Ген раффинозосинтазы, зонд или затравка, способ выявления и способ амплификации нуклеиновой кислоты, содержащей ген раффинозосинтазы, способ получения гена раффинозосинтазы, экспрессирующий вектор, раффинозосинтаза

Ген раффинозосинтазы, зонд или затравка, способ выявления и способ амплификации нуклеиновой кислоты, содержащей ген раффинозосинтазы, способ получения гена раффинозосинтазы, экспрессирующий вектор, раффинозосинтаза

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии. Раффинозосинтазу получают культивированием клетки-хозяина, трансформированной вектором, содержащим ген раффинозосинтазы. Полученную раффинозосинтазу выделяют из культуральной жидкости. Частичную последовательность гена раффинозосинтазы используют в качестве зонда или затравки. Данное изобретение позволяет варьировать уровень экспрессии и активности у растений. 9 н. и 15 з.п. ф-лы, 1 табл.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Представляемое изобретение касается генов, кодирующих раффинозосинтазу, и их использования.

ОПИСАНИЕ ИЗВЕСТНОГО УРОВНЯ ТЕХНИКИ

Олигосахариды семейства раффиноз являются производными сахарозы, которые представлены общей формулой o--D-галактопиранозил-(16) _n-o--D-глюкопиранозил-(12)--D-фруктофуранозил. Их называют "раффинозами", когда n=1, "стахиозами" при n=2, "вербаскозами" при n=3, "айюгозами" при n=4.

Было установлено, что олигосахариды семейства раффиноз обладают позитивным эффектом в отношении качества кишечной бактериофлоры, если они присутствуют в пище в соответствующем количестве. С учетом этого олигосахариды семейства раффиноз уже применяются в качестве функционального пищевого материала для добавок в некоторых видах пищевых продуктов, а также используются в специальных диетических и лечебных продуктах. С другой стороны, олигосахариды семейства раффиноз не перевариваются и не всасываются у млекопитающих, в частности у человека, но ассимилируются и разрушаются энтеробактериями с образованием газов, что приводит к метеоризму и заболеваниям, связанным с нарушением усвоения пищи. Таким образом, желательным представляется точное регулирование количества олигосахаридов семейства раффиноз в пищевых продуктах и кормах.

Олигосахариды семейства раффиноз синтезируются в соответствующей биосинтетической системе, у многих видов растений начинающейся с сахарозы. В норме эта биосинтетическая система вовлечена в реакцию последовательного прибавления галактозильных групп от галактинола с помощью связи -(16) к гидроксильной группе, присоединенной к атому углерода в 6-м положении остатка D-глюкозы в молекуле сахарозы. Раффинозосинтаза - фермент, участвующий в реакции образования раффинозы за счет обеспечения способности D-галактозильной группы, производной от галактинола, образовывать связь типа -(16) с гидроксильной группой, присоединенной к атому углерода в 6-м положении остатка D-глюкозы в молекуле сахарозы на первом этапе данной биосинтетической системы. Подтверждается, что этот фермент обеспечивает этап, лимитирующий скорость обозначенной системы синтеза, т.е. данный фермент весьма важен в контроле биосинтеза олигосахаридов семейства раффиноз.

Таким образом, способ контроля уровня экспрессии или активности раффинозосинтазы у растений с использованием гена раффинозосинтазы является эффективным способом контроля системы биосинтеза олигосахаридов семейства раффиноз у растений с целью увеличения или уменьшения выработки раффиноз у растений. Соответственно, выделение гена раффинозосинтазы, который может быть использован в таком способе, становится желательным.

Основным объектом данного изобретения является выделение новых генов раффинозосинтаз из растений.

Этот и другие объекты и преимущества данного изобретения станут понятны специалистам в данной области в процессе ознакомления с описанием.

С учетом вышеизложенных обстоятельств авторы интенсивно исследовали и добились успеха в выделении новых генов, кодирующих фермент раффинозосинтазу из различных видов растений. Таким образом, данное изобретение является завершенным.

