Способ прогнозирования эффективности терапии у больных лепрой

Способ прогнозирования эффективности терапии у больных лепрой

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторным методам исследования, и может быть, в частности, использовано для прогнозирования эффективности терапии у больных лепрой.

Из практики медицины известен способ прогнозирования эффективности терапии у больных лепрой лабораторным методом исследования, заключающийся в том, что определяют количество солюсульфона в суточной пробе мочи и рассчитывают скорость выведения препарата из организма больного, на основании чего прогнозируют эффективность проводимой сульфоновой терапии у больных лепрой (Рыжова Н.Я., Евстратова В.А. Определение скорости выведения солюсульфона из организма больных лепрой для оценки эффективности сульфоновой терапии. Методические рекомендации. Астрахань, 1975, 7 с.). Недостатками этого способа являются: предварительное введение больному стандартной тест-дозы солюсульфона, что противопоказано при лекарственной непереносимости препарата, снижение информативности способа при наличии у больного нарушения водовыделительной и концентрационной функции почек, невозможность проведения во время осуществления способа других лабораторных исследований мочи, необходимость для осуществления способа стационарного лабораторного оборудования (фотоэлектроколориметр) и предварительного построения калибровочной кривой солюсульфона; наличии токсических и малодоступных реактивов, а также большая продолжительность выполнения способа (от 1 до 3 суток), что не дает возможность получить конкретный технический результат - упрощение способа.

Известен также способ прогнозирования эффективности терапии у больных лепрой лабораторными методами исследования, заключающийся в том, что определяют антитела к различным антигенным детерминантам М.leprae с использованием комплекса серологических реакций в сыворотке крови больных лепрой (Дячина М.Н., Ющенко А.А., Дегтярев О.В., Лукин Ю.В., Ибраимов М.И. Серологический контроль за эффективностью химиотерапии при лепре. Методические рекомендации. Астрахань, 1994, 16 с.). Недостатками этого способа являются: необходимость в параллельном выполнении 5 серологических тестов, что требует осуществления способа в иммунологической лаборатории, предварительное получение сыворотки крови больного в качестве биологического материала, наличие большого количества (не менее 19), в том числе дорогих и малодоступных химических реактивов, пула сывороток от доноров и больных активной стадией лепры, наборов антител к различным классам иммуноглобулинов человека, тест-антигенов УЗД-М.leprae и УЗД-М.avium, а также большая продолжительность (не менее 20 часов) и высокие требования к технической оснащенности способа (планшеты плоскодонные полистироловые, пипетки-дозаторы переменного объема, микрофотометр, рН - метр, термостат, аппарат для проведения встречного иммуноэлектрофореза), что в итоге не позволяет получить конкретный технический результат - упрощение способа.

Наиболее близким к предлагаемому является способ прогнозирования эффективности терапии у больных лепрой лабораторным методом исследования, заключающийся в том, что в клетках гемопоэтического происхождения - тканевых макрофагах, а также в клетках эпидермиса определяют суммарную активность эстераз, и по величине соотношения активности которых (коэффициент эффективности) определяют эффективность терапии у больных лепрой (Осипов А.А. Эстеразная активность в кожных поражениях при лепре: Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук. - Москва, 1983. - 23 с.).

Сходство данного способа с предлагаемым заключается в том, что оба они относятся к лабораторным методам исследования и основаны на исследовании метаболизма клеток гемопоэтического происхождения. Недостатками известного способа являются:

- многоэтапное осуществление способа, состоящего из забора материала от больного методом биопсии, специального метода фиксации материала в растворе кальция - формола при строго определенном температурном режиме (0-4°С), приготовления на микротоме - криостате из материала нескольких гистологических срезов с их последующей инкубацией в буферном растворе с ограниченным интервалом температуры (+37°С) и рН 7,4, оценки интенсивности гистохимической реакции на сканирующем микроскопе - фотометре, что в итоге определяет большую трудоемкость и техническую сложность осуществления способа;

- большая травматичность способа вследствие многократной физической и психологической травматизации больного из-за взятия материала методом малой хирургии - биопсией участка кожного покрова, что требует предварительного обезболивания, соблюдения правил асептики, а также оптимального выбора места, глубины и размера биопсированного участка кожи, что влияет на результат исследования;

- необходимость в использовании не менее 5 дорогостоящих и токсичных химических реактивов;

- большая продолжительность осуществления способа - не менее 18 часов;

- дорогостоящее техническое оборудование, необходимое для обеспечения способа, а именно, - микротом - криостат МК-25, стационарный термостат, холодильник и микроскоп - фотометр SMP-01 фирмы “Opton”, позволяющий увеличивать изображение изучаемых гистологических срезов не менее, чем в 800 раз, а также режущий инструментарий (ножницы, скальпель), что в итоге делает возможным осуществление способа только в условиях специализированной патоморфологической лаборатории.

