Фармацевтические композиции, включающие циклические глицерофосфаты и их аналоги, для активации дифференцировки нервных клеток

Фармацевтические композиции, включающие циклические глицерофосфаты и их аналоги, для активации дифференцировки нервных клеток

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область изобретения

Настоящее изобретение касается фармацевтических композиций, включающих циклические глицерофосфаты и их аналоги, и лечения состояний и нарушений, связанных с нервной системой.

Уровень техники

Далее приведен список ссылок, которые предназначены для лучшего понимания предпосылок настоящего изобретения.

Boyd, R.K., De Freitas, A.S.W., Hoyle J., McCulloch, A.W., Mclnnes, A.G., Rogerson, A. and Walter, J.A., J.Biol. Chem., 262: 12406-12408 (1987).

Clarke, N. and Dawson, R.M.C., Biochem.J., 216: 867-874 (1976).

Dawson, R.M.C., Ann.Rept. Progr.Chem., 55: 365 (1958).

Dawson, R.M.C., Freinkel, N.. Jungalwala, F.B. and Clarke, N., Biochem.J., 122: 605-607 (1971).

Forrest, H.S. and Todd, A.R., J.Chem.Soc., 1950, 3925 (1950).

Friedman, P., Haimovitz, R., Markman, 0., Roberts, M.F. and Shinitzky, M., Conversion of lysophospholipids to cyclic lysophosphatidic acid by phospholipase, D.J.Biol.Chem., 271: 953-957 (1996).

Hagg, Т. and Varon, S., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90: 6315-6319 (1993).

Kennedy and Weiss, J.Biol.Chem., 222: 193 (1956).

Knusel, В., "et al., Neurosci., 3J3: 558-570 (1990).

Knusel, et al., Proc.Nakl.Acad.Sci.USA, 88: 961-965 (1991).

Leloir, L.F., Blochem.Biophys.J., 33: 186 (1951).

Linn, L.F.H., et al., Science, 260: 1130-1134 (1993).

Markham, R. and Smith, J.D., Biochem.J., 52: 552 (1952).

Shinitzky, M., Friedman, P. and Haimovitz, R., Formation of 1,3-cyclic glycerophosphate by the action of phospholipase С on phosphatidylglycerol, J.Biol.Chem., 268: 14109-14115 (1993).

Su, В., Kappler, F., Szwergold, B.S. and Brown, T.R., Cancer Res., 53: 1751-1754 (1993).

Tomac, A., et al., Nature, 373: 335-339 (1995).

Ukita, Т., Bates, N.A. and Carter, H.E., J.Biol.Chem., 216: 867-874 (1955).

Предпосылки изобретения

L-α-глицерофосфат (αGP), ключевой компонент фосфолипидного метаболизма (Kennedy and Weiss, 1956), в изобилии имеется в большинстве биологических тканей (Dawson, 1958). β-Глицерофосфат (βGp) является продуктом ферментативного (Ukita и др.) и щелочного (Clarke and Dawson, 1976) гидролиза фосфолипидов и образуется через циклический фосфодиэфирный промежуточный продукт 1,2-циклический глицерофосфат (1,2 cGP) (Ukita и др., 1955; Clarke and Dawson, 1976). 1,2 cGP обнаружен в образцах морских водорослей (Boyd и др., 1987), а также в раковых тканях человека (Su и др., 1993). Аналогично, αGP в принципе может принимать циклическую форму 1,3-циклического глицерофосфата (1,3 cGP). Показано, что данное соединение образуется как промежуточный продукт в гидролизе фосфатидилглицерина (PG) с фосфолипазой С (Shinitzky и др., 1993) и после дальнейшего гидролиза преобразуется в αGP.

Шестичленным циклическим фосфатом первостепенной биологической важности является АМР. Кольцо циклического АМР фактически является производным основной цепи 1,3 cGP. Другие циклические фосфаты, которые обнаружены в биологических системах, включают циклический фосфодиэфир глюкозы (Leloir, 1951), 2’,3’-циклический фосфодиэфир (Markham and Smith, 1952), рибофлавин-4’,5’-циклический фосфодиэфир (Forrest and Todd, 1950), миоинозитол-1,2-циклический фосфодиэфир (Dawson и др., 1971) и циклическую лизофосфатидную кислоту (Friedman и др., 1960).

