Рекомбинантный вирус, экспрессирующий чужеродную днк, кодирующую кошачий cd80, кошачий ctla-4 или кошачий cd86, и его использование

Рекомбинантный вирус, экспрессирующий чужеродную днк, кодирующую кошачий cd80, кошачий ctla-4 или кошачий cd86, и его использование

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Интерферон-γ и его использование

В этой заявке испрашивается приоритет заявки США рег. №09/071711, поданной 1 мая, 1998, содержание которой вводится в настоящее описание посредством ссылки. В настоящей заявке ссылки на различные публикации даны в скобках. Все ссылки на эти публикации можно найти в конце описания непосредственно перед списком последовательностей. Для более полного описания предшествующего уровня техники в области, к которой относится настоящее изобретение, указанные публикации во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки.

Предшествующий уровень техники

Предполагается, что стимуляция активации и пролиферации Т-клеток в ответ на заболевание хозяина зависит от двух типов взаимодействия: распознавания Т-клеточного рецептора (TCR) иммуногенными пептидами в присутствии молекул МНС класса I, и вторичного взаимодействия дополнительных лигандов, таких как CD80 и CD86 с их корецепторами CD-28 и/или CTLA-4 на Т-клетках. Эффективное взаимодействие по этим двум путям каскадов реакций приводит к активации и пролиферации как CD4⁺-T-, так и СD8⁺-T-клеток и к повышенному продуцированию регулирующих иммунный ответ цитокинов типа Th1 и Th2. В отсутствие адекватной ко-стимуляции Т-клеток может развиваться анергическое состояние, в результате чего будет отсутствовать пролиферация Т-клеток и секреция цитокинов. За последние несколько лет было выявлено, что главными регуляторами Т-клеточного ответа являются две молекулы, CD28 и его лиганды, CD80 и CD86. CD28 представляет собой главный ко-стимулирующий Т-клеточный рецептор, и после взаимодействия с CD80 и CD86 он усиливает пролиферацию Т-клеток и синтез цитокинов, предупреждая гибель Т-клеток. CTLA-4 (также называемый CD152), гомолог CD-28, также играет важную роль в ко-стимуляции. Очевидно, хотя это точно не известно, он ингибирует Т-клеточные ко-стимулирующие ответы. Взаимодействие и взаимосвязь между CD28, CTLA-4 и их лигандами CD80 и CD86 в процессах ко-стимуляции играют ключевую роль в общем индуцировании и супрессии иммунных реакций в ответ на заболевание хозяина. (Linsley et al., 1991 a; 1993 a).

В настоящее время не существует эффективных вакцин для предупреждения состояния иммунодефицита у кошек и инфекционного перитонита у кошек. В настоящее время имеются вакцины против вируса кошачьего лейкоза, но уровень их эффективности остается проблематичным, а в некоторых случаях они могут даже вызывать данное заболевание. Было показано, что экспериментальные вакцины против инфекционного перитонита у кошек не обладают протективным действием или даже вызывают преждевременную гибель животного вследствие антитело-опосредованного обострения заболевания. Поэтому необходимо получить лекарственные средства и композиции, которые обеспечивали бы защиту от этих и других заболеваний, против которых еще не существует вакцин, либо которые повышали бы эффективность существующих и широко применяемых вакцин. Кроме того, необходимо получить вакцины и лекарственные средства, которые индуцировали бы клеточно-опосредованный ответ в отсутствие антител, способствующих обострению заболевания. И наконец, вакцинация котят представляет определенные трудности вследствие невозможности подавлять у них продуцирование материнских антител. Следовательно, необходимо получить безопасные и эффективные средства, которые позволяли бы решить эти проблемы.

В настоящем изобретении, для продуцирования нужного иммунного ответа на конкретный кошачий патоген или патологическое состояние у кошек можно регулировать Т-клеточные ответы посредством модификации экспрессии кошачьего CD28, кошачьего CTLA-4 и их лигандов, и к о-стимулирующих молекул кошачьего CD80 и кошачьего CD86 путем усиления, супрессии или переориентации этой экспрессии. В частности, указанные ко-стимулирующие молекулы могут быть использованы для вакцинации против инфекционных болезней, лечения инфекционных болезней и лечения опухолевых, дегенеративных, аутоиммунных и иммунодефицитных состояний у кошек. Настоящее изобретение позволяет решить проблемы, связанные с отсутствием эффективности и действенности современных кошачьих вакцин, описанных выше.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение относится к рекомбинантному вирусу, который содержит, по крайней мере, одну чужеродную нуклеиновую кислоту, встроенную в не-основную область вирусного генома, где каждая такая чужеродная нуклеиновая кислота, кодирует белок.

