Тромбопоэтин

Тромбопоэтин

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к выделению, очистке и рекомбинантному или химическому синтезу белков, которые влияют на выживаемость, пролиферацию, дифференцировку или созревание кроветворных клеток, в особенности прогениторных клеток тромбоцитов. Настоящее изобретение, в частности, относится к клонированию и экспрессии нуклеиновых кислот, кодирующих белковые лиганды, способные к связыванию и активации mpl, члена суперсемейства цитокиновых рецепторов. Настоящее изобретение далее относится к использованию этих белков самих по себе или в сочетании с другими цитокинами для лечения заболеваний кроветворения, включая тромбоцитопению.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

I. Система кроветворения

Кроветворная система производит зрелые высокоспецифичные клетки крови, как известно, необходимые для жизнедеятельности всех млекопитающих. Эти зрелые клетки включают: эритроциты, специализированные для транспорта кислорода и углекислого газа; Т- и В-лимфоциты, ответственные за клеточный и опосредованный антителами иммунные ответы; кровяные пластинки или тромбоциты, специализированные для образования кровяных тромбов; и гранулоциты и макрофаги, специализированные как ловушки или как вспомогательные клетки для борьбы с инфекцией. Гранулоциты далее подразделяются на: нейтрофилы, эозинофилы, базофилы и тучные клетки, специализированные типы клеток, обладающие дискретными функциями. Необходимо отметить, что все эти специализированные клетки происходят из одного общего примитивного типа клеток, обозначаемых как плюрипотентные (или тотипотентные) стволовые клетки, первично обнаруживаемые в костном мозге (Dexter et al., Ann. Rev. Cell Biol., 3: 423-441 [1987]).

Зрелые высокоспециализированные клетки крови должны производиться непрерывно в большом количестве в течение всей жизни млекопитающего. Подавляющему большинству этих специализированных клеток предназначено сохраняться функционально активными только в течение от нескольких часов до нескольких недель (Cronkite et al., Blood Cells, 2: 263-284 [1976]). Таким образом, непрерывное обновление зрелых клеток крови, самих примитивных стволовых клеток, так же как и любых промежуточных или предназначенных для дифференцировки прогениторных клеточных линий, лежащих между примитивными и зрелыми клетками, являются необходимыми для поддержания постоянного нормального состояния клеток крови, требующегося млекопитающему.

В центре гемапоэтической системы лежит плюрипотентная стволовая клетка(клетки). Этих клеток относительно немного по количеству и они подлежат самообновлению путем пролиферации с получением дочерних стволовых клеток или трансформируются в течение серии этапов дифференцировки в возрастающе зрелые, ограниченно дифференцированные клетки, однозначно образующие высокоспециализированную зрелую клетку(клетки) крови.

Например, определенные мультипотентные прогениторные клетки, обозначаемые как CFC-Mix, происходящие от стволовых клеток, подвергаются пролиферации (самообновлению) и развитию с получением колоний, содержащих все различные миелоидные клетки: эритроциты, нейтрофилы, мегакариоциты (предшественники тромбоцитов), макрофаги, базофилы, эозинофилы и тучные клетки. Другие прогениторные клетки лимфоидной линии дифференцировки подвергаются пролиферации и развитию в Т-клетки или В-клетки.

Помимо этого между CFC-Mix прогениторными клетками и миелоидными клетками лежат прогениторные клетки другого уровня, промежуточно комитированные по отношению к своему потомству. Эти ограниченно дифференцированные прогениторные клетки классифицируются на основании своего потомства, которое они производят. То есть известными прямыми предшественниками миелоидных клеток являются: эритроидные колониеобразующие единицы (КОЕ-Э) для эритроцитов, гранулоцит/макрофаг колониеобразующие клетки (ГМ-КОК) для нейтрофилов и макрофагов, мегакариоцит колониеобразующие клетки (Мег-КОК) для мегакариоцитов, эозинофил колоние-образующие клетки (Эоз-КОК) для эозинофилов и базофил колоние-образующие клетки (Баз-КОК) для тучных клеток. Другими клетками предшественниками, промежуточными между плюрипотентными стволовыми клетками и зрелыми клетками крови, являются известные клетки (см. выше), или клетки, которые, вероятно, будут открыты, имеющие различную степень ограниченной дифференцировки и способности к самообновлению.

Основополагающим принципом нормальной гемапоэтической клеточной системы, по-видимому, является пониженная способность к самообновлению, выражающаяся в виде потери мультипотентности и приобретения ограниченной дифференцировки и созревания. Таким образом, у одного конца спектра гемапоэтической клетки лежит плюрипотентная стволовая клетка, проявляющая способность к самообновлению и дифференцировке во все различные подлежащие специфической дифференцировке прогениторные клетки. Эта способность является основой терапии костно-мозговыми трансплантантами, где примитивные стволовые клетки восстанавливают популяцию полной гемапоэтической системы клеток. С другого конца спектра лежат высокоограниченной дифференцировки прогениторные клетки и их потомства, которые потеряли способность самообновления, но приобрели функциональные способности зрелых клеток.