Исключая циклический АМР и циклический GMP, которые были интенсивно исследованы, для других биологических циклических фосфатов до сих пор не установлено специфической активности.

Существует несколько видов нарушений и заболеваний, которые являются результатом повреждения областей головного мозга и утраты нейронов. Примером таких заболеваний являются нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Паркинсона (PD). Данные заболевания часто включают дегенерацию дофаминпродуцирующих нейронов. Современные терапевтические методы предполагают, главным образом, постоянную стимуляцию дофаминных рецепторов лекарственными препаратами, которые, первоначально обеспечивая симптоматическое облегчение, постепенно теряют эффективность. Кроме того, данные лекарственные препараты не предупреждают характерную для таких заболеваний прогрессирующую дегенерацию дофаминэргических нейронов.

Большое количество факторов роста, таких как фактор роста нервной ткани (NGF), основной фактор роста фибробластов (bFGF), эпидермальный фактор роста (EGF), инсулиноподобный фактор роста, производный головного мозга фактор роста и производный глии нейротрофический фактор (Knusel В. и др., 1990; Knusel В. и др., 1991; Linn и др., 1993) стимулируют выживание и дифференцировку In vitro дофаминэргических нейронов. При проведении исследований на животных моделях, включающих индуцирование болезни Паркинсона, зараженные животные показывают улучшение поведения и повышение уровня тирозингидроксилазы (ТН), ключевого фермента иммунореактивности на пути производства дофамина, если их обрабатывают такими факторами как GDNF (Тоmас, А. и др., 1995) и цилиарный нейротрофический фактор (CNTF) (Наgg, Т. and Varon, 1993).

Перечень соединений и их обозначений

Перечисленные далее соединения, формулы которых приведены в приложении А непосредственно перед формулой изобретения, представлены здесь в описании следующей аббревиатурой:

1. 1,3-циклический глицерофосфат - 1,3 cGP

2. 1,2-циклический глицерофосфат - 1,2 cGP

3. 3-ацил 1,2-циклический глицерофосфат (циклическая лизофосфатидная

кислота) - c-lysoPA

4. фенил 1,3 cGP - P-1,3 cGP

5. фенил 1,2 cGP - P-1,2 cGP

6. 1,3-циклический пропандиолфосфат - 1,3 сРР

7. 1,2-циклический пропандиолфосфат - 1,2 сРР

8. фенил 1,3 сРР - Р-1,3 сРР

9. фенил 1,2 циклический пропандиолфосфат - Р-1,2 сРР

10. циклический дигидроксиацетонфосфат - cDHAP

11. фенил циклический дигидроксиацетонфосфат - P-cDHAP

Словарь специальных терминов

Далее приведено объяснение некоторых терминов, использованных выше и ниже в описании и формуле изобретения:

"CG" - циклические глицерофосфаты и их аналоги, использованные в настоящем изобретении.

"Активация дифференцировки нервных клеток" - это выражение касается способности CG, использованных в данном изобретении, вызывать созревание клеток в нервные клетки после взаимодействия с ними. Такую активность можно оценить посредством одного из многих исследований in vitro и in vivo, таким как описанные ниже в примерах. Примером исследования in vitro может быть культивирование клеток, способных дифференцировать в нервные клетки (например, клетки РС12), в присутствии исследуемых соединений, и определение прорастания нейронов в клетках посредством микроскопического исследования. Исследования in vivo могут, например, включать обработку исследуемыми соединениями животных с пораженными дофаминэргическими нейронами и определение двигательных параметров и тремора конечностей, а также определение непосредственно на месте молекул, связанных с дофаминэргическим путем передачи, у обработанных животных.

"Клетки-мишени" - любые клетки, которые обладают возможностью созревать в нервные клетки. Неограничительными примерами таких клеток являются РС12 и первичные клетки головного мозга.

"Аналог" - касается любого соединения, которое является производным одного из циклических глицерофосфатов данного изобретения и в значительной степени сохраняет активность циклического фосфата, производным которого является, включая, например, дезоксианалоги и фениловые эфиры циклических глицерофосфатов, предпочтительно дезоксианалоги.

"Сохранять в значительной степени" - это выражение касается способности аналогов в определенной степени стимулировать активность, проявляемую циклическими глицерофосфатами, производными которых они являются. Активность аналогов считают сохраненной в значительной степени, если она составляет 30% или выше, предпочтительно 50% или выше, более предпочтительно 70% или выше и наиболее предпочтительно 90% или выше уровня активности данного глицерофосфата.