Таким образом, перечисленные недостатки не позволяют получить конкретный технический результат - упрощение способа.

Предлагаемое изобретение решает основную задачу - упрощение способа. Сущность изобретения выражена совокупностью существенных признаков, достаточных для обеспечиваемого изобретением технического результата.

Поставленная задача решается в изобретении тем, что определяют средний цитохимический коэффициент степени накопления липидов в лейкоцитах периферической крови в условных единицах до начала терапии (CЦK₁) и через 2-3 или 5-6, 10-12, 20-24 месяцев терапии (СЦК₂), затем рассчитывают коэффициент эффективности терапии в условных единицах (К) по формуле:

и при его значении, равном 1,20 условных единиц и выше, прогнозируют эффективность терапии у больных лепрой.

Упрощение способа дает возможность полностью исключить два и упростить три этапа осуществления способа-прототипа. При этом продолжительность осуществления способа сокращается не менее, чем в 35 раз, а количество используемых реактивов не менее, чем в 1,5 раза. Кроме того, нет необходимости в использовании микротома - криостата МК-25, стационарного термостата, режущего инструментария, холодильника и сканирующего микроскопа - фотометра SMP-01 фирмы “Opton”. Осуществление способа не требует специальной подготовки и возможно в любой лаборатории и полевых условиях.

Проблема прогнозирования эффективности терапии у больных лепрой остается одной из наиболее актуальных в современной лепрологии. Важнейшим ее аспектом является поиск новых средств терапии и индивидуализация схем лечения каждого конкретного больного лепрой, что невозможно без использования в каждодневной практике врача -лепролога надежных и доступных лабораторных способов прогнозирования эффективности терапии больных лепрой. Использование таких способов способствует и своевременному выявлению у М.leprae лекарственной устойчивости, с которой связаны дальнейшие прогрессирование, развитие осложнений болезни в результате неэффективной терапии больного лепрой.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом.

Определяют коэффициент эффективности терапии по формуле:

где К - коэффициент эффективности терапии в условных единицах;

CЦK₁ - рассчитанное значение среднего цитохимического коэффициента степени накопления липидов в лейкоцитах периферической крови (в условных единицах), определенное до начала терапии;

СЦК₂ - рассчитанное значение среднего цитохимического коэффициента степени накопления липидов в лейкоцитах периферической крови (в условных единицах), определенное через 2-3 или 5-6, 10-12, 20-24 месяцев терапии.

Коэффициент эффективности терапии (К) определяют соответственно через 2-3 или 5-6, 10-12, 20-24 месяцев терапии.

Липиды в лейкоцитах периферической крови определяют по известной методике (Раскин И.М., “Липидсодержащие лейкоциты при ишемической болезни сердца”, Москва, “Медицина”, 1977 г., с.42-47). Для этого готовят препарат - мазок периферической крови больного на предметном стекле по общепринятой методике (В.В.Меньшиков, 1999). После проведения специфической окраски высохший на воздухе препарат просматривают под микроскопом (иммерсионная система, объектив Х 90, окуляр Х 7). Просмотренные 100 лейкоцитов периферической крови в зависимости от интенсивности их специфической окраски условно делят на четыре группы. Группы, в зависимости от интенсивности специфической окраски входящих в них лейкоцитов периферической крови, условно обозначают как “1+”, “2+”, “3+ и “4+”. Первая группа (1+) - лейкоциты со слабоположительной специфической окраской, цитоплазма которых окрашена по периферии в виде тонкого бледно-голубого ободка; ядро неконтрастно или слабо контрастно. Вторая группа (2+) - лейкоциты с положительной специфической окраской, цитоплазма которых диффузно окрашена в бледно-голубой цвет, а ядро имеет размытые контуры. Третья группа (3+) - лейкоциты с резко положительной специфической окраской, цитоплазма которых интенсивно окрашена в голубой цвет; ядро имеет четкие контуры. Четвертая группа (4+) - лейкоциты с максимальной специфической окраской, цитоплазма которых диффузно окрашена в синий цвет, содержит скопления красителя в виде отдельных гранул; ядро имеет четкие контуры. Степень накопления липидов в лейкоцитах периферической крови выражают значением среднего цитохимического коэффициента (СЦК), который рассчитывают путем суммирования произведений количеств плюсов (от 1 до 4) и лейкоцитов периферической крови каждой группы и делят эту сумму на 100 (G.Astaldi et L.Verga, 1957).