Пролиферация и развитие стволовых клеток и ограниченно-дифференцированных прогениторных клеток находится под тщательным контролем различных гемапоэтических факторов роста или цитокинов. Роль этих факторов in vivo сложна и недостаточно понятна. Некоторые факторы роста, такие как интерлейкин-3 (ИЛ-3), способны стимулировать как мультипотентные стволовые клетки, так и комитированные прогениторные клетки нескольких дифференцирующихся линий, включая, например, мегакариоциты. Первоначально предполагалось, что другие факторы, такие как гранулоцит/макрофаг колоние-стимулирующий фактор (ГМ-КСФ), ограничиваются в своем действии на ГМ-КОК. Однако позднее, было обнаружено, что ГМ-КСФ также влияет на пролиферацию и развитие interalia мегакариоцитов. Таким образом, было обнаружено, что ИЛ-3 и ГМ-КСФ обладают частично перекрывающимися активностями, хотя с различающейся силой действия. Недавно было обнаружено, что интерлейкин-6 (ИЛ-6) и интерлейкин-11, хотя и не обладают заметным влиянием на Мег-колониеобразование сами по себе, действуют синергично вместе с ИЛ-3 на стимуляцию созревания мегакариоцитов (Yonemura et al., Exp. Hematol., 20:1011-1016 [1992]).

Следовательно, гемапоэтические факторы роста могут влиять на рост и дифференцировку одной или более дифференцирующихся линий, могут перекрываться с другими факторами роста во влиянии на отдельные прогениторные клеточные линии или могут действовать синергично с другими факторами.

Также вероятно, что гемапоэтические факторы роста могут проявлять свои эффекты на различных стадиях развития клетки от тотипотентной стволовой клетки, различных комитированных прогениторных клеток с ограниченной дифференцировкой, до зрелых клеток крови. Например, эритропоэтин (эпо), по-видимому, вызывает пролиферацию только зрелых эритроидных прогениторных клеток. ИЛ-3, по-видимому, проявляет свой эффект ранее, влияя на примитивные стволовые клетки и промежуточные ограниченно-дифференцированные прогениторные клетки. Другие факторы роста, такие как фактор стволовых клеток (ФСК), могут влиять на развитие даже более примитивных клеток.

Из последующего будет понятно, что новые гематопоэтические факторы роста, которые влияют на выживание, пролиферацию, дифференцировку или созревание любых клеток крови или их предшественников, были бы полезны, особенно для содействия восстановления ослабленной гематопоэтической системы, что является следствием заболевания или радиационной или химиотерапии.

II. Мегакариоцитопоэз - продукция тромбоцитов

Регуляция мегакариоцитопоэза и продукции тромбоцитов рассмотрены Mazur, Exp. Hematol., 15: 248 [1987] и Hoffman, Blood, 74: 1196-1212 [1989]. Вкратце, плюрипотентные стволовые клетки костного мозга дифференцируются в мегакариоцитарные, эритроцитарные и миелоцитарные клеточные линии. Предполагается, что существует иерархия комитированных мегакариоцитарных прогениторных клеток среди стволовых клеток и мегакариоцитов. Были идентифицированы, по крайней мере три класса мегакариоцитарных прогениторных клеток, а именно: мегакариоциты очаг-формирующей единицы (ОФЕ-МК), мегакариоциты колоние-формирующей единицы (КФЕ-МК) и мегакариоцитарные прогениторные клетки легкой плотности (МК-КФЕ-ЛП). Созревание мегакариоцитов само по себе представляет непрерывность развития, которое было разделено на стадии на основании обычных морфологических критериев. Самыми ранними распознаваемыми членами мегакариоцитарной (МК или Мег) семьи являются мегакариобласты. Эти клетки, первоначально от 20 до 30 мкм в диаметре, обладают базофильной цитоплазмой и слегка неправильным ядром с утраченным, каким-либо образом, ретикулярным хроматином и несколькими нуклеолями. Поздние мегакариоцитобласты могут содержать до 32 ядер (полиплоидия), но цитоплазма остается разреженной и незрелой. Как только наступает созревание, ядро становится более сегментированным и пикнотическим, цитоплазма увеличивается в количестве и становится более ацидофильной и гранулярной. Большинство зрелых клеток этого семейства могут дать появление высбождаемых тромбоцитов на своей периферии. Обычно менее чем 10% мегакариоцитов находятся на стадии бласта и более чем 50% являются зрелыми. По условной морфологической классификации, обычно применяемой для мегакариоцитарной серии, мегакариоцитобласт является самой ранней формой; промегакариоцит или базофильный мегакариоцит является промежуточной формой; и зрелый (ацидофильный, гранулярный или продуцирующий тромбоциты мегакариоцит) является последней формой. Зрелые мегакариоциты распространяют филаменты цитоплазмы в синусоидальное пространство, где они отрываются и фрагментируются на отдельные тромбоциты (Williams et al., Hematology, 1972).