"Эффективное количество" - количество, которое в способе данного изобретения применяется для профилактики нежелательного состояния, при этом термин "эффективное количество" следует понимать как обозначающий количество активного соединения, которое при введении обеспечивает профилактику проявления указанного состояния. Профилактика такого состояния, например нейродегенеративного состояния, может потребоваться до появления каких-либо симптомов заболевания, например, у пациентов с высокой предрасположенностью развития данного заболевания, или когда композиции применяют для лечения с целью спасения нервов, которое предполагается после повреждения нервов. Если предполагают использовать композиции или способы для лечения текущих нежелательных состояний, тогда термин "эффективное количество" следует понимать как обозначающий количество активного соединения, которое эффективно для облегчения или предупреждения осложнения рассматриваемого состояния и связанных с ним симптомов.

"Невральное активирующее действие" - данное выражение включает разнообразные воздействия, связанные с нейронами, которые могут быть активированы в клетках-мишенях после их взаимодействия с CG, использованными в данном изобретении. Такие воздействия включают (но не ограничены этим) активацию роста нервов, обеспечение дофаминотрофической поддерживающей среды в пораженной части головного мозга, профилактику дегенерации нервов и спасение нервов.

"Профилактика или лечение" - выражение "профилактика нарушений и заболеваний в соответствии с данным изобретением" следует понимать как снижение вероятности появления таких нарушений и заболеваний у пациента с высокой предрасположенностью развития таких нарушений и заболеваний, снижение степени проявления симптомов, связанных с такими нарушениями и заболеваниями, если они случаются, или полное предотвращение их появления.

Лечение таких нарушений или заболеваний в соответствии с данным изобретением означает облегчение симптомов, связанных с данными нарушениями или заболеваниями, снижение степени проявления таких симптомов или полное их устранение.

Краткое описание изобретения

В соответствии с данным изобретением неожиданно обнаружено, что 1,2 cGP, 1,3 cGP и некоторые их аналоги способны активировать нейронное прорастание злокачественных клеток надпочечника РС12 в культуре после короткого инкубационного периода.

Таким образом, настоящее изобретение первым своим аспектом обеспечивает фармацевтическую композицию для активации дифференцировки нервных клеток из клеток-мишеней, включающую фармацевтически приемлемый носитель и в качестве активного ингредиента соединение общей формулы I:

где Y обозначает -(СН₂)_m-, -СН(ОН)- или -С(=O)- и m=0-3;

Х обозначает Н, алкил, -СН₂ОН-, -СН₂О ацил или -СН₂ ацил; и

R обозначает Н, катион, алкил или необязательно замещенный арил.

Использованный здесь термин "алкил" относится к алкильной группе, имеющей примерно от 1 до 24 атомов углерода, предпочтительно примерно от 3 до 20 атомов углерода, наиболее предпочтительно от примерно 5 до примерно 15 атомов углерода; термин "ацил" относится к алифатической насыщенной или ненасыщенной C₁-C₂₄ ацильной группе, предпочтительно к ацильной группе, имеющей четное число атомов углерода, наиболее предпочтительно к ацильной группе, являющейся производной природной жирной кислоты, такой как насыщенная алифатическая ацильная группа, выбранная из ацетила, бутирила, капроила, октаноила, деканоила, лауроила, миристила, пальмитоила и стеароила, или ненасыщенная алифатическая ацильная группа, выбранная из пальмитолеила, олеила, линолеила и рицинолеила; а термин "арил" относится к моно- или поликарбоциклической арильной группе, наиболее предпочтительно фенилу, необязательно замещенному C₁-C₄ алкилом, галогеном и/или гидроксилом. R может быть любым физиологически подходящим катионом и предпочтительно является Nа⁺.

В одном варианте Y обозначает -СН(ОН)-, Х обозначает Н и R обозначает Н или фенил. Согласно данному варианту композиция включает 1,3-циклический глицерофосфат (1,3 cGP) или фенил 1,3-циклический глицерофосфат (Р-1,3 cGP).

В другом варианте Y обозначает -С(=O)-, Х обозначает Н и R обозначает Н или фенил. Согласно данному варианту композиция включает циклический дигидроксиацетонфосфат (cDHAP) или фенил циклический дигидроксиацетонфосфат (P-cDHAP).

