Адгезивные молекулы сосудов и модуляция их функций

Адгезивные молекулы сосудов и модуляция их функций

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение касается идентификации нового подсемейства адгезивных молекул сосудов и модуляции функций таких молекул с целью лечения различных заболеваний.

В процессе эмбрионального и раннего постнатального развития эндотелиальные клетки пролиферируют и дифференцируются с образованием новых кровеносных сосудов за счет процессов васкулогенеза и ангиогенеза. У взрослых организмов эндотелий определяет гематотканевый барьер и состоит из неделящихся (покоящихся) клеток. Такие поляризованные клетки соединены друг с другом с помощью плотных контактов и контактов с помощью адгезинов с образованием непрерывного клеточного слоя. Функции эндотелиального слоя заключаются в поддержании тканевого гомеостаза, фибринолизе, свертывании, подержании тонуса сосудов и перемещении лейкоцитов. Все эти свойства находятся под контролем тонкой настройки экспрессии и функций адгезивных молекул.

Такие патологические ситуации, как воспаление, рост опухолей, образование ран или ангиогенез, приводят к временным изменениям числа и функций адгезивных молекул в эндотелии сосудов, и это обусловливает изменение гомеостаза сосудов. Как пример, опухоли приводят к возрастанию локальной концентрации ангиогенных факторов, которые индуцируют переключение неделящихся покоящихся эндотелиальных клеток в пролиферирующий эндотелий. Ангиогенное переключение индуцируется рядом факторов, включая IL-8, эпидермальный фактор роста (EGF), фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF), растворимый VCAM-1, основной фактор роста фибробластов (bFGF) и фактор некроза опухолей (TNF). Как результат, эндотелиальные клетки существующих сосудов разрушают внеклеточный матрикс (ЕСМ) и внедряются в окружающую ткань, что приводит к васкуляризации опухолей.

В процессе ангиогенного переключения экспрессия генов эндотелия претерпевает модификации. Например, обработка эндотелиальных клеток bFGF или TNFα обусловливает четырехкратное усиление экспрессии интегрина α _vβ ₃ - адгезивной молекулы, участвующей в миграции эндотелиальных клеток. Кроме того, ангиогенное переключение модифицирует воспалительный ответ эндотелия, что приводит к аномальной миграции лейкоцитов по направлению к опухолям. В норме лейкоциты покидают кровяное русло путем прикрепления к эндотелию и миграции через него. Такие механизмы имеют место в многоступенчатом процессе, который вовлекает селектины, интегрины и адгезивные молекулы из суперсемейства иммуноглобулинов.

Было показано, что в эндотелии, ассоциированном с опухолями, VCAM, ICAM и селектины подвержены негативной регуляции. Негативная регуляция данных адгезивных молекул может представлять собой механизм, с помощью которого опухоли избегают инвазии цитотоксическими клетками иммунной системы.

Объектом настоящего изобретения является поиск новых адгезивных белков из суперсемейства иммуноглобулинов (Ig-Sf), которые регулируются на транскрипционном уровне в эндотелии под влиянием опухолей.

Следующим объектом настоящего изобретения является установление молекул, происходящих от новых адгезивных белков, для использования для лечения по различным показаниям, таким как, например, опухоли и воспаление.

В исследованиях, приведших к настоящему изобретению, экспериментальную мышиную модель использовали для идентификации транскриптов, регулируемых в ходе совместного культивирования линии эндотелиальных клеток с меланомными клетками. Для ограничения стратегии скрининга на адгезивные молекулы из состава Ig-Sf был разработан новый способ представления РНК, названный “направленным дифференциальным представлением”. Новое в модифицированном способе представления связано с использованием только одной группы вырожденных праймеров. Как будет показано далее в примерах, неожиданно было обнаружено, что это обеспечивает существенный уровень специфичности.

Более конкретно частично вырожденные праймеры (в данном случае уровень вырожденности находится между 2048 и 4096 разных праймеров в составе одного набора), сконструированные так, чтобы иметь мишенью консервативные последовательности, найденные в доменах С2 членов Ig-Sf, были использованы для осуществления полимеразной цепной реакции (ПЦР) в соответствии со способом направленного дифференциального представления (Samaridis & Colonna, 1997, Eur. J. Immunol., 27, 660-665).

Основываясь на этих данных, настоящее изобретение представляет способ специфичной идентификации дифференцированно экспрессированных ДНК-последовательностей, включающий использование обратнотранскриптазной ПЦР с дифференцированным представлением, в которой используют один набор частично или полностью вырожденных праймеров, специфичных в отношении гена-мишени. Одним основным ограничением стандартной стратегии представления РНК является отсутствие специфичности данного метода. С целью повышения такой специфичности авторы изобретения при проведении поиска других адгезивных молекул использовали вырожденные праймеры, направленные на последовательности, которые кодируют молекулы, включающие домены С2. Этого удалось достичь путем сопоставления доменов С2 из нескольких адгезивных молекул Ig-Sf и идентификации линейного консенсусного аминокислотного мотива, окружающего остаток цистеина, участвующего в организации структуры домена С2: Y-(RQYS)-C-х-A-S-N-х₂-G. В более общем смысле такой способ также может быть использован при поиске других последовательностей, в котором обратная трансляция одной или большего числа наиболее часто встречающихся консенсусных последовательностей используется для конструирования вырожденных праймеров для дифференцированного представления.

