Новый фактор роста/дифференциации tgf--семейства и фармацевтическая композиция

Новый фактор роста/дифференциации tgf--семейства и фармацевтическая композиция

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к новому фактору роста/дифференциации TGF-β-семейства и к фармацевтической композиции на его основе.

TGF-β-семейство факторов роста, к которому относятся родственные BMP, TGF и ингибину протеины (Roberts и Spon, Handbook Experimental Pharmacology, (1990), 419-472), особенно пригодно для медицинских методов лечения и применений. Эти факторы пригодны для заживления ран и регенерации тканей. Далее, некоторые члены TGF-β-семейства индуцируют рост тканей и поэтому играют центральную роль при индуцировании развития хрящей и костей.

Wozney (Progress in Growth Fact or Research, , (1989), 267-280 и Vale и др. (Handbook of Experimental Pharmacology, (1990), 211-248)) описывают различные факторы роста, как например таковые, которые являются родственными группе BMP (костно-морфогенетические протеины) и группе ингибина. Представители этих групп обладают значительным структурным сходством. Предшественник протеина состоит из амино-концевой сигнальной последовательности, пропептид- и карбокси-концевой последовательности примерно из 110 аминокислот, которая отщепляется от предшественника и представляет собой зрелый протеин. Далее, ее представители определяются путем гомологии аминокислотных последовательностей. Зрелый протеин содержит высококонсервативные последовательности, в особенности семь цистеиновых остатков, которые консервативны у членов семейства. TGF-β-образные протеины представляют собой многофункциональные, гормонально активные факторы роста. Они обладают также родственными биологическими активностями, как например хемотактическое притяжение клеток, способствование дифференциации клеток и индуцирующую активность в отношении ткани, как например хрящи и кости. Многие типы клеток в состоянии синтезировать TGF-β-образные протеины, и практически все клетки содержат TGF-β-рецепторы.

В целом, эти протеины различаются по своей структуре, что приводит к значительным вариациям в их точной биологической функции. Далее, они находятся в широкой области различных видов тканей и стадий развития. Следовательно, они могут иметь различия в отношении их точной функции, например необходимой клеточной физиологической среды, продолжительности их жизни, их местоположения, их потребности во вспомогательных факторах и их устойчивости к деструкции. Описываются многочисленные протеины, которые обладают индуктивным потенциалом в отношении тканей, их естественные задачи в организме и, еще важнее, их медицинскую применимость еще нужно детально исследовать. С большой вероятностью предполагается наличие еще неизвестных членов TGF-β-семейства, которые важны для остеогенеза или для дифференциации/индукции других видов тканей. Большая трудность при выделении этих новых TGF-β-образных протеинов состоит в том, что их функции еще недостаточно точно могут быть описаны для разработки биологического анализа с целью их распознавания. С другой стороны, ожидаемая гомология нуклеотидных последовательностей для известных членов семейства слишком незначительна, чтобы сделать возможным скрининг с помощью классических методов гибридизации нуклеиновых кислот. Однако дальнейшее выделение и характеристика новых TGF-β-образных протеинов необходимы, чтобы получить другие протеины дифференцирования и индукции, которые удовлетворяют всем желательным медицинским требованиям. Эти факторы могут найти применение в медицине при лечении (заживлении) повреждений и при лечении дегенеративных заболеваний костей и/или других видов тканей, как например почки или печень.

В патентной заявке РСТ/ЕР 93/00350 указана нуклеотидная и аминокислотная последовательность для TGF-β-протеина МР-52, причем указана соответствующая зрелому пептиду последовательность и большая часть соответствующей пропептиду МР-52 последовательности. Полная последовательность пропептида МР-52 не раскрыта.

Задачей настоящего изобретения является протеин TGF-β-семейства, содержащий указанную аминокислотную последовательность SEQ ID NO.2 или в случае необходимости ее функционально активные части и обладающий биологическими свойствами, как например индуктивная при ангиогенезе и в отношении ткани, в особенности остеоиндуктивная, и/или митогенная активность, которые могут быть пригодны для терапевтического применения. Вышеуказанные признаки протеина могут изменяться в зависимости от образования гомодимеров или гетеродимеров. Такие структуры могут оказаться также пригодными для клинических применений, в особенности при показаниях ангиогенеза, как индуцирующие и/или улучшающие образование кровеносных сосудов.

Биологические свойства предлагаемых согласно изобретению протеинов, в особенности митогенный и остеоиндуктивный потенциал, можно определять, например, путем испытания согласно Seyedin и др., PNAS, (1985), 2267-2271; или Sampath и Reddi, PNAS, (1981), 7599-7603.

Предлагаемый согласно изобретению протеин TGF-β-семейства кодируется ДНК-последовательностью, включающей

(а) часть, кодирующую зрелый протеин и в случае необходимости другие функциональные части указанной нуклеотидной последовательности SEQ ID NO.1;

(б) нуклеотидную последовательность, соответствующую последовательности из п. (а) в силу вырожденности генетического кода;

(в) аллельное производное нуклеотидной последовательности, соответствующей последовательностям из пп.(а) и (б);

или

(г) последовательность, гибридизирующуюся с одной из последовательностей (а), (б) или (в);

при условии, что молекула ДНК согласно п. (г) кодирует, по меньшей мере, полностью часть зрелого протеина TGF-β-семейства. Ниже кратко описываются протоколы последовательностей и чертежи.