Еще в одном варианте Y обозначает -(СН₂)_m-, m равно 0, Х обозначает -СН₂OН и R обозначает Н или фенил. Согласно данному варианту композиция включает 1,2-циклический глицерофосфат (1,2 cGP) или фенил 1,2-циклический глицерофосфат (P-1,2-cGP).

Еще в одном варианте Y обозначает -(CH₂)_m-, m равно 0, Х обозначает C₁-C₂₄ алкил, предпочтительно -СН₃, и R обозначает катион или фенил. Согласно данному варианту композиция включает 1,2-циклический пропандиолфосфат (1,2 сРР) или фенил 1,2-циклический пропандиолфосфат (Р-1,2-сРР).

Еще в одном варианте Y обозначает -(СН₂)_m-, m равно 1, Х обозначает C₁-C₂₄ алкил, предпочтительно -СН₃, и R обозначает катион или фенил. Согласно данному варианту композиция включает 1,3-циклический пропандиолфосфат (1,3 сРР) или фенил 1,3-циклический пропандиолфосфат (Р-1,3-сРР).

Еще в одном варианте Y обозначает -(CH₂)_m-, m равно 0, Х обозначает -СН₂ (C₁-C₂₄) ацил, предпочтительно олеил, и R обозначает катион. Согласно данному варианту композиция включает 3-ацил-1,2-циклический глицерофосфат (циклическая лизофосфатидная кислота-c-lysoPA).

CG, использованные в данном изобретении, могут оказывать одно из многих невральных активирующих действий, включая (но не ограничиваясь этим) активацию нейронного прорастания, активацию роста нервов, обеспечение дофаминотрофической поддерживающей среды в пораженной части головного мозга, профилактику дегенерации нервов и спасение нервов. Все эти воздействия включены в область неврального активирующего действия.

Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает также фармацевтическую композицию для неврального активирующего действия, включающую фармацевтически приемлемый носитель и соединение приведенной выше общей формулы I в качестве активного ингредиента.

Способность фармацевтических композиций данного изобретения активировать дифференцировку нервных клеток и нейронную активность одним или более из указанных выше способов делает их предельно полезными для лечения различных нарушений. Следовательно, данное изобретение обеспечивает также фармацевтическую композицию, включающую фармацевтически приемлемый носитель и соединение приведенной выше общей формулы I в качестве активного ингредиента, для профилактики или лечения нарушений и заболеваний, которые можно предупредить или вылечить посредством активации дифференцировки нервных клеток и/или невральной активности.

Такими нарушениями могут быть психические нарушения, такие как, например, шизофрения или слабоумие, или расстройства, ведущие к неспособности к обучению.

Кроме того, фармацевтические композиции данного изобретения можно также использовать для лечения нейродегенеративных состояний, включая повреждение дофаминэргических нервных клеток. Примерами таких состояний являются болезнь Альцгеймера (AD) или болезнь Паркинсона (PD).

Другими нейродегенеративными состояниями, которые включены в область настоящего изобретения, являются состояния вследствие воздействия на человека вредных факторов окружающей среды, таких как опасные химические вещества, нейродегенеративные состояния вследствие механического повреждения (например, повреждения оптического нерва в результате контакта глаза с вредным внешним фактором) и др.

Кроме того, известно, что после первичной дегенерации нервов дополнительные нервы, находящиеся вблизи дегенерированных нервов, подвергаются вторичной дегенерации. Лечение пациента, страдающего от первичного нейродегенеративного состояния, может предупредить или ослабить появление вторичной дегенерации в других нервах, находящихся вблизи дегенерированных нервов. Такое лечение, называемое "спасением нервов", также включено в область настоящего изобретения.

Еще один аспект настоящего изобретения обеспечивает способ индуцирования активации дифференцировки нервных клеток из клеток-мишеней, включающий взаимодействие указанных клеток-мишеней в течение подходящего периода времени с эффективным количеством соединения приведенной выше формулы I.

Подходящим является такой период времени, который дает возможность композициям данного изобретения проявить свою активность. Специалист в данной области может легко определить данный период времени для каждого вида композиции и клеток-мишеней, используя любые описанные здесь способы. Обычно, в противоположность некоторым известным факторам, которые воздействуют на нервные клетки, таким как NGF, период времени, необходимый для контакта использованных в данном изобретении CG с клетками-мишенями с целью проявления их действия, является очень коротким (несколько минут).