Таким образом, настоящее изобретение представляет

1. Ген раффинозосинтазы, включающий нуклеотидную последовательность, гибридизующуюся с нуклеотидной последовательностью, отобранной из группы, состоящей из:

(a) нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1,

(b) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:2,

(c) нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3,

(d) нуклеотидной последовательности, представленной 236-2584 нуклеотидами в нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:4,

(e) нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5,

(f) нуклеотидной последовательности, представленной 134-2467 нуклеотидами в нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:6,

(g) нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7,

(h) нуклеотидной последовательности, представленной 1-1719 нуклеотидами в нуклеотидной последовательности SEQ ID NO 8, в жестких условиях и кодирования белка, способного связывать галактозильную группу по связи -(16) с гидроксильной группой, присоединенной к атому углерода в 6-м положении остатка D-глюкозы в молекуле сахарозы с образованием раффинозы.

2. Ген раффинозосинтазы, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1.

3. Ген раффинозосинтазы, включающий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:2.

4. Ген раффинозосинтазы, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3.

5. Ген раффинозосинтазы, включающий нуклеотидную последовательность, представленной 236-2584 нуклеотидами в нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:4.

6. Ген раффинозосинтазы, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5.

7. Ген раффинозосинтазы, включающий нуклеотидную последовательность, представленной 134-2467 нуклеотидами в нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:6.

8. Ген раффинозосинтазы, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7.

9. Ген раффинозосинтазы, включающий нуклеотидную последовательность, представленную 1-1719 нуклеотидами в нуклеотидной последовательности SEQ ID NO 8.

10. Ген раффинозосинтазы, включающий нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO:6 или SEQ ID NO:8.

11. Нуклеиновая кислота, включающая частичную нуклеотидную последовательность гена раффинозосинтазы по любому из предыдущих пунктов 1-10.

12. Способ выявления нуклеиновой кислоты, содержащий ген раффинозосинтазы, который включает выявление названной нуклеиновой кислоты, с помощью гибридизации с использованием меченой нуклеиновой кислоты по п.11 в качестве зонда.

13. Способ амплификации нуклеиновой кислоты, включающей ген раффинозосинтазы, который включает амплификацию названной нуклеиновой кислоты с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием нуклеиновый кислоты по п.11 в качестве праймера.

14. Способ получения гена раффинозосинтазы, который включает следующие этапы:

- выявление нуклеиновой кислоты, содержащей названный ген раффинозосинтазы, с помощью гибридизации с использованием меченой нуклеиновой кислоты по п.11 в качестве зонда и

- выделение идентифицированной нуклеиновой кислоты.

15. Способ получения гена раффинозосинтазы, включающий следующие этапы:

- амплификация нуклеиновой кислоты, содержащей названный ген раффинозосинтазы с помощью ПЦР с использованием нуклеиновой кислоты по п.11 в качестве затравки, и

- выделение амплифицированной нуклеиновой кислоты.

16. Нуклеиновая кислота, включающая ген раффинозосинтазы по любому из п.п.1-10, или нуклеиновая кислота по п.10, которая присоединена к нуклеиновой кислоте, проявляющей промоторную активность в клетке-хозяине.

17. Вектор, включающий ген раффинозосинтазы по любому из п.п.1-10.

18. Трансформант, в котором ген раффинозосинтазы по любому из п.п.1-10 введен в клетку-хозяина.

19. Трансформант, в котором нуклеиновая кислота по п.16 введена в клетку-хозяина.

20. Трансформант, в котором вектор по п.17 введен в клетку-хозяина.

21. Трансформант по любому из предыдущих п.п.18-20, в котором хозяином является микроорганизм.

22. Трансформант по любому из предыдущих п.п.18-20, в котором хозяином является растение.

23. Способ получения раффинозосинтазы, включающий следующие этапы:

- культивирование и выращивание трансформанта по любому из предыдущих п.п.18-22 с целью получения раффинозосинтазы, и

- сбор раффинозосинтазы.

24. Раффинозосинтаза, включающая аминокислотную последовательность SEQ ID NO 1.

25. Раффинозосинтаза, включающая аминокислотную последовательность SEQ ID NO 3.

26. Раффинозосинтаза, включающая аминокислотную последовательность SEQ ID NO 5.

27. Раффинозосинтаза, включающая аминокислотную последовательность SEQ ID NO 7.