В SEQ ID NO.1 (см. в конце описания) представлена полная нуклеотидная последовательность ДНК, кодирующей TGF-β-протеин МР-52. ATG - стартовый кодон начинается с нуклеотида 640. "Старт" зрелого протеина начинается после нуклеотида 1782.

В SEQ ID NO.2 (см. в конце описания) представлена полная аминокислотная последовательность TGF-β-протеина МР-52, которая производится от указанной нуклеотидной последовательности SEQ ID NO.1.

На фиг.1 представлено сравнение аминокислотной последовательности МР-52 с некоторыми членами семейства ВМР-протеинов с началом на первом из семи сохранившихся цистеиновых остатков. Знак* обозначает, что аминокислота одинакова во всех сравниваемых протеинах; знак + обозначает, что аминокислота совпадает, по меньшей мере, в одном из протеинов по сравнению с МР-52.

На фиг.2 представлены нуклеотидные последовательности олигонуклеотидных праймеров, которые применяются в настоящем изобретении, и сравнение этих последовательностей с известными членами TGF-β-семейства. М обозначает А или С; S обозначает С или G; R обозначает А или G; и К обозначает G или Т. "2а" обозначает последовательность праймера OD; "2b" обозначает последовательность праймера OID.

На фиг.3 представлен вестерн-блоттинг, показывающий, что только в случае рекомбинантных вирусов, однако, не в случае вирусов дикого типа (без интегрированной чужеродной ДНК), появляются специфические для МР-52 полосы. М обозначает предварительно окрашенный маркер по молекулярной массе протеина с указанными кажущимися молекулярными массами (Gibco BRL # 26041-020), 1 обозначает надосадочную жидкость культуры клеток (100 мкл) после инфекции с помощью рекомбинантных вирусов (со вставленной МР52-кДНК) при восстанавливающих (1% β-меркаптоэтанола) условиях, 2 обозначает надосадочную жидкость культуры клеток (100 мкл) после инфекции вирусами дикого типа (без вставленной чужеродной ДНК) при восстанавливающих (1% β-меркаптоэтанола) условиях, 3 обозначает надосадочную жидкость культуры клеток (500 мкл) после инфекции с помощью рекомбинантных вирусов (со вставленной МР52-кДНК) при невосстанавливающих условиях, 4 обозначает надосадочную жидкость культуры клеток (500 мкл) после инфекции вирусами дикого типа (без вставленной чужеродной ДНК) при невосстанавливающих условиях.

На фиг.4 представлена плазмида pABWN.

Понятие "функциональная часть" в объеме настоящего изобретения обозначает часть протеина, которая в состоянии действовать, как например часть сигнального пептида, пропептида, или зрелого протеина, т.е. выполнять, по меньшей мере, одну из биологических функций естественных частей протеина МР-52.

Область, кодирующая зрелую часть протеина, простирается от нуклеотида 1783 до 2142 в указанной SEQ ID NO.1 последовательности. В случае необходимости молекула ДНК может еще содержать функциональные части указанной SEQ ID NO.1 последовательности, а именно кодирующие сигнальную и/или пропептидную часть нуклеотидные последовательности. Особенно предпочтительно молекула ДНК содержит последовательность сигнальной и пропептидной части и часть зрелого протеина, т.е. нуклеотиды 640-2142 указанной в SEQ ID NO.1 последовательности. С другой стороны, молекула ДНК, наряду с частью, кодирующей зрелый протеин, также может содержать еще функциональные сигнальные и/или пропептидные части других протеинов, в особенности других протеинов TGF-β-семейства.

Молекула ДНК может дополнительно содержать между нуклеотидами 1270 и 1271 в указанной SEQ ID NO.1 последовательности некодирующую интропоследовательность. Эта интронная последовательность содержится в депонированной в DSM плазмиде SKL 52 (Н 3) МН 12, которая имеет геномную последовательность нуклеиновых кислот МР-52.

Последовательность МР-52-протеина, кодируемая фагом λ15.1 кДНК, начинается с нуклеотида 321 указанной SEQ ID NO.1 последовательности.

Хотя аллельные, вырожденные и гибридизирующие последовательности имеют структурные различия из-за незначительных изменений в нуклеотидной и/или аминокислотной последовательности, протеины, кодированные такого рода последовательностями, обладают по существу такими же полезными свойствами, что делает возможным их использование для таких же назначений в медицине.

Согласно настоящему изобретению обозначение "гибридизация" представляет собой обычные условия гибридизации, предпочтительно условия с концентрацией соли 5×SSC при 62-66°С, с последующей, осуществляемой в течение 1 часа промывкой с помощью 0,6×SSC, 0,1% SDS, при 62-66°C. Особенно предпочтительно обозначение "гибридизация" относится к строгим условиям гибридизации с концентрацией соли 4×SSC при 62-66°С, с последующей, осуществляемой в течение 1 часа промывкой с помощью 0,1×SSC, 0,1% SDS, при 62-66°С.

