Способ выделения и селекции бактерий-продуцентов циклодекстринглюканотрансферазы, штамм бактерий bacillus circulans b-65 ncaim (p) 001277 (b-65) - продуцент внеклеточной циклодекстринтрансферазы, циклодекстринглюканотрансфераза, полученная из него, и его применение для получения циклодекстрина

Способ выделения и селекции бактерий-продуцентов циклодекстринглюканотрансферазы, штамм бактерий bacillus circulans b-65 ncaim (p) 001277 (b-65) - продуцент внеклеточной циклодекстринтрансферазы, циклодекстринглюканотрансфераза, полученная из него, и его применение для получения циклодекстрина

Реферат

Область изобретения

Это изобретение касается биотехнологии, в частности способа получения циклодекстрина путем воздействия циклодекстринглюканотрансферазы (называемой также ЦГТ-аза) на крахмал и продукции ЦГТ-азы бактериями штамма Bacillus circulans B-65. По Международной классификации изобретение относится к следующим классам: С 08 В 37/16; С 12 Р 19/18; C 12 N 1/20; C 12 N 9/10.

Цели изобретения

Это изобретение решает проблему биосинтеза ЦГТ-азы, которая обычно используется для получения циклодекстрина, а также проблему получения циклодекстрина путем воздействия ЦГТ-азы на крахмал. Биосинтез ЦГТ-азы чаще всего осуществляют с помощью бактерий рода Bacillus, которые обычно продуцируют ЦГТ-азу, воздействующую на крахмал с образованием смеси α-, β- и γ-циклодекстринов в различном соотношении, в то же время выход отдельного циклодекстрина не высок, и его выделение увеличивает стоимость продукции.

Биосинтез ЦГТ-азы согласно изобретению осуществляется алкалифильными бактериями нового штамма Bacillus circulans B-65, характеризующегося продукцией большого количества ЦГТ-азы, которая обычно используется для получения циклодекстрина. Циклодекстрины получают с помощью ЦГТ-азы из бактерий В. circulans, которая характеризуется высокой степенью превращения крахмала в циклодекстрины, и специфична для образования β-циклодекстрина.

Уровень техники

Циклодекстрины получают путем воздействия ЦТГ-азы на крахмал. В процессе получения циклодекстринов наиболее важной стадией является получение ЦТГ-азы. ЦТГ-аза продуцируется некоторыми видами бактерий, среди которых чаще всего встречаются бактерии, относящиеся к роду Bacillus: В. macerans, В. circulans, В. megaterium, В. coagulans, B.lentus, В. ohbensis, В. firmus, В. amyloliquefaciens, В. stearothermophilus, В. subtilis, B.cerus. ЦТГ-аза продуцируется и некоторыми другими бактериями, не принадлежащими к роду Bacillus, например: Klebsiella pneumoniae, Micrococcus luteus, Micrococcus varians. Чаще всего в качестве продуцентов ЦГТ-азы выступают бактерии Bacillus macerans и алкалифильные бактерии, относящиеся к роду Bacillus.

ЦГТ-аза продуцируется растущими бактериями в жидкой среде в аэробных условиях в ферментаторе. Этот процесс является весьма дорогостоящим, и бактерии продуцируют определенное количество ЦГТ-азы. Дорогостоящий процесс получения ЦГТ-азы существенно влияет на высокую стоимость конечного продукта, т.е. циклодекстрина, что ограничивает его широкое применение во многих отраслях промышленности.

Поскольку циклодекстрины имеют широкое применение в промышленности и их стоимость является одним из существенных факторов, ограничивающих их применение, ученые всех стран ищут пути увеличения экономичности способа получения ЦГТ-азы. Для этой цели проводят оптимизацию состава питательной среды и оптимизацию физико-химических факторов для роста бактерий, ведутся работы по увеличению продуктивности бактерий с использованием различных генетических методов (индуцированного мутагенеза, генной инженерии), также ведутся работы по выделению новых микроорганизмов, которые характеризуются высокой продукцией ЦГТ-азы.

В способе получения циклодекстрина также очень важны свойства ЦГТ-азы, продуцируемой бактериями. Свойства ЦГТ-аз, продуцируемых различными видами бактерий, относящимися к роду Bacillus, представлены в Таблице 1.