В мегакариоцитопоэзе, как представляется, участвуют несколько регуляторных факторов (Williams et al., Br. J. Haematol., 52:173 [1982] и Williams et al., J. Cell Phisiol., 110: 101 [1982]). Ранний уровень мегакариоцитопоэза постулирован как митотический, имеющий отношение к пролиферации клетки и инициации колонии из КФЕ-МК, но не к количеству тромбоцитов (Burstein et al., J. Cell Phisiol., 109:333 [1981] и Kimura et al., Exp. Hematol., 13: 1048 [1985]). Поздняя стадия созревания является не митотической, связанной с ядерной полиплоидизацией и цитоплазматическим созреванием и, по-видимому, регулируется по механизму обратной связи, зависящему от количества периферических тромбоцитов (Odell et al.. Blood, 48: 765 [1976] и Ebbe et al., Blood, 32: 787 [1968]).

Обсуждалось существование отдельного и специфического колоние-стимулирующего фактора мегакариоцитов (МК-КСФ) (Mazur, Exp. Hematol., 15: 340-350 [1987]). Однако большинство авторов полагают, что процессы, столь жизненно важные для выживания, как продукция тромбоцитов, должны были бы регулироваться цитокином(ами), ответственным исключительно за этот процесс. Гипотеза, что существует мегакариоцит/тромбоцит специфический цитокин(ы), представляла основу для поисков в течение более чем 30 лет, но на настоящий день ни одного цитокина, подобного уникальному МК-КСФ (ТРО), не было очищено, секвенировано и установлено в исследовании.

Хотя, было сообщено, что МК-КСФ был частично очищен при экспериментально полученной тромбоцитопении (Hill et al., Exp. Hematol., 14: 752 [1986]), из кондиционированной среды почки эмбриона человека [КС] (McDonald et al., J. Lab. Clin. Med., 85: 59 [1975]), из экстрактов мочи человека с пластической анемией и идиопатической тромбоцитопенической пурпурой (Kawakita et al., Blood, 6: 556 [1983]) и из плазмы (Hoffman et al., J. Clin. Invest., 75: 1174 [1985]), в большинстве случаев их физиологическая функция до сих пор неизвестна.

В качестве потенциаторов мегакариоцитов была использована кондиционированная среда клеток селезенки, активированных митогеном из фитолакки американской (PWM-SpCM), и клеточной линии миеломоноцитов мыши WEHI-3 (WEHI-3CM). PWM-SpCM содержит факторы, усиливающие рост КФЕ-МК (Metcalf et al., Pro. Natl. Acad. Sci., USA, 72:1744-1748 [1975]; Quesenberry et al., Blood, 65:214 [1985]; Iscove, N.N., Hemapoetic Cell Differentiation, ICN-UCLA Simposia on Molecular and Cell Biology, Vol. 10, Golde et al., eds. [New York, Academy Press] pp 37-52 [1978], один из которых является интерлейкином-3 (ИЛ-3), мультидифференцирующим колоние-стимулирующим фактором (мульти-КСФ) (Burstein, Blood Cells, 11:469 [1986]). Другие факторы в этой среде еще не были определены и выделены. WEHI-3 является миеломоноцитарной клеточной линией мыши, секретирующей сравнительно большое количество ИЛ-3 и небольшое количество ГМ-КСФ. Было обнаружено, что ИЛ-3 потенцирует рост широкого круга гемапоэтических клеток (Ihle et al., J. Immunol., 13:282 [1983]). Было также обнаружено, что ИЛ-3 обладает синергизмом со многими известными гематопоэтическими гормонами или факторами роста (Barteliaez et al., J. Cell Physiol., 122:362-369 [1985] и Warren et al., Cell, 46:667-674 [1988]), включая и эритропоэтин (ЭП), и интерлейкин-1 (ИЛ-1), в индукции самых ранних мультипотентных предшественников и в образовании очень больших смешанных гематопоэтических колоний.

В кондиционированной среде легких, кости, клеточных линиях макрофагов, перитонеальных экссудатных клетках мыши и в эмбриональных клетках почки человека были обнаружены другие источники потенциаторов мегакариоцитов. Несмотря на некоторые противоречивые данные (Mazur, Exp. Hematol., 15:340-350 [1987]), существует доказательство (Geissler et al., Br.J.Haematol., 60: 233-238 [1985]), что скорее активированные Т-лимфоциты, чем моноциты играют усиливающую роль в мегакариоцитопоэзе. Эти данные свидетельствуют о том, что секреты активированных Т-лимфоцитов, такие как интерлейкины, могут быть регуляторными факторами в развитии МК (Geissler et al., Exp. Hematol., 15: 845-853 [1987]). Род исследований мегакариоцитопоэза при использовании очищенного эритропоэтина ЭПО (Vainchenker et al., Blood, 54:940 [1979]; McLeod et al., Nature, 261: 492-4 [1976]; Williams et al., Exp. Hematol., 12: 734 [1984]) указывает, что этот гормон обладает усиливающим действием на образование колонии МК. Это было также показано и на свободной от сыворотки, и на содержащей сыворотку культурах, и в отсутствии вспомогательных клеток (Williams et al., Exp. Hematol., 12: 734 [1984]). Было постулировано, что ЭПО участвует в большей степени на одно- или двух клеточной стадии мегакариоцитопоэза в противоположность к действию PWM-SрСМ, который участвует на четырехклеточной стадии развития мегакариоцита. Взаимодействие этих факторов на обеих, ранней и поздней, фазах развития мегакариоцита остается требующим разъяснения.