Способ позволил идентифицировать транскрипт, негативно регулируемый в эндотелиальных клетках конфлюентностью в присутствии меланомных или карциномных клеток. кДНК кодировала новую молекулу из состава Ig-Sf с необычными структурными свойствами, которая была обозначена как CRAM-1 ("Confluency Regulated Adhesion Molecule" - "регулируемая конфлюентностью адгезивная молекула"). Недавнее описание структурно родственной молекулы JAM, вовлеченной в трансмиграцию лейкоцитов, подтвердило существование нового семейства адгезивных молекул, прототипами для которого являются JAM и CRAM-1. Сравнение с последовательностями из базы данных по маркерам EST дополнительно позволило клонировать CRAM-2 - третий член данного молекулярного семейства. На фиг.1 показаны последовательности кДНК мыши, кодирующие белки CRAM-1 и CRAM-2. В настоящей заявке обозначения JAM и JAM-1, CRAM-1 и JAM-2, а также CRAM-2 и JAM-3 использованы взаимозаменяемо.

Сравнительное тканевое распределение транскриптов, кодирующих JAM, CRAM-1 и CRAM-2, показало преобладающую экспрессию этих молекул в эндотелиальном и эпителиальном компартментах, подтверждая их роль в поддержании межклеточных контактов. Такие межклеточные взаимодействия у покоящихся эндотелиальных клеток регулируют пропускную способность сосудов, клеточный цикл и трансмиграцию лейкоцитов сквозь стенку эндотелия.

Для дальнейшего определения функции и взаимодействия данных трех молекул был применен молекулярный подход. В связи с этим были сконструированы химерные молекулы, включающие метку FLAG и последовательность усиленного зеленого флуоресцирующего белка (EGFP), образующего гибрид с растворимой или связанной с мембранной формой CRAM-1, CRAM-2 или JAM (обобщено на фиг.2). При трансфекции в клеточные линии EGFP-химерные продукты CRAM-1 и JAM оказывались в областях контактов между клетками: это подтверждает участие данных молекул в межклеточных связях. Напротив, CRAM-2 был более широко распределен по клеточной поверхности. Более того, растворимая конструкция CRAM-1 блокировала миграцию лейкоцитов через эндотелий in vitro, в то время как растворимый JAM проявил лишь незначительный подобный эффект. Взятые вместе, эти данные подтвердили главенствующую роль данного нового подсемейства адгезивных молекул в поддержании целостности сосудов и функционировании эндотелиального слоя.

Основываясь на полученных данных, настоящее изобретение представляет новое средство для противодействующих медицинских показаний, таких как хроническое воспаление и развитие опухоли, с использованием агентов, основанных на полипептидах CRAM.

Более конкретно, настоящее изобретение касается полипептида в изолированной форме, относящегося к подсемейству суперсемейства иммуноглобулинов человека, причем данный полипептид проявляет по крайней мере 70%-ный уровень гомологии последовательности с аминокислотной последовательностью мышиных регулируемых конфлюентностью адгезивных молекул 1 или 2 (CRAM-1 или CRAM-2) в соответствии с показанным в верхнем и втором рядах на фиг.3, соответственно. На фиг.4 и 5 показано сопоставление аминокислотных последовательностей у JAM-2 (CRAM-1) и JAM-3 (CRAM-2) мыши, соответственно.

Полипептиды CRAM, найденные в организме человека или животного, являются маркерами растущих клеток. Экспрессия CRAM позитивно регулируется в клетках, являющихся растущими.

В настоящей заявке описываются два новых мышиных полипептида, которые являются членами данного семейства. Основываясь на информации о последовательности данных полипептидов, другие члены семейства могут быть идентифицированы с помощью хорошо известных методов, таких как ПЦР, перекрестная гибридизация библиотек ДНК, перекрестная реактивность антител.

Информация о последовательности может относиться либо к аминокислотной последовательности, либо к нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность.

Таким образом, изобретение, в частности, касается соответствующего полипептида человека, включающего по существу аминокислотную последовательность, показанную на фиг.6В, или аминокислотную последовательность, которая гомологична ей по крайней мере на 70%.

Помимо использования информации о последовательности у двух белков CRAM, описанных здесь, для идентификации других членов семейства у других видов, таких как человек, два белка и соответствующие им члены семейства также могут быть использованы для получения производных молекул, таких как антитела, специфичные в отношении (поли)пептидов по настоящему изобретению, или рекомбинантные эквиваленты белков, необязательно в растворимой форме, или пептиды, включающие по крайней мере сегмент аминокислотной последовательности данных полипептидов. Подходящими сегментами аминокислотной последовательности являются, в частности, внеклеточные домены - VC₂, и проксимальная по отношению к мембране цитоплазматическая последовательность -A-[Y,Q]-[R,S]-[R,K]-G-[C,Y]-F.