Таблица 1: Свойства ЦГТ-аз из различных микроорганизмов
Продуцент ЦГТ-азы	Соотношение α-, β- и γ-ЦД	Оптим. рН	рН устой-чивость	Оптим. темп-pa (°С)	Термостабильность (°С)
без Са2+	с Са2+
Bacillus coagulans (термофил)	2:2,6:1	6,5	6,0-9,0	65	50	60
Алкалифильный Bacillus sp. (АТСС21783)	71% β-ЦД	6,5 и 8,5	-	65
Bacillus macerans (IF03490)	71% α-ЦД	5,5	-	55	-	-
Bacillus lentus (алкалифиль-ный)	1:67:1,6	6,5-7,5	6,5-8,5	45-55	-	-
Bacillus sp. (алкалифиль-ный)	в основном β-ЦД	6,0	6,0-11,0	55	60	-
Bacillus sp. (термофил)	-	6,5	5,0-10	50	55	-
Bacillus stearothermophilus	-	5,0-5,5	5,0-8,0	70-75	65	70
Bacillus macerans (IAM 1243)	-	6,0	5,5-9,5	60	50	-
Bacillus macerans	-	5,4-5,8	-	60	50	-
Продуцент ЦГТ-азы	Соотношение α-, β- и γ-ЦД	Оптим. рН	рН устойчивость	Оптим. темп-pa (°С)	Термостабильность (°С)
без Са2+	с Са24
Bacillus macerans (IFO 3490)	2,7:1:1	5,0-5,7	8,0-10	55	60	-
Bacillus egaterium	1:2,4:1	5,0-5,7	7,0-10	55	55	-
Bacillus circulans	3:3:1	5,5	6,0 9,0	60	45	60
Bacillus amyloliquefaciens	95% α-ЦД	6,0	-	70	60	65
Bacillus sp.	1,6:4:1	5,5	6,0-9,5	65-70	65	-
Bacillus ohbensis	в основном β-ЦД	5,5	6,5-9,5	60	55	-
Bacillus macerans (IAM 1227)	в основном α-ЦД	5,5	6,5 8,5	50	50	-
Bacillus circulans (IF03329)	β->α-ЦД	6,0	6,0-9,5	55	55	-
Bacillus coagulans (термофил)	1:0,9:0,3	-	-	-	-	-
Bacillus cereus (NCIMB 13123)	22:23:0	5,0	-	40	-	-
Bacillus firmus (алкалифил)	0,08:1:0,2	-	-	-	-	-
Акалифильный Bacillus subtilis	0:25,1:4,7	-	-	50	-	-
Акалифильный Bacillus sp.	5,7:23,5:4,7	-	-	40	-	-

Из представленных данных можно видеть, что ЦГТ-азы из различных микроорганизмов демонстрируют похожие свойства, но есть и определенные различия. Наибольшие различия среди ЦГТ-аз касаются количеств образующихся специфических α-, β- или γ-циклодекстринов, ЦГТ-азы образуют в основном смесь α; β- и γ-циклодекстринов в различном соотношении. Однако существуют ЦГТ-азы, которые не образуют α- или γ-циклодекстрины. Большинство ЦГТ-аз образуют смесь циклодекстринов, в которой преобладает β-циклодекстрин, тогда как γ-циклодекстрин присутствует в минимальном количестве. Алкалифильные микроорганизмы продуцируют ЦГТ-азы, которые дают наибольшее содержание β-циклодекстрина, по сравнению с α- и γ-циклодекстринами. ЦГТ-азы из алкалифильных микроорганизмов образуют β-циклодекстрин, который составляет более 70% от общего количества циклодекстринов. Из данных, представленных в Таблице 1, мы можем сделать вывод, что ЦГТ-азы, продуцируемые штаммами, относящимися к видам Bacillus macerans, дают наибольший выход α-циклодекстрина, по сравнению с другими циклодекстринами. Кроме В. macerans, ЦГТ-аза, продуцируемая В. amyloliquefaciens AL 35, также образует α-циклодекстрин с выходом до 95%. В отличие от большинства ЦГТ-аз из различных продуцентов, ЦГТ-аза, продуцируемая Bacillus subtilis №313, образует γ-циклодекстрин, но не образует ни α-, ни β-циклодекстрины. ЦГТ-аза из Bacillus sp. AL-6 также дает наибольший выход γ-циклодекстрина и β-циклодекстрина, но не образует α-циклодекстрин.

В способе получения циклодекстринов с использованием ЦГТ-аз, которые в конце реакции дают смесь циклодекстринов, α-, β- и γ-циклодекстрины образуются в различном соотношении, и наибольший выход одного какого-либо циклодекстрина приводит к наименьшему выходу других циклодекстринов. После завершения ферментативной реакции с образованием циклодекстринов, осуществляют их выделение и очистку. Поскольку выделение и очистка циклодекстринов увеличивают стоимость способа их получения, желательно выделить микроорганизмы, которые продуцируют ЦГТ-азы, специфичные для образования одного из циклодекстринов.

Из патента US 4477568 известна ЦГТ-аза, полученная путем культивировния бактерий Bacillus circulans RIV №11115, которая используется для получения циклодекстринов. С помощью этой ЦГТ-азы можно получить до 66% β-циклодекстринов. Эта ЦГТ-аза активна при температуре 60°С, но ее активность существенно снижается при 65°С, в диапазоне рН от 4 до 7 (рН оптимум - 6-6.5). Существует необходимость в получении фермента, который будет продуцировать более 66% β-циклодекстринов и будет активен в более широком диапазоне температур, а также и при более высоких рН, что существенно уменьшит опасность инфекций.