Этот кодируемый белок выбирают из группы, состоящей из белка кошачьего CD28 или его иммуногенной части, белка кошачьего CD80 или его иммуногенной части, белка кошачьего CD86 или его иммуногенной части или белка кошачьего CTLA-4 или его иммуногенной части. Эта часть может быть экспрессирована при введении указанного рекомбинантного вируса в соответствующего хозяина.

Настоящее изобретение также относится к рекомбинантному вирусу, который, кроме того, содержит чужеродную нуклеиновую кислоту, кодирующую иммуноген, происходящий от патогена. Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным вирусам, которые способны усиливать иммунный ответ у кошек.

Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным вирусам, способным подавлять иммунный ответ у.кошек. Краткое описания чертежей

Фигура 1А: ДНК и аминокислотная последовательность кошачьего CD80 (В7-1) (TAMU)(SEQ ID NO. 1 и 2).

Фигура 1В: Кривая гидрофобности аминокислотной последовательности кошачьего CD80 (В7-1) (TAMU).

Фигура 2А: ДНК и аминокислотная последовательность кошачьего CD80 (b7-1) (SYNTRO) (SEQ ID NO. 3 и 4).

Фигура 2В: Кривая гидрофобности аминокислотной последовательности кошачьего CD80 (B7-1) (SYNTRO).

Фигура 3А: ДНК и аминокислотная последовательность кошачьего CD86 (В7-2)(SEQ ID NO. 5 и 6).

Фигура 3В: Кривая гидрофобности аминокислотной последовательности кошачьего CD86 (В7-2).

Фигура 4А: ДНК и аминокислотная последовательность кошачьего CD28 (SEQ ID NO. 7 и 8).

Фигура 4В: Кривая гидрофобности аминокислотной последовательности кошачьего CD28.

Фигура 5А: ДНК и аминокислотная последовательность кошачьего CTLA-4 (CD152)(SEQ ID NO. 9 и 10).

Фигура 5В: Кривая гидрофобности аминокислотной последовательности кошачьего CTLA-4 (CD152). Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к рекомбинантному вирусу, который содержит, по крайней мере, одну чужеродную нуклеиновую кислоту, встроенную в не-основную область вирусного генома, где каждая такая чужеродная нуклеиновая кислота (а) кодирует белок, выбранный из группы, состоящей из белка кошачьего CD28 или его иммуногенной части, белка кошачьего CD80 или его иммуногенной части, белка кошачьего CD86 или его иммуногенной части; белка кошачьего CTLA-4 или его иммуногенной части; и (Ь) способна экспрессироваться при введении указанного рекомбинантного вируса в соответствующего хозяина.

В одном из вариантов осуществления вышеописанного изобретения указанный рекомбинантный вирус содержит, по крайней мере, две чужеродные нуклеиновые кислоты, каждая из которых встроена в не-основную область вирусного генома.

В другом варианте осуществления изобретения указанный рекомбинантный вирус содержит, по крайней мере, три чужеродные нуклеиновые кислоты, каждая из которых встроена в не-основную область вирусного генома.

В другом варианте осуществления изобретения указанный рекомбинантный вирус содержит четыре чужеродные нуклеиновые кислоты, каждая из которых встроена в не-основную область вирусного генома.

В другом варианте осуществления изобретения, указанным рекомбинантным вирусом является, но не ограничивается ими, вирус оспы енотов, вирус оспы свиней или вирус герпеса кошек.

В другом варианте осуществления вышеописанного изобретения указанный рекомбинантный вирус содержит более чем одну чужеродную нуклеиновую кислоту, и каждая из этих чужеродных нуклеиновых кислот встроена в одну и ту же не-основную область. В другом варианте осуществления настоящего изобретения любой из указанных рекомбинантных вирусов содержит более чем одну чужеродную нуклеиновую кислоту, где все указанные чужеродные нуклеиновые кислоты не являются встроенными в одну и ту же неосновную область.

В одном из вариантов осуществления изобретения любой из указанных рекомбинантных вирусов содержит чужеродную нуклеиновую кислоту, кодирующую иммуноген, происходящий от патогена. В еще одном варианте осуществления изобретения рекомбинантный вирус кодирует кошачий патоген, рабивирусный патоген, патоген, происходящий от хламидий, патоген Toxoplasmosis gondii, патоген Dirofilaria immitis, патоген, происходящий от блох, или бактериальный патоген. В другом варианте осуществления изобретения рекомбинантный вирус содержит кодирующую последовательность вируса иммунодефицита кошек (FIV), вируса лейкоза кошек (FeLV), вируса инфекционного перитонита кошек (FIP), вируса панлейкопении кошек, кошачьего калицивируса, кошачьего реовируса типа 3, кошачьего ротавируса, кошачьего коронавируса, синцитиального вируса кошек, вируса саркомы кошек, вируса герпеса кошек, вируса болезни Борна кошек или кошачьих паразитов.