В дополнение к антителам и производным в форме (поли)пептидов настоящее изобретение также касается поли- и олигонуклеотидов, характеризующихся последовательностью, которая кодирует полный полипептид или его часть, причем этот полипептид имеет аминокислотную последовательность, которая по крайней мере на 70% гомологична аминокислотной последовательности белков CRAM-1 или CRAM-2, описанных в данном тексте. Более конкретно настоящее изобретение касается нуклеотидных последовательностей, которые по крайней мере на 70%, предпочтительно по крайней мере на 80%, более предпочтительно по крайней мере на 90%, наиболее предпочтительно по существу на 100% гомологичны последовательности ДНК CRAM-1 человека в соответствии с показанным на фиг.6.

Такие поли- или олигонуклеотиды могут являться, например, РНК или ДНК, и могут быть праймерами, зондами, антисмысловыми РНК и т.п.

Все такие молекулы могут быть использованы для модуляции функций исходных полипептидов, обнаруживаемых в организме человека или животного, или для диагностики.

С помощью антител может быть подавлен ангиогенез, например, в опухолях. Их можно использовать в качестве направляющих молекул для клеток, несущих полипептиды CRAM. Антитела могут действовать сами по себе или могут объединяться с другими молекулами, такими как токсины, радиоактивные метки, флуоресцентные метки, ферментные метки, активируемые освещением метки, а также липосомы, клетки и т.п.

Помеченные антитела, в частности, пригодны для целей диагностики с помощью антител, т.е. их можно использовать для выявления участков ангиогенеза в растущей опухоли. Кроме того, антитела, присоединенные к токсинам или радиоактивным молекулам, могут быть использованы для направленного уничтожения опухоли изнутри путем атаки, направленной на (растущие) сосуды в опухоли.

Было установлено, что молекулы типа CRAM не выявляются в нормальной сосудистой системе, за исключением венул лимфатической системы и венул с плотным эндотелием (HEV) в лимфатических органах, таких как лимфатические узлы и пейеровы бляшки. Преимущество этого состоит в том, что направленность, например, антител к CRAM, может быть высокоспецифичной в отношении, например, опухолевых клеток, что тем самым исключает нежелательные побочные эффекты.

Более того, (поли)пептиды также могут связываться с молекулой новоообразующихся сосудов, тем самым стимулируя или подавляя ангиогенез.

Растворимый (поли)пептид, обладающий по существу такой же аминокислотной последовательностью, что и полипептиды CRAM, может быть использован для лечения воспалительных реакций в эндотелии сосудов. В связи с настоящим изобретением было установлено, что миграция лейкоцитов через эндотелий может быть подавлена действием sCRAM-1-IG2Do или моноклональными антителами, специфичными в отношении CRAM-1. Такие и сходные молекулы могут быть, следовательно, использованы для подавления или стимуляции иммунологической реакции, такой как реакция, сопровождающая воспаление.

Специфичная экспрессия молекулы на сосудистых клетках HEVs in vivo, которые связаны с миграцией лимфоцитов, является свидетельством стимулирующего действия CRAM на миграцию лимфоцитов или пропускную способность сосудов. Такой эффект, следовательно, может быть обусловлен модуляцией молекул, которые в норме вовлечены в выстилку сосудистого ложа (CRAM-1, CRAM-2, JAM, РЕСАМ, VE-кадгерин). Эта информация служит основой для других применений настоящего изобретения, связанных с регуляцией межэндотелиальных связей за счет доставки рекомбинантных (поли)пептидных молекул CRAM по настоящему изобретению или моноклональных антител, специфичных для CRAM-1.

Антитела к CRAM также могут быть использованы для блокирования межклеточных взаимодействий у растущих клеток. Это приводит к дезорганизации межклеточных контактов, которые в норме являются необходимыми для выполнения кровеносными сосудами барьерной функции. Эти данные могут быть использованы для повышения пропускной способности растущих сосудов с целью улучшения доставки лекарственных средств в конкретные места, такие как растущие опухоли, постменструальная матка и т.п. Дезорганизацию межклеточных контактов можно, следовательно, использовать для блокировки развития опухолевых клеток, несущих антиген, таких как ангиомы (опухоли, происходящие из эндотелия сосудов) или некоторые быстрорастущие карциномы.

Использование для целей диагностики может быть осуществлено с помощью меченных антител, но также и меченных олигонуклеотидов, которые комплементарны ДНК или мРНК CRAM, обнаруживаемым в эндотелиальных клетках, экспрессирующих белок (белки) CRAM.

Настоящее изобретение далее будет проиллюстрировано следующим примером, в котором делаются ссылки на сопровождающие чертежи, на которых показано следующее.

Фиг.1. Последовательность кДНК мыши, кодирующей белки CRAM-1 и CRAM-2. muCRAM-1 была субклонирована в вектор pcDNA3 и секвенирована с использованием праймеров Sр6 и Т7. muCRAM-2 была получена в качестве клона IMAGE из библиотеки ЕSТ-маркеров (депозитарные №№АА690843 и W80145) и секвенирована в составе вектора pT7T3-DPac с использованием праймеров Т7 и Т3.