Краткое изложение изобретения

Биосинтез ЦГТ-азы, которая затем используется для получения циклодекстрина, осуществляется алкалифильными бактериями штамма Bacillus circulans B-65. Биосинтез осуществляется растущими бактериями в щелочной (рН 10) жидкой среде, в аэробных условиях, в ферментаторе. Эта питательная среда содержит: в качестве источника углерода - от 0,5 до 3% крахмала, в качестве источника азота - от 0,5 до 6% вещества, выбранного из группы, состоящей из пептона, дрожжевого экстракта, дрожжевого автолизата, кукурузного автогидролизата (corn step liquid) или их смеси, в качестве источника минералов: К₂НРO₄, MgSO₄ × 7H₂O, Na₂CO₃.

После завершения биосинтеза бактериальные клетки удаляют путем центрифугирования или фильтрации, и затем внеклеточно продуцируемые ЦГТ-азы концентрируют с помощью ультрафильтрации.

При воздействии полученной таким образом ЦГТ-азы на крахмал, концентрация которого варьирует от 5% до 15%, получают циклодекстрины. Ферментативную реакцию осуществляют в течение 24 часов в щелочной среде (рН 8,0) при температуре 60°С.

Новизна этого изобретения заключается в том, что биосинтез ЦГТ-азы, которая используется для получения циклодекстрина, осуществляют с использованием алкалифильных бактерий В. circulars B-65. Эти бактерии были выделены из почвы, взятой на территории г. Лесковац. Бактерии В. circulans были выделены из приблизительно 2000 бактериальных колоний, которые характеризовались продукцией ЦГТ-азы. Изолят, который затем был идентифицирован и обозначен как В. circulans В-65, продемонстрировал существенно большую активность в продуцировании ЦГТ-азы, и это свойство явно отличает его от других изолятов. Таким образом, алкалифильные бактерии В. circulans B-65 представляют собой новый штамм, отличающийся тем, что он продуцирует значительное количество ЦГТ-азы, которая может использоваться для получения циклодекстринов. Штамм Bacillus circulans B-65 депонирован в Национальной коллекции сельскохозяйственных и промышленных микроорганизмов (National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, NCAIM) в Будапеште под номером NCAIM (Р) 001277.

Преимущество использования ЦГТ-азы, которая продуцируется данным алкалифильным штаммом В. circulans B-65, заключается в его использовании для получения β-циклодекстрина. ЦГТ-аза этого штамма специфична для образования β-циклодекстрина и характеризуется высокой степенью превращения крахмала в β-циклодекстрин. В описанных условиях реакции при концентрации крахмала 5%, ЦГТ-аза осуществляет превращение до 45% крахмала в циклодекстрины. Из общего количества продуцируемых циклодекстринов количество β-циклодекстрина составляет около 95%, что является наиболее высоким значением, по сравнению с имеющимися литературными данными. В отличие от ЦГТ-азы, известной из патента US 4477568, ЦГТ-аза согласно изобретению активна при более высоких температурах (вплоть до 75°С), в более широком диапазоне рН (от 4 до 12).

Отличие способа выделения и селекция бактерий-продуцентов ЦГТ-азы согласно изобретению от известного из патента US 4477568 также заключается в том, что в состав среды для культивирования бактерий в качестве основания входит фенолфталеин или метилоранж и не используется FeСl₃ × 6Н₂О.

Выделение и селекция бактерий-продуцентов ЦГТ-азы

ЦГТ-азы, продуцируемые бактериями, были выделены из 54 различных образцов почвы, которые были взяты на территории г. Лесковац. Суспензию почвы (0,5-1,0 г) в 10 мл стерильной дистиллированной воды нагревали в течение 10 минут при 80°С. После нагревания 0,1 мл почвенной суспензии наносили на агаровые чашки со средой Парка, содержащей: 1% растворимого крахмала, 0,5% пептона, 0,5% дрожжевого экстракта, 0,1% К₂НРО₄, 0,02% MgSO₄ · 7H₂O, 1% Na₂CO₃, 0,03% фенолфталеина, 0,01% гелиантина, 1,5% агара, рН 10,0 (Park et al., 1989). Инкубацию осуществляли при 37°С. Через 48 часов инкубации, колонии, окруженные наиболее широкими желтыми зонами на окрашенных в красный цвет агаровых чашках, выделяли и очищали.

Число колоний, полученных из различных образцов почвы, варьировало в диапазоне от 0 до 200. Колонии, которые продуцировали ЦГТ-азу, были окружены желтыми зонами различной величины. Различные образцы почвы имели различный процент колоний, продуцирующих ЦГТ-азу, который варьировал от 0 до 90% от общего числа колоний. Принимая во внимание размер зоны вокруг колоний, выделили и очистили 85 колоний из 2000 колоний, продуцирующих ЦГТ-азы. После очистки на среде Парка были отобраны 45 колоний для дальнейшей работы. Отобранные колонии переносили на скошенный агар со средой Хорикоши (Horikoshi) II и после инкубации хранили при +4°С.

