Питательная среда накопления образца клеток для последующего цитологического и/или иммуноцитохимического анализа

Питательная среда накопления образца клеток для последующего цитологического и/или иммуноцитохимического анализа

Реферат

Изобретение относится к составам для консервации живых клеток и представляет собой среду для накопления, сохранения и промывания образца клеточного материала, изъятого у пациента, на период до проведения последующего цитологического и/или иммуноцитохимического анализа. Заявляемый состав может быть также использован для культивирования живых клеток.

Известен раствор для консервации клеток, представляющий собой водный спиртово-буферный раствор, предназначенный для сохранения в пробе in vitro морфологии ядер клеток млекопитающих, включающий смешивающийся с водой спирт, ионы кальция и магния и буферный агент (ЕР 0772972 А1, 14.05.97). Известному раствору присущи недостатки, свойственные как буферным, так и спиртовым средам. А именно:

- частичное обезвоживание исследуемых клеток за счет присутствия в составе спиртов. Обезвоживание цитоплазмы приводит к нарушению внутриклеточных биохимических процессов, в частности к сморщиванию цитоплазматической мембраны и, следовательно, к изменению морфологии многих клеток, особенно злокачественных, ускорению их гибели и, в конечном результате, к искажению результатов последующего анализа;

- буферные системы являются хорошими консервантами, но не пригодны для сохранения клеточного материала в течение более десяти - двенадцати часов вследствие отсутствия в их составе источника питания клеток: белков и углеводов.

Известна также физиологическая среда для промывания, консервации и хранения клеток тканей и органов, содержащая солевые компоненты, буферные компоненты, компоненты субстрата, аминокислоты, компоненты ку-энзимов, витаминные компоненты, компоненты протеинов (ЕР 1164841 А1, 02.01.2002). Недостатком известной среды, препятствующим достижению указанных ниже технических результатов, является наличие большого количества чужеродных белков, в частности белковых компонентов сывороток, присутствие которых в исследуемой пробе может привести к искажению тонких иммунных реакций при проведении последующего иммунногистохимического анализа.

Наиболее близким к заявляемому изобретению является солевой раствор Хенкса, предназначенный для консервирования образцов клеток в промежутке между отбором пробы и ее анализом или фиксацией (Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К., Справочник биохимика, М.: Мир 1991). Принят за прототип. Известный раствор представляет собой буферную систему, включающую смесь растворимых в воде неорганических солей (г/100 мл), а именно: NaCl - 0,80, КСl - 0,04, СаСl₂ безводный - 0,014, MgSO₄·6H₂O - 0,01, MgCl₂·6H₂O - 0,01, Na₂HPO₄ ·2H₂O - 0,006, КН₂РO₄ - 0,006, NаНСО₃ - 0,035 и глюкозы - 0,1. Однако после содержания в растворе-прототипе более двадцати минут имеет место изменение морфологии исследуемых клеток, что полностью искажает объективную картину последующего цитологического анализа. Это происходит вследствие недостаточного количества энергетического материала для поддержания жизнеспособности клеток.

Заявляемое изобретение направлено на решение задачи создания среды для накопления, сохранения и промывания образца клеток, изъятых у пациента, для последующего цитологического и/или иммуноцитохимического анализа максимально приближенной к естественным физиологическим условиям их существования.

Использование в лабораторной практике заявляемого раствора позволяет достичь нескольких технических результатов:

- возможность сохранения и транспортировки образца клеточного материала в течение до 48 часов.

- сохранение морфологических, биологических и биохимических характеристик исследуемых клеток, в частности их иммунной специфичности;

- низкая себестоимость;

- возможность длительного хранения питательной среды для последующего использования;

- возможность использования для последующего осуществления различных приемов аналитических исследований, в том числе центрифугирования.