В другом варианте осуществления изобретения указанный рекомбинантный вирус содержит, по крайней мере, одну чужеродную нуклеиновую кислоту, которая включает промотор для экспрессии чужеродной нуклеиновой кислоты. В другом варианте осуществления изобретения указанный рекомбинантный вирус экспрессирует, по крайней мере, одну чужеродную нуклеиновую кислоту, которая находится под контролем промотора, который является эндогенным для этого вируса.

В одном из вариантов осуществления изобретения любой из указанных рекомбинантных вирусов содержит чужеродную нуклеиновую кислоту, кодирующую детектируемый маркер. В другом варианте осуществления изобретения указанным детектируемым маркером является бета-галактозидаза E.coli.

Настоящее изобретение также относится к рекомбинантному вирусу, кодирующему иммуногены, происходящие от gаg-протеазы FIV, белка оболочки FIV, gаg-протеазы FeLV или белка оболочки FeLV.

Настоящее изобретение относится к рекомбинантному вирусу, который, кроме того, содержит нуклеиновую кислоту, включающую геном вируса иммунодефицита кошек или его часть. Настоящее изобретение относится к рекомбинантному вирусу, который, кроме того, содержит нуклеиновую кислоту, включающую геном вируса лейкоза кошек или его часть. Настоящее изобретение относится к рекомбинантному вирусу, который, кроме того, содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую кошачий IL12, GM-CSF, р35 или р40. Настоящее изобретение также относится к вакцине, включающей эффективное иммунизирующее количество такого рекомбинантного вируса и соответствующий носитель.

Настоящее изобретение относится к рекомбинантному вирусу герпеса кошек, содержащему не-основную область, которой является ген гликопротеина G вируса герпеса кошек.

Настоящее изобретение относится к рекомбинантному вирусу герпеса кошек по п.12 формулы изобретения, обозначенному S-FHV-031 (АТСС, номер доступа VR-2604). Этот вирус был депонирован 1 мая 1998 в Американской коллекции типовых культур (АТСС), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20108-0971, U.S.A. в рамках Будапештского договора в соответствии Международным соглашением по депонированию микроорганизмов для проведения патентной экспертизы.

Настоящее изобретение относится к рекомбинантному вирусу оспы свиней, имеющему не-основную область в более крупном HindIII-BglII-субфрагменте HindIII-фрагмента М вируса оспы свиней. Настоящее изобретение относится к рекомбинантному вирусу оспы свиней по п.14 формулы изобретения, обозначенному S-SPV-246 (АТСС, номер доступа VR-2603). Этот вирус был депонирован 1 мая 1998 в Американской коллекции типовых культур (АТСС), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20108, U.S.A. в рамках Будапештского договора в соответствии Международным соглашением по депонированию микроорганизмов для проведения патентной экспертизы.

В одном из вариантов своего осуществления вышеописанное изобретение относится к рекомбинантному вирусу, где часть белка CD28, CD80 или CD86 является растворимой частью белка. В другом варианте своего осуществления настоящее изобретение относится к рекомбинантному вирусу, который содержит чужеродную нуклеиновую кислоту, кодирующую белок CTLA-4 кошек.

Вышеописанное изобретение относится к вакцине, которая содержит эффективное иммунизирующее количество рекомбинантного вируса и подходящий носитель. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения вакцина содержит эффективное иммунизирующее количество рекомбинантного вируса, составляющее от около 1×10⁵ б.о.е./мл до около 1×10⁸ б.о.е./мл. В другом варианте настоящего изобретения вакцина, кроме того, включает смесь, содержащую рекомбинантный вирус и эффективное иммунизирующее количество второго иммуногена.

Настоящее изобретение относится к способу усиления иммунного ответа у кошек, предусматривающему введение этим кошкам эффективного иммунизирующего количества любого из вышеиндентифицированных рекомбинантных вирусов. Настоящее изобретение, кроме того, относится к способу иммунизации кошек, предусматривающему введение этим кошкам эффективного иммунизирующего количества любого из вышеиндентифицированных рекомбинантных вирусов.

Настоящее изобретение относится к способу супрессии (подавления) иммунного ответа у кошек, предусматривающему введение этим кошкам эффективного супрессирующего количества рекомбинантного вируса, содержащего растворимый CD28, CD80 или CD86. Настоящее изобретение относится к способу супрессии иммунного ответа у кошек путем введения этим кошкам любого эффективного супрессирующего количества рекомбинантного вируса, содержащего белок кошачьего CTLA-4.

Настоящее изобретение относится к внутривенному, подкожному, внутримышечному, чрезмышечному, местному, пероральному или внутрибрюшинному введению вышеописанного рекомбинантного вируса.