Термин "нуклеиновая кислота", используемый в тексте, обозначает олигомерное соединение или высокомолекулярное соединение, которое обычно называют "ДНК" или "РНК".

Генно-инженерные методики, описываемые ниже, могут быть применены, например, в соответствии со способами, описанными в "Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition" (1989), Cold Spring Harbor Press, ISBN 0-87969-309-6; "Current Protocols in Molecular Biology" (1987), J.Wiley & Sons Inc., ISBN 0-471-50338-X; "Current Protocols in Protein Science" (1995), J.Wiley & Sons Inc., ISBN 0-471-11184-8.

Гены согласно данному изобретению могут быть выделены из сои, растений, относящихся к семействам маревых, Chenopodiaceae (например, свеклы и др.), и крестоцветных, Cruciferae (такие как сарептская горчица, брюква и др.). Специфические примеры генов в настоящем изобретении включают те гены, которые имеют нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1; нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:2; нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3; нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO:4 или 236-2584 нуклеотидами в нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:4; нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5; нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO:6 или 134-2467 нуклеотидами в нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:6; нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7; нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID No.8 или 1-1719 нуклеотидами в нуклеотидной последовательности SEQ ID No.8.

Гены данного изобретения могут быть получены, например, следующим способом.

Соответственно, гены, данного изобретения, производные от сои, могут быть получены, например, следующим способом.

Например, ген может быть получен с помощью гибридизации с использованием нуклеиновой кислоты, имеющей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO 2, или части нуклеотидной последовательности, используемой в качестве зонда для идентификации фрагмента нуклеиновой кислоты, который гибридизует с зондом, в ДНК, выделенным из растений сои, с последующим выделением идентифицированной нуклеиновой кислоты.

В этом способе сначала готовится нуклеиновая кислота, рассматриваемая в качестве зонда. Таковой, например, может быть нуклеиновая кислота, включающая олигонуклеотид, синтезированный химическим путем с помощью традиционных методов на основе нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:2. В качестве специфического примера представлена нуклеиновая кислота с 800-899-й нуклеотидами в нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:2.

Напротив, представленный в изобретении ген, производный сои, может быть получен следующим способом.

Например, ткани сои (Glycine max) замораживают в жидком азоте и измельчают физическим воздействием в ступке или аналогичном устройстве с целью получения измельченного тканевого порошка. РНК экстрагируют из этого порошка с помощью стандартного метода: для этой цели может быть использован промышленно и коммерчески доступный набор реактивов для РНК-экстракции. РНК выделяют из полученного таким методом экстракта с помощью осаждения этиловым спиртом. Фракционирование РНК с полиадениловыми "хвостами" осуществляют из выделенной таким способом РНК стандартным способом. Для этой цели может быть использована промышленно доступная олиго-дТ колонка. кДНК синтезируют на матрице полиаденилированной хвостовой РНК с помощью стандартного метода. Синтез может быть осуществлен с использованием стандартного набора реактивов для синтеза кДНК. ДНК амплифицируют с помощью ПЦР с использованием ранее выделенной кДНК в качестве матрицы и затравок, определенных и синтезированных по параметрам нуклеотидной последовательности SEQ ID NO 2. Более конкретно, затравками, например, могут быть праймеры 11 и 12, приведенные ниже в перечне 1. По окончании ПЦР с данными затравками и матрицей кДНК, полученной из сои, могут быть получены гены сои по данному изобретению (т.е. "ген раффинозосинтазы с нуклеотидной последовательностью, кодирующей аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO 1" и "ген раффинозосинтазы с нуклеотидной последовательностью согласно SEQ ID NO 2").

Амплифицированная ДНК может быть клонирована согласно стандартному методу, описанному, например, в "Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition" (1989), Cold Spring Harbor Lab. Press; или "Current Protocols in Molecular Biology" (1987), J.Wiley & Sons Inc., ISBN 0-471-50338-Х. С другой стороны, клонирование может быть проведено, например, с использованием стандартного набора реактивов для клонирования, такого как ТА набор для клонирования (Invitrogen) и стандартного плаэмидного вектора типа pBluescript II (Stratagene). Нуклеотидная последовательность ДНК-клона может быть определена способом дидезокситерминирования, например, по способу Сэйнджера (F.Sanger, S.Nicklen, A.R.Coulson, 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467). В частности, предпочтительным является использование стандартного набора ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction, производимого фирмой Perkin-Elmer.

