Способ определения концентрации серотонина и гистамина в биологической жидкости

Способ определения концентрации серотонина и гистамина в биологической жидкости

Реферат

Изобретение относится к области медицины, к биохимическим исследованиям и способам оценки изменений уровня серотонина и гистамина в организме.

Определение серотонина и гистамина находит широкое применение при диагностике различных патологических процессов.

Известно, что образование серотонина в организме возрастает при карциноидном синдроме, при злокачественных опухолях предстательной железы, прямой кишки, при аллергических заболеваниях, туберкулезе, шизофрении. Снижение уровня серотонина отмечено при тромбоцитопенической пурпуре, лейкозах, коллагенозах, ревматоидном полиартрите. В диагностических целях обычно исследуют обычно исследуют концентрацию серотонина в крови и 5-оксииндолуксусной кислоты в моче.

Известны патологические процессы, в которых определенную роль играет образование и освобождение гистамина. Это различные аллергические заболевания, эмоциональное напряжение, реакция на рентгеновское облучение, гипоксию.

Взаимосвязь между гистамином и серотонином в развитии многих патологических процессах изучена недостаточно. Поэтому определенный интерес представляет их одновременное определение в одной пробе.

В литературе описаны несколько методов одновременного определения сертотнина и гистамина в одной пробе крови.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является метод определения содержания гистамина и серотонина в цельной крови (Мещерякова С.А., Герасимова Ц.И. Флуориметрический метод определения гистамина и серотонина в одной пробе. Лабораторное дело, 1974, №11, с.670-672).

Принцип известного метода основан на экстрагировании серотонина и гистамина из крови сульфатом цинка в щелочной среде, очищении от примесей путем экстракции бутанолом и хроматографии на колонке, содержащей янтарнокислую целлюлозу, переведении в водную фазу, с которой осуществляют реакцию орто-фтальальдегидным реактивом. По интенсивности флуоресценции количественно оценивают концентрацию гистамина и серотонина.

Недостатком известного способа определения содержания серотонина и гистамина является то, что в качестве биологического материала, который берется у людей при исследовании, используют кровь, забор которой из вены является травматичным для человека, имеет место повреждение кровеносного сосуда, иногда с последующими нарушениями кровообращения, занесением инфекции в кровь. Эти обстоятельства, а также болевые ощущения и отрицательные эмоции часто служат причиной отказа больных от обследования, тем более в тех случаях, когда необходимо проведение серии анализов с короткими интервалами времени.

Кроме того, при заборе крови человека из вены требуется специально подготовленное помещение с обученным медицинским персоналом, стерильные инструменты и одноразовые шприцы, что приводит к увеличению стоимости обследования.

Техническим результатом, на достижение которого направлено создание данного изобретения, является повышение эффективности способа диагностики за счет упрощения и удешевления процесса обнаружения серотонина и гистамина.

Поставленный технический результат достигается тем, что в способе определения концентрации серотонина и гистамина в биологической жидкости, включающем забор пробы у обследуемого человека, экстрагирование из нее серотонина и гистамина, хроматографирование экстракта и определение концентрации серотонина и гистамина по интенсивности флуоресценции, в качестве биологической жидкости используют слюну, экстракцию 1 мл слюны проводят 4 мл 1 н. раствора хлорной кислоты, после чего добавляют 2 г безводного карбоната калия и 5 мл смеси бутанола и хлороформа в соотношении 3:2, встряхивают, центрифугируют, отсасывают 4 мл органической фазы и пропускают через хроматографическую колонку с диаметром 3 мм и высотой 16 мм с помещенной в нее ионообменной смолой КБ-4, или КБ-4П-2, или Bio Rex - 70 в Н⁺-форме, размер гранул 0,1±0,02 мм, гистамин элюируют 4 мл 0,1 н. соляной кислоты при скорости движения элюирующего раствора 0,4 мл/мин, концентрацию гистамина определяют по реакции с орто-фталевым альдегидом, растворенным в этаноле, концентрацию серотонина определяют по реакции с нингидрином в прошедшей через колонку органической фазе.