Из данных, полученных в нескольких лабораториях, предполагается, что только мультидифференцирующие факторы, которыми являются ГМ-КСФ и ИЛ-3, и, в меньшей степени, ИЛ-6, стимулирующий фактор В-клеток, обладают индивидуально МК-колоние-стимулирующей активностью, (Ikebuchi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:9035 [1987]). Совсем недавно несколько авторов доложили, что ИЛ-11 и фактор ингибирующий лейкемию (ФИЛ) действуют синергично вместе с ИЛ-3 на увеличение размеров мегакариоцитов и плоидию (Yonemura et al., British Journal of Hematology, 84:16-23 [1993]; Burstein et al., J. Cell. Physiol., 153:305-312 [1992]; Metcalf et al.. Blood, 76:50-56 [1990]; Metcalf et al.. Blood, 77:2150-2153 [1991]; Bruno et al., Exp. Hematol., 19:378-381 [1991]; Yonemura et al., Exp. Hematol., 20:1011-1016 [1992]).

Другие материалы, представляющие интерес, включают: Eppstein et al., US Patent No. 4962091; Chong, US Patent No. 4879111; Fernandes et al., U.S. Patent No. 4604377; Wissler et al., US Patent No. 4512971; Gottlieb, US Patent No. 4468379; Bennet et al., US Patent No. 5215895; Kogan et al., US Patent No. 5250732; Kimura et al., Eur. J. Immunol., 20(9): 1927-1931 [1990]; Secor et al., J. of Immunol., 144 (4): 1484-1489 [1990]; Warren et al., J. of Immunol., 140(1): 94-99 [1988]; Warren et al., Exp. Hematol., 17(11): 1095-1099 [1989]; Bruno et al., Exp. Hematol., 17(10): 1038-1043 [1989]; Tanikawa et al., Exp. Hematol., 17 (8): 883-888 [1989]; Koike et al., Blood, 75 (12): 2286-2291 [1990]; Lotem, Blood, 75(5): 1545-1551 [1989]; Rennik et al., Blood, 73(7): 1828-1835 [1989]; и Clutterbuck et al.. Blood, 73(6): 1504-1512 [1989].

III. Тромбоцитопения

Тромбоциты являются ключевым элементом в механизме свертывания крови. Обеднение уровня циркулирующих тромбоцитов, называемое тромбоцитопения, наблюдается при различных клинических состояниях и заболеваниях. Тромбоцитопению обычно определяют, когда содержание тромбоцитов ниже 150×10⁹ на литр. Большинство причин заболевания тромбоцитопенией может быть подразделено на три категории на основании продолжительности жизни тромбоцитов, а именно: (1) нарушенная продукция тромбоцитов костным мозгом, (2) секвестрация тромбоцитов в селезенке (сплиномегалия), или (3) увеличенное разрушение тромбоцитов в периферическом круге кровообращения (т.е. аутоиммунная тромбоцитопения или химио- и радиационная терапия). Кроме того, у пациентов, получающих большие объемы быстро вводимых обедненных тромбоцитами продуктов крови, тромбоцитопения может развиться из-за разведения.

Клиническое проявление кровотечения при тромбоцитопении зависит от тяжести тромбоцитопении, ее причины и возможной взаимосвязи с нарушениями свертываемости. В общем, пациенты со счетом тромбоцитов между 20 и 100×10⁹ на литр имеют риск усиленного посттравматического кровотечения, когда этот счет тромбоцитов ниже 20×10⁹ на литр, может быть спонтанное кровотечение. Эти последние пациенты являются кандидатами для трансфузии тромбоцитов, сопровождающуюся иммунным или вирусным риском. Для любых данных степеней тромбоцитопении кровотечение имеет тенденцию быть более тяжелым, когда причиной является пониженная продукция, чем при увеличенном распаде тромбоцитов. В последней ситуации ускоренный оборот тромбоцитов приводит к появлению в круге циркуляции более молодых, больших и гемастатически более эффективных тромбоцитов. Тромбоцитопения может быть следствием различных нарушений, кратко описанных ниже. Более детальное описание может быть найдено у Schafner, A.I., Thrombocytopenia and Disorders of Platelet Function, Internal Medicine, 3^rd Ed., John J. Hutton et al., Eds., Little Brown and Co., Boston/Toronto/London [1990].

(а) Тромбоцитопения вследствие пониженной продукции тромбоцитов

Причины врожденной тромбоцитопении включают конституциональную апластическую анемию (синдром Фанкони) и врожденную амегакариоцитарную тромбоцитопению, которая может быть связана с пороком развития скелета. Приобретенные нарушения продукции тромбоцитов являются вызванными или гипоплазией мегакариоцитов, или неэффективным тромбопоэзом. Мегакариоцитарная гипоплазия может быть следствием различных состояний, включая костную аплазию (включая идиопатические формы или миелосупрессию химиотерапевтическими агентами или радиационной терапией), миелофиброз, лейкемия и инвазия в костный мозг опухоли или гранулемы. В некоторых ситуациях токсины, инфекционные агенты или лекарственные препараты могут влиять на тромбоцитопению относительно избирательно; примеры включают перемежающуюся тромбоцитопению, вызванную алкоголем или определенными вирусными инфекциями, и умеренную тромбоцитопению, связанную с введением тиазидовых диуретиков. Наконец, неэффективный тромбоцитопоэз, вторичный по отношению к мегалобластическим процессам (дефицит фолиевой кислоты или B₁₂), может также вызывать тромбоцитопению, обычно сопровождающуюся анемией и лейкопенией.