45 отобранных алкалифильных изолятов, продуцирующих ЦГТ-азу, выращивали в жидкой среде во флаконах Эрленмейера при перемешивании для последующей селекции изолятов. Инкубацию осуществляли при 37°С в течение 48 часов при постоянном перемешивании 200 об/мин. На третий и четвертый день отбирали образцы, и после удаления бактериальных клеток путем центрифугирования (10000 × g, 10 мин, +4°С) определяли амилолитическую и циклодекстриногенную активности супернатанта.

Амилолитическая активность изолятов варьировала в диапазоне от 0,4 U/мл до 12,17 U/мл. Наибольшее количество изолятов продемонстрировало амилолитическую активность от 1 U/мл до 2 U/мл. Количество изолятов, которые показали более высокую амилолитическую активность, постепенно уменьшалось, так что амилолитическую активность выше 5 U/мл продемонстрировали только 3 изолята. Циклодекстриногенная активность варьировала в диапазоне от 0,019 U/мл до 0,530 U/мл. Циклодекстриногенная активность большинства изолятов составляла до 0,100 U/мл. Циклодекстриногенная активность выше 0,200 U/мл была продемонстрирована единственным изолятом. Изолят В-65 показал амилолитическую активность 12,17 U/мл и циклодекстриногенную активность 0,530 U/мл, которые были существенно выше, по сравнению с другими изолятами.

Морфологические и таксономические характеристики бактериального штамма

С целью идентификации были исследованы морфологические и физиолого-биохимические характеристики бактериального штамма. Результаты исследования были проанализированы с помощью “Bergey’s Manual Systematic Bacteriology” (Систематического справочника по бактериологии под редакцией Bergey, Sneath, 1968). В качестве контрольного штамма использовали Bacillus circulans (ATCC 4513).

Результаты этих исследований показали, что бактерии нового штамма представляют собой палочки, имеющие размер 0,6-0,7 × 2-4 мкм, являются подвижными, грамположительными, образуют эндоспоры эллиптической формы, растут в аэробных и анаэробных условиях и продуцируют каталазу. Эти характеристики показывают, что данный бактериальный штамм принадлежит к роду Bacillus. Результаты этих исследований показывают, что бактериальный штамм: демонстрирует отрицательную реакцию по Voges-Proskauer; продуцирует кислоты из глюкозы, арабинозы, ксилозы и маннита; не продуцирует газ из глюкозы; гидролизует желатин и крахмал; не использует (не метаболизирует) цитраты; не продуцирует индол; не растет в среде с рН 6,8 и 5,7 и демонстрирует хороший рост в среде с 2, 5, 7 и 10% NaCl.

Морфологические и физиолого-химические характеристики изолята В-65 в основном совпадают с характеристиками Bacillus circulans. Однако существенной особенностью изолята В-65 является то, что он демонстрирует хороший рост в щелочной среде (рН 10) и не растет в нейтральной среде, такой как питательная среда с рН 6,8, что отличает его от описанных штаммов Bacillus circulans. Изолят В-65 также отличается от штаммов Bacillus circulans тем, что растет в среде с 10% NaCl.

На основании указанных характеристик изолят В-65 был идентифицирован как штамм Bacillus circulans. Поскольку его особенностью является хороший рост в щелочной среде (рН 10) и отсутствие роста в нейтральной среде, изолят В-65 обозначили как алкалифильный штамм Bacillus circulans В-65. Характристики изолята В-65 представлены в Таблице 2.

Таблица 2: Характеристики бактерий Bacillus circulans (ATCC 4513) и изолята В-65
Морфологические и физиолого-биохимические характеристики	Bacillus circulans(ATCC 4513)	Изолят В-65
Форма	Палочки	Палочки
Размер (мкм)	0,5-0,7×2-5	0,6-0,7×2-4
Подвижность	+	+
Форма спор	эллиптическая	эллиптическая
Окрашивание по Граму	+	+
Каталаза	+	+
Анаэробный рост	+	+
Анализ по Voges-Proskauer	-	-
Продукция кислот из углеводов:D-глюкозаL-арабинозаD-ксилозаD-маннит	++++	++++
Продукция газа из глюкозы	-	-
Гидролиз: желатинакрахмала	++	++
Использование цитратов	-	-
Продукция индола	-	-
Рост при рН: 6,8 (питательная среда)5,7	++	--
Рост в присутствии NaCl: 2%5%7%10%	+++-	++++
Рост при: 30°С37°С40°С	+++	+++

Биосинтез ЦГТ-азы штаммом В, circularis B-65

Биосинтез ЦГТ-азы осуществляется бактериями штамма В. circulans B-65, растущими в щелочной (рН 10) жидкой среде. Питательная среда включает: 1% растворимого крахмала, 0,5% пептона-1, 0,5% дрожжевого экстракта, 0,1% К₂НРО₄, 0,02% MgSО₄ × 7H₂O, 1% Na₂CO₃.