Способ осуществляется следующим образом.

В качестве биологического материала используют слюну человека, перед забором пробы которой обследуемый промывает ротовую полость кипяченой водой и обсушивает салфеткой.

В центрифужные пробирки, содержащие 4 мл 1 н. раствора хлорной кислоты, вносят 1 мл слюны, тщательно перемешивают, оставляют на 30 мин для экстракции, а при необходимости можно оставить в холодильнике на 1-2 суток. Затем перемешивают и центрифугируют 15 мин при 3000 об/мин. При необходимости материал можно хранить в замороженном состоянии. При этом потери исследуемого вещества при хранении в течение одного месяца не превышают 3-5%.

Далее к 4 мл экстракта прибавляют 2 г карбоната калия и 5 мл смеси бутанола и хлороформа в соотношении 3:2, встряхивают 3 мин. После этого пробы центрифугируют 3 мин при 3000 об/мин, отсасывают 4 мл органической фазы и пропускают через хроматографическую колонку с диаметром 3 мм и высотой 16 мм и с помещенной в нее ионообменной смолой КБ-4, или КБ-4П-2, или Bio Rex - 70 в H⁺-форме, размер гранул 0,1±0,02 мм. Колонку промывают 1 мл этилового спирта, 3 мл воды и элюируют гистамин 4 мл 0,1 н. соляной кислоты при скорости движения элюирующего раствора 0,4 мл/мин. Для восстановления работоспособности колонку промывают 10 мл 1 н. соляной кислоты, затем 10 мл воды. Хранить ионообменную смолу следует в воде.

К элюату приливают 0,15 мл 5 н. раствора гидроксида натрия, 0,1 мл 0,1% раствора орто-фталевого альдегида в этиловом спирте, тщательно перемешивают. Через 4 минуты приливают 0,5 мл 1,5 М раствора ортофосфорной кислоты, перемешивают. Величину флуоресценции измеряют при длине волны 470 нм, используя для возбуждения светофильтр с максимум пропускания 365 нм на флуориметре БИАН-130. Интенсивность свечения стабильна в течение 30 минут.

Для определения серотонина к органической фазе, прошедшей через хроматографическую колонку, добавляют 0,33 М раствор фосфата натрия для проведения рН до 6,5-7. Затем приливают 0,1 мл 0,1 М раствора нингидрина, перемешивают и помещают в термостат на 30 минут при температуре 75°С. Охлаждают в воде и через час измеряют флюоресценцию при длине волны 470 нм. Длина волны возбуждения 365 нм.

По определенной интенсивности флуоресценции и калибровочной кривой определяют концентрацию серотонина и гистамина, повышенная концентрация которых свидетельствует об увеличении уровня этих веществ в организме, о повышении их концентрации в крови, а понижение содержания любого из этих веществ в слюне свидетельствует соответственно об уменьшении их количества в организме.

Метод определения концентрации серотонина по реакции с нингидрином в известном способе недостаточно специфичен.

Для повышения специфичности часто применяют различные варианты экстракции органическими растворителями. Но и в этом случае метод по специфичности уступает реакции с орто-фталевым альдегидом. Для повышения специфичности заявителями использована колоночная ионообменная хроматография в сочетании с экстракцией бутанолом в щелочной среде при высокой концентрации солей в растворе.

Известно применение хроматографических методов при определении гистамина. При этом изготовление янтарнокислой целлюлозы по известному методу трудоемко.

Заявителями предложено использование выпускаемой промышленностью ионообменной смолы. В результате проведенных заявителями исследований было установлено, что наиболее оптимальными характеристиками для выделения гистамина из слюны обладают слабые катиониты - ионообменные смолы КБ-4 и КБ-4П-2, Bio Rex -70.