Указанные технические результаты при осуществлении заявляемого изобретения достигаются за счет того, что питательная среда накопления образца клеток для последующего цитологического и/или иммуноцитохимического анализа так же как известный раствор Хенкса, содержит соли NaCl, KCl, СаСl₂ безводный, MgSO₄·6H₂O, MgCl₂·6H₂O, Na₂HPO₄·2H₂O, KH₂PO₄, NaHCO₃ и глюкозу. Особенность заявляемой среды состоит в том, что она дополнительно включает 10% раствор альбумина и полиглюкин (декстран 60000) при следующем соотношении: 10% раствор альбумина : раствор Хенкса : полиглюкин = 1:1:1.

Сущность изобретения.

Среди многообразных видов анализов качественного и количественного состава биологического материала особенно бережного отношения к сохранности требуют образцы ткани, в которых предположительно присутствуют опухолевые клетки. Клетки злокачественных опухолей характеризуются дистрофичными изменениями по сравнению с нормальными (здоровыми), что приводит к ускорению их гибели в период от изъятия образца клеточного материала от пациента до стадии его анализа. Это обстоятельство обуславливает повышенные требования к составу среды для хранения, транспортировки и подготовки образца клеточного материала для проведения цитологического и/или иммуноцитохимического анализа, особенно при наличии в образце, с большой вероятностью, опухолевых клеток.

Кроме того, актуальной является проблема сохранения и транспортировки образца клеточного материала, изъятого у пациента, к месту проведения сложного цитологического и/или иммуноцитохимического анализа, требующего наличия соответствующего лабораторного оборудования и квалифицированного персонала исследователей.

В настоящее же время наиболее эффективным способом подготовки образца ткани для проведения сложного цитологического и/или иммуноцитохимического анализа является центрифугирование, то есть разделение на фракции клеточных элементов по размеру с целью получения многослойных препаратов. Достоинство этого метода состоит в том, что в процессе центрифугирования происходит отмывание - удаление фоновых элементов: слизи, бактерий, продуктов распада. В то же время при осуществлении стадии центрифугирования живые клетки испытывают интенсивную механическую нагрузку, которая может привести к искажению их морфологии. В связи с этим большое значение имеет состав среды, в которую помещен образец живой ткани. С одной стороны, исследуемые клетки должны сохранить свои морфологические. биологические и биохимические характеристики. в частности их иммунную специфичность, а с другой стороны, среда для накопления клеток не должна препятствовать осуществлению процесса центрифугирования.

Заявляемый состав питательной среды накопления образца клеток является оптимальным и отвечающим всем указанным требованиям.

Количественный и качественный состав неорганических ионов, присутствующих в растворе Хенкса, является адекватно необходимым для нормального метаболизма клеток, способен поддерживать осмотическое давление в пределах физиологических норм и оптимальный уровень рН.

Полиглюкин, представляющий собой плазмозаменяющий раствор, включает солевую компоненту (NaCl) и сбалансированный комплекс углеводов, тем самым обеспечивает необходимое питание и поддержание жизнеспособности живых клеток в изъятом у пациента образце ткани.

В большинстве случаев питательные растворы, предназначенные для поддержания жизнеспособности тканей в условиях in vitro и содержащие белковые компоненты сывороток, способны искажать тонкие иммунные реакции. В то же время используемый белок - альбумин - не обладает этим недостатком и его присутствие не искажает цитохимических свойств исследуемых клеток. Альбумин способствует созданию и поддержанию исследуемого клеточного образца в состоянии суспензии - коллоидного, состояния, близкого к естественному.

Все используемые составляющие выпускаются отечественной промышленностью, что обуславливает невысокую себестоимость заявляемого состава, а также обеспечивает соответствие критерию промышленной применимости заявляемого изобретения.

Фирмы-изготовители:

- раствор Хэнкса (Soluto Hanksi) - РАМН ЭПП по производству бактерийных и вирусных препаратов ИПВЭ им. М.П. Чумакова;

- поликлюкин - ОАО “Красфарма”, г. Красноярск;

- альбумин - ГУЗ Нижегородская областная станция переливания крови им. Н.Я.Климова.

Для приготовления заявляемого состава перечисленные выше компоненты смешивают в указанной пропорции.