Инокулят для способа получения ЦГТ-азы приготавливали путем инокуляции культуры, взятой из скошенного агара, в жидкую среду. Инкубацию проводили при 37°С при постоянном перемешивании (200 об/мин) в течение 48 часов. В ферментатор со свежей средой вносили 5% инокулята. Биосинтез ЦГТ-азы осуществляли в течение 96 часов при 37°С в потоке стерильного воздуха при 0,5 vvm (volume of air per volume of medium min^-1, объем воздуха на объем среды в минуту) при скорости вращения мешалки 300^-1. Через 96 часов роста бактериальные клетки удаляли путем центрифугирования (10000 × g, 10 мин, +4°С) или путем фильтрации, и затем осуществляли концентрированно внеклеточно продуцируемой ЦГТ-азы путем ультрафильтрации. Полученную таким образом ЦГТ-азу использовали затем для получения циклодекстрина. В процессе получения определяли амилолитическую и циклодекстриногенную активности ЦГТ-азы, внеклеточно продуцируемой штаммом В. circulans B-65. Клеточный рост и активность ЦГТ-азы, продуцируемой штаммом В. circulans B-65, растущим в описанных условиях, охарактеризованы в Таблице 3.

Таблица 3
Активность ЦГТ-азы, клеточный рост и изменения рН в процессе роста штамма В. circulans B-65
Время (ч)	Активность Амилолитическая активность	ЦГТ-азы (U/мл) Циклодекстриногенная активность	Клеточный рост (610 нм)
0	/	/	0,125
24	7,30	0,20	1,677
48	9,70	0,24	1,489
72	14,85	0,38	1,497

ЦГТ-аза продуцируется в процессе клеточного роста. До завершения фазы роста величина циклодекстриногенной активности достигает 0,20 U/мл, что составляет чуть более 30%, по сравнению с активностью, полученной после 96-часового периода роста. После завершения фазы роста продукция ЦГТ-азы продолжается, так что через 96 часов роста циклодекстриногенная активность достигает величины 0,60 U/мл, а амилолитическая активность 23,37 U/мл. Увеличение циклодекстриногенной и амилолитической активностей после завершения фазы роста составляет около 70% от общей величины. Таким образом, изолят B-65 продуцирует больше ЦГТ-азы после завершения фазы клеточного роста.

В процессе роста В. circulans B-65 амилолитическая и циклодекстриногенная активности увеличиваются пропорционально, что приводит к выводу, что штамм В. circulans B-65 продуцирует ЦГТ-азу и не продуцирует какие-либо другие амилолитические ферменты.

Этот вывод подтверждается определением содержания циклодекстринов и восстанавливающих сахаров во время инкубации ЦГТ-азы из В, circulans B-65 с крахмалом. Эти результаты показали, что в ходе реакции наблюдалось образование циклодекстринов, в то время как количество восстанавливающих сахаров не увеличивалось, что имело бы место в присутствии других амилолитических ферментов.

Преимущество данного способа получения ЦГТ-азы, которое подтверждается данными результатами, состоит в том, что биосинтез ЦГТ-азы осуществляется новым алкалифильным штаммом В. circulans B-65, который характеризуется внеклеточной продукцией большого количества ЦГТ-азы. Другой, также важной характеристикой штамма В. circulans B-65 является то, что кроме ЦГТ-азы этот штамм не продуцирует другие амилолитические ферменты. Присутствие этих ферментов в препаратах ЦГТ-азы в процессе получения циклодекстринов привело бы к гидролизу крахмала, то есть к уменьшению концентрации субстрата для получения циклодекстринов, что оказало бы негативное влияние на конечный выход продукта.

Преимущество биосинтеза ЦГТ-азы штаммом В. circulans B-65, по сравнению с другими продуцентами этого фермента состоит в том, что биосинтез ЦГТ-азы штаммом В. circulans B-65 осуществляется в очень щелочной среде (рН 10), при этом снижается риск инфекции другими микроорганизмами, что чрезвычайно важно для производства в промышленных условиях.

Свойства ЦГТ-азы из В. circulans B-65

Кроме того, что штамм В. circulans B-65 продуцирует ЦГТ-азу в большом количестве, очень важно, что эта ЦГТ-аза характеризуется хорошими свойствами, касающимися термостабильности и оптимальной для ее активности температуры, а также рН-устойчивости и оптимальных значений рН.

