Способ определения длительности заболевания детей хроническим обструктивным пиелонефритом (варианты)

Способ определения длительности заболевания детей хроническим обструктивным пиелонефритом (варианты)

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к медицине, а именно к клинико-морфологическим и лабораторным методам диагностики, и может быть использовано в детской клинической нефрологии для подбора соответствующей терапии.

В последние десятилетия все большее внимание обращается на заболевания органов мочевой системы у детей. К сожалению, часто диагностирование таких заболеваний проводится не сразу. Если в стадии обострения пиелонефрит (особенно обструктивный) имеют яркую клиническую картину - лихорадка, боли в пояснице, дизурия, симптомы интоксикации, то хронический пиелонефрит (ХП), в том числе и хронический обструктивный пиелонефрит, вне обострения протекает с весьма скудной симптоматикой, и только целенаправленный расспрос позволяет выявить эпизоды немотивированного субфебрилитета, озноба, болей в поясничной области, расстройства мочеиспускания (никтурия), снижение работоспособности, утомляемости, которые обычно не ассоциируются с конкретным недугом.

Нередко единственным признаком ХП является изолированный мочевой синдром (лейкоцитурия, бактериурия, протеинурия не более 0,5 г/сут или сочетание мочевого синдрома с анемией в отсутствие почечной недостаточности и гипертензия (Л.Т. Теблоева, В.И. Кириллов / К вопросу топической диагностики и лечения инфекций мочевыводящих путей у детей / Педиатрия, №1, 1999, - с.93-97).

Как правило для подтверждения диагноза необходимы анамнестические данные о повторных эпизодах инфекции мочевыводящих путей (ИМП) или перенесенной бактериурии и лейкоцитурии с их количественной оценкой. Часто такие сведения отсутствуют, что вызывает затруднения в определении тяжести и длительности заболевания.

Известно, что длительность заболевания ХП напрямую связана с нефросклеротическими изменениями в почках и, зная длительность протекания заболевания, можно представить приближенную к реальности картину заболевания. Несмотря на большое количество исследований, касающихся структурно-функциональных изменений почек при обструктивном пиелонефрите (Шулутко Б.И. Патология почек: (Клинико-морфологическое исследование). - Л.: Медицина, 1983. – 296 с.; Максимова И.Г. Особенности склеротического процесса в почках при гидронефрозе и пиелонефрите у детей // Урология и нефрология. - 1984. - №5. - С.18-21.; Зозуляк В.И. О гидронефротическом нефросклерозе // Врачебн. дело. - 1976. - №6. - С.66-68), данных о корреляционной зависимости между длительностью заболевания хроническим обструктивным пиелонефритом и данными клинико-морфологических и лабораторных исследований в литературе обнаружить не удалось.

В то же время проблема ранней диагностики и прогноза склерозирования почечной ткани при обструктивных уропатиях является достаточно актуальной.

Наиболее объективную картину состояния почек на сегодня дают инструментальные методы анализа, например метод нефросцинтиграфии, являющийся наиболее близким к заявляемому, так как позволяет по полученному снимку объективно оценить изменения почечной ткани и определить степень развития нефросклероза, что в свою очередь позволяет в какой-то мере судить о длительности заболевания (Папаян А.В., Савенкова Н.Д. Клиническая нефрология детского возраста: Руководство для врачей. - СПб.: Сотис, 1997, – 718 с.)

Однако метод требует дорогостоящего оборудования и препаратов и не всегда применим в практической медицине на сегодняшний день.

Многочисленные исследования последних лет убедительно показали, что одним из наиболее важных биологических медиаторов, который вовлечен во множество физиологических и патофизиологических процессов является оксид азота (NO). Однако опубликованные материалы в основном освещают участие NO в деятельности нервной, сердечно-сосудистой и дыхательной системах (Елисеева Е.В. Нитроксидергическая регуляция легких. - Владивосток: ДВГУ, 2001, – 176 с; Мотавкин П.А., Гельцер Б.И. Клиническая и экспериментальная патофизиология легких. – М.: Наука, 1998, – 336 с.; Anggard E.Nitric oxide: mediator, murderer, and medicine // Lancet. – 1994 (May). - Vol.343. - №8907. - P.1199-206; Bredt D.S., Snyder S.H. Isolation of nitric oxide synthase, a calmodulin-requiring enzyme // Proc. Nat. Sci. U.S. - 1990. - Vol.87. - P.682-685).