Процесс накопления, промывания и сохранения образца клеточного материала, изъятого у пациента, на период до проведения последующего анализа осуществляют следующим образом. Производят отбор образца исследуемых тканей, например тонкоигольную биопсию из новообразования либо мазок слизистой оболочки специальным предназначенным для этой цели медицинским инструментом. Далее помещают содержимое шприца или иного инструмента для отбора пробы в специальную микропробирку с готовой средой накопления, производят, по крайней мере, двукратное промывание шприца указанной средой до полной очистки инструмента от частиц исследуемой ткани (увеличение объема образца). При этом пунктирование или иная процедура отбора пробы может быть повторена, если это целесообразно для качественного выполнения последующего анализа. Заранее приготовленная среда накопления может храниться в холодильнике при температуре -4° С. Транспортировка и хранение образца живой ткани, помещенного в заявляемую питательную среду накопления, может быть осуществлена при температуре окружающей среды в течение до двух суток.

Затем исследуемый образец, помещают в центрифугу, где происходит стадия отмывания - удаления фоновых элементов: слизи, бактерий, продуктов распада и разделения на фракции клеточных элементов по размеру с целью получения монослойных препаратов. По окончании процедуры центрифугирования исследуемый образец готов для проведения морфологического, цитологического и/или иммуноцитохимического анализа.

Заявляемая среда может быть использована для анализа образцов опухолевой ткани, крови, лимфоузлов, слизистой и др.

Таким образом, заявляемая питательная среда для накопления клеток обладает значительными преимуществами по сравнению с известными составами того же предназначения и отвечает критериям патентоспособности.

Для приготовления порции заявляемой питательной среды объемом 90 мл растворы Хэнкса, поликлюкина и альбумина в равных объемах по 30 мл помещают в колбу объемом 100 мл и перемешивают при комнатной температуре в течение 1-2 мин. Приготовленную среду разделяют на порции в соответствии с количеством, необходимым для проведения одного аналитического исследования.

В том случае если порция указанного состава предназначена для длительного хранения, ее помещают в морозильную камеру и хранят при температуре -5-10° С. В том случае, если порция указанного состава предназначена для проведения текущих анализов в промежуток времени до 10 суток, ее помещают в холодильник и хранят при температуре +5-10° С. Питательную среду, сохраненную в морозильной камере, размораживают перед проведением требуемых анализов при комнатной температуре.

Примеры использования питательной среды.

1. Больная М. 61 года, обратилась в поликлинику МНИОИ им. А.П.Герцена 19.05.02 с жалобами на уплотнение в правой молочной железе. После проведенного УЗИ исследования и цитологического изучения пунктата опухоли, был поставлен предварительный диагноз: рак молочной железы с метастазами в подмышечные лимфатические узлы. Было решено провести химиогормональное предоперационное лечение. Для определения гормонального статуса опухоли назначили иммуноцитохимическое исследование, в связи с чем больной М. 26.05.02 в 11.00 была произведена пункция опухоли правой молочной железы и лимфатического узла под контролем УЗИ. Полученный материал-пунктат был сразу помещен в питательную среду накопления, приготовленную заранее (04.04.02) в отделении онкоцитологии МНИОИ им. П.А.Герцена и доставленную в поликлинику, где она хранилась при температуре -10° С. Среду разморозили перед проведением пункции при комнатной температуре. Полученный материал (питательная среда с опухолевыми клетками) для проведения иммуноцитохимического анализа был доставлен в отделение онкоцитологии МНИОИ им. П.А.Герцена 27.05.02 в 14.00 (через 27 часов после изъятия материала-пунктата). Все это время он хранился при комнатной температуре (+18-20° С). После центрифугирования на аппарате Cytospin-3 (система обработки клеток и приготовления препаратов) с последующим получением монослоя опухолевых клеток на стекле было проведено иммуноцитохимическое исследование 27.05.02 в 15.00.ч. (через 28 часов). Были получены следующие результаты: экспрессия рецепторов эстрогенов и прогестерона в опухолевых клетках - положительная. Морфологические и иммунные свойства опухолевых клеток молочной железы после нахождения в питательной среде накопления в течение 28 часов не изменились. Питательная среда накопления нисколько не исказила гормонального статуса опухолевых клеток молочной железы.

