Гемопоэтический белок (варианты), последовательность днк, способ получения гемопоэтического белка, способ селективной экспансии кроветворных клеток, способ продуцирования дендритных клеток, способ стимуляции продуцирования кроветворных клеток у пациента, фармацевтическая композиция, способ лечения
Патент 2245887
Авторы
- ВУЛЬФ Сьюзн Л. (US)
- МАК ВЕРТЕР Чарльз А. (US)
- МАК КЕРН Джон П. (US)
- МИННЕРЛИ Джон К. (US)
- МИНСТЕР Нэнси И. (US)
- САММЕРС Нина Л. (US)
- СТРИТЕР Филип Р. (US)
- СТЭЙТЕН Николас Р. (US)
- ФЕНГ Йиквинг (US)
Правообладатели
Классы МПК
- A61P31 - Противоинфекционные средства, т.е. антибиотики, антисептики, химиотерапевтические средства
- A61P35 - Противоопухолевые средства
- A61P37 - Лекарственные средства против иммунологических или аллергических заболеваний
- C12N5 - Недифференцированные клетки человека, животных или растений, например клеточные линии; ткани; культивирование или сохранение их; питательные среды для них (размножение растений из тканевых культур A01H 4/00)
- C12P21 - Получение пептидов или протеинов (клеточные протеины C12N 1/00)
- A61K38/19 - цитокины; лимфокины; интерфероны
- C07K14/475 - факторы роста; регуляторы роста
- C07K14/52 - цитокины, лимфокины, интерфероны
- C12N15/62 - ДНК последовательности, кодирующие белки при слиянии
Гемопоэтический белок (варианты), последовательность днк, способ получения гемопоэтического белка, способ селективной экспансии кроветворных клеток, способ продуцирования дендритных клеток, способ стимуляции продуцирования кроветворных клеток у пациента, фармацевтическая композиция, способ лечения
Иллюстрации
Изобретение относится к биотехнологии, в частности генной инженерии, и может быть использовано для получения химерных многофункциональных гемопоэтических белков. Гемопоэтический белок содержит аминокислотную последовательность формулы R1–L1–R1, R2–L1–R1, R1–R2 или R2–R1, где R1 представляет собой модифицированный лиганд flt–3, R2 представляет собой модифицированный IL-3 человека, модифицированный или немодифицированный колониестимулирующий фактор. Модификацию R1 получают путем присоединении N-конца с С-концом непосредственно или через линкер (L2), способный соединять N-конец с С-концом с образованием новых С- и N-концов. Модифицированный IL-3 человека получают путем замены аминокислот в положении 17-123. G-CSF человека модифицируют путем аминокислотных замен. Гемопоэтический белок получают путем культивирования клеток, трансформированных вектором, содержащим РНК, кодирующую гемопоэтический белок. Гемопоэтический белок стимулирует продуцирование кроветворных клеток. В составе фармацевтической композиции его используют для лечения человека, страдающего опухолью, инфекционным или аутоиммунным заболеванием. Изобретение позволяет получать многофункциональные гемопоэтические белки, проявляющие повышенную активность стимуляции кроветворных клеток и обладающие улучшенными физическими характеристиками. 10 н. и 12 з.п. ф-лы, 10 ил., 18 табл.
Реферат
По настоящей заявке испрашивается приоритет согласно статье 35 закона США, б, в соответствии с предварительной заявкой серийный № 60/029629, поданной 25 октября 1996 года.
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к многофункциональным химерным агонистам гемопоэтических рецепторов. Такие многофункциональные химерные агонисты гемопоэтических рецепторов проявляют один или более типов активности отдельных компонентов химерной молекулы и также могут проявлять повышенную активность по стимуляции кроветворных клеток и(или) проявлять повышенную активность, которая может включать снижение нежелательных биологических активностей, связанных с отдельными гемопоэтическими факторами роста, и(или) обладают улучшенными физическими характеристиками, которые могут включать повышенную растворимость, устойчивость и эффективность восстановления пространственной структуры.
Предпосылки изобретения
Колониестимулирующие факторы (CSFs), которые стимулируют дифференцировку и(или) пролиферацию клеток костного мозга, вызывают большой интерес ввиду их терапевтического потенциала, связанного с восстановлением подавленного уровня активности клеток, производных от кроветворных стволовых клеток.
CSFs и у человека, и у мыши уже идентифицированы и разграничены по типу их активности. Например, CSFs гранулоцитов (G-CSF) и CSF макрофагов (M-CSF) стимулируют формирование in vitro колоний нейтрофилов и макрофагов, соответственно, в то время как GM-CSF и интерлейкин-3 (IL-3) характеризуются более широким спектром активности и стимулируют формирование колоний как макрофагов нейтрофилов, так и эозинофилов. IL-3 также стимулирует формирование базофильных, мегакариоцитарных и чистых и смешанных эритроидных колоний.
В Патентах США 4877729 и 4959455 описаны кДНК IL-3 гиббона и расшифрованную последовательность ДНК IL-3 человека и последовательности белков, которые ими кодируются. Представленный hIL-3 содержит в 8-м положении белковой последовательности серин вместо пролина.
В заявке на Международный патент (РСТ) WO 88/00598 описаны IL-3, подобные IL-3 гиббона и человека. В составе hIL-3 произведена замена серина8 на пролин8. Получены подтверждения замещения цистеина серином, что приводит к разрушению дисульфидной связи и замещению одной или нескольких аминокислот по сайтам потенциального гликозилирования.
В патенте США 4810643 представлена последовательность ДНК, кодирующая G-CSF человека.
В Международном патенте WO 91/02754 представлен гибридный белок, включающий GM-CSF и IL-3, который проявляет повышенную биологическую активность, по сравнению с отдельными GM-CSF и IL-3. Также представлены негликозилированные белковые аналоги IL-3 и GM-CSF, такие как компоненты многофункционального химерного агониста гемопоэтических рецепторов.
В Международном патенте WO 92/04455 представлены гибридные белки, включающие IL-3, гибридизованный с лимфокином, выбранный из группы, состоящей из IL-3, IL-6, IL-7, IL-9, IL-11, ЕРО и G-CSF.
В Международных патентах WO 95/21197 и WO 95/21254 представлены гибридные белки, обладающие широким спектром многофункциональных кроветворных эффектов.
Патент Великобритании 2285446 относится к лиганду с-mpl (тромбопоэтин) и различными формами тромбопоэтина, для которых продемонстрировано влияние на репликацию, дифференцировку и созревание мегакариоцитов и предшественников мегакариоцитов, которые могут быть использованы в лечении тромбоцитопении.
Патент ЕР 675201 А1 относится к лиганду с-mpl (фактор роста и развития мегакариоцитов, MGDF), аллельным вариантам лиганда с-mpl и лиганду с-mpl, прикрепленному к водорастворимым полимерам, таким как полиэтиленгликоль.
В Международном патенте WO 95/21920 описаны лиганды с-mpl мыши и человека и его полипептидные фрагменты. Белки применимы для использования в терапии in vivo и ex vivo с целью стимуляции выработки тромбоцитов.
В патенте США 4703008, выданном F.-K.Lin, описана последовательность кДНК, кодирующая эритропоэтин, способы получения и использования эритропоэтина.