ДНК-последовательности, указанные выше, получают от позвоночных животных, предпочтительно млекопитающих, как например свинья, коровы, и грызуны, как например крысы или мыши, и в особенности от приматов, как например люди.

Особенно предпочтительна указанная в SEQ ID NO.1 и обозначаемая как МР-52 последовательность. Транскрипты МР-52 получают из эмбриональной ткани и кодируют протеин, который проявляет значительную гомологию аминокислот по отношению к зрелой части ВМР-образных протеинов (см. фиг.1). Протеиновые последовательности ВМР2 (=ВМР 2А) и BMP 4 (=ВМР 2В) описаны Wozney и др., Sience, (1988), 1528-1534. Соответствующие последовательности BMP 5, BMP 6 и BMP 7 описаны Celeste и др., Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 87, (1990), 9843-9847.

Еще одним предметом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, которая содержит фармацевтически эффективное количество предлагаемого согласно изобретению TGF-β-протеина в качестве биологически активного вещества. В случае необходимости, такая композиция включает фармацевтически приемлемый носитель, вспомогательные вещества, разбавитель или наполнитель. Такая фармацевтическая композиция может применяться при показаниях ангиогенеза для улучшения и/или индуцирования образования кровеносных сосудов, либо индивидуально, либо в комбинации с другими биологически активными веществами, например с другими протеинами TGF-β-семейства или факторами роста, как например EGF (эпидермальный фактор роста) или PDGF (происходящий от тромбоцитов фактор роста). Кроме этого, такую фармацевтическую композицию можно применять для предупреждения заболеваний, связанных с ангиогенезом. Предлагаемую согласно изобретению фармацевтическую композицию можно также применять для профилактики или в косметической хирургии. Далее, применение композиции не ограничивается людьми, а ее можно применять также в случае животных, в особенности домашних животных.

Далее изобретение иллюстрируется нижеследующими примерами.

ПРИМЕР 1

Выделение МР-52

1.1. Полную РНК выделяют из человеческой эмбриональной ткани (в возрасте 8-9 недель) по методу Chirgwin и др., Biochemistry, (1979), 5294-5299. Поли(А+)-РНК отделяют от полной РНК путем олиго(dT)-хроматографии согласно инструкциям изготовителя (Stratagene Poly (A) Quick-колонки).

1.2. Для обратной реакции транскрипции 1-2,5 мкг поли (А+)-РНК в течение 5 минут нагревают при 65°С и быстро охлаждают льдом. Реакционная смесь содержит 27 ед. PHK-Guarol (Pharmacia), 2,5 мкг олиго(dT)12-18 (Pharmacia) 5хбуфер (250 ммоль/л ТРИС/НСl, рН=8,5; 50 ммоль/л MgCl₂; 50 ммоль/л ДТТ (дитиотреитола); 5 ммоль/л любого дНТФ (дезоксинуклеозидтрифосфата); 600 ммоль/л КСl) и 20 ед. AM обратной транскриптазы (Boehringer Mannheim) на 1 мкг поли(А+)-РНК. Реакционную смесь (25 мкл) инкубируют в течение 2 часов при 42°С.

1.3. Указанные на фиг.2 дезоксинуклеотидные праймеры OD и OID получают на автоматическом ДНК-синтезаторе (Biosearch). Очистку осуществляют путем денатурирующего электрофореза на полиакриламидном геле и выделения основной полосы из геля путем изотахофореза. Путем сравнения последовательностей нуклеиновых кислот известных членов TGF-β-семейства и выбора областей с самым высоким сохранением проектируют олигонуклеотиды. Сравнение этих областей представлено на фиг.2. Для облегчения клонирования оба нуклеотида содержат сайты рестрикции EcoRI и OD содержит дополнительно сайт рестрикции NcoI на своем 5’-конце.

1.4. В случае полимеразной цепной реакции (PCR-реакции) применяют 20 нг соответствующей поли(А+)-РНК кДНК из исходного материала. Реакцию осуществляют в объеме 50 мкл, и он содержит 1xPCR - буфер (16,6 ммоль/л (NH₄)₂SO₄; 67 ммоль/л ТРИС/НСl, рН=8,8; 2 ммоль/л MgCl₂; 6,7 мкмоль/л ЭДТК, 10 ммоль/л β-меркапто-этанола; 170 мкг/мл альбумина сыворотки крупного рогатого скота (Gibco); 200 мкмоль/л любого дНТФ (Pharmacia); 30 пкмоль каждого олигонуклеотида (OD и OID) и 1,5 ед. Taq-полимеразы (Ampli Taq, Perkin Elmer Cetus). Реакционную смесь покрывают парафином и осуществляют 40 циклов полимеразной цепной реакции. Продукты полимеразной цепной (PCR)-реакции очищают путем экстракции с помощью фенола с хлороформом и концентрируют путем осаждения этанолом.

1.5. Продукт полимеразной цепной реакции расщепляют с помощью рестрикционных ферментов SphI (Pharmacia) и AIWNI (Biolabs) соответственно инструкциям изготовителя.