2. Больной С., 53 лет, обратился в поликлинику МНИОИ им. А.П.Герцена 26.08.02 с жалобами на незаживающее кровоточащее при контакте с одеждой образование в области левого предплечья. После клинического осмотра и цитологического исследования соскоба с раны был поставлен предварительный диагноз: недифференцированный рак кожи? Меланома?

Для установления точного диагноза было назначено проведение иммуноцитохимического исследования, в связи с чем 27.08.02 в 10.00 ч в поликлинике МНИОИ им. А.П.Герцена стерильным узким шпателем был взят соскоб с изъязвленной поверхности раны и сразу помещен в питательную среду накопления, размороженную заранее при комнатной температуре. Питательная среда была приготовлена в отделении онкоцитологии института 15.06.02 и отправлена в поликлинику для последующего использования. Среда хранилась в морозильной камере холодильника при -10° С. Материал для исследования был доставлен в институт 28.08.02 в 15.00 (через 29 часов). Иммуноцитохимическое исследование провели 29.08.02 в 10.00 ч (через 48 часов после помещения материала в питательную среду). Все это время среда с опухолевыми клетками хранилась больным в холодильнике при +8° С. Иммуноцитохимическое исследование, проведенное в соответствие с методикой, описанной в примере 1, подтвердило диагноз злокачественной меланомы кожи. Таким образом установлено, что хранение исследуемого препарата, содержащего опухолевые клетки, в питательной среде накопления в течение 48 часов, не искажает иммунных и морфологических качеств клеток и не влияет на результаты иммуноцитохимического анализа.

3. Больная К., 42 лет, обратилась в МНИОИ им. А.П.Герцена 10.10.02 для обследования. При проведении УЗИ исследования щитовидной железы было обнаружено небольшое образование в правой доли. После проведения пункции образования и цитологического исследования пунктата был поставлен предварительный диагноз: медуллярный рак? Папиллярный рак щитовидной железы? Для уточнения диагноза было назначено проведение иммуноцитохимического анализа, для чего больной 11.10.02 в 10.00 была произведена пункция правой доли щитовидной железы под контролем УЗИ.

Полученный материал-пунктат сразу был помещен в питательную среду накопления. Среда была приготовлена днем раньше (10.10.02), в отделении онкоцитологии и хранилась в холодильной камере при +5 - 8° С. Взвесь клеток в питательной среде подвергли центрифугированию на системе Cytospin-3 для получения монослойных препаратов. Проведенное 11.10.02 в 12.00 Иммуноцитохимическое исследование подтвердило диагноз медуллярного рака щитовидной железы. Находясь в течение 2 часов в питательной среде накопления, клетки полностью сохранили свои иммунные и морфологические свойства.

Приведенные примеры могут служить иллюстрацией указанных в описании изобретения преимуществ заявляемого состава питательной среды накопления, а именно:

- возможность сохранения и транспортировки образца клеточного материала в течение до 48 часов.

- сохранение морфологических, биологических и биохимических характеристик исследуемых клеток, в частности их иммунной специфичности;

- возможность длительного хранения питательной среды для последующего использования;

- возможность использования для последующего осуществления различных аналитических исследований: цитологического анализа клеток, иммуноцитохимических исследований, изучения морфометрии опухолевых клеток в монослойных мазках;

- возможность использования для анализа образцов опухолевой ткани различных органов, крови, лимфы и лимфатических узлов, слизистых и др.

Питательная среда накопления образца клеток для последующего цитологического и/или иммуноцитохимического анализа, представляющая собой раствор Хенкса, содержащий соли NaCl, KCl, CaCl₂ безводный, MgSO₄·6H₂O, MgCl₂·6H₂O, Na₂HPO₄·2H₂O, KH₂PO₄, NaHCO₃ и глюкозу, отличающаяся тем, что дополнительно включает 10%-ный раствор альбумина и полиглюкин (декстран 60000), при соотношении 10%-ный раствор альбумина: раствор Хенкса: полиглюкин = 1:1:1.