В Международном патенте WO 91/05867 описаны аналоги эритропоэтина человека, имеющие большее число сайтов присоединения углеводов в сравнении с эритропоэтином человека, такие как EPO(-Asn69), EPO(-Asn125, Ser127), EPO(-Thr125) и ЕРО(-Pro124, Thr125).
В Международном патенте WO 94/24160 представлены мутантные варианты эритропоэтина, которые характеризуются повышенной активностью, что связано с заменами в положениях 20, 49, 73, 140, 143, 146, 147 и 154.
В Международном патенте WO 94/28391 представлена последовательность нативного лиганда flt3 и последовательность кДНК, кодирующая лиганд flt3, способы экспрессии лиганда flt3 в клетке-хозяине, трансфицированной кДНК, и способы терапии пациентов с нарушениями кроветворения с использованием лиганда flt3.
В патенте США 5554512 представлен лиганд flt3 человека в виде выделенного белка, ДНК, кодирующего лиганд flt3, клетки-хозяина, трансформированные кДНК, кодирующей лиганд flt3, и способы терапии пациентов с использованием лиганда flt3.
В Международном патенте WO 94/26891 представлены лиганды flt3 млекопитающих, включая вариант, имеющий вставку из 29 аминокислот, и соответствующий фрагмент.
Реаранжировка белковых последовательностей
В эволюции реаранжировка последовательностей ДНК играет важную роль в возникновении многообразий структуры и функций белков. Дупликации генов и "перемешивание" экзонов представляют собой важные механизмы быстрого образования разнообразия, и, соответственно, обеспечивают организмам конкурентоспособность, особенно в случаях низкого естественного уровня мутирования (Doolittle, 1992, Protein Sci., 1, 191-200).
Разработка методик рекомбинантной ДНК сделала возможным изучение влияния изменений последовательности на пространственную структуру, организацию и функции белка. Способ создания новых последовательностей позволил установить, что в природе существуют пары белков, которые характеризуются родственной линейной реорганизацией их аминокислотных последовательностей (Cunningham et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 3218-3222; Teather & Erfle, 1990, J. Bacteriol., 172, 3837-3841; Schimming et al., 1992, Eur. J. Biochem., 204, 13-19; Yamiuchi & Minamikawa, 1991, FEBS Lett., 260, 127-130; MacGregor et al., FEBS Lett., 378, 263-266). Впервые применение такого типа перестроек белков in vitro было описано Гольденбергом и Крейтоном (Goldenberg & Creighton, 1983, J. Mol. Biol., 165, 407-413). Новый N-конец был выбран в промежуточном сайте (как точка разрыва) исходной последовательности: новая последовательность характеризуется тем же порядком расположения аминокислот, как и исходная последовательность, от точки разрыва до или почти до исходного С-конца. В этой точке новую последовательность соединяют (прямо или опосредованно через добавочный фрагмент последовательности - линкер) с аминокислотой, находящейся в или рядом с исходным N-концом; новую последовательность продолжают той же последовательностью, что и оригинальная последовательность, до тех пор, пока она не достигнет самой точки или участка, соседствующего с аминокислотой, которая является N-концевой в сайте разрыва исходной последовательности - этот остаток образует новый С-конец цепи.
Такой подход был применен к белкам, размеры которых варьировались в пределах от 58 до 462 аминокислот (Goldenberg & Creighton, 1983, J. Mol. Biol., 165, 407-413; Li & Coffino, 1993, Mol. Cell. Biol., 13, 2377-2383). Исследованные белки охватывают широкий круг структурных классов, включая белки, содержащие доминирующие α-спирали, например, интерлейкин-4 (Kreitm an et al., 1995, Cytokine, 7, 311-318), β-плоскости, например, интерлейкин-1 (Horlick et al., 1992, Protein Eng., 5, 427-431), или смесь этих двух структур, например, фосфорибозилантранилатизомераза дрожжей (Luger et al., 1989, Science, 243, 206-210). Большое число категорий белковых функций представлены в перечисленных исследованиях реорганизации аминокислотных последовательностей:
| Ферменты | |
| лизоцим Т4 | Zhang et al., 1993, Biochemistry, 32, 12311-12318; Zhang et al., 1995, Nature Struct. Biol., 1, 434-438 |
| дигидрофолатредуктаза | Buchwalder et al., 1994, Biochemistry, 31, 1621-1630; Protasova et al., 1995, Protein Eng., 7, 1373-1377 |
| рибонуклеаза Т1 | Mullins et al., 1994, J. Amer. Chem. Sco., 116, 5529-5533; Garrett et al., 1996, Protein Sci., 5, 204-211 |
| β-глюканаза палочек | Hahn et al., 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 10417-10421 |
| аспартаттранскарбамилаза | Yang & Schachman, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 11980-11984 |
| фосфорибозил-антранилатизомераза | Luger et al., 1989, Science, 243, 206-210; Luger et al., 1990, Protein Eng., 3, 249-258 |
| пепсин/пепсиноген | Lin et al., 1995, Protein Sci., 4, 159-166 |
| глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа | Vignais et al., 1995, Protein Sci., 4, 994-1000 |
| орнитиндекарбоксилаза | Li & Coffino, 1993, Mol. Cell. Biol., 13, 2377-2383 |
| фосфоглицератдегидрогеназа дрожжей | Ritco-Vonsovici et al., 1995, Biochemistry, 34, 16543-16551 |
| Ингибиторы ферментов | |
| основной ингибитор трипсина поджелудочной железы | Goldenberg & Creighton, 1983, J. Mol. Biol., 165, 407-413 |
| Цитокины | |
| интерлейкин-1b | Horlick et al., 1992, 'Protein Eng., 5, 427-431 |
| интерлейкин-4 | Kreitman et al., 1995, Cytokine, 7, 311-318 |
| Домен узнавания тирозинкиназ | |
| домен SH3 α-спектрина | Viguera et al., 1995, J. Mol. Biol., 247, 670-681 |
| Трансмембранный белок | |
| оmр-А | Koebnik & Krmer, 1995, J. Mol. Biol., 250, 617-626 |
| Химерный белок | |
| интерлейкин-4-экзотоксин Pseudomonas | Kreitman et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 6889-6893. |
Результаты этих исследований в значительной степени варьируются. Во многих случаях была выявлена существенно меньшая активность, растворимость и термодинамическая стабильность (дигидрофолатредуктаза кишечной палочки, аспартат-транскарбамилаза, фосфорибозилантранилатизомераза, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, орнитиндекарбоксилаза, оmр-А, фосфоглицератдегидрогеназа дрожжей). В других случаях белки с перестроенной последовательностью характеризуются многими свойствами, практически идентичными таковым у их естественных аналогов (основной трипсиновый ингибитор поджелудочной железы, лизоцим Т4, рибонуклеаза Т1, β-глюканаза палочки, интерлейкин-1b, домен SH3 α-спектрина, пепсиноген, интерлейкин-4). В исключительных случаях было отмечено неожиданное улучшение некоторых свойств естественной последовательности, например, растворимости и темпа восстановления пространственной структуры (у домена SH3 α-спектрина), рецепторной аффинности и противоопухолевой активности переносимой молекулы химерного белка, состоящего из интерлейкина-4 и экзотоксина псевдомонады (Kreitman et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 6889-6893; Kreitman et al., 1995, Cancer Res., 55, 3357-3363).