где СЦК - рассчитанное значение среднего цитохимического коэффициента степени накопления липидов в лейкоцитах периферической крови (в условных единицах), определенное до и после начала терапии;

А, Б, В, Г - количество лейкоцитов периферической крови в каждой из четырех групп из 100, просмотренных в препарате;

1, 2, 3, 4 - количество плюсов, соответствующее каждой из четырех групп просмотренных в препарате 100 лейкоцитов периферической крови в зависимости от их специфической окраски;

100 - общее количество просмотренных в препарате лейкоцитов периферической крови.

Все применявшиеся реактивы имели допустимую для лабораторных исследований категорию качества. Работа осуществлялась с использованием микроскопа отечественного производства “Микмед-1, вариант 2”.

Статистическая обработка полученных результатов осуществлялась с использованием электронных таблиц Microsoft Excel с определением общепринятых статистических параметров: средней арифметической (М), среднего квадратического отклонения (S) и критерия Стьюдента (t).

Изложенная сущность изобретения поясняется графиком и таблицей.

Из графика видно, что у больных лепрой среднее значение СЦК₁, отражающего степень накопления липидов в лейкоцитах периферической крови, имеет самое низкое значение (1,72 условных единиц) до момента начала курса терапии. В последующем, уже через 2-3 месяца лечения, степень накопления липидов в лейкоцитах периферической крови (значение СЦК₂) значительно и достоверно (р<0,01) возрастает по сравнению с исходным показателем (значение СЦК₁) и становится равным 2,04 условных единиц. Кроме того, параллельно появлению клинико-лабораторных признаков эффективности терапии и длительности лечения, а именно, через 5-6 и 10-12 месяцев лечения, отмечается дальнейшее статистически достоверное (р<0,01) увеличение среднего значения СЦК₂, который составляет 2,2 и 2,28 условных единиц соответственно. Максимальное значение данный показатель (СЦК₂, равное 2,39 условных единиц) достигает после 20-24 месяцев проводимой терапии на фоне формирования у большинства больных признаков регресса заболевания. Таким образом, у больных лепрой в результате лечения и параллельно появлению клинико-лабораторных признаков ее эффективности наблюдается увеличение степени накопления липидов в лейкоцитах периферической крови (значение СЦК₂) по сравнению с аналогичным показателем, определенным до начала терапии (значение CЦK₁).

Это позволяет использовать значения данного показателя (до начала и в различные сроки лечения) для расчета коэффициента эффективности терапии (К) у больных лепрой.

Таблица
Коэффициент эффективности терапии (К) после начала терапии в условных единицах
Через 2-3 мес	Через 5-6 мес	Через 10-12 мес	Через 20-24 мес
1,20	1,28	1,33	1,40

Из таблицы видно, что после начала терапии по мере появления признаков регресса заболевания, наблюдается увеличение значения коэффициента эффективности терапии (К), который равен 1,20, 1,28, 1,33 и 1,40 условных единиц соответственно через 2-3, 5-6, 10-12 и 20-24 месяцев лечения. Причем максимальное значение данного коэффициента (1,40 условных единиц) совпадает с периодом регресса как клинических, так и гистологических признаков заболевания после 20-24 месяцев терапии. Кроме того, уже через 2-3 месяцев терапии значение коэффициента эффективности терапии (К) равно 1,20 условных единиц. Данная величина была принята в качестве минимального значения коэффициента эффективности терапии (К), по значению которого, равному 1,20 условных единиц и выше, прогнозировали эффективность терапии у больных лепрой. Таким образом, в результате противолепрозной терапии и параллельно появлению клинико-лабораторных признаков регресса заболевания наблюдается увеличение значения коэффициента эффективности терапии (К), что позволяет использовать данный показатель в качестве лабораторного теста для прогнозирования эффективности терапии у больных лепрой.