В соответствии с еще одним аспектом данного изобретения обеспечен способ активации невральной активности у пациента, включающий введение нуждающемуся пациенту эффективного количества соединения приведенной выше общей формулы I.

Обеспечен также способ профилактики или лечения нарушений и заболеваний, которые можно предупредить или вылечить посредством активации дифференцировки нервных клеток и/или невральной активности, включающий введение нуждающемуся пациенту эффективного количества соединения приведенной выше общей формулы I.

Способ данного изобретения можно использовать для лечения разнообразных нарушений и заболеваний, при которых полезны указанные выше эффекты, то есть при которых действие CG облегчает или уменьшает нежелательные симптомы подлежащего лечению состояния или заболевания. Такими состояниями и заболеваниями могут быть (но не ограничены этим) психические нарушения, такие как шизофрения или слабоумие, расстройства, ведущие к неспособности к обучению, нейродегенеративные нарушения, такие как болезнь Альцгеймера или болезнь Паркинсона. Данный способ можно также применять для профилактики или лечения по спасению нервов после поражения нервов.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 показаны фотографии клеток РС12 после инкубации в течение 48 часов с питательной средой, содержащей линейный α-глицерофосфат в качестве контроля (Фиг.1А), с фактором роста нервной ткани (NGF) при концентрации 50 нг/мл (Фиг.1В) и с 1,3-циклическим глицерофосфатом (1,3 GP) при концентрации 1 мкМ (Фиг.1С). На Фиг.1В и 1С ясно видно нейронное прорастание.

На Фиг.2 показаны фотографии клеток РС12, культивированных в культуральной среде (контроль) (Фиг.2А), после воздействия в течение трех часов линейными α и β-глицерофосфатами (Фиг.2В и 2С, соответственно), циклическими глицерофосфатами и аналогами 1,3 cGP, фенил-1,3 cGP, 1,2 cGP, 1,3 сРР и фенил-1,3 сРР (Фиг.2D-2Н, соответственно) или NGF (Фиг.21). После инкубации клетки были промыты и культивированы в питательной среде, при этом на фотографиях показаны клетки на 7 день после обработки различными факторами. Нейронное прорастание видно только у клеток, обработанных указанными выше циклическими глицерофосфатами и аналогами (Фиг.D-Н).

На Фиг.3 показаны фотографии клеток РС12, обработанных в течение 7 дней контрольной средой (Фиг.3А), αGP (Фиг.3В), βGp (Фиг.3С), CG: 1,3 cGP, фенил-1,3 cGP, cGP, 1,2 cGP, 1,3 сРР и фенил-1,3 сРР (Фиг.3D-3Н, соответственно) при концентрации 0,5 мкМ и NGF (Фиг.31). После инкубации с α или βGp (Фиг.3В и 3С) не наблюдается нейронного прорастания, тогда как наблюдают нейронное прорастание различной степени в клетках, инкубированных с разными CG (Фиг.3D-Н). В таких условиях видно обширное прорастание нейронов в клетках, культивированных с NGF (Фиг.31).

На Фиг.4 показаны фотографии клеток РС12, обработанных в течение 14 дней контрольной средой (4А), 50 нг/мл NGF (4B), обработанных в течение 7 дней 50 нг/мл NGF и затем промытых и обработанных еще в течение 7 дней питательной средой без NGF (4С) или с 2 мкМ, 4 мкМ или 6 мкМ 1,3 сРР (4D, 4Е и 4F, соответственно).

Подробное описание изобретения

Циклические глицерофосфаты можно получить путем ферментативного разложения фосфолипидов, которое в большинстве случаев дает пяти- или шестичленные циклические глицерофосфаты. Область настоящего изобретения охватывает композиции, включающие оба эти типа циклических глицерофосфатов, полученные посредством ферментативного разложения фосфолипидов, а также полученные синтетическим путем. В область настоящего изобретения включены также CG, имеющие в цикле менее пяти и более шести атомов углерода.

Использованные в данном изобретении циклические глицерофосфаты и их аналоги обычно можно синтезировать, применяя один из известных специалистам способов синтеза эфиров фосфорной кислоты. Конкретные способы, которые обычно можно применять для получения циклических фосфатов настоящего изобретения, подробно описаны ниже (смотри примеры).