Известно, что оксид азота играет важную роль в регуляции функциональных отправлений почек. Нарушение синтеза NO в различных отделах почки приводит к существенным изменениям, прежде всего водно-солевого обмена и уровня системного АД. Установлено, что in vivo длительное ингибирование синтеза NO стимулирует развитие нефросклероза и гипертонии. (Radomski M.W., Palmer R.M., Moncada S. An L-arginine / nitric oxide pathway present in human platelets regulates aggregation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1990. - Vol.87. - P.5193-5197). Морфологически в почках развивается повреждение сосудов, заключающееся в фокальной адгезии и инфильтрации мононуклеарных клеток в интиму и среднюю оболочку прегломерулярных артерий и артериол. Указанные изменения ассоциируются с некрозом средней оболочки сосудов и частичным или полным тромбозом из просвета. Обнаруживаются и ишемизированные клубочки (Verhagen A., Rabelink Т., Braam В. A receptor blockade alleviates hypertension and renal lesions associated with chronic nitric oxide synthase inhibition // J. Am. Soc. Nephrol. – 1998 (May). - Vol.9. - N.5. - P.755-762).

Известно также, что о состоянии NO-синтазы (NOS) в различных органах и тканях животных и человека можно судить по содержанию NADPH - диафоразы, являющейся ферментом, функция которого меняется синхронно и одновременно с нитроксидсинтазой (NOS) (Neuronal NADPH-diaphorase synthasizes a second messenger: yes or no / V.T. Hope, G.J. Michael, K.M. Knigge, S.R. Vincent // Neurosci. Abstr. - 1990. - Vol.15. - P.538) (Малышев И.Ю. Введение в биохимию оксида азота: Роль оксида азота в регуляции основных систем организма // Рос.жур. гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 1997. - №1. - с.49-55).

Таким образом, литературные данные свидетельствуют, что оксид азота, синтезированный нитроксидсинтазой (NOS), способствует прогрессированию заболеваний почек, но разными путями. Изучение нитроксидпродуцирующей функции почек и участие самого NO в патогенезе нефрогенной гипертензии на фоне обструктивного пиелонефрита у детей и привело к появлению данного решения.

Технической задачей изобретения поставлено определение длительности заболевания детей хроническим обструктивным пиелонефритом путем исследования NO-продуцирующей функции почек в различных отделах нефрона, эндотелии и гладких миоцитах сосудов, а также собирательных трубочках мозгового вещества почек и определения корреляционной зависимости между активностью NOS в почках и клинико-лабораторными показателями, что позволит расширить диагностические возможности при обследовании детей.

Поставленная задача решается предлагаемым способом определения длительности заболевания детей хроническим обструктивным пиелонефритом, реализуемым в двух вариантах.

Способ по первому варианту осуществляют путем оценки энзиматической активности NADPH-диафоразы гистохимическим методом в единицах оптической плотности в эпителиоцитах проксимальных, дистальных канальцев (ДК), в сосудистых клубочках, а также в эндотелии и гладких миоцитах сосудов почек и последующее ее сравнение с нормой, при этом при превышении нормы, равной 143 ЕОП в эпителиоцитах проксимальных канальцев и 88,3 ЕОП в эпителии дистальных канальцев на 10% и 29,8% соответственно, и/или превышении нормы, равной 103,1 ЕОП в эндотелии сосудов на 13% и появлению активности NADPH-диафоразы в гладких миоцитах сосудов до величины 65 ЕОП диагностируют длительность заболевания до 3-х лет; при снижении активности NADPH-диафоразы в эпителиоцитах проксимальных и дистальных канальцев до 131 и 83 ЕОП соответственно, и/или в эндотелии и гладких миоцитах сосудов до 82 и 38 ЕОП соответственно, диагностируют длительность заболевания до 7-8 лет; при активности NADPH-диафоразы в эпителии канальцев 80 ЕОП, а сосудистых клубочках 35 ЭОП, при норме в последних - 61 ЕОП диагностируют длительность заболевания - 10-12 лет, а при величинах ниже этих значений - длительность заболевания составляет 13-15 лет.

Способ по второму варианту осуществляют путем проведения клинико-лабораторных исследований больного ребенка, сравнения полученных результатов со среднестатистической нормой для соответствующего возраста ребенка и определения длительности заболевания хроническим обструктивным пиелонефритом на основе комплексного учета всех показателей, приведенных в таблице 1, где минус относится к снижению показателя, а (+) плюс - к его увеличению:

Технический результат изобретения достигается за счет того, что авторами впервые определена величина активности NADPH-диафоразы, отражающей каталитическую активность NO-синтазы (NOS), в различных отделах почек здоровых и больных детей и осуществлена корреляции полученных значений с длительностью заболевания хроническим обструктивным пиелонефритом, а также проведена комплексная оценка корреляционной зависимости между активностью NADPH-диафоразы в различных отделах почки и клинико-лабораторными показателями больного и здорового ребенка.

Достоверно установлено, что на начальных стадиях заболевания (до 3-х лет) происходит усиление нитроксидпродуцирующей функции почек в эпителиоцитах дистальных и проксимальных канальцев, а также в эндотелии и гладких миоцитах сосудов почек, но снижается активность этого фермента, а следовательно, и синтеза оксида азота, в эпителии собирательных трубочек мозгового вещества почек. При дальнейшем развитии заболевания NO-продуцирующая функция почек все больше угнетается, что приводит к снижению активности нитроксидсинтазы (NOS) во всех отделах почек ниже нормы, при этом степень снижения этой активности говорит о длительности заболевания.