Исходная мотивация отмеченых типов исследований была связана с изучением роли кратко- и долговременных взаимодействий складчатости белков и стабильности. Перестройки аминокислотных последовательностей такого типа представляют группу взаимодействий, которые могут превращаться из долговременных в исходной последовательности в кратковременные в перестроенной последовательности, и наоборот. Тот факт, что многие из этих перестроенных последовательностей способны поддерживать конформационное состояние по крайней мере с некоторым уровнем активности, является убедительным доказательством того, что образование складчатости белка (пространственной организации) происходит с участием разнообразных механизмов (Viguera et al., 1995, J. Mol. Biol., 247, 670-681). В случае с доменом SH3 α-спектрина подбор новых окончаний в сайтах, соответствующих оборотам β-шпилек, приводят к образованию белков с ненамного сниженной стабильностью, которые, тем не менее, способны формировать пространственную структуру.
Положения внутренних точек разрывов, используемых в перечисленных выше работах, обнаруживаются исключительно на поверхности белков и распределены вдоль первичной последовательности полипептида без отчетливого смещения по направлению к концам или середине (изменчивость относительного расстояния от исходного N-конца до точек разрывов составляла от 10 до 80% в расчете на полную длину последовательности). Длина линкеров, использовавшихся для соединения исходных N- и С-концов, составляла от 0 до 9 аминокислотных остатков. В одном случае (Yang & Schachman, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 11980-11984) фрагмент последовательности вырезали из исходного С-концевого сегмента, а соединение осуществляли через укороченый С-конец с исходным N-концом. Гибкие гидрофильные остатки, такие как глицин и серин, часто используются в составе линкеров. Фигуероа с соавт. (Viguera et al., 1995, J. Mol. Biol., 247, 670-681) сравнивали соединение исходных N- и С-концов через 3- или 4-аминокислотные линкеры; термодинамически 3-аминокислотный линкер оказывается менее стабильным. Протасова с соавт. (Protasova et al., 1994, Protein Eng., 7, 1373-1377) использовали линкеры, состоящие из 3 или 5 остатков, при соединении исходных N-концов дигидрофолатредуктазы E.coli: только 3-аминокислотный линкер позволял получать белок с хорошим выходом.
Сущность изобретения
Гемопоэтический белок, включающий аминокислотную последовательность по следующей формуле:
R1-L1-R2, R2-L1-R1 или R1-R2 или R2-R1,
при том, что R1 и R2 являются независимо отбираемыми фрагментами из группы, включающей:
(I) полипептид агониста рецептора ЕРО человека, включающий модифицированную аминокислотную последовательность ЕРО согласно формуле:
при том, что произвольно 1-6 аминокислот с N-конца и 1-5 аминокислот с С-конца могут быть делетированы из состава упомянутого полипептида рецепторного агониста;
при том, что N-конец присоединяют к С-концу напрямую или через линкер (L2), способный соединять N-конец с С-концом и имеющий новые С- и N-концы в аминокислотах;
| 23-24 | 47-48 | 109-110 |
| 24-25 | 48-49 | 110-111 |
| 25-26 | 49-50 | 111-112 |
| 26-27 | 50-51 | 112-113 |
| 27-28 | 51-52 | 113-114 |
| 28-29 | 52-53 | 114-115 |
| 29-30 | 53-54 | 115-116 |
| 30-31 | 54-55 | 116-117 |
| 31-32 | 55-56 | 117-118 |
| 32-33 | 56-57 | 118-119 |
| 33-34 | 57-58 | 119-120 |
| 34-35 | 77-78 | 120-121 |
| 35-36 | 78-79 | 121-122 |
| 36-37 | 79-80 | 122-123 |
| 37-38 | 80-81 | 123-124 |
| 38-39 | 81-82 | 124-125 |
| 39-40 | 82-83 | 125-126 |
| 40-41 | 84-85 | 126-127 |
| 41-42 | 85-86 | 127-128 |
| 42-43 | 86-87 | 128-129 |
| 43-44 | 87-88 | 129-130 |
| 44-45 | 88-89 | 130-131 |
| 45-46 | 108-109 | 131-132 |
| 46-47 | соответственно; и |
(II) полипептид агониста рецептора фактора стволовых клеток человека, включающий модифицированную аминокислотную последовательность фактора стволовых клеток согласно формуле:
при том, что произвольно 1-23 аминокислоты могут быть делетированы от С-конца упомянутого полипептида агониста рецептора фактора стволовых клеток;
при том, что N-конец присоединяют к С-концу напрямую или через линкер (L2), способный соединять N-конец с С-концом и имеющий новые С- и N-концы в аминокислотах;
| 23-24 | 39-40 | 96-97 |
| 24-25 | 40-41 | 97-98 |
| 25-26 | 64-65 | 98-99 |
| 26-27 | 65-66 | 99-100 |
| 27-28 | 66-67 | 100-101 |
| 28-29 | 67-68 | 101-102 |
| 29-30 | 68-69 | 102-103 |
| 30-31 | 69-70 | 103-104 |
| 31-32 | 70-71 | 104-105 |
| 32-33 | 89-90 | 105-106 |
| 33-34 | 90-91 | 106-107 |
| 34-35 | 91-92 | 107-108 |
| 35-36 | 92-93 | 108-109 |
| 36-37 | 93-94 | 109-110 |
| 37-38 | 94-95 | 110-111 |
| 38-39 | 95-96 | соответственно |
(III) полипептид агониста рецептора flt-3 человека, включающий модифицированную аминокислотную последовательность лиганда flt-3 согласно формуле:
при том, что 1-7 аминокислот произвольно делетируют с С-конца упомянутого полипептида агониста рецептора flt-3;