Фиг.2. Схематическое представление молекулярных средств, используемых в примере. Структура и важные остатки в новом семействе показаны на верхней схеме (a). Звездочки указывают на предполагаемые сайты фосфорилирования в цитоплазматическом сегменте трех молекул. Второй канонический остаток Суs домена С2 в последовательности JAM пропущен. Различные химерные молекулы представлены внизу (B) с указанием на положение и окружающие остатки сайтов слияния. На белом фоне показаны сегменты молекул, происходящих от последовательностей JAM, CRAM-1 или CRAM-2.

Фиг.3. Сопоставление аминокислотных последовательностей CRAM-1 и CRAM-2. Пробелы показаны пунктиром.

Фиг.4. Сопоставление CRAM-1 (JAM-2) мыши и человека.

Фиг.5. Сопоставление CRAM-2 (JAM-3) мыши и человека.

Фиг.6. Последовательность нуклеиновой кислоты CRAM-1 человека (верхняя схема), полная аминокислотная последовательность CRAM-1 человека (средняя схема) и частичная аминокислотная последовательность CRAM-2 человека.

Фиг.7. Направленное дифференцированное представление с использованием вырожденных праймеров. (А): Показаны нуклеотидные последовательности праймеров для ПЦР, кодирующие последовательности, присутствующие в доменах С2 Ig. Два праймера кодируют одну и ту же последовательность благодаря кодонам, кодирующим остаток Ser. Уровень вырожденности составляет 4096 разных форм праймеров, кодирующих YRCXAS, и 2048 форм для других праймеров. (В): Показано представление радиоактивных ПЦР-продуктов, полученных с праймерами YYCXAS1. Дорожки соответствуют представлению разогнанного электрофорезом ПЦР-продукта на материале кДНК, полученной из линии эндотелиальных клеток t-end (дорожка "t-end"), линии меланомных клеток В16 (дорожка "В16") или совместной культуры этих двух клеточных линий (средняя дорожка). Стрелка указывает на интересующий ПЦР-продукт, полученный для негативно регулируемого транскрипта CRAM-1 в условиях совместного культивирования.

Фиг.8. (А) Нуклеотидная и расшифрованная аминокислотная последовательности кДНК регулируемой конфлюентностью адгезивной молекулы-1 (CRAM-1). Предполагаемые гидрофобные сигнальный пептид (первый) и трансмембранный сегмент (второй) подчеркнуты. Отмечены предполагаемые сайты N-гликозилирования (перечеркнуты), остатки цистеина, предположительно образующие дисульфидные связи (в скобках) и остатки Ser/Thr/Tyr в предполагаемых сайтах фосфорилирования (жирный шрифт). (В) Структурная модель белка CRAM-1 мыши. Внеклеточный сегмент показывает VH и С2-подобный иммуноглобулиновый домен с двумя предполагаемыми сайтами N-гликозилирования. Стрелка указывает на участок, являющийся мишенью для частично вырожденных праймеров (YYCXAS1), использованных для направленного дифференциального представления.

Фиг.9. Сопоставление последовательностей белков JAM, CRAM-1 и CRAM-2 мыши. Идентичные остатки взяты в прямоугольник черного цвета, а гомологичные остатки затенены серым. Общий уровень идентичности между CRAM-2 и CRAM-1 составляет 36%, между JAM и CRAM-1 - 31% и между JAM и CRAM-2 - 33%; соответствующие уровни гомологии - 52%, 52% и 49%. Пробелы в последовательностях показаны пунктиром. Консервативные канонические остатки (Суs и Тrр) в доменах V и С2 отмечены звездочками.

Фиг.10. Экспрессия транскриптов, кодирующих JAM, CRAM-1 и CRAM-2, выявленная методом ПЦР с ревертированием в различных линиях (А) или выявленная с помощью Нозерн-блоттинга в различных тканях (В). (А): ПЦР с ревертированием проводят на материале кДНК, происходящей от линии эндотелиальных клеток, обработанных TNF (дорожки 2 и 11 соответствуют клеткам t-end, обработанным TNF) или не обработанных (дорожки 3, 4, 6, 7, 9, 12 соответствуют b-end.5, e-end.2, t-end V⁺⁺L^-, t-end V^lowL⁺⁺, TME и t-end, соответственно). Дорожки 5 и 10 соответствуют линиям опухолевых клеток В16 (меланома) и KLN205 (карцинома). Дорожка 8 соответствует линии нетрансформированных эпителиальных клеток вилочковой железы МТЕ4-14. Дорожка 1 представляет позитивный контроль для амплификации JAM, CRAM-1 и CRAM-2 по плазмидам, включающим клонированные кДНК. (В): Авторадиограмма гибридизации ³²Р-меченного зонда на Нозерн-блотте мыши. Слева показаны зонды, использованные при каждой гибридизации. Сигналы гибридизации для JAM и CRAM-1 выявляют при размере 2 тысячи пар нуклеотидов (т.п.н.).