В одном из вариантов своего осуществления настоящее изобретение относится к способу супрессии иммунного ответа у кошки, где эта кошка является реципиентом трансплантированного органа или ткани или подвержена иммунной реакции.

В другом варианте своего осуществления настоящее изобретение относится к способу супрессии иммунного ответа у кошек, предусматривающему введение этим кошкам антисмысловой нуклеиновой кислоты, способной гибридизоваться: (а) с мРНК-транскриптом кошачьего CD28, (b) с транскриптом кошачьего CD80 или (с) с мРНК-транскриптом кошачьего CD86, или ингибировать их трансляцию, где указанная антисмысловая нуклеиновая кислота присутствует в количестве, эффективном для ингибирования трансляции, и тем самым подавляет иммунный ответ у кошек.

В одном из вариантов своего осуществления вышеописанное изобретение относится к способу уменьшения или уничтожения опухоли у кошки, предусматривающему введение в опухоль этой кошки рекомбинантного вируса, содержащего нуклеиновую кислоту, которая кодирует белок кошачьего CD80, белок кошачьего CD86 или их комбинацию в количестве, эффективном для уменьшения и уничтожения этой опухоли.

В одном из вариантов своего осуществления настоящее изобретение относится к способу уменьшения или уничтожения опухоли у кошек, где указанный рекомбинантный вирус, кроме того, содержит и способен экспрессировать опухолеассоциированный антиген кошек, и где указанный способ осуществляют путем системного введения этого рекомбинантного вируса.

Настоящее изобретение относится к выделенной и очищенной ДНК, кодирующей лиганд кошачьего CD80 (В7-1) или лиганд кошачьего CD86 (В7-2), либо рецептор CD28 кошек или рецептор CTLA-4 кошек (CD152), а также к клонирующим и экспрессирующим векторам, содержащим CD80 или CD86, либо CD28 или CTLA-4, или РНК, частично или целиком, и к клеткам, трансформированным CD80-кодирующими векторами или CD86-кодирующими векторами, либо CD28-кодирующими векторами или CTLA-4-кодирующими векторами. Животных семейства кошачьих, от которых происходит CD80, CD86, CD28 или CTLA-4, выбирают из группы, включающей, но не ограничивающейся ими: домашние кошки, львы, пумы, рыси и гепарды.

Настоящее изобретение относится к выделенной и очищенной кДНК кошачьего CD80 (В7-1), содержащей приблизительно 941 нуклеотид. Настоящее изобретение также относится к выделенному и очищенному полипептиду кошачьего CD80, содержащему приблизительно 292 аминокислоты, в нативной мембраноассоциированной или зрелой форме, и имеющему молекулярную массу около 33485 кДа, изоэлектрическую точку около 9,1, и общий заряд при рН 7,0, равный 10. Ко-экспрессия CD80, вместе с костимулирующей молекулой CD28 и опухолевым антигеном или антигеном от патогенного организма, способствует активации или усилению активации Т-лимфоцитов, что приводит к продуцированию цитокина, стимулирующего иммунный ответ, а также способствует регуляции роста клеток других типов. Ко-экспрессия CD80, вместе с ко-стимулирующей молекулой CTLA-4, способствует регуляции активации Т-лимфоцитов.

Настоящее изобретение относится к выделенной и очищенной кДНК кошачьего CD86 (В7-2), содержащей приблизительно 1176 нуклеотидов. Настоящее изобретение также относится к выделенному и очищенному полипептиду кошачьего CD86, содержащему приблизительно 320 аминокислот, в нативной мембраноассоциированной или зрелой форме, и имеющему молекулярную массу приблизительно 36394 кДа, изоэлектрическую точку около 9,19, и общий заряд при рН 7,0, равный 11,27. Ко-экспрессия CD86, вместе с ко-стимулирующей молекулой CD28 и опухолевым антигеном или антигеном от патогенного микроорганизма, способствует активации или усилению активации Т-лимфоцитов, что приводит к продуцированию цитокинов, стимулирующих иммунный ответ, а также способствует регуляции роста клеток других типов. Ко-экспрессия CD86, вместе с ко-стимулирующе и молекулой CTLA-4, способствует регуляции активации Т-лимфоцитов.

В соответствии с настоящим изобретением кошачий CD80 или кошачий CD86 получают из природных или рекомбинантных источников. В соответствии с настоящим изобретением кошачьи CD80 или CD86 имеют нативную или мембраносвязанную форму либо секретированную форму, в которой отсутствует трансмембранный домен.

Настоящее изобретение относится к выделенной и очищенной кДНК кошачьего CD28, содержащей около 689 нуклеотидов. Настоящее изобретение также относится к выделенному и очищенному полипептиду кошачьего CD28, содержащему приблизительно 221 аминокислоту, в нативной мембрано-связанной или зрелой форме, и имеющему молекулярную массу около 25319 кДа, изоэлектрическую точку около 9,17 и общий заряд при рН 7,0, равный 9,58.