при том, что N-конец присоединяют к С-концу напрямую или через линкер (L2), способный соединять N-конец с С-концом и имеющий новые С- и N-концы в аминокислотах;
| 28-29 | 42-43 | 93-94 |
| 29-30 | 64-65 | 94-95 |
| 30-31 | 65-66 | 95-96 |
| 31-32 | 66-67 | 96-97 |
| 32-33 | 86-87 | 97-98 |
| 34-35 | 87-88 | 98-99 |
| 36-37 | 88-89 | 99-100 |
| 37-38 | 89-90 | 100-101 |
| 38-39 | 90-51 | 101-102 |
| 39-40 | 91-92 | 102-103 |
| 40-41 | 92-93 | соответственно, и |
| 41-42 |
(IV) полипептид, включающий модифицированную аминокислотную последовательность G-CSF человека согласно формуле:
при том, что
Хаа в положении 1 - это Thr, Sеr, Аrg, Туr или Gly;
Хаа в положении 2 - это Pro или Leu;
Хаа в положении 3 - это Leu, Аrg, Tyr или Ser;
Хаа в положении 13 - это Phe, Ser, His, Thr или Pro;
Хаа в положении 16 - это Lys, Pro, Ser, Thr или His;
Хаа в положении 17 - это Cys, Ser, Gly, Ala, Ile, Tyr или Arg;
Хаа в положении 18 - это Leu, Thr, Pro, His, Ile или Cys;
Хаа в положении 22 - это Arg, Tyr, Ser, Thr или Ala;
Хаа в положении 24 - это Ile, Pro, Tyr или Leu;
Хаа в положении 27 - это Asp или Gly;
Хаа в положении 30 - это Ala, Ile, Leu или Gly;
Хаа в положении 34 - это Lys или Ser;
Хаа в положении 36 - это Cys или Ser;
Хаа в положении 42 - это Cys или Ser;
Хаа в положении 43 - это His, Thr, Gly, Val, Lys, Trp, Ala,Arg, Cys или Leu;
Хаа в положении 44 - это Pro, Gly, Arg, Asp, Val, Ala, His, Trp, Gln или Thr;
Хаа в положении 46 - это Glu, Arg, Phe, Arg, Ile или Ala;
Хаа в положении 47 - это Leu или Thr;
Хаа в положении 49 - это Leu, Phe, Arg или Ser;
Хаа в положении 50 - это Leu, Ile, His, Pro или Tyr;
Хаа в положении 54 - это Leu или His;
Хаа в положении 64 - это Cys или Ser;
Хаа в положении 67 - это Gln, Lys, Leu или Cys;
Хаа в положении 70 - это Gln, Pro, Leu, Arg или Ser;
Хаа в положении 74 - это Суs или Ser;
Хаа в положении 104 - это Asp, Gly или Val;
Хаа в положении 108 - это Leu, Ala, Val, Arg, Trp, Gln или Gly;
Хаа в положении 115 - это Thr, His, Leu или Ala;
Хаа в положении 120 - это Gln, Gly, Arg, Lys или His;
Хаа в положении 123 - это Glu, Arg, Phe или Thr;
Хаа в положении 144 - это Phe, His, Arg, Pro, Leu, Gln или Glu;
Хаа в положении 146 - это Arg или Gln;
Хаа в положении 147 - это Arg или Gln;
Хаа в положении 156 - это His, Gly или Ser;
Хаа в положении 159 - это Ser, Arg, Thr, Туг, Val или Gly;
Хаа в положении 162 - это Glu, Leu, Gly или Trp;
Хаа в положении 163 - это Val, Gly, Arg или Ala;
Хаа в положении 169 - это Arg, Ser, Leu, Arg или Cys;
Хаа в положении 170 - это His, Arg или Ser;
при том, что 1-11 аминокислот с N-конца и 1-5 аминокислот с С-конца могут произвольно делетироваться из упомянутой модифицированной аминокислотной последовательности G-CSF человека; и
при том, что N-конец присоединяют к С-концу напрямую или через линкер (L2), способный соединять N-конец с С-концом и имеющий новые С- и N-концы в аминокислотах;
| 38-39 | 62-63 | 123-124 |
| 39-40 | 63-64 | 124-125 |
| 40-41 | 64-65 | 125-126 |
| 41-42 | 65-66 | 126-127 |
| 42-43 | 66-67 | 128-129 |
| 43-44 | 67-68 | 128-129 |
| 45-46 | 68-69 | 129-130 |
| 48-49 | 69-70 | 130-131 |
| 49-50 | 70-71 | 131-132 |
| 52-53 | 71-72 | 132-133 |
| 53-54 | 91-92 | 133-134 |
| 54-44 | 92-93 | 134-135 |
| 55-56 | 93-94 | 135-136 |
| 56-57 | 94-95 | 136-137 |
| 57-58 | 95-96 | 137-138 |
| 58-59 | 96-97 | 138-139 |
| 59-60 | 97-98 | 139-140 |
| 60-61 | 98-99 | 140-141 |
| 61-62 | 99-100 | 141-142 |
| или 142-143 | ||
| соответственно |
(V) полипептид, включающий модифицированную аминокислотную последовательность IL-3 человека, согласно формуле:
при том, что
Хаа в положении 17 - это Ser, Lys, Gly, Asp, Met, Gln или Arg;
Хаа в положении 18 - это Asn, His, Leu, Ile, Phe, Arg или Gln;
Хаа в положении 19 - это Met, Phe, Ile, Arg, Gly, Ala или Cys;
Хаа в положении 20 - это Ile, Cys, Gln, Glu, Arg, Pro или Ala;
Хаа в положении 21 - это Asp, Phe, Lys, Arg, Ala, Gly, Glu, Gln, Asn, Thr, Ser или Val;
Хаа в положении 22 - это Glu, Trp, Pro, Ser, Ala, His, Asp, Asn, Gln, Leu, Val или Gly;
Хаа в положении 23 - это Ile, Val, Ala, Gly, Trp, Lys, Phe, Leu, Ser или Arg;
Хаа в положении 24 - это Ile, Gly, Val, Arg, Ser, Phe или Leu;
Хаа в положении 25 - это Thr, His, Gly, Gln, Arg, Pro или Ala;
Хаа в положении 26 - это His, Thr, Phe, Gly, Arg, Ala или Trp;
Хаа в положении 27 - это Leu, Gly, Arg, Thr, Ser или Ala;
Хаа в положении 28 - это Lys, Arg, Leu, Gln, Gly, Pro, Val или Trp;
Хаа в положении 29 - это Gln, Asn, Leu, Pro, Arg или Val;
Хаа в положении 30 - это Pro, His, Thr, Gly, Asp, Gln, Ser, Leu или Lys;
Хаа в положении 31 - это Pro, Asp, Gly, Ala, Arg, Leu илиGln;
Хаа в положении 32 - это Leu, Val, Arg, Gln, Asn, Gly, Ala или Glu;
Хаа в положении 33 - это Pro, Leu, Gln, Ala, Thr или Glu;
Хаа в положении 34 - это Leu, Val, Gly, Ser, Lys, Glu, Gln, Thr, Arg, Ala, Phe, Ile или Met;
Хаа в положении 35 - это Leu, Ala, Gly, Asn, Pro, Gln или Val;
Хаа в положении 36 - это Asp, Leu или Val;
Хаа в положении 37 - это Phe, Ser, Pro, Trp или Ile;
Хаа в положении 38 - это Asn или Ala;
Хаа в положении 40 - это Leu, Trp или Arg;