1.6. Продукты рестрикционного расщепления фракционируют путем электрофореза на агарозном геле. После окрашивания с помощью этидиумбромида нерасщепленные продукты амплификации вырезают из геля и выделяют путем экстракции фенолом. Полученную ДНК затем очищают путем двукратной экстракции фенолом с хлороформом.

1.7. После осаждения этанолом одну четвертую или одну пятую часть выделенной ДНК реамплифицируют, причем используют такие же условия, как и для первичной амплификации, кроме того, что число циклов уменьшается до 13. Продукты реамплификации (повторной амплификации) очищают, разрезают с помощью таких же ферментов, как указанные выше, и неразрезанные продукты, как пояснено выше для продуктов амплификации, выделяют из агарозных гелей. Стадию реамплификации (повторной амплификации) повторяют дважды.

1.8. После последнего выделения из геля продукты амплификации расщепляют благодаря 4 ед. EcoRI (Pharmacia) при рекомендуемых изготовителем условиях. Одну четвертую часть смеси после рестрикции лигируют с расщепленным с помощью EcoRI вектором pBluescript II SK+(Stratagene). После лигирования 24 клона анализируют далее путем секвенирования. Расщепленный с помощью ALWNI и SphI образец дает новую последовательность, которая обозначается как МР-52. Другие клоны содержат преобладающие BMP 6-последовательности и один клон содержит BMP 7-последовательность.

Клон на 3’-конце дополняют кДНК согласно подробно описанному Frohmann методу (амплификации, опубликовано Perkin-Elmer Corp., Issue 5 (1990), с.11-15). Такую же эмбриональную мРНК, которая была применена для выделения первого фрагмента МР-52, подвергают обратной транскрипции, как описано выше. Амплификацию осуществляют при применении адаптерного праймера (AGAATTCGCATGCCATGGTCGACG) и внутреннего праймера (CTTGAGTACGAGGCTTTCCACTG) МР-52-последовательности. Продукты амплификации реамплифицируют (повторно амплифицируют) при применении перекрывающего адаптерного праймера (ATTCGCATGCCATGGTCGACGAAG) и перекрывающего внутреннего праймера (GGAGCCCACGAATCATGCAGTCA) МР-52-последовательности. Продукты реамплификации, после рестрикционного расщепления с помощью NcoI, клонируют в расщепленном таким же образом векторе [pUC 19 (Pharmacia №27-4951-01) с одним измененным составным (multiplen) участком клонирования, который содержит единственный сайт рестрикции NcoI], и секвенируют. Клоны характеризуют путем соединения внахлестку их последовательности с 3’-концом известной МР-52-последовательности. Один из них используют в качестве зонда для скрининга человеческого геномного банка генов (Stratagene №946203) согласно описанному подробно Ausubel и др. методу (Current Protocols in Molecular Biology, опубликовано Greene Publishing Associates und Wiley-Intersience /1989/). Из 8·10⁵ λ-фагов выделяют фаг (λ 2.7.4), который содержит вставку примерно из 20 кб и депонирован в DSM под номером 7387. Этот клон, наряду с выделенной из мРНК путем описанных методов амплификации последовательностью, содержит другие, несущие информацию последовательности (Sequenzinformationen) на 5’-конце.

Для анализа путем секвенирования HindIII-фрагмент длиной примерно 7,5 кб субклонируют в разрезанном таким же образом векторе (Bluescript SK, Stratagene №212206). Эта, обозначаемая как SKL 52 (Н 3) МР 12, плазмида также хранится в DSM под номером 7353. Представленная в SEQ ID NO.1 несущая информацию последовательность происходит от фага λ 2.7.4. ATG в положении 640 представляет собой первый ATG в рамке считывания (в положении 403 появляется стоп-кодон). На основании указанной последовательности нужно предполагать, что при этом речь идет о стартовом кодоне для трансляции.

Геномная ДНК содержит интрон длиной примерно 2 кб между парами оснований 1270 и 1271 SEQ ID NO.1. Последовательность интрона не показана. Правильность места сплайсинга подтверждается путем секвенирования продукта амплификации, который происходит от кДНК, содержащий эту область. Эти несущие информацию последовательности получают с помощью слегка модифицированного метода, который подробно описан Frohman (амплификации, опубликовано Perkin-Elmer-Corporation, Issue 5, (1990), с.11-15). Такую же эмбриональную РНК, которую использовали для изолирования 3’-конца МР-52, подвергают обратной транскрипции при применении внутреннего, ориентированного в 5’-направлении, праймера МР-52-последовательности (ACAGCAGGTGGGTGGTCTGGACT). Поли-А-конец (хвост) присоединяют к 5’-концу первой кДНК-нити при применении концевой трансферазы. Осуществляют двухстадийную амплификацию, сначала путем применения состоящего из олиго-dT и адаптерной последовательности праймера (AGAATTCGCATGCCATGGTCGACGAAGC) T16 и, во-вторых, при применении адаптерного праймера (AGAATTCGCATGCCATGGTCGACG) и внутреннего праймера (CCAGCAGCCCATССТТСТСС) МР-52 - последовательно. Продукты амплификации реамплифицируют (повторно амплифицируют) при применении такого же адаптерного праймера и перекрывающего (соединяющегося внахлестку) внутреннего праймера (TCCAGGGCACTAATGTCAAACACG) МР-52-последовательности. Затем продукты реамплификации повторно амплифицируют при применении перекрывающего адаптерного праймера (ATTCGCATGCCATGGTCGACGAAG) и перекрывающего внутреннего праймера (ACTAATGTCAAACACGTACCTCTG) МР-52-последовательно. Продукты повторной амплификации с помощью гладких концов клонируют в векторе (Bluescript, SK, Stratagene №212206), который расщеплен с помощью EcoRV. Клоны характеризуют путем перекрывания их последовательности с помощью ДНК фага λ 2.7.4.