Настоящее изобретение относится к выделенной и очищенной кДНК кошачьего CTLA-4, содержащей около 749 нуклеотидов. Настоящее изобретение также относится к выделенным и очищенным полипептидам кошачьего CTLA-4, содержащим приблизительно 223 аминокислоты, в нативной мембраноассоциированной или зрелой форме, и имеющим молекулярную массу около 24381 кДа, изоэлектрическую точку около 6,34, и общий заряд при рН 7,0, равный -0,99.

Настоящее изобретение относится к рекомбинантному вирусу оспы свиней, экспрессирующему чужеродную ДНК, где указанная чужеродная ДНК кодирует кДНК и полипептиды кошачьего CD80, кошачьего CD86, кошачьего CD28 и кошачьего CTLA-4.

Настоящее изобретение относится к рекомбинантному вирусу оспы енотов, экспрессирующему чужеродную ДНК, где указанная чужеродная ДНК кодирует кДНК и полипептиды кошачьего CD80, кошачьего CD86, кошачьего CD28 и кошачьего CTLA-4.

Настоящее изобретение относится к рекомбинантному вирусу герпеса кошек, экспрессирующему чужеродную ДНК, где указанная чужеродная ДНК кодирует кДНК и полипептиды кошачьего CD80, кошачьего CD86, кошачьего CD28 и кошачьего CTLA-4.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу усиления иммунного ответа у кошек на иммуноген, который достигается введением этого иммуногена до, после или, в основном, одновременно с введением кошачьего CD80 или кошачьего CD86 вместе с кошачьим CD28 или кошачьим CTLA-4 или без них в рекомбинантном векторе на основе вируса оспы свиней, в рекомбинантном векторе на основе вируса оспы енотов, или в рекомбинантном векторе на основе вируса герпеса кошек, в количестве, эффективном для усиления иммунного ответа.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу подавления иммунного ответа у кошек на иммуноген, который достигается введением этого иммуногена до, после или, в основном, одновременно с введением кошачьего CD80 или кошачьего CD86 вместе с кошачьим CD28 или кошачьим CTLA-4 или без них, либо вместе с антисмысловой РНК или ДНК, частично или целиком кодирующей кошачий CD80, кошачий CD86, кошачий CD28 или кошачий CTLA-4, в рекомбинантном векторе на основе вируса оспы свиней, в рекомбинантном векторе на основе вируса оспы енотов или в рекомбинантном векторе на основе вируса герпеса кошек, в количестве, эффективном для подавления иммунного ответа.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к вакцине для индуцирования иммунного ответа у кошек на иммуноген, содержащей иммуноген и эффективное количество кошачьего CD80 в рекомбинантном векторе на основе вируса оспы свиней, в рекомбинантном векторе на основе вируса оспы енотов или в рекомбинантном векторе на основе вируса герпеса кошек, для усиления иммунного ответа. Этот иммуноген происходит, например, от кошачьих патогенов, таких как вирус иммунодефицита кошек, вирус лейкоза кошек, парвовирус кошек, коронавирус кошек, лептовирус кошек и т.п.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к вакцине для индуцирования иммунного ответа у кошек на иммуноген, которое достигается путем введения рекомбинантного вектора на основе вируса оспы свиней, рекомбинантного вектора на основе вируса оспы енотов или рекомбинантного вектора на основе вируса герпеса кошек, экспрессирующего ДНК или РНК иммуногена и ДНК или РНК дополнительных молекул кошачьих CD80, CD86, CD28 в любой комбинации, кодирующих белки или фрагмент белков в количестве, эффективном для модуляции иммунного ответа.

Белок кошачьего CD80 имеет аминокислотную последовательность, которая на 59% и 46% идентична последовательностям белков человека и мыши, соответственно. Белок кошачьего CD86 имеет аминокислотную последовательность, которая на 68% и 64% идентична последовательностям белков человека и кролика, соответственно. Белок кошачьего CD28 имеет аминокислотную последовательность, которая на 82% и 74% идентична последовательностям белков человека и мыши, соответственно. Белки кошачьего CTLA-4 имеют аминокислотную последовательность, которая на 88% и 78% идентична последовательностям белков человека и мыши, соответственно. Человеческие или мышиные белки CD80 или CD86 не могут функционально заменять белки кошачьего CD80 или CD86. Поэтому кошачий CD80, кошачий CD86, кошачий CD28 и кошачий CTLA-4 представляют собой новые реагенты, необходимые для регуляции иммунитета у кошек.