Хаа в положении 41 - это Asn, Cys, Arg, Leu, His, Met или Pro;
Хаа в положении 42 - это Gly, Asp, Ser, Cys, Asn, Lys, Thr, Leu, Val, Glu, Phe, Tyr, Ile, Met или Ala;
Хаа в положении 43 - это Glu, Asn, Tyr, Leu, Phe, Asp, Ala, Cys, Gln, Arg, Thr, Gly или Ser;
Хаа в положении 44 - это Asp, Ser, Leu, Arg, Lys, Thr, Met, Trp, Glu, Asn, Gln, Ala или Pro;
Хаа в положении 45 - это Gln, Pro, Phe, Val, Met, Leu, Thr, Lys, Trp, Asp, Asn, Arg, Ser, Ala, Ile, Glu или His;
Хаа в положении 46 - это Asp, Phe, Ser, Thr, Cys, Glu, Asn, Gln, Lys, His, Ala, Tyr, Ile, Val или Gly;
Хаа в положении 47 - это Ile, Gly, Val, Ser, Arg, Pro или His;
Хаа в положении 48 - это Leu, Ser, Cys, Arg, Ile, His, Phe, Glu, Lys, Thr, Ala, Met, Val или Asn;
Хаа в положении 49 - это Met, Arg, Ala, Gly, Pro, Asn, His или Asp;
Хаа в положении 50 - это Glu, Leu, Thr, Asp, Tyr, Lys, Asn, Ser, Ala, Ile, Val, His, Phe, Met или Gln;
Хаа в положении 51 - это Asn, Arg, Met, Pro, Ser, Thr или His;
Хаа в положении 52 - это Asn, His, Arg, Leu, Gly, Ser или Thr;
Хаа в положении 53 - это Leu, Thr, Ala, Gly, Glu, Pro, Lys, Ser или Met;
Хаа в положении 54 - это Arg, Asp, Ile, Ser, Val, Thr, Gln, Asn, Lys, His, Ala или Leu;
Хаа в положении 55 - это Arg, Thr, Val, Ser, Leu или Gly;
Хаа в положении 56 - это Pro, Gly, Cys, Ser, Gln, Glu, Arg, His, Thr, Ala, Tyr, Phe, Leu, Val или Lys;
Хаа в положении 57 - это Asn или Gly;
Хаа в положении 58 - это Leu, Ser, Asp, Arg, Gln, Val или Cys;
Хаа в положении 59 - это Glu, Tyr, His, Leu, Pro или Arg;
Хаа в положении 60 - это Ala, Ser, Pro, Tyr, Asn или Thr;
Хаа в положении 61 - это Phe, Asn, Glu, Pro, Lys, Arg или Ser;
Хаа в положении 62 - это Asn, His, Val, Arg, Pro, Thr, Asp или Ile;
Хаа в положении 63 - это Arg, Tyr, Trp, Lys, Ser, His, Pro или Val;
Хаа в положении 64 - это Ala, Asn, Pro, Ser или Lys;
Хаа в положении 65 - это Val, Thr, Pro, His, Leu, Phe или Ser;
Хаа в положении 66 - это Lys, Ile, Arg, Val, Asn, Glu или Ser;
Хаа в положении 67 - это Ser, Ala, Phe, Val, Gly, Asn, Ile, Pro или His;
Хаа в положении 68 - это Leu, Val, Trp, Ser, Ile, Phe, Thr или His;
Хаа в положении 69 - это Gln, Ala, Pro, Thr, Glu, Arg, Trp, Gly или Leu;
Хаа в положении 70 - это Asn, Leu, Val, Trp, Pro или Ala;
Хаа в положении 71 - это Ala, Met, Leu, Pro, Arg, Glu, Thr,Gln, Trp или Asn;
Хаа в положении 72 - это Ser, Glu, Met, Ala, His, Asn, Arg или Asp;
Хаа в положении 73 - это Ala, Glu, Asp, Leu, Ser, Gly, Thr или Arg;
Хаа в положении 74 - это Ile, Met, Thr, Pro, Arg, Gly или Ala;
Хаа в положении 75 - это Glu, Lys, Gly, Asp, Pro, Trp, Arg, Ser, Gln или Leu;
Хаа в положении 76 - это Ser, Val, Ala, Asn, Trp, Glu, Pro, Gly или Asp;
Хаа в положении 77 - это Ile, Ser, Arg, Thr или Leu;
Хаа в положении 78 - это Leu, Ala, Ser, Glu, Phe, Gly или Arg;
Хаа в положении 79 - это Lys, Thr, Asn, Met, Arg, Ile, Gly или Asp;
Хаа в положении 80 - это Asn, Trp, Val, Gly, Thr, Leu, Glu или Arg;
Хаа в положении 81 - это Leu, Gln, Gly, Ala, Thr, Arg, Val или Lys;
Хаа в положении 82 - это Leu, Gln, Lys, Trp, Arg, Asp, Glu, Asn, His, Thr, Ser, Ala, Tyr, Phe, Ile, Met или Val;
Хаа в положении 83 - это Pro, Ala, Thr, Trp, Arg или Met;
Хаа в положении 84 - это Cys, Glu, Gly, Arg, Met или Val;
Хаа в положении 85 - это Leu, Asn, Val или Gln;
Хаа в положении 86 - это Pro, Cys, Arg, Ala или Lys;
Хаа в положении 87 - это Leu, Ser, Trp или Gly;
Хаа в положении 88 - это Ala, Lys, Arg, Val или Trp;
Хаа в положении 89 - это Thr, Asp, Cys, Leu, Val, Glu, His, Asn или Ser;
Хаа в положении 90 - это Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Asp, Ile или Met;
Хаа в положении 91 - это Ala, Pro, Ser, Thr, Phe, Leu, Asp или His;
Хаа в положении 92 - это Pro, Phe, Arg, Ser, Lys, His, Ala, Gly, Ile или Leu;
Хаа в положении 93 - это Thr, Asp, Ser, Asn, Pro, Ala, Leu или Arg;
Хаа в положении 94 - это Arg, Ile, Ser, Glu, Leu, Val, Gln, Lys, His, Ala или Pro;
Хаа в положении 95 - это His, Gln, Pro, Arg, Val, Leu, Gly, Thr, Asn, Lys, Ser, Ala, Trp, Phe, Ile или Tyr;
Хаа в положении 96 - это Pro, Lys, Tyr, Gly, Ile или Thr;
Хаа в положении 97 - это Ile, Val, Lys, Ala или Asn;
Хаа в положении 98 - это His, Ile, Asn, Leu, Asp, Ala, Thr, Glu, Gln, Ser, Phe, Met, Val, Lys, Arg, Tyr или Pro;
Хаа в положении 99 - это Ile, Leu, Arg, Asp, Val, Pro, Gln, Gly, Ser, Phe или His;
Хаа в положении 100 - это Lys, Tyr, Leu, His, Arg, Ile, Ser, Gln или Pro;
Хаа в положении 101 - это Asp, Pro, Met, Lys, His, Thr, Val, Tyr, Glu, Asn, Ser, Ala, Gly, Ile, Leu или Gln;
Хаа в положении 102 - это Gly, Leu, Glu, Lys, Ser, Tyr или Pro;
Хаа в положении 103 - это Asp или Ser;
Хаа в положении 104 - это Trp, Val, Cys, Tyr, Thr, Met, Pro, Leu, Gln, Lys, Ala, Phe или Gly;
Хаа в положении 105 - это Asn, Pro, Ala, Phe, Ser, Trp, Gln, Tyr, Leu, Lys, Ile. Asp или His;
Хаа в положении 106 - это Glu, Ser, Ala, Lys, Thr, Ile, Gly или Pro;
Хаа в положении 108 - это Arg, Lys, Asp, Leu, Thr, Ile, Gln, His, Ser, Ala или Pro;
Хаа в положении 109 - это Arg, Thr, Pro, Glu, Tyr, Leu, Ser или Gly;