Фиг.11. Локализация JAM-2 и JAM-1 в сформировавшихся межклеточных контактах. А: иммуноцитохимический анализ проводили на клетках TME, зафиксированных параформальдегидом, с использованием антител к JAM-2 (а) или JAM-1 (b). Стрелки указывают на конкретную локализацию белков в межклеточных контактах. Масштабная линейка 10 мкм. В: Химерные молекулы JAM-2-EGFP (а) и JAM-1-EGFP (с) были специфически локализованы в межклеточных контактах между трансфицированными клетками. Обогащение по рекомбинантным белкам EGFP не было выявлено в контактах трансфицированных и нетрансфицированных клеток (короткие стрелки). Масштабная линейка - 20 мкм. С: Иммунопреципитация JAM-2 после поверхностного биотинилирования эндотелиальных клеток ТМЕ. Антитела к РЕСАМ (дорожка 1) и к JAM-1 (дорожка 2) были использованы в качестве позитивного и негативного контролей, соответственно, для иммунопреципитации с помощью антитела CRAM-XIXH36 (дорожка 3). Справа показаны молекулярные массы. D: иммунопреципитация рекомбинантных белков EGFP из трансфицированных клеток СНО. Антитела к JAM-2 (дорожки 2, 3, 6) и к JAM-1 (дорожки 1, 4, 5) использовали для иммунопреципитации биотинилированных лизатов на материале нетрансфицированных (дорожки 1 и 2) клеток или клеток СНО, трансфицированных JAM-1-EGFP (дорожки 3 и 4) или JAM-2-EGFP (дорожки 5 и 6). Молекулярные массы указаны справа.

Фиг.12. Миграция спленоцитов через монослои TNF-активированных эндотелиом в присутствии или отсутствие хемокина SDF-1. Использовали три эндотелиомы: t.end.1 дикого типа или t.end.1, трансфицированная кДНК, кодирующей CRAM-1 или CRAM-2. Два моноклональных антитела были протестированы по их способности влиять на трансмиграцию - F-26 или Н-26: оба являются крысиными моноклональными антителами типа IgGI, специфичными в отношении CRAM-1 мыши.

Фиг.13. Регуляция CRAM-1 как функция конфлюентности. Полуколичественную ПЦР проводили с использованием смеси праймеров, специфичных для кДНК HPRT и CRAM-1. Реакции ПЦР разгоняли в 1,2%-ном агарозном геле, который окрашивали бромистым этидием. Дорожки 1, 2 и 3 соответствуют уровням конфлюентности 100%, 50% и 10%, соответственно. Был выявлен более слабый сигнал для CRAM-1 при 100%-ной конфлюентности (дорожка 1). Указаны условия культивирования линий эндотелиальных клеток (t.end.1 и ТМЕ) самих по себе или в смеси с линией опухолевых клеток KLN-205.

Фиг.14. Анализ методом Нозерн-блоттинга транскриптов JAM-2 (a), JAM-1 (b) или β -актина (с) в тканях мыши. Показаны параметры препаратов эмбриональных мРНК после оплодотворения (п/о) и мРНК от взрослых особей. Справа показана величина сигнала гибридизации.

Фиг.15. Иммуногистологический анализ экспрессии JAM-2, JAM-1, ZO-1 и РЕСАМ. Серийные срезы почки (a-d) или срезы брыжеечного лимфатического узла (е-l) окрашивали с помощью антител к JAM-2 (a, e, i), к JAM-1 (b, f, j), к ZO-1 (с, g, k) или РЕСАМ (d, h, l). Для каждой серии изображений (a-d, e-h и i-l) использовали идентичные установки видеосистемы CCD.

Фиг.16. Экспрессия JAM-2 в эндотелиальных клетках. А: цитофлуорометрический анализ экспрессии JAM-2, JAM-1 и РЕСАМ в линиях эндотелиальных клеток (tEnd.1, eEnd.2 и ТМЕ) или линии плоскоклеточной карциномы (KLN-205). Показанные пунктиром графики представляют негативные контроли, полученные с использованием антитела, специфичного для CD4. В: цитофлуорометрический анализ JAM-2 на свежевыделенных эндотелиальных клетках. Указанные органы диспергировали путем обработки коллагеназой/диспазой, окрашивали DilAc-LDL, CD31, анти-JAM-2 или анти-JAM-1 в соответствии с указанным. Гистограммы были получены путем изъятия популяции эндотелиальных клеток, позитивных по DilAc-LDL (FL-2) и CD31 (FL-3). Негативные контроли были получены путем исключения первичных моноклональных антител к JAM-1 или JAM-2.

Фиг.17. Локализация JAM-2-EGFP в процессе формирования межклеточного контакта. Отдельные изображения флуоресценции получали каждые 3 минуты в течение 1 часа в процессе формирования монослоя клеток СНО, трансфицированных JAM-2-EGFP. Показаны изображения, полученные в первые 18 минут. Во время 0 звездочки указывают на три клетки, присутствующие в поле зрения. Во время 6, 12 и 18 минут стрелки указывают на перемещение JAM-2-EGFP в область новообразующегося межклеточного контакта. (В): локализация JAM-2-EGFP после повреждения. Стрелки указывают на поврежденную сторону, а короткие стрелки указывают на мембранные отростки, богатые JAM-2-EGFP. На изображениях указано прошедшее время. Масштабная линейка 10 мкм.