Сущность предложенного решения по первому варианту заключается в том, что у больного ребенка берут участки почечной ткани (нефробиопсия), определяют активность NADPH-диафоразы в Единицах оптической плотности (ЕОП) по величине плотности осадка диформазана, сравнивают полученные значения с нормой и делают вывод о длительности заболевания.

Сущность предложенного решения по второму варианту заявляемого способа заключается в том, что проводят клинико-лабораторное обследование ребенка, сравнивают полученные результаты со среднестатистической нормой для соответствующего возраста ребенка и по комплексной оценке отклонений всех показателей, приведенных в таблице 1, определяют длительность заболевания.

Преимущество заявляемого способа по первому варианту заключается в ранней и достоверной диагностике заболевания, а отсюда и правильном выборе последующей тактики лечения за счет выявленной особенности гистохимической локализации и активности NADPH-диафоразы в различных отделах почек в состоянии нормы и патологии.

Для определения гистохимической локализации и активности NADPH-диафоразы использовали участки почечной ткани, полученные сразу после нефрэктомии у 16 детей 3-15 лет (9 мальчиков и 7 девочек) с врожденным гидронефрозом IV-V ст., осложненным хроническим обструктивным пиелонефритом, и сравнивали их с нормой. Норму определяли по величинам, полученным при исследовании аутопсийного материала здоровых почек от 8 детей того же возраста, погибших в результате несчастного случая (автодорожная травма). Исследования проводили не позднее 6-8 часов от момента биологической смерти.

Для второго варианта способа провели корреляцию между активностью NADPH и клинико-лабораторными показателями с использованием статистического анализа с расчетом коэффициента корреляции между средними величинами активности NADPH в различных структурах почек и средними значениями лабораторных показателей крови и мочи (всего 22 показателя), выявленных в результате обследования тех же 16 больных вторичным хроническим обструктивным пиелонефритом, которым проведена нефрэктомия. На основании проведенного анализа выявили статистически значимые клинико-лабораторные показатели, которые имеют достоверную зависимость с активностью NADPH в различных структурах почек.

Для количественной оценки состояния NOS в условиях физиологической нормы и при патологии почки исследовались с помощью комплекса методических приемов: общеморфологического, гистохимического, спектрофотометрического и статистического анализа опытного материала.

Морфологическую структуру почек в норме и при патологии изучали путем окраски срезов материала гематоксилином и эозином по стандартной методике.

Поскольку на сегодняшний момент NADPH-диафораза рассматривается как кофермент NO-синтазы или ее парный энзим (Neuronal NADPH-diaphorase is a nitric oxide synthase / V.T.Hope, G.J.Michael, K.M.Knigge, S.R.Vincent // Proc. Nat. Acad. Sci. U.S. - 1991. - Vol.88. - P.2811-2814) локализацию NO-синтазы (NOS) определяли по активности NADPH диафоразы с использованием гистохимического метода по стандартной методике Hope и Vincent (Hope V.T., Vincent S.R. Histochemical characterization of neuronal NADPH-diaphorase // Histochem. Cytochem. - 1989. - Vol.37. - P.653-661 (1989), которая заключается в образовании диформазана в присутствии эндогенного NADPH и солей тетразолия. NADPH-диафораза осуществляет перенос протонов от NADPH к нитросинему тетразолию (НСТ). Восстановленный НСТ превращается в нерастворимый продукт - диформазан. Плотность его осадка прямо пропорциональна молекулярному содержанию NOS, а следовательно, дает возможность судить об активности и локализации данного энзима. Участки органов человека размерами 1,0×0,5 см выделяли с помощью лезвия и опускали в охлажденный, приготовленный на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7.4), 4% параформальдегид, который из всего класса диафораз сохраняет активность только NADPH-диафоразы. Материал фиксировали в течение 2-х часов при t=+4°C, сутки промывали при той же температуре в 15% растворе сахарозы, 7-8 раз меняя раствор. Из образцов ткани, замороженных в криостате, изготавливали срезы толщиной 10 мкм, монтировали на предметные стекла и помещали в инкубационную среду. Состав и конечная концентрация среды были следующими: 50 мМ Трис-буфер (рН 8.0), 1 мМ NADPH (“Sigma”), 0,5 мМ нитросинего тетразолия (“Sigma”) и 0,2% Тритон Х-100 (“Serva”). Инкубацию проводили в течение 60 минут в термостате при температуре 37°С. Затем срезы ополаскивали в дистиллированной воде, обезвоживали и заключали в бальзам по общепринятой в гистологии методике.

При проведении гистохимических исследований особое внимание обращали на соблюдение стандартизации условий забора, подготовки и обработки материала для изучения.

Описанным выше методом изучили локализацию и активность NADPH-диафоразы в сосудах почечного тельца, эпителии проксимальных, дистальных канальцев и собирательных трубочек, а также эндотелии и гладких миоцитах внутрипочечных сосудов в обеих группах детей.