Хаа в положении 110 - это Lys, Ala, Asn, Thr, Leu, Arg, Gln, His, Glu, Ser или Trp;
Хаа в положении 111 - это Leu, Ile, Arg, Asp или Met;
Хаа в положении 112 - это Thr, Val, Gln, Tyr, Glu, His, Ser или Phe;
Хаа в положении 113 - это Phe, Ser, Cys, His, Gly, Trp, Tyr, Asp, Lys, Leu, Ile, Val или Asn;
Хаа в положении 114 - это Tyr, Cys, His, Ser, Trp, Arg или Leu;
Хаа в положении 115 - это Leu, Asn, Val, Pro, Arg, Ala, His, Thr, Trp или Met;
Хаа в положении 116 - это Lys, Leu, Pro, Thr, Met, Asp, Val, Glu, Arg, Trp, Ser, Asn, His, Ala, Tyr, Phe, Gln или Ile;
Хаа в положении 117 - это Thr, Ser, Asn, Ile, Trp, Lys или Pro;
Хаа в положении 118 - это Leu, Ser, Pro, Ala, Glu, Cys, Asp или Tyr;
Хаа в положении 119 - это Glu, Ser, Lys, Рro, Leu, Thr, Туг или Аrg;
Хаа в положении 120 - это Asn, Ala, Pro, Leu, His, Val или Gln;
Хаа в положении 121 - это Ala, Ser, Ile, Asn, Pro, Lys, Asp или Gly;
Хаа в положении 122 - это Gln, Ser, Met, Trp, Arg, Phe, Pro, His, Ile, Туr или Cys;
Хаа в положении 123 - это Ala, Met, Glu, His, Ser, Pro, Туг или Leu;
при том, что аминокислоты с 1-й по 14-ю могут быть произвольно делетированы с N-конца и (или) аминокислоты с 1-й по 15-ю могут быть произвольно делетированы с С-конца упомянутой модифицированной аминокислотной последовательности IL-3 человека; при том, что аминокислоты с 0-й по 44-ю, обозначенные Хаа, отличаются от соответствующей аминокислотной последовательности нативного интерлейкина-3 (I-133) человека; и
при том, что N-конец присоединяют к С-концу напрямую или через линкер (L2), способный соединять N-конец с С-концом и имеющий новые С- и N-концы в аминокислотах;
| 26-27 | 49-50 | 83-84 |
| 27-28 | 50-51 | 84-85 |
| 28-29 | 51-52 | 85-86 |
| 29-30 | 52-53 | 86-87 |
| 30-31 | 53-54 | 87-88 |
| 31-32 | 54-55 | 88-89 |
| 32-33 | 64-65 | 89-90 |
| 33-34 | 65-66 | 90-91 |
| 34-35 | 66-67 | 91-92 |
| 35-36 | 67-68 | 92-93 |
| 36-37 | 68-69 | 97-98 |
| 37-38 | 69-70 | 98-99 |
| 38-39 | 70-71 | 99-100 |
| 39-40 | 71-72 | 100-101 |
| 40-41 | 72-73 | 101-102 |
| 41-42 | 82-83 | 102-103 |
| или 103-104 | ||
| соответственно |
(VI) полипептид, включающий модифицированную аминокислотную последовательность лиганда с-mpl человека, согласно формуле:
при том, что
Хаа в положении 112 делетируется или является Leu, Ala, Val, Ile, Pro, Phe, Trp или Met;
Хаа в положении 113 делетируется или является Pro, Phe, Ala, Val, Leu, Ile, Trp или Met;
Хаа в положении 114 делетируется или является Pro, Phe, Ala, Val, Leu, Ile, Trp или Met;
Хаа в положении 115 делетируется или является Gln, Gly, Ser, Thr, Туг или Asn;
и
при том, чго N-конец присоединяют к С-концу напрямую или через линкер (L2), способный соединять N-конец с С-концом и имеющий новые С- и N-концы в аминокислотах;
| 26-27 | 51-52 | 108-109 |
| 27-28 | 52-53 | 109-110 |
| 28-29 | 53-54 | 110-111 |
| 29-30 | 54-55 | 111-112 |
| 30-31 | 55-56 | 112-113 |
| 32-33 | 56-57 | 113-114 |
| 33-34 | 57-58 | 114-115 |
| 34-35 | 58-59 | 115-116 |
| 36-37 | 59-60 | 116-117 |
| 37-38 | 78-79 | 117-118 |
| 38-39 | 79-80 | 118-119 |
| 40-41 | 80-81 | 119-120 |
| 41-42 | 81-82 | 120-121 |
| 42-43 | 82-83 | 121-122 |
| 43-44 | 83-84 | 122-123 |
| 44-45 | 84-85 | 123-124 |
| 46-47 | 85-86 | 124-125 |
| 47-48 | 86-87 | 125-126 |
| 48-49 | 87-88 | 126-127 |
| 50-51 | 88-89 | или 127-128, |
| соответственно; |
(VII) полипептид, включающий модифицированную аминокислотную последовательность IL-3 человека, согласно формуле:
при том, что
Хаа в положении 17 - это Ser, Lys, Gly, Asp, Met, Gln или Arg;
Хаа в положении 18 - это Asn, His, Leu, Ile, Phe, Arg или Gln;
Хаа в положении 19 - это Met, Phe, Ile, Arg, Gly, Ala или Cys;
Хаа в положении 20 - это Ile, Cys, Gln, Glu, Arg, Pro или Ala;
Хаа в положении 21 - это Asp, Phe, Lys, Arg, Ala, Gly, Glu, Gln, Asn, Thr, Ser или Val;
Хаа в положении 22 - это Glu, Trp, Pro, Ser, Ala, His, Asp, Asn, Gln, Leu, Val или Gly;
Хаа в положении 23 - это Ile, Val, Ala, Gly, Trp, Lys, Phe, Leu, Ser или Arg;
Хаа в положении 24 - это Ile, Gly, Val, Arg, Ser, Phe или Leu;
Хаа в положении 25 - это Thr, His, Gly, Gln, Arg, Pro или Ala;
Хаа в положении 26 - это His, Thr, Phe, Gly, Arg, Ala или Trp;
Хаа в положении 27 - это Leu, Gly, Arg, Thr, Ser или Ala;
Хаа в положении 28 - это Lys, Arg, Leu, Gln, Gly, Pro, Val или Trp;
Хаа в положении 29 - это Gln, Asn, Leu, Pro, Arg или Val;
Xaa в положении 30 - это Pro, His, Thr, Gly, Asp, Gln, Ser, Leu или Lys;
Xaa в положении 31 - это Pro, Asp, Gly, Ala, Arg, Leu илиGln;
Xaa в положении 32 - это Leu, Val, Arg, Gln, Asn, Gly, Ala или Glu;
Xaa в положении 33 - это Pro, Leu, Gln, Ala, Thr или Glu;
Xaa в положении 34 - это Leu, Val, Gly, Ser, Lys, Glu, Gln, Thr, Arg, Ala, Phe, Ile или Met;
Xaa в положении 35 - это Leu, Ala, Gly, Asn, Pro, Gln или Val;
Xaa в положении 36 - это Asp, Leu или Val;
Xaa в положении 37 - это Phe, Ser, Pro, Trp или Ile;
Xaa в положении 38 - это Asn или Ala;
Хаа в положении 40 - это Leu, Trp или Arg;
Xaa в положении 41 - это Asn, Cys, Arg, Leu, His, Met или Pro;