ЦГТ-аза из штамма В. circulans B-65 характеризуется тем, что она стабильна при температурах до 55°С, и в присутствии Са²⁺ ее стабильность увеличивается до 60°С. Оптимальная температура для ее действия составляет 60°С. Благодаря высокой оптимальной температуре действия и высокой термостабильности ЦГТ-азы из штамма В. circulans B-65 способ получения циклодекстринов осуществляют при температуре 60°С. Преимущество получения циклодекстринов при высокой температуре состоит в том, что при этих условиях реакции уменьшается риск инфекции другими микроорганизмами. При высоких температурах также выше скорость ферментативной реакции, что уменьшает длительность процесса получения циклодекстринов.

ЦГТ-аза из штамма В. circulans B-65 характеризуется тем, что оптимальное для ее активности значение рН находится в пределах рН от 5,0 до 6,0, однако ЦГТ-аза сохраняет свою активность в довольно широком диапазоне значений рН в щелочной среде. ЦГТ-аза из штамма В. circulans B-65 стабильна при рН от 6,5 до 10,0. Благодаря этим свойствам ЦГТ-азы получение циклодекстринов может осуществляться в широком диапазоне значений рН. Константа Михаэлиса для ЦГТ-азы из штамма B.circulans B-65 составляет от 3,016 мг/мл (рассчитанная методом Lineweaver-Burck) до 4.77 мг/мл (рассчитанная методом Idi-Hofsti). Ингибиторами этого фермента являются NaN₃, CuSO₄, MnSO₄, FeSO₄, MgSO₄ и глюкоза.

Результаты изучения свойств ЦГТ-азы из штамма В. circulans B-65 представлены ниже.

Влияние рН на активность ЦГТ-азы

Влияние рН на активность ЦГТ-азы исследовали в диапазоне рН от 4,0 до 10,0 при температуре 40°С. Для подведения рН использовали следующие буферы: 50 Мм ацетатный буфер (рН 4-5), 50 мМ фосфатный буфер (рН 5-8), 50 мМ карбонатный буфер (рН 8-10). Результаты этих исследований, представленные в Таблице 4, показывают, что оптимальное значение рН для активности ЦГТ-азы находится в пределах рН от 5,0 до 6,0, однако ЦГТ-аза сохраняет свою активность в довольно широком диапазоне значений рН в щелочной среде.

Таблица 4
Циклодекстриногенная активность ЦГТ-азы при различных значениях рН.
РН	50 мМ буфер	Циклодекстриногенная активность (U/мл)	Относительная активность (%)1
4	Ацетатный	0,18	19,8
4,5	0,74	80,4
5	Фосфатный	0,92	100
5,5	0,91	98,9
6	0.89	96,7
6,5	0,76	82,6
7	0,66	71,7
8	0,56	60,3
9	Карбонатный	0,42	45,2
10	0,26	28,6
28,6Относительная активность выражается как процент от максимальной активности, полученной при рН 5,0.

Влияние рН на стабильность ЦГТ-азы

Влияние рН на стабильность ЦГТ-азы исследовали в диапазоне рН от 4,0 до 12,0. Для подведения рН использовали следующие буферы: 50 мМ ацетатный буфер (рН 4-5), 50 мМ фосфатный буфер (рН 6-7), 50 мМ трис-HCl буфер (рН 8-10) и 50 мМ глицин-NaOH буфер (рН 11-12). ЦГТ-азу инкубировали при различных значениях рН в течение 1 часа при 40°С, и затем рН подводили до 6,0 и определяли остаточную ферментативную активность. Результаты этих исследований представлены в Таблице 5, показывающей, что ЦГТ-аза была стабильна в широком диапазоне рН-значений от 6,5 до 10,0.

Таблица 5
Остаточная ЦГТ-азная активность после инкубации при различных значениях рН
рН	50 мМ буфер	Циклодекстриногенная активность (U/мл)	Относительная активность (%)
4	Ацетатный	0,18	19,8
5	0,74	80,4
6	Фосфатный	0,92	100
6,5	0,91	98,9
7	0,89	96,7
8	Трис-HCl	0,76	82,6
9	0,66	71,7
10	0,56	60,3
11	Глицин-NaOH	0,42	45,2
12		0,26	28,6

Влияние температуры на активность ЦГТ-азы

Влияние температура на активность ЦГТ-азы в диапазоне температур от 30°С до 75°С при рН 6,0. Результаты этих исследований показали, что оптимальная температура для ЦГТ-азной активности составляла 60°С (Таблица 6).

Таблица 6: Активность ЦГТ-азы при различных температурах
Температура (°С)	Относительная активность (%)
30	23,1
40	36,2
45	49,8
50	71,7
55	85
60	100
65	94,7
70	45,3
75	15,9

Влияние температуры на стабильность ЦГТ-азы

Влияние температуры на стабильность ЦГТ-азы исследовали в диапазоне температур от 30°С до 80°С. Исследование термостабильности ЦГТ-азы проводили в отсутствие и в присутствии ионов Са²⁺ в концентрации 10 мМ. ЦГТ-азу инкубировали в течение 30 минут при различных температурах при рН 8,5, и затем рН подводили до 6,0 и исследовали остаточную ферментативную активность.