Гены согласно настоящему изобретению, производные от растений семейства Chenopodiaceae, таких как свекла, могут быть получены следующим способом.

Например, ткани растения семейства Chenopodiaceae, такого как обыкновенная свекла (Beta vulgaris), замораживают в жидком азоте и физически измельчают в ступке или аналогичном устройстве с получением тканевого порошка. Из этого тканевого порошка РНК экстрагируют стандартным способом. Может быть использован стандартный набор для РНК-экстракции. РНК восстанавливают из полученного РНК-экстракта с помощью осаждения этанолом. РНК с полиадениловыми "хвостами" фракционируют из восстановленной РНК с помощью стандартного способа. Стандартная олиго-дТ колонка может быть применена для такого фракционирования. кДНК синтезируют из полиаденилированной хвостовой РНК с помощью стандартного способа. Синтез может быть проведен с использованием стандартного набора для синтеза кДНК. ДНК амплифицируют с помощью ПЦР с использованием полученной кДНК в качестве матрицы и затравок, определенных и химически синтезированных по параметрам нуклеотидной последовательности SEQ ID NO 4. Более детально, что касается затравок, такие затравки 21 и 22 приведены ниже в перечне 2. По завершении ПЦР с использованием этих затравок кДНК-матрицы, выделенной из свеклы, гены свеклы согласно настоящему изобретению (т.е. "ген раффинозосинтазы с нуклеотидной последовательностью, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID NO 3" и "ген раффинозосинтазы с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO 4") могут быть выделены. В частности ПЦР-затравки могут быть также определены и синтезированы по нуклеотидной последовательности seq ID no 4. Например, с целью амплифицирования "гена раффинозосинтазы, включающего нуклеотидную последовательность, представленную 236-2584 нуклеотидами в нуклеотидной последовательности SEQ ID NO 4" олигонуклеотиды с нуклеотидными последовательностями, представленными затравками 23 и 24 в перечне 2, лучше всего синтезировать и использовать в качестве затравок.

Амплифицированная ДНК может быть клонирована согласно стандартному методу, описанному, например, в "Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition" (1989), Cold Spring Harbor Lab. Press или "Current Protocols in Molecular Biology" (1987), J.Wiley & Sons Inc., ISBN 0-471-50338-Х. С другой стороны, клонирование может быть проведено, например, с использованием стандартного набора реактивов для клонирования, такого как ТА Набора для клонирования (Invitrogen) и стандартного плазмидного вектора типа pBluescript II (Stratagene). Нуклеотидная последовательность ДНК-клона может быть определена способом дидезокситерминирования, описанного F.Sanger, S.Nicklen, A.R.Coulson, 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467. Например, предпочтительным является использование стандартного набора, такого как ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (Perkin-Elmer).

Гены данного изобретения, выделенные из растений семейства крестоцветных, Cruciferae, таких как сарептская горчица (Brassica juncea) и брюква (Brassica napus), могут быть получены с помощью следующего способа.

Например, ткани растений семейства Cruciferae, таких как горчица или брюква, замораживают в жидком азоте и физически измельчают в ступке или аналогичном устройстве с получением тканевого порошка. Из этого тканевого порошка РНК экстрагируют стандартным способом. Может быть использован стандартный набор для РНК-экстракции. РНК восстанавливают из полученного РНК-экстракта с помощью осаждения этанолом. РНК с полиадениловыми "хвостами" фракционируют из восстановленной РНК с помощью стандартного метода. Стандартная олиго-дТ колонка может быть применена для такого фракционирования. кДНК синтезируют из полиаденилированной хвостовой РНК, полученной с помощью стандартного метода. Синтез может быть проведен с использованием стандартного набора для синтеза кДНК. ДНК амплифицируют с помощью ПЦР с использованием полученной выше кДНК в качестве матрицы и затравок, определенных и химически синтезированных по параметрам нуклеотидной последовательности SEQ ID NO 6. Например, при проведении ПЦР с использованием в качестве матрицы кДНК, полученной из горчицы (Brassica juncea), и затравок 33 и 34, приведенных ниже в перечне 3, гены растений семейства Cruciferae согласно настоящему изобретению (т.е. "ген раффинозосинтазы с нуклеотидной последовательностью, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID NO 5" и "ген раффинозосинтазы с нуклеотидной последовательностью, представленной 1-2654 нуклеотидами в нуклеотидной последовательности SEQ ID NO 6") могут быть получены. В частности ПЦР-затравки могут быть определены и синтезированы на основе нуклеотидной последовательности SEQ ID NO 6.