Xaa в положении 42 - это Gly, Asp, Ser, Cys, Asn, Lys, Thr, Leu, Val, Glu, Phe, Tyr, Ile, Met или Ala;
Xaa в положении 43 - это Glu, Asn, Tyr, Leu, Phe, Asp, Ala, Cys, Gln, Arg, Thr, Gly или Ser;
Xaa в положении 44 - это Asp, Ser, Leu, Arg, Lys, Thr, Met, Trp, Glu, Asn, Gln, Ala или Pro;
Xaa в положении 45 - это Gln, Pro, Phe, Val, Met, Leu, Thr, Lys, Trp, Asp, Asn, Arg, Ser, Ala, Ile, Glu или His;
Xaa в положении 46 - это Asp, Phe, Ser, Thr, Cys, Glu, Asn, Gln, Lys, His, Ala, Tyr, Ile, Val или Gly;
Xaa в положении 47 - это Ile, Gly, Val, Ser, Arg, Pro или His;
Xaa в положении 48 - это Leu, Ser, Cys, Arg, Ile. His, Phe, Glu, Lys, Thr, Ala, Met, Val или Asn;
Xaa в положении 49 - это Met, Arg, Ala, Gly, Pro, Asn, His или Asp;
Xaa в положении 50 - это Glu, Leu, Thr, Asp, Tyr, Lys, Asn, Ser, Ala, Ile, Val, His, Phe, Met или Gln;
Xaa в положении 51 - это Asn, Arg, Met, Pro, Ser, Thr или His;
Xaa в положении 52 - это Asn, His, Arg, Leu, Gly, Ser или Thr;
Xaa в положении 53 - это Leu, Thr, Ala, Gly, Glu, Pro, Lys, Ser или Met;
Xaa в положении 54 - это Arg, Asp, Ile, Ser, Val, Thr, Gln, Asn, Lys, His, Ala или Leu;
Xaa в положении 55 - это Arg, Thr, Val, Ser, Leu или Gly;
Xaa в положении 56 - это Pro, Gly, Cys, Ser, Gln, Glu, Arg, His, Thr, Ala, Tyr, Phe, Leu, Val или Lys;
Xaa в положении 57 - это Asn или Gly;
Xaa в положении 58 - это Leu, Ser, Asp, Arg, Gln, Val или Cys;
Xaa в положении 59 - это Glu, Tyr, His, Leu, Pro или Arg;
Xaa в положении 60 - это Ala, Ser, Pro, Tyr, Asn или Thr;
Xaa в положении 61 - это Phe, Asn, Glu, Pro, Lys, Arg или Ser;
Хаа в положении 62 - это Asn, His, Val, Arg, Pro, Thr, Asp или Ile;
Хаа в положении 63 - это Arg, Tyr, Trp, Lys, Ser, His, Pro или Val;
Хаа в положении 64 - это Ala, Asn, Pro, Ser или Lys;
Хаа в положении 65 - это Val, Thr, Pro, His, Leu, Phe или Ser;
Хаа в положении 66 - это Lys, Ile, Arg, Val, Asn, Glu или Ser;
Хаа в положении 67 - это Ser, Ala, Phe, Val, Gly, Asn, Ile, Pro или His;
Хаа в положении 68 - это Leu, Val, Trp, Ser, Ile, Phe, Thr или His;
Хаа в положении 69 - это Gln, Ala, Pro, Thr, Glu, Arg, Trp, Gly или Leu;
Хаа в положении 70 - это Asn, Leu, Val, Trp, Pro или Ala;
Хаа в положении 71 - это Ala, Met, Leu, Pro, Arg, Glu, Thr,Gln, Trp или Asn;
Хаа в положении 72 - это Ser, Glu, Met, Ala, His, Asn, Arg или Аsp;
Хаа в положении 73 - это Ala, Glu, Asp, Leu, Ser, Gly, Thr или Arg;
Хаа в положении 74 - это Ile, Met, Thr, Pro, Arg, Gly или Ala;
Хаа в положении 75 - это Glu, Lys, Gly, Asp, Pro, Trp, Arg, Ser, Gln или Leu;
Хаа в положении 76 - это Ser, Val, Ala, Asn, Trp, Glu, Pro, Gly или Asp;
Хаа в положении 77 - это Ile, Ser, Arg, Thr или Leu;
Хаа в положении 78 - это Leu, Ala, Ser, Glu, Phe, Gly или Arg;
Хаа в положении 79 - это Lys, Thr, Asn, Met, Arg, Ilе, Gly или Asp;
Хаа в положении 80 - это Asn, Trp, Val, Gly, Thr, Leu, Glu или Arg;
Хаа в положении 81 - это Leu, Gln, Gly, Ala, Thr, Arg, Val или Lys;
Хаа в положении 82 - это Leu, Gln, Lys, Trp, Arg, Asp, Glu, Asn, His, Thr, Ser, Ala, Tyr, Phe, Ile, Met или Val;
Хаа в положении 83 - это Pro, Ala, Thr, Trp, Arg или Met;
Хаа в положении 84 - это Cys, Glu, Gly, Arg, Met или Val;
Хаа в положении 85 - это Leu, Asn, Val или Gln;
Хаа в положении 86 - это Pro, Cys, Arg, Ala или Lys;
Хаа в положении 87 - это Leu, Ser, Trp или Gly;
Хаа в положении 88 - это Ala, Lys, Arg, Val или Trp;
Хаа в положении 89 - это Thr, Asp, Cys, Leu, Val, Glu, His, Asn или Ser;
Хаа в положении 90 - это Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Asp, Ile или Met;
Хаа в положении 91 - это Ala, Pro, Ser, Thr, Phe, Leu, Asp или His;
Хаа в положении 92 - это Pro, Phe, Arg, Ser, Lys, His, Ala, Gly, Ile или Leu;
Хаа в положении 93 - это Thr, Asp, Ser, Asn, Pro, Ala, Leu или Arg;
Xaa в положении 94 - это Arg, Ile, Ser, Glu, Leu, Val, Gln, Lys, His, Ala или Pro;
Xaa в положении 95 - это His, Gln, Pro, Arg, Val, Leu, Gly, Thr, Asn, Lys, Ser, Ala, Trp, Phe, Ile или Tyr;
Xaa в положении 96 - это Pro, Lys, Tyr, Gly, Ile или Thr;
Xaa в положении 97 - это Ile, Val, Lys, Ala или Asn;
Xaa в положении 98 - это His, Ile, Asn, Leu, Asp, Ala, Thr, Glu, Gln, Ser, Phe, Met, Val, Lys, Arg, Tyr или Pro;
Xaa в положении 99 - это Ile, Leu, Arg, Asp, Val, Pro, Gln, Gly, Ser, Phe или His;
Xaa в положении 100 - это Lys, Tyr, Leu, His, Arg, Ile, Ser, Gln или Pro;
Xaa в положении 101 - это Asp, Pro, Met, Lys, His, Thr, Val, Tyr, Glu, Asn, Ser, Ala, Gly, Ile, Leu или Gln;
Xaa в положении 102 - это Gly, Leu, Glu, Lys, Ser, Tyr или Pro;
Xaa в положении 103 - это Asp или Ser;
Xaa в положении 104 - это Trp, Val, Cys, Tyr, Thr, Met, Pro, Leu, Gln, Lys, Ala, Phe или Gly;
Xaa в положении 105 - это Asn, Pro, Ala, Phe, Ser, Trp, Gln, Tyr, Leu, Lys, Ile, Asp или His;
Xaa в положении 106 - это Glu, Ser, Ala, Lys, Thr, Ile, Gly или Pro;
Xaa в положении 108 - это Arg, Lys, Asp, Leu, Thr, Ile, Gln, His, Ser, Ala или Pro;
Xaa в положении 109 - это Arg, Thr, Pro, Glu, Tyr, Leu, Ser или Gly;