Далее, кДНК-банк, полученный из РНК человеческих фибробластов и клонированный в фаге λ gt 10, подвергают скринингу. При этом исследуют 2×106 фагов, причем в качестве радиоактивного зонда служит величиной примерно 1 кб фрагмент геномной МР-52-ДНК (2-й экзон вплоть до сайта рестрикции Hind III в неподвергнутой трансляции 3’-области). Выделяют 17 пятен (зон гемолиза) смеси, которые дополнительно исследуют с помощью PCR при применении праймеров из 5’-3’-области МР-52-последовательности. После этого выбирают и разъединяют 8 стериальных пятен, кДНК выделяют из фага путем частичного расщепления с помощью EcoRI и клонируют в также расщепленном с помощью EcoRI Bluescript-векторе.

Секвенирование одной из результирующих плазмид SK 52 L 15. IMP25 показывает, что самый длинный фаг (15.1) начинается с нуклеотида №321 SEQ ID К NO.1. Далее, путем секвенирования подтверждается место сплайсинга (нуклеотид 1270).

Плазмида SKL 52 (Н 3) МР 12 хранится под номером 7353 в DSM (немецкая коллекция микроорганизмов и культур клеток, Mascheroder Weg Ib, 38124, Brounschweig) с 10 декабря 1992 г.

Фаг λ 2.7.4 хранится под номером 7387 в DSM с 13 января 1993 г.

Плазмида SK52L15. IMP25 хранится под номером 8421 в DSM с 16 июля 1993 г.

ПРИМЕР 2

Экспрессия МР-52

Для экспрессии МР-52 испытывают различные системы. Применение вирусов осповакцины в качестве системы экспрессии подробно и как служащее руководством для специалиста описано в Current Protocols в Molecular Biology (Ausubel и др., Greene Publishing Associates and Wilay-Interscience, Wiley and Sans), в дальнейшем сокращенно называемых СР, в главе 16, часть 16.15-16.18. Система основана на том, что чужеродные ДНК при применении определенных векторов путем гомологичной рекомбинации можно интегрировать в геном вируса осповакцины. Для этой цели используемый вектор содержит ТК (тимидинкиназа) ген из генома осповакцины. Для того чтобы сделать возможной селекцию в отношении рекомбинантных вирусов, вектор далее содержит E.coli - ксантин-гуанин-фосфорибозил-трансфераза-ген (gpt)/Falkner и др., J.Virol 62 (1988), 1849-1854/. В этом векторе клонируют кДНК со всей кодирующей областью МР-52. кДНК происходит от плазмиды SK52L15. IMP25 (DSM, номер 8421), которую для удаления большой части не подвергнутой трансляции 5’-области, однако, сначала подвергают делеции и промежуточно клонируют. Для этого плазмиду SK52L15. IMP25 линеаризируют с помощью SaLI и 5’-конец последовательно подвергают делеции с помощью набора Exo III/Mung Bean (Stratagene # 200 330) согласно указаниям изготовителя. После рестрикции с помощью BamHI в разной степени подвергшиеся делеции МР-52-кДНК на агарозогеле отделяют от остаточного вектора, изолируют и согласно стандартным методам (Sambrook и др., Molecular Cloning, 2-е издание, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) промежуточно клонируют в подвергнутом рестрикции с помощью EcoRV и BamHI pBluescript II SK-векторе (Stratagene # 212206/p.SK52S/. Все рестрикции осуществляют согласно указаниям изготовителя. Дополнительное секвенирование с помощью секвеназы (USB/Amersham #70770) дает, между прочим, клон, который начинается с нуклеотида 576 в SEQ ID NO.1 (на 64 пары оснований удален от стартового кодона). Из него за счет рестрикции с помощью SalI и SacI изолируют кДНК-вставку и клонируют в таким же образом расщепленном векторе для рекомбинации в осповакцине. Результирующую плазмиду (pBPIMP52S) хранят в DSM (под номером 9217) с 24 мая 1994 г. и используют для получения рекомбинантных вирусов осповакцины. Для этого до 80% конфлюэнтных 14 3В клеток (HuTk, ATCC CRL 8303) в чашках для культур диаметром 35 мм инфицируют с помощью вируса осповакцины дикого типа в 2 мл PBS (фосфатно-буферного рассола в течение 30 минут при комнатной температуре и при встряхивании по случаю (1 вирус на 10 клеток). После отсасывания надосадочной жидкости и добавки 2 мл питательной среды (MEM, Gibco BRL #041-01095) инкубируют в течение 2 часов при 37°С. Среду затем удаляют, и трансформации этих клеток достигают с помощью 100 нг pBPIMP52S, 2 мкг носителя ДНК (телячья вилочковая железа, Boehringer Mannheim # 104175) и 10 мкл липофектина (Gibco BRL # 18292-011) в 1 мл MEM в течение 15 часов при 37°С. После добавки 1 мл MEM с 20% FCS (Gibco BRL # 011-06290) инкубируют в течение следующих 24 часов при 37°С и лизированные клетки затем замораживают.