Например, с целью амплификации ДНК, кодирующей участок открытой рамки считываний "гена раффинозосинтазы с нуклеотидной последовательностью, кодирующей белок с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 5" и "ген раффинозосинтазы с нуклеотидной последовательностью, представленной 134-2467 нуклеотидами SEQ ID No.6", олигонуклеотиды, с нуклеотидными последовательностями, представленными затравками 35 и 36 в перечне 3, предпочтительно синтезировать и использовать в качестве праймеров.

Амплифицированная ДНК может быть клонирована согласно стандартному методу, описанному, например, в "Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition" (1989), Cold Spring Harbor Lab. Press или "Current Protocols in Molecular Biology" (1987), J.Wiley & Sons Inc., ISBN 0-471-50338-Х. С другой стороны, клонирование может быть проведено, например, с использованием стандартного набора реактивов, такого как набор ТА Набор для клонирования (Invitrogen) и стандартного плазмидного вектора типа pBluescript II (Stratagene). Нуклеотидные последовательности ДНК-клона могут быть определены методом дидезокситерминирования, например, по методу Сэйнджера (F.Sanger, S.Nicklen, A.R. Coulson, 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467). Например, предпочтительным является использование стандартного набора ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (Perkin-Elmer).

Далее, нуклеиновую кислоту, имеющую частичную нуклеотидную последовательность гена по данному изобретению (здесь и далее определяемой как "фрагмент гена"), выделяемую описанным выше методом, метят и затем используют в качестве зонда в гибридизационном методе. Зонд может быть гибридизован, например, с ДНК, производной сои, растения семейства Chenopodiaceae или растения семейства Cruciferae с целью выявления нуклеиновой кислоты, специфически связывающейся с зондом, что позволит идентифицировать нуклеиновую кислоту, включающую ген раффинозосинтазы.

Что касается ДНК, производной сои, растения семейства Chenopodiaceae, такого как свекла, или растения семейства Cruciferae, таких как горчица или брюква, могут быть использованы, например, библиотека кДНК или геномная ДНК-библиотека этих растений. В качестве генной библиотеки могут служить стандартная генная библиотека как таковая, или библиотека, сформированная с помощью стандартного метода конструирования библиотек, например, описанного в "Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition" (1989), Cold Spring Harbor Lab. Press или "Current Protocols in Molecular Biology" (1987), J.Wiley & Sons Inc., ISBN 0-471-50338-X.

Что касается метода гибридизации, то могут быть применены, например, методы гибридизации на плашках или в колониях: их выбор зависит от типа вектора, используемого при конструировании библиотеки. Более детально, в случае, когда библиотека для дальнейшего применения формируется в составе фагового вектора, подходящий микроорганизм-хозяин смешивается с библиотечным фагом в инфективных условиях с целью получения трансформантов. Далее трансформант смешивают с мягкой агаровой средой, а полученную смесь распластывают на агаре. Затем смесь культивируют при 37°С до тех пор, пока не образуется плашки необходимого размера. Когда же библиотеку для дальнейшего анализа создают с помощью плазмидного вектора, плазмиду вводят в подходящий микроорганизм-хозяин с целью получения трансформантов. Полученные трансформанты разбавляют до нужной концентрации и полученный раствор помещают на агар, после чего культивируют при 37°С до тех пор, пока не образуется колонии необходимого размера. В любом варианте получения обозначенных выше библиотек, мембранный фильтр помещают на поверхность агара после указанного варианта культивирования, в результате чего фаг или трансформант перемещается на мембрану. Эту мембрану денатурируют щелочью, которую затем нейтрализуют и, например, когда используют нейлоновую мембрану, ее облучают ультрафиолетом, что проводит к фиксации ДНК фага или трансформанта на мембране. Эта мембрана становится пригодной для метода гибридизации, в котором фрагмент гена, являющийся частью нуклеотидной последовательности гена по данному изобретению и помеченный стандартным методом (здесь и далее обозначаемый как "меченый фрагмент гена"), используется в качестве зонда. Ссылку на описание этого способа можно найти в "DNA cloning, a practical approach" (1985), ed. D.M.Glover, IRL PRESS, ISBN 0-947946-18-7. Существуют различные реагенты и температурные режимы, применяемые в гибридизации. Например, в целом, предварительная гибридизация проводится путем погружения мембраны в прегибридизационный раствор [6×SSC (0,9 М NaCl, 0,09 М лимонной кислоты), 0,1-1 об.% SDS, 100 мкг/мл денатурированной ДНК сперматозоидов лосося] и инкубации при 65°С в течение 1 часа. Затем гибридизацию осуществляют путем добавления и смешивания меченого фрагмента гена и инкубирования мембраны при 42-68°С от 4 до 16 часов.