Визуализацию изображения всех микропрепаратов на компьютере получили с помощью видеосистемы, вмонтированной в микроденситометр “Vickers-M85”. Цифровую обработку изображения проводили с помощью программ Adobe Photoshop 5.0 и Microsoft Exel 98. Активность фермента и оптическую плотность выражали в единицах оптической плотности (ЕОП).

Установили, что у детей группы сравнения (норма) NADPH-диафораза определяется во всех исследованных структурах почек, кроме гладких миоцитов сосудов. Наибольшая активность фермента зарегистрирована в эпителиоцитах проксимальных канальцев (143,0±2,9 ЕОП), более низкая активность фермента обнаружена в дистальных канальцах (88,3±3,8 ЕОП), умеренная активность NADPH-диафоразы, отражающая каталитическую активность NOS, зарегистрирована в эпителиоцитах собирательных трубочек мозгового вещества (78,6±3,2 ЕОП), а самая низкая базальная активность исследуемого энзима зафиксирована в структурах почечного тельца (сосудистого клубочка) - 60,9±3,6 ЕОП.

На фиг.1 а, б приведен снимок здоровой почки человека, NADPH-диафораза в эпителии канальцев и клубочках нефрона. “а” - ув. 100^х; “б” - ув. 400^х. Метод Hope, Vincent.

Наличие NADPH-диафоразы установлено в эндотелии сосудов коркового вещества (103,1±3,2 ЕОП). Здесь активность фермента была достоверно выше, чем в других структурах почки (р<0,001), но не достигала уровня таковой в проксимальном канальце.

Для изучения нитроксидпродуцирующей функции почек у детей, больных хроническим обструктивным пиелонефритом, они были разделены на 4 группы в зависимости от длительности патологического процесса: I - дети в возрасте до 3-х лет (n=3); II - дети в возрасте 7-8 лет (n=5); III - дети в возрасте 10-12 лет (n=5); IV -13-15 лет (n=3), при этом получили следующую динамику активности исследуемого фермента.

В таблице 2 приведено изменение активности NADPH-диафоразы у здоровых детей и больных хроническим обструктивным пиелонефритом при длительности заболевания до 3-х лет и 7-8 лет.

Таблица 2
Группы больных	Показатели активности NADPH-диафоразы (ЕОП)
	Проксимальный каналец	Дистальный каналец	Собирательные трубочки	Сосудистый клубочек
Норма	143,0±2,9	88,3±3,8	78,6±3,2	60,9±3,6
До 3-х лет	157,3±1,2	114,6±2,1	67,8±2,0	55,3±1,9
7-8 лет	130,6±1,6	83,1±1,3	65,8±1,8	34,7±1,1

Обнаружили, что при длительности заболевания до 3-х лет активность NADPH-диафоразы по сравнению с нормой увеличивается в эпителиоцитах проксимальных канальцев на 10% и составляет 157,3±1,2 ЕОП (р<0,001).

На фиг.2 приведен снимок почки больного пиелонефритом на фоне врожденного гидронефроза с длительностью заболевания 3 года, на котором видна повышенная активность NADPH-диафоразы в проксимальных канальцах и сниженная активность в сосудистых клубочках. Метод Hope, Vincent. Ув. 200^х.

Эпителиоциты дистальных канальцев также демонстрируют повышенную активность фермента, которая превышает норму на 29,8% (р<0,001).

При количественной оценке энзиматической активности NADPH-диафоразы в почечных клубочках и эпителии собирательных трубочек у детей до 3-х лет по сравнению с нормой зарегистрировали ее снижение до 55,3±1,9 ЕОП (р>0,05) и 67,8±2,0 ЕОП (р<0,001) (на 13,7%) соответственно.

Дальнейший анализ состояния NO-продуцирующей функции почек показал ее снижение по мере прогрессирования заболевания (таблица 2).

В возрастной группе 7-8 лет активность NADPH-диафоразы в эпителиоцитах ПК снижается на 9,9% по сравнению с таковой у здоровых детей (р<0,001) и на 23,4% по сравнению с I возрастной группой и составляет 130,6±1,6 ЕОП (р<0,001) (фиг.3 и 4). Активность фермента в эпителии ДК также имеет тенденцию к снижению по сравнению с нормой. При этом в ДК снижение энзиматической активности NADPH-диафоразы более значительно в сравнении с таковой у детей с длительностью заболевания 3 года - на 47,2% (р<0,0001).

На фиг.3 приведен снимок почки больного ребенка с длительностью заболевания 7 лет. В единичных сохраненных канальцах - умеренная активность NADPH-диафоразы Метод Hope, Vincent. Ув. 200^х.

У детей данной возрастной группы зарегистрировано и значительное снижение NO-продуцирующей функции в эндотелии сосудистого клубочка до 34,7±1,1 ЕОП (р<0,0001), что в 1,8 раза ниже нормы.