Заявителями были проведены дополнительные исследования с учетом специфики состава слюны и наличия в ней веществ, которые могут образовывать флуоресцирующие продукты при использованных нами длинах волн. Для обеспечения необходимой специфичности метода нами были подобраны оптимальные условия экстракции и параметры хроматографической колонки, размер гранул смолы.

Заявителями подобраны диаметр хроматографической колонки 3 мм, высота 16 мм, скорость движения элюирующего раствора 0,4 мл в минуту. В качестве элюирующего раствора предложена 0,1 н. соляная кислота.

При экстракции предложенная авторами в прототипе смесь солей со щелочью заявителями заменена на безводный карбонат калия. Как показали исследования, проведенные нами, именно эта соль способствует максимальной экстракции гистамина и серотонина и минимальной экстракции мешающих его определению примесей при предложенном нами способе экстракции и хроматографии с учетом специфики используемого биологического материала - слюны.

Из всех известных способов осаждения белков в слюне оказался наиболее эффективным способ с помощью хлорной кислоты. Поскольку, как было установлено заявителями, хлорная кислота (точнее перхлорат-анион) мешает адсорбции гистамина на ионообменной смоле, было предложено осадить ее добавлением карбоната калия. Эта соль выполняет две функции: создает высокую концентрацию солей и оптимальную величину рН для экстракции гистамина в бутанол и осаждает перхлорат калия. Использованный заявителями способ депротеинизации имеет преимущество перед тем, который применен в прототипе, поскольку серотонин быстро разрушается в щелочной среде, что может иметь существенное значение при одновременной обработке большого числа проб.

При экстракции заявителями не использован дорогостоящий гептан, требующий трудоемкой очистки. Для растворения орто-фталевого альдегида вместо токсичного метанола применен этанол.

Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации, и выявление источников, содержащих сведения об аналогах заявляемого изобретения, позволил установить, что заявитель не обнаружил аналог, характеризующийся признаками тождественными (идентичными) всем существенным признакам заявляемого изобретения.

Определение из перечня аналогов наиболее близкого технического решения (прототипа) позволило выявить совокупность существенных по отношению к усматриваемому техническому результату отличительных признаков в заявляемом способе диагностики гипергистаминемии, изложенных в формуле изобретения.

Следовательно, заявляемое изобретение соответствует критерию “новизна”.

Для проверки соответствия заявляемого изобретения критерию “изобретательский уровень” заявителем проведен дополнительный поиск известных решений, чтобы выявить признаки, совпадающие с отличительными от прототипа признаками заявляемого способа диагностики гипергистаминемии.

Результаты поиска показали, что заявляемое изобретение не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, определенного заявителем.

Следовательно, заявляемое изобретение соответствует критерию “изобретательский уровень”.

Критерий изобретения “промышленная применимость” подтверждается тем, что предлагаемый способ может быть успешно, с большой эффективностью использован в медицинских учреждениях России и СНГ.

Способ определения концентрации серотонина и гистамина в биологической жидкости, включающий забор пробы у обследуемого человека, экстрагирование из нее серотонина и гистамина, хроматографирование экстракта и определение концентрации серотонина и гистамина по интенсивности флуоресценции, отличающийся тем, что в качестве биологической жидкости используют слюну, экстракцию 1 мл слюны проводят 4 мл 1 н раствора хлорной кислоты, после чего добавляют 2 г безводного карбоната калия и 5 мл смеси бутанола и хлороформа в соотношении 3:2, встряхивают, центрифугируют, отсасывают 4 мл органической фазы и пропускают через хроматографическую колонку с диаметром 3 мм и высотой 16 мм с помещенной в нее ионообменной смолой КБ-4 или КБ-4П-2, или Bio Rex – 70 в Н⁺-форме, размер гранул 0,1±0,02 мм, гистамин элюируют 4 мл 0,1 н соляной кислоты при скорости движения элюирующего раствора 0,4 мл/мин, концентрацию гистамина определяют по реакции с ортофталевым альдегидом, растворенным в этаноле, концентрацию серотонина определяют по реакции с нингидрином в прошедшей через колонку органической фазе.