В настоящем изобретении под "жесткими условиями" подразумевается инкубация, например, при 65-68°С гибридизации.

После гибридизации мембрану вынимают и промывают раствором 2×SSC, содержащим 0,1-1 об.% SDS, еще раз промывают раствором 0,2×SSC, содержащим 0.1-1 об.% SDS и затем высушивают. Мембрану анализируют, например, авторадиографически или с помощью других способов с целью определения положения зонда на мембране и определения положения на мембране нуклеиновой кислоты, имеющей нуклеотидную последовательность, гомологичную использованному зонду. Клон, соответствующий положению нуклеиновой кислоты, идентифицированному таким способом на мембране, маркируют на исходном агаре и позитивный клон отбирают так, чтобы этот включающий нуклеиновую кислоту клон мог быть выделен. Такую процедуру идентификации повторяют с целью очистки клона, включающего нуклеиновую кислоту.

С другой стороны, стандартный набор, такой как GENE TRAPPER cDNA Positive Section System (производства GibcoBRL) может быть использован. В этом методе, во-первых, библиотеку одноцепочечных фрагментов ДНК гибридизуют с биотинилированным фрагментом гена (т.е. с зондом) с последующим добавлением связанных со стрептавидином магнитных шариков и перемешивают. Связанные со стрептавидином намагниченные шарики удаляют из смеси с помощью магнита: таким образом одноцепочечную ДНК, включающую нуклеотидную последовательность, гомологичную той, что использована в зонде, которая оказалась прикрепленной к этим шарикам опосредованно через фрагмент гена, биотин и стрептавидин, собирают и выявляют. Собранная одноцепочечная ДНК может быть преобразована в двухцепочечную форму путем проведения реакции с подходящей ДНК-полимеразой с использованием подходящего олигонуклеотида в качестве затравки.

Как было описано выше, нуклеиновая кислота, включающая ген раффинозосинтазы, может быть получена путем выявления нуклеиновой кислоты, гибридизующейся с фрагментом гена в ДНК генной библиотеки, выделенной из сои, растения семейства Chenopodiaceae или растения семейства Cruciferae, очистки клона, содержащего нуклеиновую кислоту, и выделения фаговой или плазмидной ДНК из клона. С помощью составления карты рестрикции или определения нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, полученной таким образом, с помощью традиционного метода, может быть подтверждено получение нуклеиновой кислоты, включающей ген по данному изобретению.

Например, ген по данному изобретению из растения семейства Chenopodiaceae может быть подтвержден по следующему критерию.

Аминокислота, кодируемая нуклеотидной последовательностью, определенной выше указанным способом, имеет 75%-ную или более высокую степень гомологии с аминокислотной последовательностью, представленной 103-208 аминокислотами в аминокислотной последовательности SEQ ID NO 3;

80%-ную и более высокую степень гомологии с аминокислотной последовательностью, представленной 255-271 аминокислотами в аминокислотной последовательности SEQ ID NO 3;

70%-ную и более высокую степень гомологии с аминокислотной последовательностью, представленной 289-326 аминокислотами в аминокислотной последовательности SEQ ID NO 3;

70%-ную и более высокую степень гомологии с аминокислотной последовательностью, представленной 610-696 аминокислотами в аминокислотной последовательности SEQ ID NO 3.