gpt-селекцию на ксантин-гуанин-фосфорибозил-трансферазу и изоляцию и амплификацию отдельных рекомбинантных вирусов осуществляют по существу, как описано в части 16.17 СР, с тем различием, что применяют РК-13 клетки (ATCC CCL 37).

Интеграцию МР-52-кДНК в вирусный геном подтверждают путем анализа при использовании блоттинг-метода по Саузерну и дот-блоттинга (СР, часть 16.18). Рекомбинантный вирус используют для экспрессионных анализов в линии клеток 143 В (HuTk, ATCC CRL, 8303, человек). Конфлюэнтные клетки инфицируют с помощью соответствующего числу клеток числа вирусов в течение 45 минут при 37°С и затем добавляют соответствующую питательную среду (MEM, Gibco BRL # 041-01095) с 10% FCS и пенициллин/стрептомицин (1:500, Gibco BRL # 043-0514 ОН). Спустя 6 часов при 37°С удаляют среду, клетки промывают дважды с помощью, например, HBSS (Gibco BRL #042-0418 ОМ) и добавляют питательную среду (например, MEM) без FCS. После продуцирования в течение 20-22 часов собирают надосадочную жидкость культуры клеток. Анализ экспрессии осуществляют путем вестерн-блоттинга по стандартным методам (СР, часть 10.8). Для этого протеины осаждают из 100-500 мкл надосадочной жидкости культуры клеток путем добавки эквивалентного объема ацетона и инкубации, по меньшей мере, в течение 1 часа на льду и отделяют путем центрифугирования. После повторного суспендирования осадка в заданном буфере (7 М мочевины, 1% SDS, 7 ммоль дигидрофосфата натрия, 0,01% бромфенолового синего и, в случае необходимости, 1% β-меркаптоэтанола) осуществляют разделение на 15%-ном полиакриламидном геле. В качестве маркерных протеинов используют предварительно окрашенный стандарт по молекулярной массе протеина (Gibco BRL # 26041-020). Перенос на PVDF-мембрану (Immobilon # IPVHOOO10) и блокирование мембраны осуществляют стандартными методами.

Для обнаружения МР-52 на мембране получают поликлональные антитела против МР-52 как в случае кур, так и также в случае кроликов. Для этого зрелую часть МР-52 с 6 гистидинами на N-конце экспрессируют в E.coli и очищают, как например описано Hochuli и др. (В 10/Technology, , 1321-1325, 1988/). С помощью обоих антител можно обнаруживать специфически экспрессию МР-52, причем димерный МР-52 менее эффективно распознается, чем мономерный. Для вестерн-блоттинга, согласно фиг.3, применяют куриные антитела, которые специфически очищены путем ПЭГ-преципитации /Thalley и др., В 10/Technology, , 934-938 (1990)/ и через связанный с мембраной антиген (зрелый МР-52 с 6 гистидинами) (18, 17; Sambrook и др., Molecular Cloning, 2-е издание, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). В качестве второго антитела используют антикуриный IgG с присоединенной щелочной фосфатазой (Sigma A 9171). Обнаружение осуществляют с помощью набора для определения протеина Tropix Western-Light (Serva # WL 10 RC), согласно указаниям изготовителя.

Вестерн-блоттинг на фиг.3 показывает, что только в случае рекомбинантных вирусов, однако, не в случае вирусов дикого типа (без интегрированной чужеродной ДНК), появляются специфические для МР-52 полосы. Экспрессия МР-52 приводит к секретированному протеину с проявляющейся в геле при невосстанавливающих условиях молекулярной массой приблизительно 25 кДа. При восстанавливающих условиях протеин с 14-15 кДа проникает в гель. Эти результаты показывают, что МР-52 экспримируется как димерный зрелый протеин. В случае появляющихся при вестерн-блоттинг-анализе слабых полос в области выше 60 кДа речь идет, вероятно, об остатках неразрезанных протеинов-предшественников. Поведение в отношении проникания к тому же подтверждает получаемые из SEQ ID NO.2 теоретические молекулярные массы, сообразно с чем зрелый мономерный МР-52 имеет величину 13,6 кДа.

Экспрессию МР-52 и расщепление протеина-предшественника до зрелого МР-52 можно обнаружить в различных линиях клеток. Испытывали клетки С 127 (АТСС CRL 1616, мышь), ВНК 21 (АТСС CCL 10, хомяк), MRC-5 (АТСС CCL 171, человек) и 3Т6 Swiss albino (АТСС CCL 96, мышь).