Настоящее изобретение относится к дополнительным Т-клеточным регуляторным молекулам, CD80 (В7-1) или CD86 (В7-2) или CD28 или CTLA-4 (CD152), происходящим от животных семейства кошачьих. Настоящее изобретение относится к выделенным и очищенным нуклеиновым кислотам, кодирующим, частично или полностью, кошачий CD80, кошачий CD86, кошачий CD28 или кошачий CTLA-4, а также к полипептидам CD80, CD86, CD28 или CTLA-4, выделенным либо из нативных, либо из рекомбинантных источников. Кошачий CD80, CD86, CD28 или CTLA-4, продуцируемый в соответствии с настоящим изобретением, может быть использован для усиления эффективности кошачьих вакцин против опухолей и патогенных микроорганизмов, а также в качестве терапевтического средства для лечения вирусных и бактериальных болезней кошек. Кошачий CD80, CD86, CD28 или CTLA-4, продуцируемый в соответствии с настоящим изобретением, может быть также использован для ослабления заболевания, обусловленного высокоактивным, сверхактивным или неправильно направленным иммунным ответом.

Нуклеиновые кислоты, векторы, трансформанты

Последовательности кДНК, кодирующие кошачий CD80 (SEQ ID NO: 1, 3) кошачий CD86 (SEQ ID NO: 5), кошачий CD28 (SEQ ID NO: 7) или кошачий CTLA-4 (SEQ ID NO: 9) показаны на фиг.1-5, а предсказанные аминокислотные последовательности кошачьего CD80 (SEQ ID NO: 2, 4) кошачьего CD86 (SEQ ID NO: 6), кошачьего CD28 (SEQ ID NO: 8) или кошачьего CTLA-4 (SEQ ID NO: 10) показаны на фиг.1-5. Конструирование этих кошачьих полипептидов, таких как CD80, CD86, CD28 или CTLA-4 основано на частичной гомологии аминокислотных последовательностей с человеческим, мышиным или кроличьим гомологом этих полипептидов, и способности полипептидов CD80 или CD86 связываться с рецептором кошачьего CD28 (см. ниже) или CTLA-4 и активировать или стимулировать либо регулировать активацию Т-лимфоцитов каким-либо другим образом. Кроме того, не претендуя на какую-либо конкретную теорию, можно предположить, что полипептиды кошачьего CD80 или кошачьего CD86 также обладают одной или более биологическими активностями: активацией клеток-киллеров (природных киллеров), стимуляцией созревания В-клеток, активацией МНС-рестриктированных цитотоксических Т-лимфоцитов, пролиферацией тучных клеток, взаимодействием с рецепторами цитокинов и индуцированном цитокинов, регулирующих иммунный ответ.

Вследствие вырожденности генетического кода (то есть, когда множество кодонов кодируют определенные аминокислоты), ДНК-последовательности, отличающиеся от последовательностей, показанных на фиг.1-5, могут также кодировать аминокислотные последовательности кошачьего CD80, CD86, CD28 или CTLA-4, показанные на фиг.1-5. Такими другими ДНК являются последовательности, содержащие "консервативные в отношении последовательности" варианты, в которых модификация в одном или нескольких нуклеотидах в данном кодоне не приводит к изменению аминокислоты, кодируемой в этом положении. Кроме того, данный аминокислотный остаток в полипептиде часто может быть заменен без изменения всей конформации и функции нативного полипептида. Такими "функционально консервативными" вариантами являются, но не ограничиваются ими, замена аминокислоты другой аминокислотой, имеющей аналогичные физико-химические свойства, такие как например, кислотные, основные, гидрофобные, гидрофильные, ароматические свойства и т.п.(например, замена лизина на аргинин, аспартата на глутамат или глицина на аланин). Кроме того, аминокислотные последовательности могут быть добавлены или делетированы без нарушения биологической активности молекулы. Так, например, к амино- или к карбокси-концам могут быть добавлены дополнительные аминокислотные последовательности, которые служат в качестве меток для очистки, таких как гистидиновые метки (то есть, для обеспечения одностадийной очистки белка, после которой их удаляют химическим или ферментативным методом). Альтернативно, эти дополнительные последовательности вносят дополнительные сайты связывания на клеточной поверхности, или каким-либо другим способом изменяют специфичность кошачьих CD80, CD86, CD28 или CTLA-4 по отношению к клетке-мишени, так, чтобы в результате добавлялся антигенсвязывающий сайт для антител.