Фиг.18. Экспрессия JAM-2 снижает параклеточную проницаемость. (А): Параклеточную проницаемость оценивали по диффузии FITC-помеченного декстрана через монослои нетрансфицированных клеток СНО, через клетки СНО, трансфицированные Тас (huIL2Rα ) или с использованием указанного EGFP-химерного белка (с JAM-1 или JAM-2). Трансфекция клеток СНО конструкциями JAM-2-EGFP или JAM-1-EGFP приводила к существенному снижению параклеточной проницаемости (соответственно, 57,8±4,9% и 70,8±3,6%: р<0,0001), в то время как трансфекция Тас не влияла сколько-нибудь существенно на параклеточную проницаемость (100,4±4,4%: р=0,9872). Полученные величины нормализованы по нетрансфицированным клеткам СНО.

Фиг.19. Направление JAM-2-EGFP (А) и JAM-1-EGFP (В) в уже существующие плотные контакты. Конфлюирующие клетки MDCK, трансфицированные по стабильному типу JAM-2-EGFP (А) или JAM-1-EGFP (В), окрашивали анти-окклудином и антикроличьим-техасским красным. Серии изображений через каждый 0,9 мкм от базального до апикального слоев показаны для EGFP-флуоресценции (а) или окклудинового окрашивания (b). Базальный уровень (слева) был произвольным образом определен так, что в серии изображений уровень плотного контакта приходился на срезы +3,6 мкм и +4,5 мкм (четвертое и пятое изображение слева направо).

Фиг.20. Влияние растворимых рекомбинантных молекул на миграцию лейкоцитов через эндотелий. (А): трансмиграция выражена как относительный индекс и нормализована по величинам, полученным для необработанной линии клеток t-end (пунктирная линия индекса 1). Показаны результаты, полученные в присутствии 1 мкг sJAM-Ig2do (незакрашенные квадратики) или в присутствии 1 мкг sCRAM-1-Ig2do (закрашенные кружки). Индекс подсчитывают как среднее по пяти независимым экспериментам по трансмиграции. (В): Фенотип трансмигрировавших клеток выражен как число клеток, подсчитанных на основании процентов, определенных с помощью FACS-анализа после окрашивания антителами анти-СD3-FITS и анти-В220-РЕ. Звездочки указывают на стадии эксперимента, характеризовавшиеся достоверным отличием от контроля.

В примерах обозначения JAM и JAM-1, CRAM-1 и JAM-2, равно как CRAM-2 и JAM-3 используются взаимозаменяемо.

ПРИМЕР

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клеточные линии

Линии клеток эндотелиомы вилочковой железы (tEnd.1) и эмбриональной эндотелиомы (eEnd.2) (Williams et al., 1989, Cell, 57, 1053-1063) были предоставлены д-ром W.Risau и д-ром B.Engelhardt (Max Planck Institute, Bad-Nauheim, Германия). Трансформированная вирусом SV40 линия ТМЕ эндотелиальных клеток лимфатического узла была предоставлена д-ром A.Hamann (Harder et al., 1991, Exp. Cell Res., 197, 259-267). Клетки плоскоклеточной карциномы KLN-205, клетки СНО, клетки MDCK и линия миеломных клеток Sp2/0 были получены из Американской коллекции типовых культур (АТСС). Все клетки, за исключением СНО, культивировали в среде DMEM (Gibco BRL, Paisley, Шотландия), дополненной 10% ПТС (РАА Laboratories, Linz, Австрия), 2 мМ глутамина, 100 ед./мл пенициллина и 100 ед./мл стрептомицина (все от Gibco BRL). Клетки СНО культивировали в среде Nut.Mix.F-12 (НАМ), дополненной тем же, что указано выше. Прикрепленные клетки отделяли путем промывки в ФСБ с 0,15 мМ ЭДТА с последующей 5-минутной инкубацией с трипсином-ЭДТА при 37° С.

Представление, клонирование и секвенирование

В эксперименте по совместному культивированию 5× 10⁵ клеток t.End.1 культивировали вместе с 2,5× 10⁴ меланомных клеток В16 F10 в течение 64 часов в чашках Петри диаметром 10 см. В качестве контроля 5× 10⁵ клеток t.End.1 и 2,5× l0⁴ клеток В16 F10 культивировали раздельно при тех же условиях, в результате чего конфлюирующие монослои получали через 64 часа. Тотальную РНК экстрагировали непосредственно на чашках Петри с помощью реагента Trizol в соответствии с инструкциями производителя (Gibco BRL, Paisley, Шотландия). кДНК получали на материале 5 мкг тотальной РНК, используя олиго-дТ-праймер (16-нуклеотидный) и обратную транскриптазу Superscript (Gibco BRL, Paisley, Шотландия). Количество и качество кДНК проверяли путем проведения 27 циклов ПЦР на 1 мкл кДНК, разведенной 1:5, используя праймеры, специфичные для кДНК гена "домашнего хозяйства" HPRT. Затем дифференциальную ПЦР проводили со следующими вырожденными праймерами: 5'-TAYAGNTGYNNNGCYTCYAA-3', 5'-TAYCRGTGYNNNGCYTCYAA-3' и 5'-TAYTAYTGYNNNGCYTCYAA-3’, - кодирующими наиболее часто встречающиеся аминокислотные последовательности С2-доменов - YRCXAS, YQCXAS и YYCXAS. Использованными условиями ПЦР было следующее: 2 мкл разведенной кДНК; 2,5 мкл 10× буфера для ПУР Goldstar PCR; 2 мкл MgCl₂; 2 мкл 0,3 мМ вырожденных праймеров; 0,5 мкл 0,1 мМ dNTP; 0,1 мкл α -³³Р-dАТР, 10 мКи/мл (Amersham Pharmacia Biotech, Швейцария); 15,65 мкл Н₂О; 0,25 мкл ДНК-полимеразы Taq Goldstar (Eurogentech, Seraing, Бельгия).