Текущее лечение тромбоцитопениоза, вызванного сниженной продукцией тромбоцитов, зависит от определения и обращения, определяющей причины недостаточности костного мозга. Вливания тромбоцитов обычно резервируются для пациентов с серьезными осложнениями с кровотечениями или для восполнения при хирургических операциях, поскольку изоиммунизация может привести далее к рефрактерности к вливаниям тромбоцитов. Кровотечения слизистой, проявляющиеся при тяжелой тромбоцитопении, могут быть уменьшены путем перорального или внутривенного введения антифибринолитических агентов. Однако тромботические осложнения могут развиваться, если применяются антифибринолитические агенты у пациентов с диссиминированными внутривенными коагуляциями (ДВК).

(b) Тромбоцитопения вследствие захвата в селезенке

Увеличение селезенки, возникшее вследствие любой причины, может сопровождаться мягкой, до умеренной тромбоцитопенией. Это в значительной степени пассивный процесс (гиперспленизм) захвата тромбоцитов, в противоположность активному разрушению тромбоцитов селезенкой в результате иммуноопосредованной тромбоцитопении, обсужденной ниже. Хотя самой распространенной причиной гиперспленизма является застойное увеличение селезенки из-за гипертонии воротной вены, вследствие алкогольного цирроза, другие формы застоя, инфильтрационная или лимфопролиферативная спленомегалия также связаны с тромбоцитопенией. Счет тромбоцитов в результате только гиперспленизма в целом не падает ниже 50×10⁹ на литр.

(c) Тромбоцитопения вследствие неиммуноопосредованного разрушения тромбоцитов

Тромбоцитопения может быть следствием ускорения разрушения тромбоцитов при различных неиммунологических процессах. Нарушения этого типа включают диссиминированную внутривенную коагуляцию, внутрисосудистые протезные приспособления, экстракорпоральную циркуляцию крови, тромботические микроангиопатии, такие как тромботическая тромбоцитарная пурпура. Во всех этих ситуациях циркулирующие тромбоциты, которые задерживаются либо на искусственной поверхности, либо на нарушенной интиме сосуда, либо утилизируются на этих участках, либо разрушаются и затем преждевременно очищаются ретикуло-эндотелиальной системой. Заболевание или нарушение, при котором может возникать диссиминированная внутрисосудистая коагуляция (ДВК), изложено в деталях Braunwald et al. (eds), Harrison’s Priciples of Internal Medicine, 11^th Ed., p.1478, McGrow Hill [1987]. Внутривенные протезные приспособления, включая сердечные клапаны и внутриаортальные баллоны, могут быть причиной мягкой, до умеренной, деструктивной тромбоцитопении и перемежающейся тромбоцитопении; у пациентов, подлежащих сердечно-легочному шунтированию или гемодиализу, могут быть следствием утилизации или повреждения тромбоцитов при экстракорпоральном кровообращении.

(d) Иммунная тромбоцитопения, индуцированная лекарственными препаратами

Более чем 100 лекарственных препаратов вовлечены в иммунологически опосредованную тромбоцитопению. Охарактеризованы, однако, только хинидин, хинин, золото, сульфонамиды, цефалотины и гепарин. Вызванная лекарственными препаратами тромбоцитопения часто является очень тяжелой и обычно наблюдается стремительно в течение нескольких дней, пока пациент принимает предрасполагающую медикацию.

(e) Иммунная (аутоиммунная) тромбоцитопеническая пурпура (ИТП)

ИТП у взрослых является хроническим заболеванием, характеризующимся аутоиммунным разрушением тромбоцитов. Аутоантитела являются обычно IgG, хотя было доложено и о других иммуноглобулинах. Несмотря на то, что обнаруженные при ИТП аутоантитела связаны на мембране тромбоцитов с GPII_bIII_a, в большинстве случаев специфичность антигена тромбоцитов не идентифицирована. В ретикулоэндотелиальной системе селезенки и печени наблюдается внесосудистая деструкция сенсибилизированных тромбоцитов. Хотя более чем половина всех случаев ИТП является идиопатической, многие пациенты заболевают ревматическим или аутоиммунным заболеваниями (например, эритроматозной системной волчанкой), или лимфопролиферативными заболеваниями (например, хронической лимфоцитарной лейкемией).