Экспрессия и расщепление до зрелого МР-52 показана также в другой эукариотной системе экспрессии. Для этого кДНК МР-52 (начинающуюся с нуклеотида 576) клонируют в плазмиде экспрессии pSG5 (Stratagene # 216201). Плазмиду pSK52S подвергают рестрикции с помощью СIа I и Хba I, и путем обработки Т4-полимеразой делают тупыми выступающие концы МР-5 2-вставки. Клонирование в подвергнутом рестрикции и также с тупыми концами за счет обработки с помощью Т4-полимеразы векторе pSG5 осуществляют стандартными методами. Все ферментативные реакции осуществляют согласно указаниям изготовителя. Правильную ориентацию МР-52-вставки обеспечивают за счет рестрикционного анализа и дополнительного секвенирования с помощью Т7-праймера (Stratagene # 300 302). Результирующую плазмиду pSG52S (хранится с 17.05.1994 г. в DSM под номером 9204) можно котрансформировать с помощью вектора, который кодирует выбираемый маркер, как например ген устойчивости G418, чтобы получить стабильные линии клеток. Для этой цели pSG52S котрансформируют вместе с плазмидой р3616 (хранится в DSM под номером 9203 с 17.05.1994 г.) в L 929-клетки (АТСС CCL, I, мышь) с помощью липофектина (Gibco BRL # 18292-011), согласно указаниям изготовителя. Селекцию с помощью G418 осуществляют согласно известным специалисту методам (СР, часть 9.5) и приходят к линии клеток, которая в вестерн-блоттинге продуцирует обнаруживаемый зрелый МР-52.

Другой вектор экспрессии для МР-52 получают при применении плазмиды pABWN (Niwa и др., Gene, 108, (1991), 193-200; и фиг.4), который представлен в распоряжение Dr.Miyazaki.

Для этого Hind III-фрагмент из плазмиды pSK52S, который начинается с нуклеотида 576 в SEQ ID NO.1, изолируют и выступающие концы затупляют путем обработки с помощью фрагмента Кленова. Путем лигирования адаптера в оба конца фрагмента вводят сайт рестрикции Not I. Адаптер: AGCGGCCGCT

TCGCCGGCGA

Вектор pABWN подвергают рестрикции с помощью Xho I, также обрабатывают фрагментом Кленова и дефосфорилируют с помощью кишечной щелочной фосфатазы теленка (Boehringer Mannheim). Этот фосфорилированный адаптер дополнительно лигируют так, что теперь возможна вставка МР-52-фрагмента после рестрикции с помощью Not I в генерированное Not I место разреза вектора. Результирующий вектор экспрессии ниже обозначается как Hind III-MP-52/pABWN. Все осуществляемые реакции клонирования проводят по стандартным методам (например, СР, часть 3.16). Структура Hind III-МР-52/pABWN-вектора экспрессии подтверждается путем секвенирования и получения карты рестрикции. Hind III-MP-52/pABWN содержит МР-52-последовательность, начинающуюся с нуклеотида 576 и заканчивающуюся нуклеотидом 2278 в SEQ ID NO.1.

Hind III-MP-52/pABWN трансфицируют в L-клетки (мышиные фибробласты) и оттуда получают стабильные трансформанты. Для этого, смотря по обстоятельствам, 4 мкг плазмиды (Hind III-MP-52/pABWN или pABWN) трансфицируют в 5×10⁵ L-клеток, находящихся в чашках для культур диаметром 6 см, при применении 20 мкл реактива Lipofect AMINE (Gibco BRL # 18324-012). Для этой цели раствор А (4 мкг соответствующей плазмиде ДНК в 200 мкл OPTI-MEM I/Gibco BRL # 31985/) осторожно смешивают с раствором В (20 мкл реактива Lipofect AMINE в 200 мкл OPTI-MEM I) и при комнатной температуре в течение 45 минут инкубируют для образования комплекса ДНК-липосомы. Во время этой процедуры клетки промывают один раз с помощью 2 мл OPTI-MEM I. Для каждой трансфекции в сосуд с ДНК-липосомным комплексом вводят 1,6 мл OPTI-MEM I. Раствор осторожно перемешивают и таким образом переслаивают промытые клетки. Клетки инкубируют с разбавленным комплексом в течение 5 часов при 37°С в CO₂-содержащем инкубаторе. После инкубации добавляют 2 мл DMEM (Gibco BRL, модифицированная Dulbecco Eagle-среда) с 20% FCS. Спустя 24 часа после трансфекции среду заменяют свежей DMEM с 10% FCS. Спустя 48 часов после начала трансфекции клетки переносят в чашки для культур диаметром 10 см. Спустя 72 часа после начала трансфекции с концентрации 800 мкг/мл начинается селекция G418. Стабильные клоны появляются спустя 1-2 недели.