Предлагаемый способ прошел успешную апробацию в клинике НИИ по изучению лепры МЗ РФ на 15 больных лепрой в течение 1999-2002 годов. Все обследованные больные на момент исследования имели клинические проявления активности лепрозного процесса, которые были подтверждены лабораторными методами исследования, а именно бактериоскопически и гистологически. Общее количество проведенных исследований составило 54 анализа.

Ниже приводятся результаты апробации.

Пример 1.

Больной Г-н, 1928 г.р., (история болезни №3875). Болен лепрой с 1993 года. В феврале 2001 года впервые госпитализирован в клинику НИИ по изучению лепры МЗ РФ с диагнозом: лепра, лепроматозный тип, LLp, активная стадия. Клинически заболевание характеризовалось распространенным лепрозным процессом на кожном покрове, а именно, диффузной глубокой инфильтрацией и лепромами, facies leonina, а также поражением верхних дыхательных путей и периферической нервной системы. Бактериоскопический индекс (БИН) равен 1,83+. Гистологически при поступлении: Инфильтраты лепроматозной структуры, содержащие большое количество гомогенных и зернистых форм М.leprae.

Для прогнозирования эффективности терапии определяли коэффициент эффективности терапии (К) по формуле:

где К - коэффициент эффективности терапии в условных единицах;

СЦК₁ - рассчитанное значение среднего цитохимического коэффициента степени накопления липидов в лейкоцитах периферической крови (в условных единицах), определенное до начала терапии;

СЦК₂ - рассчитанное значение среднего цитохимического коэффициента степени накопления липидов в лейкоцитах периферической крови (в условных единицах), определенное через 2 месяца терапии.

Коэффициент эффективности терапии (К) определяли соответственно через 2 месяца терапии.

Готовили препарат - мазок периферической крови больного на предметном стекле по общепринятой методике. После проведения специфической окраски по методике И.М.Раскин (1977) просматривали препарат под микроскопом с использованием иммерсионной системы. 100 просмотренных лейкоцитов периферической крови в зависимости от интенсивности их специфической окраски условно делили на четыре группы: со слабоположительной (1+), положительной (2+), резко положительной (3+) и максимальной (4+) окраской. Степень накопления липидов в лейкоцитах периферической крови выражали рассчитанным значением среднего цитохимического коэффициента (СЦК) в условных единицах.

Значение CЦK₁ (до лечения) равнялось 1,70 условных единиц. Значение СЦК₂, определенное через 2 месяца терапии - 2,05 условных единиц. Коэффициент эффективности терапии (соотношение СЦК₁ и СЦК₂) через 2 месяца терапии соответственно составил 1,20 условных единиц. Таким образом, по значению коэффициента эффективности терапии (К), равному 1,20 условных единиц, что соответствует установленной авторами нижней границы значений коэффициента эффективности терапии (1,20 условных единиц), можно достоверно прогнозировать эффективность терапии уже через 2 месяца лечения.

Пример 2.

Больной К-н, 1936 г.р., (история болезни №3866). Болен лепрой с 1984 года. В октябре 1999 года впервые госпитализирован в клинику НИИ по изучению лепры МЗ РФ с диагнозом: лепра, лепроматозный тип, LLp активная стадия. Клинически заболевание характеризовалось диффузной глубокой инфильтрацией и лепромами на кожном покрове, поражением верхних дыхательных путей и периферической нервной системы. Бактериоскопический индекс (БИН) равен 2,33+. Гистологически: Инфильтраты лепроматозной структуры, содержащие большое количество М.leprae. Прогнозирование эффективности терапии осуществляли способом, описанным в примере 1. Значение СЦК₁ (до лечения) равнялось 1,55 условных единиц. Значение СЦК₂, определенное через 5 месяцев терапии - 2,47 условных единиц. Коэффициент эффективности терапии (соотношение CЦK₁ и СЦК₂) через 5 месяцев терапии соответственно составил 1,59 условных единиц. Таким образом, по значению коэффициента эффективности терапии (К), равному 1,59 условных единиц, что выше установленной авторами нижней границы значений коэффициента эффективности терапии (1,20 условных единиц), можно достоверно прогнозировать эффективность терапии через 5 месяцев лечения.

Пример 3.