Результаты исследования (Таблица 7) показали, что ЦГТ-аза была стабильна в диапазоне температур до 55°С и что в присутствии ионов Са²⁺ ее стабильность увеличивалась до температуры 60°С.

Таблица 7
Остаточная ЦГТ-азная активность после инкубации при различных температурах
Температура(°С)	Остаточная активность (%) без Са2+	Остаточная активность (%) с Са2+
30	97	97,3
40	98,3	96,8
50	96	96,8
55	96	98,2
60	52,8	96,8
65	17,2	81,7
70	3	19,0
75	-	0
80	-	0

Получение ииклодекстринов

Циклодекстрины получают, воздействуя ЦГТ-азой из штамма В. circulans B-65 на крахмал в концентрации от 5% до 15%. Благодаря высокой оптимальной температуре действия фермента и высокой термостабильности ЦГТ-азы из штамма В. circulans B-65, процесс получения циклодекстринов можно осуществлять при температуре до 60°С. Что касается значений рН, получение циклодекстринов можно проводить в широком диапазоне значений рН от 6,5 до 10,0.

Выход циклодекстринов в процессе инкубации 5%-ного раствора крахмала с различными концентрациями ЦГТ-азы при 40°С и рН 6,5 представлен в Таблице 8.

Таблица 8
Выход циклодекстринов при различных концентрациях ЦГТ-азы1
Концентрация ферментов (U/г крахмала)	Время инкубации(ч)	ЦД(г/л)	Выход ЦД2(%)
Циклодекстриногенная активность	Амилолитическая активность
0,6	23,4	24	10,8	21,6
1,2	46,8	24	11,2	22,3
1,8	70,2	24	11,7	23,3
2,4	93,6	24	12,1	24,2
3,0	117	2448	14,819,2	29,538,4
4,5	175	2448	17,819,7	35,639,4
6,0	234	2448	21,722,5	43,344,9
7,5	293	2448	21,120,3	42,240,6
40,6Реакционную смесь, которая содержала 5% крахмала и соответствующую концентрацию фермента, инкубировали в течение 48 часов при 40°С. 2Выход ЦД представляет степень превращения крахмала в ЦД.

Наилучшие результаты были получены для ЦГТ-азы в концентрации 6,0 U (циклодекстриногенная активность)/г крахмала. При такой концентрации ЦГТ-азы примерно 45% крахмала превращалось в циклодекстрины.

После завершения ферментативной реакции получения циклодекстринов их можно удалить из реакционной смеси путем преципитации, используя, например трихлорэтилен или толуол. Из осажденных циклодекстринов β-циклодекстрин можно удалить кристаллизацией, благодаря тому факту, что он значительно менее растворим, по сравнению с другими циклодекстринами. Циклодекстрины, полученные путем преципитации, растворяли в дистиллированной воде при нагревании при 100°С, и затем кристаллизовали β-циклодекстрин при постепенном понижении температуры до 20-25°С при осторожном перемешивании. Кристаллы β-циклодекстрина затем удаляли фильтрацией, промывали небольшим количеством холодной воды и высушивали при 70°С.

При анализе полученных циклодекстринов спектрофотометрическими методами и ВЭЖХ было установлено, что ЦГТ-аза из штамма В. circulans B-65, в описанных условиях, превращает до 45% крахмала в циклодекстрины и в основном образует β-циклодекстрин. В полученных циклодекстринах количество β-циклодекстрина составляет приблизительно 95%, в то время как количество α-циклодекстрина и γ-циклодекстрин составляет 2-3% и 0,6-3% соответственно.

ЦГТ-аза из штамма В. circulans B-65 характеризуется тем, что она специфична для образования р-циклодекстрина и превращает высокий процент крахмала в β-циклодекстрин. Следовательно, использование ЦГТ-азы из нового штамма имеет значительные преимущества для получения β-циклодекстрина, по сравнению с ЦГТ-азами из других известных бактерий.

Следующие примеры иллюстрируют, но не ограничивают данное изобретение.

Пример 1

Продукция ЦГТ-азы

ЦГТ-аза продуцируется растущими бактериями штамма В. circulans B-65 в жидкой среде, содержащей: 1% растворимого крахмала, 0,5% пептона, 0,5% дрожжевого экстракта, 0,1% К₂НРО₄, 0,02% MgSО₄ × 7H₂O, 1% Nа₂СО₃. Инокулят для способа получения ЦГТ-азы получали путем инокуляции в 450 мл жидкой среды Хорикоши (Horikoshi) II культуры из скошенного агара. Инкубацию проводили в течение 48 часов при 37°С при постоянном перемешивании (200 об/мин).

В ферментатор, содержащий 9 л среды Хорикоши, вносили 450 мл инокулята. Рост осуществляли в течение 96 часов при 37°С в потоке стерильного воздуха при 0,5 vvm и скорости вращения мешалки 300 мин^-1. В процессе роста отбирали образцы и определяли амилолитическую и циклодекстриногенную активности супернатанта. Через 96 часов роста бактериальные клетки удаляли путем центрифугирования (10000 × g, 10 мин, +4°С), и затем внеклеточно продуцируемые ЦГТ-азы концентрировали путем ультрафильтрации.