5 мл кондиционированной DMEM с или без FCS получают от конфлюэнтных трансформантов, которые выросли в течение 3 дней в чашке для культуры диаметром 10 см. Трансфицированные двумя различными надосадочными жидкостями культур клеток (Hind III-MP52/pABWN и pABWN) клетки, а также лизаты клеток исследуют путем вестерн-блоттинга. При этом в кондиционированной среде, а также в лизатах трансфицированных с помощью Hind III-MP52/pABWN клеток найден зрелый МР-52. Клоны клонируют далее и продуцирующие МР-52-клетки, смотря по обстоятельствам, выбирают согласно вестерн-блоттинг-анализу. Оценки из вестерн-блоттинг-анализов показывают МР-52-продуцирование вплоть до 1 мг/л.

ПРИМЕР 3

Биологическая активность МР-52

Для того чтобы обнаружить биологическую активность МР-52 и доказать полезность настоящего изобретения для применений в медицине с целью избежания и/или лечения заболеваний костей, осуществляют различные эксперименты in vitro и in vivo.

1. Испытание in vitro

1.1.

Так как усиление синтеза гликозаминогликана (GAG) в хондроцитах после TGF-β-стимуляции описано (Hiraki и др., Biochimica et Biophysica Acta, (1988), 91-99), исследуют, оказывает ли также МР-52 это влияние. При применении надосадочных жидкостей культур клеток (DMEM с 10% FCS, продуцирующих МР 52 трансформантов L-клеток (трансфекция с помощью Hind III-MP52/pABWN), изучают хондрогенную активность МР-52 в первичных культурах из зародышевых конечностей крыс.

Для этой цели используют 4 конечности крысиных плодов в возрасте 16 дней. После трипсинирования, полученные клетки в F-12-среде (питательная смесь Ham’s F-12, Gibco BRL # 21700) с 10% FCS помещают на покрытые коллагеном типа 1 пластины с 24 углублениями в количестве 3×10⁵ клеток и культивируют примерно 2 дня вплоть до конфлюэнции. К 500 мкл питательной среды (F-12-среда с 10% FCS), смотря по обстоятельствам, добавляют 56 мкл кондиционированной среды (КМ) трансфектантов за счет Hind III-MP 52/pABWN L-клеток, трансфектантов за счет pABWN-L-клеток или только среду (DMEM с 10% FCS). Через промежуток времени 0, 3, 6 и 9 дней применяют F-12-среду с 10% FCS, а также соответствующие добавки. Все три дня осуществляют перемену среды с соответствующими добавками. Затем следующие 2 дня культуру культивируют в F-12-среде без FCS в присутствии соответствующих добавок (кондиционированные среды, соответственно, контрольная среда) и после этого добавляют ³⁵S-сульфат за 6 часов. Инкорпорированную в полисахариды ³⁵S определяют после проназа-Е-переваривания и преципитации, как описано Hiraki и др. (Biochimica et Biophisica Acta, , (1988), 91-99).

Таблица 1
	Радиоактивность (cpm/углубление)
Число стадий	DMEM (10% FCS) контрольных L-клеток	КМ трансфектантов L-клеток за счет pABWN	КМ трансфектантов L-клеток за счет Hind III-МР 52/pABWN
2	3720±114	3865±120	4879±422
5	4188±135	4154±29	8223±275*
8	3546±160	3310±115	9890±1260*
11	3679±218	3633±167	7520±160*
Величина относится к ±S.E.M. для 3 или 4 культуральных смесей.*) р<0,01 vs DMEM и КМ трансфектантов L-клеток, полученных с помощью pABWN (многократный t-тест Scheffe).

Как видно из таблицы 1, надосадочные жидкости культур клеток, продуцирующих МР 52 трансфектантов, значительно стимулируют синтез GAG по сравнению с чистой питательной средой (DMEM с 10% FCS) или надосадочной жидкостью культуры L-клеток, трацсфицированных с помощью pABWN. Это показывает, что МР-52 может стимулировать дифференциацию хондроцитов.

1.2.

Описанный эффект некоторых членов ВМР-семейства представляет собой усиление активности щелочной фосфатазы (ALP-активности) в остеобластах. Клональные линии клеток крыс ROB-C 26 (С-26) причисляют к остеобластам относительно ранней стадии созревания (Yamaguchi и др., Calcif. Tissue Int. 49 (1991), 221-225).

Для остеоиндуктивных протеинов, как например, BMP-2, описана способность усиливать ALP-активность: Yamaguchi и др., J.Cell. Biol. 113 (1991), 681-687.

Влияние МР 52 на С26-клетки исследуют следующим образом. С 26-клетки в количестве 3×10⁴ клеток на углубление высевают на пластину с 24 углублениями и культивируют в среде α-МЕМ (Gibco BRL) с 10% FCS вплоть до конфлэюнции. На углубление добавляют 56 мкл надосадочной жидкости культуры продуцирующих МР 52 трансфектантов L-клеток (Hind III-MP52/pABWN), соответственно, надосадочной жидкости трансфектантов L-клеток, полученных с помощью pABWN, или только надосадочной жидкости культуры (DMEM с 10% FCS) L-клеток к 500 мкл среды культуры клеток С-26. Замену среды с соответствующими добавками осуществляют все три дня. ALP-акти