Параметры ПЦР были следующими: 45 секунд при 94° С, 90 секунд при 50° С и 45 секунд при 72° С в 40 циклах. Добавляли загрузочный буфер с формамидом/ЭДТА и образцы денатурировали в течение 2 минут при 94° С. Затем ПЦР-продукты разделяли в 6%-ном полиакриламидном геле и анализировали авторадиографически с использованием пленки Kodak OM-Mat. Сравнивали интенсивность полос.

Дифференцированно экспрессированные полосы вырезали из высушенного полиакриламидного геля и фрагменты извлекали кипячением и этанольной преципитацией в соответствии с описанным ранее (Liang & Pardee, 1992, Science, 257, 967-970). Затем ПЦР-продукты повторно амплифицировали с использованием повышенных концентраций dNTPs (0,2 мМ вместо 2 мкМ) без ³³P-dATP. Продукты повторной амплификации клонировали в вектор pGem-T Easy (Promega Corp., Wallisellen, Швейцария) в соответствии с описанным ранее (Sambrook, Fritsch & Maniatis, "Molecular Cloning", 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

Последовательности нуклеиновых кислот в двух независимых клонах определяли с использованием набора для термосеквенирования с флуоресцентно помеченными праймерами Thermo Sequence Fluorescent Labeled Primer Cycle Sequencing kit (Amersham Pharmacia Biotech, Dbendorf, Швейцария) и ДНК-анализаторной системы LI-COR (MWG-Biotech GmbH, Ebersberg, Германия).

Идентификация JAM-3

Анализ и сравнение последовательностей были осуществлены с помощью средств, доступных из Интернета с сервера ExPASy Molecular Biology Server, а именно Blast, Prosite, Swiss-Prot. Были идентифицированы три различных EST, гомологичных CRAM-1 (депозитарные №№АА726206, АА052463 и АА175925). Ни один из них не кодирует полноразмерный транскрипт и не включает старт-кодон ATG. С учетом этого 5'-кодирующая последовательность была получена с использованием ПЦР-системы 5'-RACE для "быстрой амплификации концов кДНК", версия 2,0, в соответствии с инструкциями изготовителя (Gibco BRL, Paisley, Шотландия).

Три использованных праймера были сконструированы на основе EST-последовательностей следующим образом:

5'-GAGGTACTTGCATGTGCT-3' для синтеза первой цепи, 5'-CGACAGGTGTCAGATAACA-3’ и 5'-CACCCTCCTCACTCGT-3' для двух ПЦР "гнездового" типа. ПЦР-продукт 5'-RACE клонировали в состав вектора pGem-T. Для получения полноразмерной кодирующей последовательности CRAM-1 клонированный ПЦР-продукт 5'-RACE и EST-маркер (депозитарный №АА726206) расщепляли рестриктазами HpaI и NotI и лигировали в вектор pGem-t. Клонирование полноразмерного CRAM-2 было основано на такой же стратегии сравнения последовательностей и методе 5'-RACE. Полноразмерная кДНК, кодирующая CRAM-2, была в конечном счете получена на материале ЕSТ-маркеров депозитарных номеров АА690843 и W80145. Два указанных клона различаются по длине 3'-нетранслируемого участка.

Нозерн-блоттинг

Тотальную мРНК из клеток или тканей экстрагировали с использованием Trizol (Life Technologies AG, Basel, Швейцария) в соответствии с инструкциями изготовителя. Полиаденилированную мРНК экстрагировали из 250 мкг тотального пула РНК с помощью набора Oligotex mRNA Purification kit (Qiagen, Швейцария). Нозерн-блотт эмбриональной поли-А был приобретен у Clontech (P.H. Stehelin & Cie AG, Basel, Швейцария). Рибозонды были сформированы на материале вектора pcDNA3 (Invitrogen, Leek, Нидерланды): они включали последовательности, кодирующие иммуноглобулиновые домены JAM-1 и JAM-2, или полноразмерную кодирующую последовательность β -актина. Гибридизацию проводили при 62° С в буфере, содержащем 50% формамида. Затем блоты дважды промывали (0,5× SSC, 0,1% ДСН, 67° С) и авторадиографировали на пленку Kodak X-Omat при -80° С.