Больная М-а, 1936 г.р. (история болезни №3120). Болеет лепрой с 1963 года. В ноябре 2000 года госпитализирована в клинику НИИ по изучению лепры МЗ РФ с рецидивом заболевания: лепра, лепроматозный тип, LLs, активная стадия. Клинически заболевание характеризовалось диффузной глубокой инфильтрацией и лепромами на кожном покрове, поражением периферической нервной системы. Бактериоскопический индекс (БИН) равен 2,50+. Гистологически: Активно формирующейся инфильтрат лепроматозной структуры, содержащий большое количество гомогенных и зернистых форм М.leprae. Прогнозирование эффективности терапии осуществляли способом, описанным в примере 1. Значение CЦK₁ (до лечения) равнялось 2,21 условных единиц. Значение СЦК₂, определенное через 20 месяцев терапии - 2,39 условных единиц. Коэффициент эффективности терапии (соотношение СЦК₁ и СЦК₂) через 20 месяцев терапии соответственно составил 1,08 условных единиц. Таким образом, по значению коэффициента эффективности терапии (К), равному 1,08 условных единиц, что ниже установленной авторами нижней границы значений коэффициента эффективности терапии (1,20 условных единиц), нельзя достоверно прогнозировать эффективность терапии через 20 месяцев лечения.

Применением предложенного способа по сравнению со способом-прототипом достигается положительный результат, заключающийся в упрощении прогнозирования эффективности терапии у больных лепрой. Упрощение способа достигается полным исключением двух трудоемких и продолжительных этапов осуществления способа-прототипа, а именно - приготовление из материала больного нескольких гистологических срезов и их инкубацию в буферном растворе с ограниченным интервалом и температуры и рН. Это, в свою очередь, исключает необходимость использования для осуществления способа микротома - криостата МК-25, стационарного термостата и предварительного приготовления буферного раствора. Кроме этого, упрощается этап забора материала от больного, так как вместо используемого с этой целью в способе-прототипе метода малой хирургии - биопсии кожи, в предлагаемом способе используется общепринятый и малотравматичный метод забора периферической крови больного путем прокола мякоти пальца руки. Это позволяет избежать многократной физической и психологической травматизации больного, не требует предварительного обезболивания, режущего инструментария, а также не влияет на результат исследования. Упрощается этап фиксации материала, так как нет необходимости с целью сохранения активности внутриклеточных эстераз применять специальный метод фиксации материала при строго определенном температурном режиме (0-4°С), что исключает необходимость в холодильнике для технического осуществления предлагаемого способа и дает возможность заменить раствор кальция формола на доступный и недорогой раствор формалина. Упрощение этапа оценки интенсивности гистохимической реакции позволяет заменить дорогостоящий и технически сложный в работе сканирующий микроскоп - фотометр SMP-01 фирмы “Opton" на доступный в любой лаборатории и простой в обращении световой микроскоп отечественного производства. Кроме того, использование светового микроскопа в предлагаемом способе позволяет уменьшить необходимую величину увеличения изображения не менее чем в 1,3 раза по сравнению со способом-прототипом. Таким образом, упрощение способа позволяет за более короткий период времени (приблизительно в 35 раз меньший по сравнению со способом-прототипом) осуществить прогнозирование эффективности терапии у больных лепрой. В свою очередь, это даст возможность своевременно установить наличие или формирование медикаментозной резистентности у возбудителя лепры, следовательно, оценить вероятность прогрессирования болезни и развитие ее осложнений. Это позволит адекватно планировать противоэпидемиологические мероприятия, как в отношении самого больного, так и контактных с ним лиц. Количество используемых химических реактивов, необходимых для осуществления предлагаемого способа, сокращается не менее чем в 1,5 раза по сравнению со способом-прототипом. Осуществление способа возможно в полевых условиях, для чего не требуется специальной подготовки, стационарного оборудования, дорогостоящих и токсичных реактивов.

Таким образом, авторами предложен новый, никем ранее не предлагаемый способ прогнозирования эффективности терапии больных лепрой.

Предлагаемый способ может быть рекомендован к клиническому использованию в противолепрозных учреждениях.

Способ прогнозирования эффективности терапии у больных лепрой, состоящий в исследовании метаболизма клеток гемопоэтического происхождения, отличающийся тем, что определяют средний цитохимический коэффициент степени накопления липидов в лейкоцитах периферической крови в условных единицах до начала терапии (СЦК₁) и через 2-3 или 5-6, 10-12, 20-24 месяцев терапии (СЦК₂), затем рассчитывают коэффициент эффективности терапии в условных единицах (К) по формуле

и при его значении, равном 1,20 условных единиц и выше, прогнозируют эффективность терапии у больных лепрой.