На фиг.4 - почка больного с длительностью заболевания 8 лет. На NADPH-диафоразу реагируют эпителиоциты проксимальных канальцев. Снижение активности NADPH-диафоразы в измененных дистальных канальцах и сосудистых клубочках почечного тельца (Метод Hope, Vincent. Ув. 400^х).

Клетки эпителиальной выстилки собирательных трубочек имеют практически одинаковую активность энзима по сравнению с первой возрастной группой (65,8±1,8 ЕОП), но достоверно ниже нормы (р<0,001).

В III группе больных наблюдается дальнейшее снижение активности нитроксидсинтазы во всех исследуемых почечных структурах (таблица 3). Следует отметить, что на определенном этапе течения заболевания, а именно через 10 лет (III-IV возрастные группы) достоверно отличить при световой микроскопии проксимальные канальцы от дистальных не представляется возможным (Куркин А.В. Ультраструктурные изменения в почках у детей при гидронефрозе // Здравоохранения Таджикистана. - 1977. - №1. - С.14-18), поэтому в таблице 2 представлена суммарная активность в эпителии канальцевого аппарата.

Активность энзима в данной почечной структуре (эпителий канальцев) составляет 80,1±1,9 ЕОП, что на 44% ниже по сравнению с таковой в проксимальных канальцах и на 10% ниже по сравнению с таковой в дистальных канальцах в норме (р<0,001).

На фиг.5 - снимок коркового вещества почки больного с длительностью заболевания 11 лет. Снижение активности NADPH-диафоразы в канальцах (Метод Hope, Vincent, ув.20).

В пиелонефритически сморщенных клубочках почек детей при длительности заболевания 10-12 лет активность энзима практически не отличается от таковой в предыдущей группе пациентов и составляет 34,7±1,9 ЕОП.

Таблица 3
Группы больных	Показатели активности NADPH-диафоразы (ЕОП)
	Эпителий канальцев	Собирательные трубочки	Сосудистый клубочек
10-12 лет	80,1±1,9	44,5±1,3	34,7±1,9
13-15 лет	59,4±0,9	44,1±1,2	18,4±1,2

Снижение активности энзима в эпителии собирательных трубочек достигает 44,5±1,3 ЕОП, что в 1,8 раз меньше нормы (р<0,0001).

В IV группе больных при длительности заболевания 13-15 лет нитроксидпродуцирующая функция всех исследованных структур почек была минимальной и составляет в эпителиальных клетках канальцев - 59,4±0,9 ЕОП, что на 58,5% ниже, чем в нормальных проксимальных канальцах и на 32,7% ниже, чем в эпителиоцитах дистальных канальцах в норме (р<0,001).

На фиг.6 - почка больного пиелонефритом с длительностью заболевания 15 лет. NADPH-диафораза со сниженной активностью выявляется лишь в некоторых дистрофически измененных извитых канальцах (Метод Hope, Vincent, ув.200х).

Структурные элементы сморщенного почечного клубочка демонстрируют самую низкую активность энзима - 18,4±1,2 ЕОП, что в 3,3 раза меньше нормы (р<0,0001).

Активность NADPH-диафоразы в дистрофически измененных эпителиальных клетках собирательных трубочек мозгового вещества почек практически не отличается от таковой в III группе детей и составляет 44,1±1,2 ЕОП (р>0,5), что, тем не менее, в 1,8 раза ниже, чем в норме (р<0,001).

Изменение активности NADPH-диафоразы в почечных сосудах в разных возрастных группах детей также характеризуется определенной динамикой (таблица 4).

Таблица 4
Группы больных	Показатели активности NADPH-диафоразы (ЕОП)
	Эндотелий сосудов	Гладкие миоциты сосудов
Норма	103,05±1,4	00,0±0,0
До 3-х лет	118,5±1,9	64,8±1,1
7-8 лет	81,9±3,15	38,2±1,6
10-12 лет	62,6±2,6	38,9±1,3
13-15 лет	32,3±1,3	31,3±1,3

Так, при длительности заболевания 3 года происходит достоверное повышение энзиматической активности как в эндотелии, так и в гладких миоцитах сосудов до 118,5±1,9 ЕОП и 64,8±1,1 ЕОП (в норме - 103,05±1,4 ЕОП и 0,0 ЕОП соответственно, р<0,001).

На фиг.7 - почка больного пиелонефритом с длительностью заболевания 3 года. На NADPH-диафоразу реагируют эндотелий и гладкие миоциты сосуда. Метод Hope, Vincent. Ув.200^x.

В дальнейшем активность фермента снижается, особенно значительно в эндотелии: во II группе - в 1,3 раза, а в III возрастной группе - в 1,6 раза по сравнению с нормой и составляет 81,9±3,15 ЕОП и 62,6±2,6 ЕОП (р<0,001) соответственно. К 15 годам болезни происходит более чем трехкратное угнетение энзиматической активности нитроксидсинтазы - до 32,3±1,3 ЕОП.