Аналоги циклических глицерофосфатов данного изобретения также включены в его объем и обычно представляют собой дезоксианалоги, а также фениловые эфиры 1,3-циклических фосфатов. Такие аналоги можно также получить ферментативными способами или синтетически одним из способов, известных специалистам.

Кроме активного ингредиента фармацевтические композиции могут также включать носитель, выбранный из любых известных специалистам носителей. Природа носителя будет зависеть от предлагаемого способа введения и показаний для использования данной композиции. Композиции могут также включать ряд дополнительных ингредиентов, таких как разбавители, лубриканты, связующие, консерванты и др.

Композиции данного изобретения можно вводить любым подходящим способом. Предпочтительным способом для их введения является внутривенный, локальный или пероральный, хотя иногда могут быть полезны и другие способы введения.

Обычно фармацевтические композиции данного изобретения включают примерно от 1 до 10 мг активного вещества на кг веса тела пациента.

При том, что композиции данного изобретения обычно содержат один CG, иногда можно включать в композицию или совместно вводить два или более CG, которые затем действуют вместе синергетическим или аддитивным образом, предупреждая или излечивая нейродегенеративное нарушение.

Использованные в данном изобретении CG можно применять в любой из их изомерных форм (смотри, например, четыре стереоизомера синтетического 1,3 cGP, изображенного в приложении А). Для различных целей один из изомеров может быть предпочтительнее других.

Согласно данному изобретению CG можно вводить либо разовой дозой, либо многократно через некоторый период времени.

Для лечения пациента композиции данного изобретения можно также вводить в комбинации с дополнительным лечением, например, когда подлежащее лечению состояние является нейродегенеративным, композиции можно давать вместе с одним из современных лекарственных препаратов или терапевтических средств, применяемых для лечения нейродегенеративных заболеваний, таких как стимуляторы дофаминных рецепторов, L-dopa, или вместе с фактором роста, таким как NGF. При таком комбинированном лечении CG можно вводить одновременно с дополнительным лечением или в разное время, так, чтобы получить максимальный профилактический или терапевтический эффект.

Примеры

Теперь данное изобретение будет проиллюстрировано посредством следующих неограничительных примеров со ссылкой на приложенные чертежи.

ХИМИЧЕСКИЙ РАЗДЕЛ

Синтез циклических фосфатов

Циклические фосфаты данного изобретения получают путем взаимодействия подходящего дигидроксисоединения, в котором Y обозначает -(СН₂)_m- или -С(=O)-, и Х обозначает Н или алкил, с хлорангидридом фосфорной кислоты (РОСl₃), если R является Н, или с моноариловым (например, фениловым) эфиром ди-хлорангидрида фосфорной кислоты (RO-P(=O)Cl₂), если R является арилом.

Если в исходном соединении присутствует одна или более гидроксильных групп, а именно Y обозначает -СН(ОН)- и/или Х обозначает -СН₂ОН, то данные гидроксильные группы должны быть защищены, например, посредством бензилирования, а затем после циклизации бензильную группу удаляют обычным каталитическим гидрированием в присутствии подходящего катализатора, такого как Pt или Pd.

Реакцию проводят в безводном растворителе, например, диоксане или метиленхлориде, в присутствии эквивалентного количества нуклеофила, такого как пиридин или триэтиламин. Конечные продукты, если R не является арилом, обычно получают в виде солей.

Ниже приведены пояснения синтеза серий известных и новых циклических фосфатов с 5- и 6-членными кольцами.

ПРИМЕР 1: Синтез 1,3-циклического глицерофосфата (1,3 cGP)

В основном следуют процедуре Buchnea (Buchnea, 1973), как описано. Кратко говоря, 2-бензилокси-1,3-пропандиол (Aldrich) подвергают взаимодействию с эквимолярным количеством хлорангидрида фосфорной кислоты (Aldrich) в метиленхлориде. Полученный 2-бензил-1,3 cGP обрабатывают водородом с катализатором палладиевой чернью в метаноле, удаляя бензильный остаток. 1,3 cGP, выделенный в виде соли бария, очищают при помощи бумажной хроматографии (н-пропанол:аммиак:вода=6:3:1, R_f=0,52).

1,3 cGP получают также расщеплением фосфатидилглицерина (PG) посредством фосфолипазы С, как описано (Shinitzky и др., 1993). Как определено при помощи бумажной хроматографии, продукт содержит следы, примерно 10-20%, α-GP.