(f) ВИЧ-индуцированная ИТП

ИТП является всевозрастающим обычным осложнением при инфекции ВИЧ (Morris et al., Ann. Intern. Med., 96: 714-717 [1982]) и может наблюдаться на различных стадиях развития заболевания и у пациентов с диагносцированным синдромом приобретенного иммунодефицита (СПИД), у которых имеется СПИД-зависимый комплекс, и у инфицированных ВИЧ, но без синдрома СПИД. ВИЧ инфекция является передаваемым заболеванием, однозначно характеризующимся выраженным дефицитом клеточной иммунной функции, так же как и сопровождающимися сопутствующими инфекциями и злокачественными новообразованиями. Первичные иммунологические нарушения, являющиеся следствием ВИЧ инфекции, - это прогрессирующее уменьшение и функциональная ослабленность Т-лимфоцитов, экспрессирующих клеточный поверхностный гликопротеин CD4 (Lane et al., Ann. Rev. Immunol., 3: 477 [1985]). Потеря CD4 хелперной/индукторной Т-клеточной функции, очевидно, подчеркивает глубокий дефект в клеточном и гуморальном иммунитете, приводящий к сопутствующим инфекциям и злокачественности, характеризующей СПИД (Н. Lane, выше). Хотя механизм ИТП, связанной со СПИДом, неизвестен, представляется, что он отличен от механизма ИТП, не ассоциированной с ВИЧ инфекцией. (Walsh et al., N. Eng. J. Med., 311: 635-639 [1984]; и Ratner, Am. J. Med., 86: 194-198 [1989]).

IV. Современная терапия тромбоцитопении

Терапевтические подходы к лечению пациентов с тромбоцитопенией определяются тяжестью и быстротой клинической ситуации. Лечение одинаково для ВИЧ-зависимой и не зависисмой от ВИЧ тромбоцитопении, и хотя применяется множество терапевтических подходов, терапия остается противоречивой.

Счет тромбоцитоов у пациентов с диагносцированной тромбоцитопенией успешно увеличивается под воздействием глюкокортикоидной (например, преднизолона) терапии, однако у большинства пациентов вылечивание неполное или наблюдаются рецидивы, когда дозировка глюкокортикоида снижается или лечение прерывается. Опираясь на пациентов, имеющих ВИЧ-связанную ИТП, некоторые исследователи предположили, что терапия глюкокортикоидами может привести к предрасположенности к СПИДу. Глюкокортикоиды обычно используются, если счет тромбоцитов падает ниже 20×10⁹/литр или когда наблюдаются спонтанные кровотечения.

Для пациентов с рефрактерностью к глюкокортикоидам успешно применяли соединение 4-(2-хлорфенил)-9-метил-2-[3-(морфолинил)-3-пропанон-1-ил]6Н-тиено[3,2,f][1,2,4]триазоло-[4,3,а][1,4]диазепин (WEB 2086) для лечения тяжелых случаев ИТП, не связанной с ВИЧ. Пациентов, имеющих счет тромбоцитов 37000 - 58000/ мкл, лечили WEB 2086 и через две недели лечения счет тромбоцитов увеличился до 14000-190000/ мкл. (ЕР 361077 и Lohman et al., Lancet, 1147 [1988]).

Хотя оптимальное лечение приобретенной амегакариоцитарной тромбоцитопенической пурпуры (ПАТП) не определено, было показано, что антитимоцитарный глобулин (АТГ) лошадиной антисыворотки к ткани тимуса человека дает продолжительную полную ремиссию (Trimble et al., Am. J. Hematol., 37: 126-127 [1991]). Однако в недавней публикации отмечают, что гематопоэтические эффекты АТГ могут быть отнесены к тимеросалу, который действует преимущественно на белки как несущий ртуть (Panella et al., Cancer Research, 50: 4429-4435 [1990]).

Было сообщено о хороших результатах по спенэктомии. При спенэктомиии удаляется основной участок разрушения тромбоцитов и основной источник продукции аутоантител у многих пациентов. Эта операция приводит к длительной, не требующей лечения ремисси у большого количества пациентов. Однако поскольку хирургическое вмешательство, в общем, у иммунокомпромисных пациентов избегается, спленэктомия рекомендуется только в тяжелых случаях тромбоцитопении (например, при тяжелой ВИЧ-зависимой ИТП), у пациентов, которые не способны отвечать в течение 2-3 недель на лечение глюкокортикоидами, или при не достижении длительного ответа, после прерывания лечения глюкокортикоидами. Основываясь на современных научных данных, не ясно, предрасполагает ли спленэктомия пациентов к СПИДу.

Помимо преднизолоновой терапии и спленэктомиии определенные цитотоксические агенты, а именно винкристин и азидотимидин (AST, zid.ovud.ine), также проявляют обещания при лечении ИТП, индуцированной ВИЧ; однако эти результаты являются предварительными.

Из последующего будет понятно, что одним из путей лечения тромбоцитопении могло бы быть получение агента, способного ускорять дифференциацию и созревание мегакариоцитов или их предшественников в формах, продуцирующих тромбоциты. Были потрачены значительные усилия по поиску такого агента, называемого обычно как "тромбопоэтин" (ТП). Другие названия ТП, обычно встречаемые в литературе, включают: фактор, стимулирующий тромбоцитопоэз (ФСТ); колоние-стимулирующий фактор мегакариоцитов (МК-КСФ); мегакариоцит-стимулирующий фактор и потенциатор мегакариоцитов. Активность ТП обнаружили достаточно рано, уже в 1959 г. (Rak et al., Med. Exp., 1: 125), но и по настоящее время продолжаются попытки охарактеризовать и очистить этот агент. Несмотря на существующие данные по частичной очистке ТП-активного полипептида (см., например, Tayrien et al., J. Biol. Chem., 262: 3262 [1987] и Hoffman et al., J. Clin. Invest. 75: 1174 [1985]), некоторые авторы постулировали, что ТП по своей сути не является отдельно существующей реальностью, но скорее это просто полифункциональное проявление известных гормонов (ИЛ-3, Sparrow et al.. Prog. Clin. Biol. Res., 215: 123 [1986]). Независимо от ее формы или природы молекула, проявляющая тромбопоэтическую активность, представляла бы значительную терапевтическую ценность. Хотя ни один белок не был однозначно идентифицирован как ТП, значительным интересом окружено недавнее открытие того, что mpl, естественный рецептор цитокинов, может опосредовать тромбопоэтический сигнал.