В гладких миоцитах сосудов после увеличения активности NADPH-диафоразы к 3 годам, в дальнейшем к возрасту 8 и 12 лет происходит ее снижение в 1,7 раза (до 38,2±1,6 ЕОП и 38,9±1,3 ЕОП соответственно) по сравнению с I возрастной группой (р<0,001).

В IV группе детей активность NADPH-диафоразы в гладких миоцитах минимальна и составляет 31,3±1,3 ЕОП, что в 2,1 раза ниже, чем в I возрастной группе. Достоверных отличий оптической плотности фермента по сравнению со значениями во II и III возрастных группах не получено.

При этом показатели активности NADPH-диафоразы в миоцитах сосудов достоверно выше нормы (р<0,0001).

Таким образом, проведенные исследования активности NADPH диафоразы в различных отделах почек здоровых и больных детей и анализ полученных результатов показали, что при хроническом обструктивном пиелонефрите у детей в течение трех лет наблюдается компенсаторное, статистически значимое повышение активности NADPH - диафоразы в проксимальных и дистальных канальцах и сосудах. Однако в эпителии собирательных трубочек мозгового вещества почек, которые уже на ранних стадиях заболевания подвергаются атрофии при нарушении оттока мочи и хроническом пиелонефрите, выявлено статистически значимое угнетение энзиматической активности NOS, и, следовательно, образования оксида азота. К 13 годам от начала заболевания наступает тотальное истощение NO-продуцирующей функции во всех почечных структурах, что сопряжено со склеротическими процессами в органе и клинически проявляется выраженной артериальной гипертензией.

Проведя анализ гистохимической активности NADPH-диафоразы (как маркера NOS) и сделав вывод о длительности заболевания, можно оценить состояние компенсаторной функции почек, а значит, провести соответствующее профилактическое лечение, что позволит в дальнейшем снизить или замедлить развитие терминальной стадии хронической почечной недостаточности (т.е. сморщивания почек) и артериальной гипертензии.

Поскольку не всегда возможно проведение гистохимического анализа почечной ткани, авторами впервые проведено изучение взаимосвязи между активностью NADPH-диафоразы в почках и лабораторными показателями крови и мочи больных хроническим обструктивным пиелонефритом на основе расчетных корреляционных коэффициентов, которые могут рассматриваться как критерии активности этого фермента в клинике (таблица 5), и предложен второй вариант способа определения длительности заболевания детей хроническим обструктивным пиелонефритом на основе лабораторных показателей крови, мочи и величинам давления.

Для этого биологический материал (кровь, моча), взятый у больных детей предыдущей группы, исследовали по общепринятым методикам с соблюдением правил забора бактериологического, микроскопического и биохимического анализа, используя качественные и количественные методы, и сравнивали результаты исследования со среднестатистической нормой и активностью NADPH в различных отделах почек и длительностью заболевания. В качестве лабораторных показателей были приняты во внимание клинические и биохимические показатели крови, показатели общего анализа мочи, анализа мочи на суточные соли, пробы Реберга, артериального давления и т.д., всего анализировали 22 показателя (таблица 5). Все исследования выполняли в клинико-диагностической лаборатории Приморской краевой детской клинической больницы, г. Владивосток.

Математическую обработку данных проводили на персональном компьютере IBM PC AT с использованием пакета статистических программ BIOSTAT. Определяли среднюю арифметическую (X), стандартную ошибку средней арифметической (х), критерии существенности различий (t). На основе доверительного коэффициента t, используя число степеней свободы или число наблюдений, по таблицам Стьюдента-Фишера определяли коэффициент вероятности ошибки (р). Разницу между средними арифметическими считали достоверной при р<0,05. (Афифи А., Эйзен С. Статистический анализ: подход с использованием ЭВМ, - М.: Мир, 1982. – 488 с.). Вероятность возникновения ошибки типа I (опровержение верной гипотезы) связана с уровнем α (Урбах В.Ю. Биометрические методы (статистическая обработка опытных данных в биологии, сельском хозяйстве и медицине). - М.: Наука, 1964, – 415 с.). Был выбран α=0,05, наиболее часто применяющийся в медицинских и биологических исследованиях. Таким образом, все полученные показатели имеют 95-процентный уровень значимости (лежат в данном интервале в 95 случаях из 100).

Анализ данных выполняли в лаборатории математического моделирования экологических систем Института автоматики и процессов управления Дальневосточного отделения Российской академии наук.

Результаты, приведенные в таблице 5, показывают, что существует достоверная (р<0,01) прямая корреляционная зависимость между активностью NADPH-диафоразы в канальцевом аппарате почек и активностью ее в клубочках (r=+0,75), в собирательных трубочках (r=+0,84), в эндотелии сосудов (r=+0,92).