кДНК кошачьего CD80, кошачьего CD86, кошачьего CD28 или кошачьего CTLA-4, входящие в объем настоящего изобретения, представляют собой последовательности, показанные на фиг.1-5; консервативные в отношении последовательности вариантные ДНК; ДНК-последовательности, кодирующие функционально консервативные вариантные полипептиды; и их комбинации. Настоящее изобретение относится к фрагментами кошачьих CD80, CD86, CD28 и CTLA-4, которые, взятые отдельно или в комбинации с другими последовательностями или компонентами, обладают нужной степенью биологической активности. Как будет объяснено ниже, каждый специалист может самостоятельно осуществлять прогнозируемые манипуляции с последовательностями CD80, CD86, CD28 или CTLA-4 и установить, обладает ли данный вариант кошачьего CD80, CD86, CD28 или CTLA-4 соответствующей стабильностью и биологической активностью для данного применения, либо установить, приводят ли изменения, которые влияют на активности связывания этих молекул, к повышенной эффективности. Каждый из кошачьих CD80 и CD86 связывается с ко-рецептором CD28 или с ко-рецептором CTLA-4. Это может быть достигнуто путем экспрессии и очистки вариантных полипептидов CD80, CD86, CD28 или CTLA-4 в рекомбинантной системе путем анализа их Т-клеточной стимулирующей активности и/или стимулирующей рост активности в клеточной культуре и в организме животных с последующим тестированием на пригодность для данного применения. Вариант CD80 тестируют на биологическую активность по функциональному связыванию с рецепторами CD28 или CTLA-4. Вариант CD86 тестируют на биологическую активность по функциональному связыванию с рецепторами CD28 или CTLA-4. Аналогичным образом вариант CD28 или CTLA-4 тестируют на биологическую активность.

Настоящее изобретение также относится к ДНК кошачьих CD80, CD86, CD28 или CTLA-4 (и к полипептидам), происходящим от животных семейства кошек, таких как, но не ограничиваюясь ими, домашние кошки, львы, тигры, гепарды, рыси и т.п. Гомологи последовательностей кошачьих CD80, CD86, CD28 или CTLA-4, показанные на фиг.1-5, были легко индентифицированы путем скрининга кДНК или геномных библиотек для идентификации клонов, которые гибридизуются с зондами, содержащими всю или часть последовательности, показанной на фиг.1-5. Альтернативно, библиотеки экспрессируемых последовательностей скринируют с использованием антител, которые распознают кошачьи CD80, CD86, CD28 или CTLA-4. Не претендуя на конкретную теорию, можно предположить, что гены CD80 или CD86 от других кошачьих имеют гомологию с генами кошачьих CD80, CD86, CD28 или CTLA-4, по крайней мере, приблизительно на 70%. В объем настоящего изобретения также входят ДНК, которые кодируют гомолог CD80, CD86, CD28 или CTLA-4, определенный как ДНК, кодирующая полипептиды, имеющие идентичность аминокислот с кошачьими CD80, CD86, CD28 или CTLA-4, по крайней мере, приблизительно на 25%.

В основном для манипуляций с нуклеиновыми кислотами в соответствии с настоящим изобретением используются методы, хорошо известные специалистам, такие, которые были описаны, например, в Molecular Cloning: A Laboratory manual, (2nd Ed., Sambrook Fritsch & Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor), или Current Protocols in Molecular Biology, (Eds. Ausubel, Brent, Kingston, More, Feidman, Smith & Stuhl, Greene Publ. Assoc. Wiley Interscience, NY, NY, 1992).

Настоящее изобретение относится к кДНК- и РНК-последовательностям и к смысловым и антисмысловым последовательностям.

Настоящее изобретение также относится к геномным ДНК-последовательностям кошачьих CD80, CD86, CD28 или CTLA-4 и к фланкирующим последовательностям, включая регуляторные последовательности, но не ограничиваясь ими. Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие полипептид(ы) кошачьих CD80, CD86, CD28 или CTLA-4, также ассоциируются с гетерологичными последовательностями, включая промоторы, энхансеры, элементы иммунного ответа, сигнальные последовательности, последовательности полиаденилирования, интроны, 5’- и 3’-некодирующие области и т.п. Элементами регуляции транскрипции, которые функционально присоединены к кДНК-последовательности(ям) кошачьих CD80, CD86, CD28 или CTLA-4, являются, но не ограничиваются ими, последовательности, которые способны регулировать экспрессию генов, происходящих от прокариотических клеток, эукариотических клеток, вирусов прокариотических клеток, вирусов эукариотических клеток и любых их комбинаций. Специалистам известны и другие подходящие гетерологичные регуляторные последовательности.

Нуклеиновые кислоты настоящего изобретения были модифицированы методами, известными специалистам, в целях изменения их стабильности, растворимости, аффинности связывания и специфичности. Так, например, эти последовательности были селективно метилированы. Последовательности нуклеиновых кислот настоящего изобретения были также модифицированы меткой, способной прямо или опосредованно продуцировать детектируемый сигнал. Примерами меток являются радиоизотопы, флуоресцентные молекулы, биотин и т.п.