Ген по данному изобретению из растения семейства Cruciferae может быть подтвержден, например, по следующим критериям.

Аминокислотная последовательность, кодируемая установленной нуклеотидной последовательностью и проявляет

75%-ную или более высокую степень гомологии с аминокислотной последовательностью, представленной 111-213 аминокислотами в аминокислотной последовательности SEQ ID NO 5;

80%-ную или более высокую степень гомологии с аминокислотной последовательностью, представленной 260-275 аминокислотами в аминокислотной последовательности SEQ ID NO 5;

70%-ную или более высокую степень гомологии с аминокислотной последовательностью, представленной 293-325 аминокислотами в аминокислотной последовательности SEQ ID NO 5;

70%-ную или более высокую степень гомологии с аминокислотной последовательностью, представленной 609-695 аминокислотами в аминокислотной последовательности SEQ ID NO 5.

Термин "гомология", используемый здесь, обозначает численную пропорцию аминокислот в сегменте, которые идентичны таковым в другом сравниваемом сегменте, по отношению к общему числу аминокислот в первом сегменте путем сравнения сегментов, имеющих сходство по двум аминокислотным последовательностям. С этой точки зрения предпочтительно, чтобы сегменты, проявляющие сходство, имели большее число аминокислот. Такая гомология аминокислотных последовательностей может быть оценена с использованием стандартных программ геноанализа, таких как GENETIX (Software Kaihatu К.К.).

Далее, в соответствии с тем же подходом, который был описан выше, нуклеиновая кислота, включающая ген раффинозосинтазы, может быть выявлена путем гибридизации ДНК желательного организма с использованием фрагмента гена в качестве зонда с целью выявления нуклеиновой кислоты, с которой зонд специфически связывается (здесь и далее обозначается как способ выявления настоящего изобретения). Фрагмент гена, используемый в данном случае, может быть химически синтезирован с помощью стандартного способа на основе нуклеотидной последовательности SEQ ID NO 2, 4, 6 или 8. С другой стороны, он может быть получен с помощью ПЦР с использованием в качестве затравок олигонуклеотидов, химически синтезированных стандартным методом на основе нуклеотидных последовательностей SEQ ID NO 2, 4, 6 или 8.

Фрагмент гена может быть частью нетранслируемого участка гена раффинозосинтазы, равно как и частью открытой кодирующей рамки. Например, может быть использован олигонуклеотид, характеризующийся такой же нуклеотидной последовательностью, как часть этого 5’-расположения против хода транскрипции, такие как нуклеотиды 1-235 в нуклеотидной последовательности SEQ ID NO 4, нуклеотиды 1-133 в нуклеотидной последовательности SEQ ID NO 6 и подобные, или часть этого 3’-расположения по ходу транскрипции, такие как нуклеотиды 2588-2675 в нуклеотидной последовательности SEQ ID NO 4, нуклеотиды 2468-2676 в нуклеотидной последовательности SEQ ID NO 6 и подобные.

Когда ПЦР проводится с использованием фрагмента гена в качестве праймеров, имеется возможность амплификации нуклеиновой кислоты, включающей ген раффинозосинтазы из состава ДНК, выделенной из желательного организма (здесь и далее обозначается как амплификационный метод настоящего изобретения).

Более детально, например, олигонуклеотиды, включающие нуклеотидные последовательности фрагмента гена конструируют и химически синтезируют с помощью стандартного способа. В целом, предпочтительно, чтобы число нуклеотидов было большим с точки зрения обеспечения специфичности отжига. Также, однако, важно, чтобы число нуклеотидов не было слишком большим в связи с тем, что затравки сами по себе лабильны и могут образовывать структуры высшего порядка, что может приводить к снижению эффективности отжига, соответственно, усложняется процедура очистки после проведения синтеза. В норме, предпочтительны олигонуклеотиды, состоящие из 15-50 оснований. С этой точки зрения, основываясь на таблице кодонов, указывающих на соответствие аминокислот, кодируемых кодонами, смесь затравок может быть также синтезирована с использованием смеси множественных оснований таким образом, чтобы остаток в определенном положении в затравке менялся на другие основания в соответствии с изменчивостью кодонов, кодирующих одну и ту же аминокислоту. С другой стороны, такое основание как инозин, который может образовывать основания, способные связываться с множественными основаниями, может быть использовано вместо указанной выше смеси множественных оснований.