Корреляционная зависимость между активностью NADPH-диафоразы в почках, клинико-лабораторными показателями и продолжительностью болезни проводилась с учетом возраста ребенка для таких показателей крови как гемоглобин, лимфоциты, нейтрофилы, а также удельного веса мочи и артериального давления, а для остальных показателей, которые не имеют выраженной зависимости от возраста, а именно лейкоциты, эозинофилы, мочевина, β-липопротеиды, уровень клубочковой фильтрации, уровень канальцевой реабсорбции, суточная экскреция оксалатов, артериальное давление (систолическое, диастолическое и пульсовое), за норму были приняты среднестатистические показатели (В.А.Доскин, X.Келлер, Н.М.Мураенко, Р.В.Тонкова-Ямпольская. Морфофункциональные константы детского организма. - М.: - Медицина, 1997, – 297 с.).

Обнаружили, что существует сильная обратная корреляционная зависимость между активностью NOS в канальцевом аппарате почек и: уровнем гемоглобина крови (r=-0,82; р<0,01), количеством эозинофилов крови (r=-0,8; р<0,01), суточной экскрецией оксалатов (r=-0,88; р<0,01), а также уровнем систолического артериального давления (r=-0,75; р<0,05), диастолического АД (r=-0,76; р<0,05) и пульсового давления (r=-0,71; р<0,05).

Активность NADPH-диафоразы в сосудистых клубочках также показала корреляционную связь с некоторыми лабораторными и функциональными показателями у больных детей, а именно установлена достоверная (р<0,01) сильная прямая корреляционная зависимость с активностью фермента в собирательных трубочках (r=+0,86) и сосудистом эндотелии (r=+0,93). Сильная отрицательная корреляционная зависимость выявлена с количеством лейкоцитов периферической крови (r=-0,84; р<0,01), количеством эозинофилов (r=-0,92; р<0,01), уровнем мочевины сыворотки крови (r=-0,84; р<0,01), суточной экскрецией оксалатов (r=-0,63; р<0,05), а также уровнем систолического, диастолического и пульсового давления (r=-0,82 - 0,9; р<0,01).

Установлена положительная корреляционная связь между активностью NOS в эпителии собирательных трубочек и эндотелии почечных сосудов (r=+0,86; р<0,01), удельным весом мочи (r=+0,68; р<0,05). Кроме того, выявлена сильная обратная корреляционная зависимость между активностью NADPH-диафоразы в указанной структуре почек и некоторыми лабораторными показателями крови и мочи, в частности: количеством лейкоцитов периферической крови (r=-0,76; р<0,05), количеством эозинофилов (r=-0,94; р<0,01), уровнем протеинурии (r=-0,72; р<0,05), суточной экскрецией оксалатов (r=-0,78; р<0,05), уровнем мочевины и (β-липопротеидов крови (r=-0,71 и -0,82, соответственно; р<0,05), а также систолическим и диастолическим АД (r=-0,69 и -0,71 соответственно; р<0,05).

Энзиматическая активность в эндотелии сосудов у детей с хроническим обструктивным пиелонефритом была в отрицательной коррелляционной связи с количеством лейкоцитов периферической крови (r=-0,76; р<0,05), количеством эозинофилов (r=-0,9; р<0,01), уровнем мочевины крови (r=-0,7; р<0,05), суточной экскрецией оксалатов (r=-0,74; р<0,05) и уровнем систолического, диастолического и пульсового давления у обследованных детей (r=-0,82; r=-0,87 и r=-0,86 соответственно; р<0,01).

Активность NADPH-диафоразы в гладких миоцитах почечных сосудов демонстрирует прямую корреляционную взаимосвязь с количеством лимфоцитов и нейтрофилов периферической крови (r=+0,69 и r=+0,8 соответственно; р<0,01), уровнем мочевины крови (r=+0,73; р<0,05), а также отрицательную зависимость с удельным весом мочи (r=-0,8; р<0,01), уровнем клубочковой фильтрации (r=-0,7; р<0,05) и реабсорбции (r=-0,8; р<0,01). Взаимосвязи фермента с артериальным давлением здесь установлено не было.

Таким образом, как видно из проведенного статистического анализа экспериментальных значений активности NADPH и лабораторных анализов крови и мочи, статистически значимыми, проявляющими корреляционную зависимость с активностью NADPH-диафоразы, как маркера активности NOS, являются гемоглобин, лейкоциты, эозинофилы, мочевина, β-липопротеиды, лимфоциты, нейтрофилы, уровень клубочковой фильтрации (КФ), уровень реабсорбции, уд. вес мочи; суточная экскреция оксалатов, артериальное давление (систолическое, диастолическое и пульсовое). Полученные результаты в абсолютных величинах приведены в таблице 6.