Настоящее изобретение также относится к векторам, которые включают нуклеиновые кислоты, которые, частично или полностью, кодируют полипептиды CD80, CD86, CD28 или CTLA-4. Такими векторами являются, например, плазмидные векторы для экспрессии в различных эукариотических и прокариотических хозяевах. Эти векторы, предпочтительно, также содержат промотор, функционально присоединенный к части, кодирующей полипептид кошачьего CD80, CD86, CD28 или CTLA-4. Кодированные полипептиды кошачьего CD80, CD86, CD28 или CTLA-4 были экспрессированы с использованием любых подходящих векторов и клеток-хозяев, описанных в настоящей заявке или известных специалистам из других источников.

Настоящее изобретение также относится к векторам, которые включают нуклеиновые кислоты, кодирующие полипетиды кошачьих CD80, CD86, CD28 или CTLA-4 частично или полностью. Такими векторами являются, например, векторы на основе "живого" вируса для экспрессии в различных эукариотических хозяевах или для экспрессии ДНК- или РНК-вакцин. В одном из вариантов осуществления изобретения этот вектор на основе живого вируса является аттенуированным (ослабленным). В другом варианте настоящего изобретения этот вектор на основе живого вируса был аттенуирован посредством делеции генов. В другом варианте настоящего изобретения этот вирусный вектор был инактивирован путем химической обработки или термообработки. Этот вектор получают на основе живого вируса, выбранного из группы, включающей, но не ограничивающейся ими, вирус герпеса, поксвирус, аденовирус, адено-ассоциированный вирус, ретровирус, бакуловирус, альфавирус, рабдовирус, пикорнавирус. Этот вектор получают на основе живого вируса, выбранного из группы, включающей, но не ограничивающейся ими, кошачий вирус герпеса, собачий вирус герпеса, птичий вирус герпеса, бычий вирус герпеса, лошадиный вирус герпеса, псевдорабивирус, вирус оспы свиней, вирус оспы птиц, вирус оспы домашней птицы, вирус оспы енотов, вирус оспы канареек, вирус коровьей оспы, вирус мышиного лейкоза Молони, вирус Синдбис и вирус Семлики-Форест.

Вектор на основе живого вируса представляет собой рекомбинантный вирусный вектор, экспрессирующий чужеродную ДНК, которой является часть или вся кДНК кошачьего CD80, CD86, CD28 или CTLA-4. Чужеродной ДНК является также кДНК для антигена от патогенного организма. Рекомбинантный вирусный вектор конструируют методами гомологичного рекомбинантного или космидного реконструирования, известными специалистам. Предпочтительно, чтобы эти векторы также включали промотор, функционально присоединенный к части, кодирующей полипептид кошачьего CD80, CD86, CD28 или CTLA-4. Этот промотор выбирают из группы, включающей, но не ограничивающейся ими, промотор вируса герпеса gЕ кошек, синтетическтй ранний/поздний промотор поксвируса, предранний промотор цитомегаловируса человека, промотор псевдорабивируса gХ. Стимуляция экспрессии генов также предусматривает экспрессию кДНК CD80, CD86, CD28 или CTLA-4, происходящую от элемента внутреннего сайта связывания с рибосомой (IRES), присутствующего в кластере (вектор pCITE, Novagen, Madison, WI). Клеточными линиями для культивирования вирусных векторов являются, но не ограничиваются ими, клетки кошачьей почки Crandell (CRFK), фибробласты куриного эмбриона, клетки почки свиного эмбриона (ESK-4), клетки свиной почки (РК). Кодируемый(е) полипептид(ы) кошачьего CD80, CD86, CD28 или CTLA-4 экспрессировали с использованием подходящих векторов и клеток-хозяев, описанных в настоящей заявке или известных специалистам из других источников.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, гены, кодирующие кошачьи CD80 и CD28, CD80 и CTLA-4, CD86 и CD28 или CD86 и CTLA-4 в комбинации с генами для иммуногена, происходящего от кошачьего патогена, вводят в один рекомбинантный вирусный вектор, а затем на основе этого вектора получают живую вакцину. Гены кошачьих CD80, CD86, CD28 или CTLA-4, отдельно или в комбинации с генами кошек, происходящими от кошачьих патогенов, вводят в рекомбинантный вирус, так, чтобы экспрессия этих генов регулировалась соответствующим промотором. В другом варианте осуществления изобретения гены, кодирующие кошачьи CD80, CD86, CD28 или CTLA-4, отдельно, или в комбинации, встраивают в рекомбинантный вирусный вектор и вводят в вакцину вместе со вторым рекомбинантным вирусным вектором, который кодирует гены для иммуногена(ов), происходящего(щие) от кошачьих патогенов. Эти два варианта осуществления изобретения позволяют продуцировать нужные иммунные ответы в тех же клетках или в клетках, находящихся в непосредственной близости от этих клеток, в результате чего достигается усиление, супрессия или переориентация нужного иммунного ответа.

Иммуноген выбирают из группы, вклю