Эксперимент по конфлюентности

Исследовали влияние конфлюентности эндотелиальных клеток на уровни мРНК JAM-2. Эндотелиальные клетки ТМЕ в количестве 2× 10⁵ культивировали на культуральных чашках диаметром 6, 10 и 15 см до достижения различных уровней конфлюентности спустя 64 часа, варьировавшихся в диапазоне от 10 до 100%. Число клеток через 64 часа, проверяемое методом исключения трипанового синего с последующим подсчетом, было одинаковым во всех случаях и не было связано с площадью поверхности чашки Петри.

Полуколичественную реакцию ПЦР или Нозерн-блоттинг использовали для определения относительного количества транскрипта в различных условиях. Для выявления транскрипта JAM-2 использовали пару праймеров 5'-GACTCACAGACAAGTGAC-3' и 5’-CACCCTCCTCACTCGT-3’, в результате чего получили амплификационный продукт длиной 750 п.н. В качестве внутреннего контроля следующие праймеры, специфичные для кДНК Hprt, были использованы для амплификации фрагмента длиной 350 п.н.: 5'-СТТССАТАСАССССАСАСТТТСТТС-3' и 5'-GAGGGTAGGCTGGCCTATAGGCT-3'.

Конструирование экспрессирующих векторов

Последовательность, кодирующая EGFP, была субклонирована из вектора pEGFP-1 (Clontech, P.H.Stehelin & Cie AG, Basel, Швейцария) в плазмиду pcDNA3 с использованием сайтов HindIII и NotI, которая в результате получила наименование pcDNA3/EGFP. Рестрикционные сайты с 3'-конца, узнаваемые рестриктазами HpaI и ScaI, обнаруженные в последовательности, кодирующей цитоплазматический домен в составе, соответственно, JAM-2 и JAM-1, использовали для химеризации этих двух последовательностей по N-концу EGFP в векторе pcDNA3 (Invitrogen, Leek, Нидерланды). Вставки, кодирующие JAM-2 или JAM-1, вырезали из pGemt или pRc/CMV с использованием расщепления рестриктазами SacII/HpaI или HindIII/ScaI, соответственно.

Затем кодирующие последовательности клонировали в вектор pcDNA3/EGFP, который расщепляли рестриктазой AgeI, затупляли по концам путем заполнения и далее расщепляли их рестриктазами HindIII или SacII. В результате образуются сайты химеризации по аминокислотным положениям DGV291 для JAM-2 и QPS₂₈₅ для JAM-1. Трансфекцию клеток СНО осуществляли в соответствии с описанным ранее (Ballestrem et al., 1998, J. Cell Sci., 111, 1649-1658).

Стабильные трансфектанты, использовавшиеся для тестов на проницаемость, были отобраны с помощью культивирования трансфицированных клеток СНО в течение двух недель в культуральной среде, содержащей 1 мг/мл антибиотика G418. Резистентные колонии выделяли и проверяли на интенсивность флуоресценции EGFP методом проточной цитометрии (прибор FACScalibur, Becton Dickinson, Mountain View, CA) и картирования флуоресценции с помощью микроскопа (Axiovert, Zeiss, Oberkochen, Германия).

Микроскопию с покадровым видеоизображением проводили с использованием флуоресцентного микроскопа Axiovert и программы Openlab для сбора и анализа изображения.

Экспрессирующий вектор pcDNA3 для клеток млекопитающих (Invitrogen, Leek, Нидерланды) был модифицирован путем внесения последовательности, кодирующей метку FLAG (G.Wiedle, Dep. Pathology, CMU, Geneva). Конструкции с меткой FLAG, включающие последовательности, кодирующие растворимые формы белков JAM, CRAM-1 и CRAM-2, получали с помощью ПЦР. Во всех случаях прямые праймеры были сформированы для внесения старт-кодона ATG. Обратные праймеры были сконструированы по последовательностям, кодирующим шарнирный сегмент одной из растворимых форм Ig, или по последовательности, кодирующей участок между С2 и трансмембранным доменами у двух растворимых молекул с Ig-доменами. Все обратные праймеры имели 3'-"выступы", включающие XbaI-рестрикционный сайт, необходимый для прямого внутрирамочного клонирования в модифицированный вектор с меткой FLAG. ДНК-полимеразу Pfu использовали в ПЦР с целью исключения частых мутаций (Stratagene, La Jolla, СА, США). ПЦР-фрагменты были затем расщеплены рестриктазой XbaI и клонированы в состав вектора pcDNA3 с меткой FLAG, который расщепляли рестриктазой EcoRI, заполняли "липкие" концы фрагментом Кленова и затем разрезали рестриктазой XbaI.

Реагенты и иммунофлуоресцентный анализ

Использовали следующие моноклональные антитела: анти-PECAM (GC51, IgG_2a крысы; EA-3, IgG₁ крысы) и анти-JAM (Н202.106.7.4, IgG₁ крысы) (Malerque et al., 1998, Mol. Immunol., 35, 1111-1119; Piali et al., 1993, Eur. J. Immunol., 23, 2464-2471).

Панель CRAM-антите