 2 показаны нуклеотидные и нуклеозидные аналоги по настоящему изобретению.

На фигура 3 показан способ использования LNA-модифицированных олигонуклеотидов в специфичном по последовательности отборе ПЦР-ампликонов.

На фигурах 4А и 4В показано, что LNA-модифицированные олигонуклеотиды способны распознавать родственный им ПЦР-ампликон за счет инвазии цепи.

На фигуре 5 показано, что LNA-модифицированные олигонуклеотиды, иммобилизованные на твердую поверхность, активно функционируют в специфичном по последовательности отборе ПЦР-ампликона.

На фигуре 6 показано, что LNA-модифицированные олигонуклеотиды могу