Xaa в положении 110 - это Lys, Ala, Asn, Thr, Leu, Arg, Gln, His, Glu, Ser или Trp;
Xaa в положении 111 - это Leu, Ile, Arg, Asp или Met;
Xaa в положении 112 - это Thr, Val, Gln, Tyr, Glu, His, Ser или Phe;
Xaa в положении 113 - это Phe, Ser, Cys, His, Gly, Trp, Tyr, Asp, Lys, Leu, Ile, Val или Asn;
Xaa в положении 114 - это Tyr, Cys, His, Ser, Trp, Arg или Leu;
Xaa в положении 115 - это Leu, Asn, Val, Pro, Arg, Ala, His, Thr, Trp или Met;
Xaa в положении 116 - это Lys, Leu, Pro, Thr, Met, Asp, Val, Glu, Arg, Trp, Ser, Asn, His, Ala, Tyr, Phe, Gln или Ile;
Xaa в положении 117 - это Thr, Ser, Asn, Ile, Trp, Lys или Pro;
Xaa в положении 118 - это Leu, Ser, Pro, Ala, Glu, Cys, Asp или Tyr;
Xaa в положении 119 - это Glu, Ser, Lys, Pro, Leu, Thr, Tyr или Arg;
Xaa в положении 120 - это Asn, Ala, Pro, Leu, His, Val или Gln;
Xaa в положении 121 - это Ala, Ser, Ile, Asn, Pro, Lys, Asp или Gly;
Xaa в положении 122 - это Gln, Ser, Met, Trp, Arg, Phe, Pro, His, Ile, Tyr или Cys;
Xaa в положении 123 - это Ala, Met, Glu, His, Ser, Pro, Tyr или Leu;
при том, что аминокислоты с 1-й по 14-ю могут быть произвольно делетированы с N-конца и (или) аминокислоты с 1-й по 15-ю могут быть произвольно делетированы с С-конца упомянутой модифицированной аминокислотной последовательности IL-3 человека; при том, что аминокислоты с 1-й по 44-ю, обозначенные Хаа, отличаются от соответствующей аминокислотной последовательности нативного (1-133) интерлейкина-3 (IL-3) человека; и
(VIII) фактор, отобранный из группы, состоящей из колониестимулирующего фактора, цитокина, лимфокина, интерлейкина;
при том, что L1 является линкером, способным связывать R1 с R2;
с оговоркой, что по крайней мере R1 или R2 отбирается из полипептидов согласно формулам (I), (II) или (III); и
произвольно упомянутый гемопоэтический белок может быть немедленно предвосхищен (метионином-1), (аланином-1) или (метионином-2, аланином-1).
Наиболее удобными точками разрыва, по которым новые С- и N-концы могут быть созданы в приведенном выше полипептиде (I), следующие: 23-24, 24-25, 25-26, 27-28, 28-29, 29-30, 30-31, 31-32, 32-33, 33-34, 34-35, 35-36, 36-37, 37-38, 38-39, 40-41, 41-42, 42-43, 52-53, 53-54, 54-55, 55-56, 77-78, 78-79, 79-80, 80-81, 81-82, 82-83, 83-84, 84-85, 85-86, 86-87, 109-110, 110-111, 111-112, 112-113, 113-114, 114-115, 115-116, 116-117, 117-118, 118-119, 119-120, 120-121, 121-122, 122-123, 123-124, 124-125, 125-126, 126-127, 127-128, 128-129, 129-130, 130-131 и 131-132.
Самыми удобными точками разрыва, по которым новые С- и N-концы могут быть созданы в приведенном выше полипептиде (I), следующие: 23-24, 24-25, 31-32, 32-33, 37-38, 38-39, 82-83, 83-84, 85-86, 86-87, 87-88, 125-126, 126-127 и 131-132.
Агонисты ЕРО-рецептора согласно настоящему изобретению могут включать аминокислотные замены, такие, какие описаны в патенте WO 94/24160, или в одном или большем числе сайтов гликозилирования (Asn24, Asn83 и Asn126) с заменами на другие аминокислоты, причем без ограничения аспарагиновой или глутаминовой кислотами, а также на делеции и (или) вставки. Также имеется в виду, что агонисты ЕРО-рецептора согласно настоящему изобретению также могут включать делеции аминокислот как в обоих N- и С-концах исходного полипептида, так и делеции в новых N- и (или) С-концах последовательности модифицированного полипептида согласно формулам, приведенным выше.
Наиболее удобными точками разрыва, по которым новые С- и N-концы могут быть созданы в приведенном выше полипептиде (II), следующие: 23-24, 24-25, 25-26, 33-34, 34-35, 35-36, 36-37, 38-39, 39-40, 40-41, 64-65, 65-66, 66-67, 67-68, 68-69, 69-70, 70-71, 89-90, 90-91, 91-92, 92-93, 93-94, 94-95, 95-96, 96-97, 97-98, 98-99, 99-100, 100-101, 101-102, 102-103, 103-104, 104-105 и 105-16, соответственно.
Самыми удобными точками разрыва, по которым новые С- и N-концы могут быть созданы в приведенном выше полипептиде (II), следующие: 64-65, 65-66, 92-93 и 93-94, соответственно.
Наиболее удобными точками разрыва, по которым новые С- и N-концы могут быть созданы в приведенном выше полипептиде (III), следующие: 36-37, 37-38, 39-40, 41-42, 42-43, 64-65, 65-66, 66-67, 86-87, 87-88, 88-89, 89-90, 90-91, 91-92, 92-93, 93-94, 94-95, 95-96, 96-97, 97-98, 98-99, 99-100 и 100-101.
Самыми удобными точками разрыва, по которым новые С- и N-концы могут быть созданы в приведенном выше полипептиде (III), следующие: 39-40, 65-66, 89-90, 99-100 и 100-101.
Наиболее удобными точками разрыва, по которым новые С- и N-концы могут быть созданы в приведенном выше полипептиде (IV), следующие: 38-39, 39-40, 40-41, 41-42, 48-49, 53-54, 54-55, 55-56, 56-57, 57-58, 58-59, 59-60, 60-61, 61-62, 62-63, 64-65, 65-66, 66-67, 67-68, 68-69, 69-70, 96-97, 125-126, 126-127, 127-128, 128-129, 129-130, 130-131, 131-132, 132-133, 133-134, 134-135, 135-136, 136-137, 137-138, 138-139, 139-140, 140-141 и 141-142.
Самыми удобными точками разрыва, по которым новые С- и N-концы могут быть созданы в приведенном выше полипептиде (IV), следующие: 38-39, 48-49, 96-97, 125-126, 132-133 и 141-142.
Н