Таблица 6
Клинико-лабораторные показатели	Длительность заболевания
	3 года	7-8 лет	10-12 лет	13-16 лет
Гемоглобин, г/л	121,5±1,2	103,0±3,4	137,0±3,3	142,0±2,4
Лейкоциты, ×109 /л	4,6±0,2	8,2±1,1	8,7±1,3	7,7±1,2
Эозинофилы, %	2,5±1,8	5,0±2,3	7,0±3,4	6,7±3,4
Мочевина, ммоль/л	4,6±0,8	6,7±0,9	6,4±0,7	6,1±1,3
β-липопротеиды, ЕД	39,0±3,1	31,0±3,4	62,5±4,3	40,7±2,6
Лимфоциты, %	32,0±1,8	36,0±1,3	37,0±1,5	33,0±2,1
Нейтрофилы, %	62,0±2,8	55,0±4,1	47,0±1,8	59,0±3,7
Уровень клубочковой фильтрации (КФ), мл/мин	96,9±3,8	101,4±3,9	81,2±4,2	78,5±5,3
Уровень канальцевой реабсорбции, %	97,0±0,6	97,0±0,5	96,0±0,2	95±0,5
Уд. вес мочи	1011±2	1007,5±3,1	1010,5±1,1	1012,5±2,6
Суточная экскреция оксалатов, мэкв/сутки	42,6±5,3	24,2±8,6	53,7±5,1	76,9±2,9
АД, мм рт.ст.- систолич.	115,0±4,8	145,0±4,0	130,0±10,2	190,0±20,3
- диастолич.	75,0±5,4	95,0±5,1	88,0±6,8	130,0±10,6
- пульсовое	40,0±5,1	50,0±4,6	42,0±8,5	80,0±15,5

Поскольку нет оснований предполагать наличия различий в течении болезни в зависимости от географического местонахождения больного ребенка, обнаруженные нами закономерности представлены в таблице 1 в процентном отклонении от нормы, где минус (-) относится к снижению показателя, а плюс (+) к его увеличению, при этом за среднестатистические показатели с учетом возраста ребенка были приняты следующие величины: до 3-х лет: Гемоглобин, г/л - 129; Лимфоциты, % - 50,5; - 144; 36; 53; 1022; и до 13-16 лет 146; 28; 60; 1024 соответственно (В.А.Доскин, Х.Келлер, Н.М.Мураенко, Р.В.Тонкова-Ямпольская. Морфофункциональные константы детского организма. - М.: - Медицина, 1997, – 297 с.).

Таким образом, проведя соответствующие клинико-лабораторные анализы ребенка с диагнозом хронический обструктивный пиелонефрит и проанализировав полученные результаты с учетом выявленных авторами данных, представленных в таблице 1, делают вывод о длительности заболевания, т.е. в конечном итоге о состоянии компенсаторной функции почек, и в соответствии с этим проводят соответствующее профилактическое лечение.

Клинический пример применения заявляемого способа.

Больной Алексей Г., 11 лет (1999 г.), поступил в уронефрологическое отделение ПКДКБ с жалобами на головные боли, боли в поясничной области, тупые, постоянные, усиливающиеся после физической нагрузки, периодические подъемы температуры тела до 37,0-38,0°С, тошноту.

Состояние средней тяжести за счет умеренных симптомов интоксикации, гипертензионного синдрома, болевого и мочевого синдромов. Температура тела - 37,2°С. Кожные покровы бледные, отмечаются периорбитальные тени, пастозность век. Тургор мягких тканей сохранен. Костно-мышечно-суставная система - без видимой патологии. Со стороны органов дыхания - без особенностей. Кардиальная область визуально не изменена. Левая граница относительной сердечной тупости - по левой среднеключичной линии. Тоны сердца громкие, акцент II тона на аорте. АД: систолическое - 150 мм рт.ст. (+44% от нормы), диастолическое - 108 мм рт.ст. (+58%), пульсовое - 42 мм рт.ст (+24%). Частота сердечных сокращений - 84 удара в минуту. Живот симметричный, при пальпации мягкий, безболезненный во всех отделах. Печень, селезенка - не увеличены. Симптом “поколачивания” положительный с двух сторон, больше справа. Пальпировалась увеличенная правая почка, безболезненная. В клиническом анализе крови: эритроцитов - 4,15·10¹²/л, Нb - 101 г/л (-22%), тромбоцитов - 190 тыс., лейкоцитов - 11,0·10⁹/л (+22%), нейтрофилов (п/я - 2%, с/я - 56% (+16%), лимфоцитов - 34% (-12,8%), эозинофилов - 7% (+250%), моноцитов - 3%, СОЭ - 23 мм/ч. В биохимическом анализе крови: общий белок - 71,6 г/л, альбумины - 45,7 г/л, мочевина - 8,2 ммоль/л (+76%), креатинин - 98,8 мкмоль/л, глюкоза - 4,6 ммоль/л, холестерин - 4,1 ммоль/л, В-липопротеиды - 32 ед. (+40%), печеночные пробы в норме. Группа крови: A(II), Rh (+). В коагулограмме: АПТВ – 42 сек, ТВ - 15 сек, ПТИ - 98%, фибриноген - 4,6 г/л, этаноловый тест - отрицательный, тромботест - 6 степени. В общем анализе мочи: рН - нейтральная, уд. вес - 1010, белок - нет, клетки эпит