ПРИМЕР 2: Синтез 1,2-циклического глицерофосфата (1,2 cGP)

Данное соединение получают, как описано (Kugel, L. and Halmann, M., J.Am.Chem.Soc., 89:4125-4128 (1967). Динатриевую соль β-глицерофосфата (Sigma) сначала переводят в кислотную форму, а затем циклизуют при помощи дициклогексилкарбодиимида (Aldrich). Продукт, выделенный в виде соли бария, очищают способом бумажной хроматографии.

ПРИМЕР 3: Синтез фенил 1,3-циклического глицерофосфата (Р-1,3 cGP)

Осуществляя взаимодействие 2-бензилокси-1,3-пропандиола с фениловым эфиром дихлорангидрида фосфорной кислоты (Aldrich), следуют способу, описанному в примере 1 для 1,3 cGP. Бензилированный промежуточный продукт очищают тонкослойной хроматографией (этилацетат:гексан=3:2, R_f=0,58), т.пл. 136°С. Далее его гидрируют как в примере 1, селективно удаляя бензильный остаток. Полученный Р-1,3 cGP, соединение III, очищают тонкослойной хроматографией (как указано выше), R_f=0,15, т.пл. 116°С.

ПРИМЕР 4: Синтез 1,3-циклического пропандиолфосфата (1,3 сРР)

1,3 сРР получают, осуществляя взаимодействие 1,3-пропандиола (Aldrich) с эквимолярным количеством хлорангидрида фосфорной кислоты и далее проводя очистку, как описано Buwalda и др., 1997. Продукт выделяют в виде свободной кислоты (т.пл. 99-100°С).

 ³²Р-меченый 1,3 сРР (1,3 сР³²P) получают при помощи ³²РОСl₃. Последний получают путем введения следов Н

32

3

РO₄ (Amersham) в избыток РОСl₃ на холоде (Neuhaus and Korkes, 1958). Далее реакция протекает в микромасштабе и 1,3 сР³²P выделяют путем совместной кристаллизации с немеченым 1,3 сРР.

ПРИМЕР 5: Синтез фенил 1,2-циклического пропандиолфосфата (1,2 сРР)

1,2 сРР получают аналогично процедуре примера 4, но используя 1,2-пропандиол (Aldrich). Соединение выделяют в виде соли бария и очищают бумажной хроматографией (н-пропанол:аммиак:вода = 6:3:1, R_f=0,55).

ПРИМЕР 6: Синтез фенил 1,3-циклического пропандиолфосфата (Р-1,3 сРР)

Р-1,3 сРР получают способом, аналогичным процедуре примера 4, путем взаимодействия 1,3-пропандиола с эквимолярным количеством фенилового эфира дихлорангидрида фосфорной кислоты в сухом пиридине. Продукт кристаллизуют дважды из смеси этилацетат-гексан, т.пл. 72°С.

ПРИМЕР 7: Синтез фенил 1,2-циклического глицерофосфата (Р-1,2 cGP)

Данное новое соединение получают как в примере 3 путем взаимодействия 1-бензилокси-2,3-пропандиола с фенил-РО₂Сl₂ с последующим удалением бензильного остатка селективным гидрированием. Кристаллизацию проводят из смеси этанол-ацетон, продукт имеет т.пл. 95°С.

ПРИМЕР 8: Синтез фенил 1,2-циклического пропандиолфосфата (Р-1,2 сРР)

Данное новое соединение получают как в примере 6 путем взаимодействия 1,2-пропандиола с эквимолярным количеством фенил-РО₂Сl₂ в сухом пиридине. Кристаллизацию проводят из смеси этилацетат-гексан, продукт имеет т.пл. 69°С.

ПРИМЕР 9: Синтез циклического дигидроксиацетонфосфата (cDHAP)

Данное новое соединение получают путем взаимодействия РОСl₃ с дигидроксиацетоном.

1,8 г (0,01М димера или 0,02М мономера) димера дигидроксиацетона (ММ=180) растворяют в 20 мл свежеперегнанного метиленхлорида.