В приведенной таблице кодонов каждый кодон приведен в соответствии с нуклеотидными последовательностями в мРНК и их легких петель с 5’-конца. U представляет основание урацил в РНК, и ему соответствует основание тимин в ДНК.

Олигонуклеотид, имеющий такую же нуклеотидную последовательность, что и в кодирующей цепи двухцепочечной ДНК гена по данному изобретению, называют "смысловой затравкой", а тот, который включает нуклеотидную последовательность, комплементарную кодирующей цепи, называют "антисмысловой затравкой".

Смысловая затравка, включающая ту же нуклеотидную последовательность, что и с 5’-стороны кодирующей цепи гена по данному изобретению, и антисмысловая затравка, включающая нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности 3’-стороны этой же кодирующей цепи, используются в сочетании с ПЦР, например с генной библиотекой, геномной ДНК или кДНК, используемыми в качестве матрицы для амплификации ДНК. С точки зрения использования генной библиотеки надо учесть, что существуют библиотеки кДНК и геномные библиотеки, выделенные из сои и растения семейства Chenopodiaceae, такого как свекла, или растений семейства Cruciferae, таких как горчица или брюква, и т.д. Генная библиотека также может быть библиотекой, сконструированной с помощью стандартного метода формирования библиотек, например, описанного в "Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition" (1989), Cold Spring Harbor Lab. Press; "Current Protocols in Molecular Biology" (1987), J.Wiley & Sons Inc., ISBN 0-471-50338-X, или быть стандартной библиотекой генов как таковой. Если выбор падает на геномную ДНК или кДНК, нужно учесть, что, например, такие библиотеки получены из сои, растения семейства Chenopodiceae, такого как свекла, или растений семейства Cruciferae, таких как горчица или брюква, и т.д. Например, ПЦР проводят с использованием затравок 31 и 32 в приведенном выше Перечне 3 и используемой в качестве матрицы кДНК, выделенной из горчицы, с целью амплификации ДНК, включающей нуклеотидную последовательность, представленную 749-1215 нуклеотидами нуклеотидной последовательности SEQ ID NO 6. Далее ПЦР проводят с использованием затравок и кДНК в качестве матрицы, выделенной из брюквы, с целью амплификации ДНК, включающей нуклеотидную последовательность, представленную 1-467 нуклеотидами нуклеотидной последовательности SEQ ID NO 8. Нуклеиновая кислота, амплифицированная таким образом, может быть подтверждена с использованием стандартного электрофореза. Нуклеиновая кислота может быть клонирована стандартным методом, таким как описано в "Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition" (1989), Cold Spring Harbor Lab. Press; "Current Protocols in Molecular Biology" (1987), J.Wiley & Sons Inc., ISBN 0-471-50338-Х. Готовят рестрикционную карту нуклеиновой кислоты или определяют ее нуклеотидную последовательность с помощью стандартного метода, таким образом, чтобы нуклеиновая кислота, включающая ген раффинозосинтазы или его часть, может быть идентифицирована. Когда нуклеиновая кислота содержит часть раффинозосинтазы, ПЦР может быть проведена на основе ее нуклеотидной последовательности с целью амплификации нуклеиновой кислоты, включающей 5’-(верхний) участок нуклеотидной последовательности или 3’-(нижний) участок нуклеотидной последовательности. Таким образом, основываясь на нуклеотидной последовательности, полученной вышеуказанным способом нуклеиновой кислоты, антисмысловую затравку определяют и синтезируют для амплификации 5’-верхней части, а смысловую затравку определяют и синтезируют для амплификации 3’-нижней части. Уже полученные нуклеотидные последовательности 5’-верхней и 3’-нижней частей могут быть определены методом RACE с использованием затравок и стандартного набора, такого как Marathon kit Clontech. Полноразмерный ген раффинозосинтазы может быть получен п