V. Mpl является мегакариоцитопоэтическим рецептром цитокинов

Предполагается, что пролиферация и созревание гематопоэтических клеток тесно регулируются факторами, которые положительно или отрицательно модулируют пролиферацию и дифференцировку полидифференцирующихся плюрипотентных стволовых клеток. Эти эффекты опосредуются путем высокоаффинного связывания внеклеточного белкового фактора со специфическими поверхностными клеточными рецепторами. Эти поверхностные рецепторы проявляют определенную гомологию и обычно классифицируются как члены суперсемейства цитокиновых рецепторов. Члены этого семейства включают рецепторы для: ИЛ-2 (β и γ-цепи) (Hatakeayma et al., Science, 244: 551-556 [1989]; Takeshita et al., Science, 257: 379-382 [1991]), ИЛ-3 (Itoh et al.. Science, 247: 324-328 [1990]; Gorman et al., Proc. Natl. Accad. Sci. USA, 87: 5459-5463 [1990]; Kitamura et al., Cell, 66: 1165-1174 [1991a]; Kitamura et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 5082-5086 [1991b]), ИЛ-4 (Mosley et al., Cell, 59: 335-348 [1989]), ИЛ-5 (Takaki et al., EMBO J., 9: 4367-4374 [1990]; Tavernier et al.. Cell, 66: 1175-1184 [1991]), ИЛ-6 (Yamasaki et al., Science, 241: 825-828 [1988]; Hibi et al., Cell, 63:1149-1157 [1990]), ИЛ-7 (Goodwin et al., Cell, 60: 941-951 [1990]), ИЛ-9 (Renault et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5690-5694 [1992]), гранулоцит-макрофаг колоние-стимулирующий фактор (ГМ-КСФ) (Gearing et al., EMBO J., 8: 3667-3676 [1991]; Hayashida et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 244: 9655-9659 [1990]), гранулоцит колоние-стимулирующий фактор (Г-КСФ) (Fukunaga et al., Cell, 61: 341-350 [1990а]; Fukunaga et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 8702-8706 [1990b]; Larsen et al., J. Exp. Med., 172: 1559-1570 [1990]), ЭП (D’Andrea et al.. Cell, 57: 277-285 [1989]; Jones et al., Blood, 76: 31-35 [1990]), фактор ингибирования лейкемии (ФИЛ) (Gearing et al., EMBO J., 10: 2839-2848 [1991]), онкостатин М (ОСМ) (Rose et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 8641-8645 [1991]) и также рецепторы пролактина (Boutin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7744-7748 [1988]; Edery et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 2112-2116 [1989]), гормона роста (ГР) (Leung et al.. Nature, 330: 537-543 [1987]) и цилиарный нейротропный фактор (ЦНТФ) (Davis et al., Science, 253: 59-63 [1991]).

Члены суперсемейства цитокиновых рецепторов могут быть сгруппированы в три функциональные категории (для обзора см. Nicola et al., Cell, 67:1-4 [1991]). Первый класс включает рецепторы с одной цепью, такие как рецептор эритропоэтина (ЭП-Р) или рецептор колоние-стимулирующего фактора гранулоцитов (Г-КСФ-Р), которые связывают лиганд с высоким сродством благодаря внеклеточному домену, а также генерируют внутриклеточный сигнал. Второй класс рецепторов, так называемых α-субъединичных, включает рецептор интерлейкина-6 (ИЛ-6-Р), рецептор гранулоцит-макрофаг колоние-стимулирующего фактора (ГМ-КСФ-Р), рецептор интерлейкина-3 (ИЛ-3-Рα) и других членов суперсемейства цитокиновых рецепторов. Эти α-субъединицы связывают лиганды с низким сродством, но не способны передавать внутриклеточный сигнал. Высокоаффинные рецепторы способны к передаче сигнала, генерированного гетеродимером, между α-субъединицей и членом третьего класса цитокиновых рецепторов, обозначенного β-субъединицей, а именно β_с, общей β-субъединицей для трех α-субъединиц ИЛ-3-Рα и ГМ-КСФ-Р.

Доказательство того, что mpl является членом суперсемейства цитокиновых рецепторов вытекает из гомологии последовательности (Gearing, EMBO J., 8: 3667-3676 [1988]; Bazan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6834-6938 [1990]; Davis et al., Science, 253: 59-63 [1991] и Vigon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5640-5644 [1992]) и его способности передавать пролиферативные сигналы.