Штамм В. circulans B-65, растущий таким образом, через 96 часов продуцировал внеклеточно ЦГТ-азу с амилолитической активностью 23,4 U/мл и циклодекстриногенной активностью 0,6 U/мл. После концентрирования фермента путем ультрафильтрации получали амилолитическую активность 450 U/мл и циклодекстриногенную активность 12 U/мл.

Пример 2

Получение ииклодекстринов

Растворимый крахмал (300 г) разводили в 6 л воды при нагревании. Температуру доводили до 40°С и рН до 6,5. В раствор крахмала добавляли ЦГТ-азу в концентрации 6U (циклодекстриногенная активность) на г крахмала. Инкубацию осуществляли в течение 30 часов при 40°С.

Через 30 часов инкубации реакцию останавливали путем нагревания реакционной смеси в течение 10 минут при 100°С. Реакционную смесь затем обесцвечивали активированным углем. После удаления с помощью фильтрации активированного угля циклодекстрины осаждали из реакционной смеси (6 л) трихлорэтиленом (1,2 л). Осажденные циклодекстрины затем удаляли фильтрацией и высушивали при 70°С. Конечный выход составлял 107 г циклодекстринов из 300 г крахмала.

Полученные циклодекстрины растворяли в 500 мл дистиллированной воды при нагревании при 100°С. Затем при постепенном понижении температуры до 20-25°С и при осторожном перемешивании осуществляли кристаллизацию β-циклодекстрина. После выдерживания в течение ночи при +4°С кристаллы удаляли фильтрацией, промывали небольшим количеством холодной дистиллированной воды и высушивали при 70°С. Таким образом получали 75,2 г β-циклодекстрина в виде белых кристаллов.

1. Способ выделения и селекции бактерий-продуцентов циклодекстринглюканотрансферазы, отличающийся тем, что бактерии выделяют из образца почвы, приготавливают водную суспензию путем нагревания до 80°С в течение 10-15 мин и инокулируют в агаровые чашки со средой, содержащей крахмал, пептон, дрожжевой экстракт, K₂HPO₄, MgSO₄, Na₂CO₃, фенолфталеин, гелиантин и агар, затем инкубируют от 20 до 72 ч при 37°С, осуществляют селекцию колоний, отобранные колонии культивируют в жидкой среде до тех пор, пока происходит продукция ферментов, и осуществляют отбор изолята Bacillus circulans В-65.

2. Штамм бактерий Bacillus circulans В-65 NCAIM (Р) 001277 (В-65) – продуцент внеклеточной циклодекстринглюканотрансферазы.

3. Способ получения циклодекстринглюканотрансферазы, отличающийся тем, что алкалифильные бактерии штамма Bacillus circulans В-65 культивируют в аэробных условиях в жидкой среде в течение 24-120 ч при температуре от 25 до 50°С, после культивирования бактериальные клетки удаляют путем центрифугирования и фильтрации, и концентрирование внеклеточно продуцируемой ЦГТ-азы осуществляют путем ультрафильтрации.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что питательная среда содержит

- 0,5-3% крахмала в качестве источника углерода,

- 0,5-6% вещества, выбранного в качестве источника азота из группы, состоящей из пептона, дрожжевого экстракта, дрожжевого автолизата, кукурузного автогидролизата или их смеси,

- источники минералов: К₂НРО₄, MgSO₄ × 7Н₂О, Nа₂СО₃.

5. Циклодекстринглюканотрансфераза, катализирующая образование циклодекстрина из крахмала, отличающаяся тем, что получена из штамма Bacillus circulans В-65 способом, охарактеризованным в пп.3 и 4, и имеет специфичность для образования циклодекстрина, в частности β-циклодекстрина, из крахмала, активна при температуре до 75°С, с оптимумом при 60°С, стабильна при температурах до 60°С, активна при рН от 4,0 до 12,0, и особенно при рН от 6,0 до 10,0.

6. Способ получения циклодекстрина, отличающийся тем, что крахмал подвергают действию циклодекстринглюканотрансферазы из штамма Bacillus circulans В-65 при температуре от 40 до 70°С, при рН раствора от 6,0 до 12,0 в течение 20 – 72 ч, после завершения реакции полученные циклодекстрины удаляют путем осаждения трихлорэтиленом или толуолом и β-циклодекстрин затем перекристаллизовывают из дистиллированной воды.

7. Способ по п.6, отличающийся тем, что используют 5-15%-ный раствор крахмала.

8. Способ по п.6, отличающийся тем, что оптимальная температура составляет 60°С.

9. β-Циклодекстрин, отличающийся тем, что его получают способом, охарактеризованным в пп.6-8.