Выведенная последовательность белка при молекулярном клонировании c-mpl мыши обнаруживает, что этот белок является гомологичным к другим цитокиновым рецепторам. Внутриклеточный домен содержит 465 аминокислотных остатков и составляет два субдомена, каждый с четырьмя высококонсервативными цистеинами, и конкретную структуру в N-терминальном субдомене и в С-терминальном субдомене. Лиганд-связывающий внеклеточный субдомен предположительно должен иметь складчатую структурную геометрию, подобную двойной β-бочонкообразной. Этот дублированный внеклеточный домен является высокогомологичным сигнальной передающей цепи, общей для ИЛ-3, ИЛ-5 и ГМ-КСФ рецепторов, так же как и низкоаффинному связывающему домену ФИЛ (Vigon et al., Oncogene, 8:2607-2615 [1993]). Таким образом, mpl может принадлежать к низкоаффинному лиганд-связывющему классу цитокиновых рецепторов.

Сравнение mpl мыши и зрелого mpl P человека обнаружило, что эти два белка проявляют 81% идентичности в последовательности. Более специфические N-концевой и С-концевой внеклеточные субдомены проявляют 75 и 80% идентичности в последовательности соответственно. Наиболее консервативным регионом является цитоплазматический домен, проявляющий 91% идентичности аминокислот, с последовательностью из 37 аминокислот, полностью идентичных в области около трансмембранного домена у обоих видов. Таким образом, сообщается, что mpl является одним из наиболее консервативных членов суперсемейства цитокиновых рецепторов (Vigon, там же).

Доказательство того, что mpl является функциональным рецептором, способным к передаче пролиферативного сигнала, вытекает из конструкции химерного рецептора, содержащего внеклеточный домен из цитокинового рецептора, имеющего высокое сродство к известным цитокинам, вместе с цитоплазматическим доменом mpl. Поскольку не доложено ни об одном известном лиганде к mpl, было необходимым сконструировать химерный высокоаффинный лиганд-связывающий внеклеточный домен из класса цитокиновых рецепторов, таких как ИЛ-4-Р или Г-КСФ-Р. Vigon et al., там же, соединил внеклеточный домен Г-КСФ-Р с обоими трансмембранным и цитоплазматическим доменами c-mpl. ИЛ-3 зависимая клеточная линия BAF/B03 (Ba/F3), была трансфецирована химерой Г-КСФ-P/mpl вместе с контролем Г-КСФ-Р полной длины. Клетки, трансфецированные химерой, росли одинаково хорошо в присутствии цитокина ИЛ-3 или Г-КСФ. Подобным образом клетки, трансфецированные Г-КСФ-Р также хорошо росли и в присутствии ИЛ-3, и Г-КСФ. Все клетки гибли в отсутствии факторов роста. Подобные эксперименты были проведены Skoda et al., EMBO J., 12(7): 2645-2653 [1993], в которых оба, внеклеточный и трансмембранный домены рецептора ИЛ-4 человека (РЧ-ИЛ-4), были слиты в цитоплазматический домен mpl мыши, и трансфецированы в ИЛ-3-зависимую Ba/F3 клеточную линию мыши. Клетки Ba/F3, трансфецированные диким типом РЧ-ИЛ-4, нормально делились в присутствии видоспецифического либо ИЛ-4, либо ИЛ-3. Ba/F3 клетки, трансфецированные РЧ-ИЛ-4/mpl, нормально делились в присутствии РЧ-ИЛ-4 (в присутствии или отсутствии ИЛ-3), показывая, что у Ba/F3 клеток mpl цитоплазматический домен содержит все элементы, необходимые для передачи пролиферативного сигнала.

Эти эксперименты с химерами показывают способность к проведению пролиферативного сигнала у цитоплазматического домена mpl, но молчащего, не обращающего внимания, может ли связать лиганд внеклеточный домен mpl. Эти данные включают, по крайней мере, две возможности, а именно, mpl представляет рецептор с одной цепью (первый класс), подобный ЭП-Р или Г-КСФ-Р, или представляет сигнал-передающую β-субъединицу (третий класс), требующую α-субъединицу, подобно ИЛ-3 Skoda et al., там же).

VI. Лиганд mpl является тромбопоэтином (ТП)

Как описано выше, было предположено, что сыворотка содержит уникальный фактор, называемый иногда как тромбопоэтин (ТП), который действует синергично с различными другими цитокинами по стимуляции роста и созревания мегакариоцитов. Несмотря на значительные усилия, приложенные многочисленными группами, никакого подобного природного фактора не было выделено из сыворотки или любого другого источника. Несмотря на то, что неизвестно, способен ли mpl непосредственно связывать мегакариоцит-стимулирующий фактор, недавние эксперименты показывают, что mpl участвует в передаче пролиферативного сигнала фактора или факторов в сыворотке пациентов с апластическим костным мозгом (Mathia et al., Blood, 82(5):1395-1401 [1993]).

Доказательство того, что уникальный колониеобразующий фактор, отличный от ИЛ-1α, ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-11, СКФ, ЭП, Г-КСФ и ГМ-КСФ, передает пролиферативный сигнал через mpl, вытекает из исследования распределен