3,07 г = 1,87 мл (0,02М) хлористого фосфорила (ММ=153,5, d=1,645) в 4 мл MeCl₂ медленно добавляют к раствору при комнатной температуре. Данный раствор кипятят с обратным холодильником в течение 15 часов (раствор черный). Выпаривают метиленхлорид и добавляют к раствору 100 мл смеси 90% ацетон/вода. Реакционную смесь кипятят с обратным холодильником в течение 18 часов. Черный раствор обрабатывают при комнатной температуре активированным углем и фильтруют. Из полученного светло-желтого раствора выпаривают ацетон и воду, а очень красивый кристаллический остаток растворяют в 10 мл ацетона. К раствору добавляют 0,01М BaJ₂ в 80 мл ацетона. Начинают выпадать красивые кристаллы бариевой соли циклического дигидроксиацетонфосфата. Осадок промывают три раза небольшим количеством ацетона и сушат. Продукт очищают, растворяя в небольшом количестве воды и осаждая ацетоном. Полученный продукт представляет собой белый кристаллический порошок и демонстрирует при помощи бумажной хроматографии (смесь растворителей: н-пропанол: NH₃:H₂O=6:3:1) R_f=0,50.

ПРИМЕР 10: Синтез фенил циклического дигидроксиацетонфосфата (P-cDHAP)

Данное новое соединение получают путем взаимодействия фенил-РО₂Сl₂ с дигидроксиацетоном в сухом пиридине. После удаления растворителя в вакууме остаток дважды экстрагируют ацетоном. После выпаривания этилацетата получают маслянистый остаток.

ПРИМЕР 11: Синтез циклических олеиллизофосфатидных кислот (c-lysoPA)

Данные новые соединения получают путем взаимодействия олеиллизофосфатидной кислоты (Avanti Polar Lipids) с избытком дициклогексилкарбодиимида (DCC) в диметилсульфоксиде. Продукт выглядит как масло.

БИОЛОГИЧЕСКИЙ РАЗДЕЛ

Материалы и методы

Иммортализованная клеточная линия РС12 является одной из наиболее исследованных систем в нейронной дифференцировке. В присутствии фактора роста нервной ткани данные клетки дифференцируют в нервные клетки. Клетки РС12 из феохромацитомы крыс культивируют в виде монослоев на среде Игла (ЕМ), содержащей 10% сыворотку плода коровы, 50 мкг/мл гентамицина и 5 мМ глутамина, в увлажненном инкубаторе с 5% CO₂ в качестве буфера при 37°С. Питательную среду заменяют каждые четыре дня и клетки пассируют каждые восемь дней и получают конфлюэнтные монослои (1,5×10⁶ на 10-см планшете или 10⁵ клеток на ячейку на 24-луночном планшете). Клетки РС12 изначально являются круглыми клетками, которые через несколько дней в присутствии фактоpa роста нервной ткани (NGF) процессируют в нервы. После удаления NGF нервы сокращаются и в клетках инициируется процесс апоптоза.

Индуцирование PD у крыс

Крысам Sprague-Dawley (SD) (вес 230-250 г) делают анестезию посредством внутрибрюшинного введения кетамина и ксилазина, их головы закрепляют в стереотаксической рамке. После этого вводят 60H-DA (8 мг / 4 мл) в центральный переднемозговой пучок для одностороннего разрушения дофаминэргических окончаний (Fitoussi, N. и др., Neuroscience, 85(2):405-413, 1998). Проявления болезни становятся очевидны в течение 2-3 недель.

Дофаминэргическое поражение оценивают по поведению, применяя тест с ротометром, который основан на позитивной регуляции дофаминных рецепторов на пораженной стороне. Системное введение DA-агониста (апоморфин, 0,25 мг/кг, подкожно) вызывает вращение крыс с односторонним дофаминэргическим поражением, причем вращение происходит в направлении, противоположном поврежденной стороне.

Введение в головной мозг циклических глицерофосфатов и их аналогов

Циклические глицерофосфаты вводят в головной мозг, используя осмотические насосы ALZET (ALZET Corporation, Palo Alto, CA). После оценки поражений, относящихся к эфферентной связи черного вещества с полосатым телом (поведение при вращении), имплантируют канюлю (размер 30) на 0,5 мм к центру от SN крыс, используя стереотаксическое устройство. Циклические фосфаты микроперфузируют со скоростью 1 мкл/час в течение 3 или 14 дней.

Вскрытие головного мозга и экстракция

Крыс обезглавливают и сразу удаляют их головной мозг. Затем помещают головной мозг в форме на лед, делают 0,5-мм серийные срезы и помещают на охлажденные предметные стекла микроскопа. Быстро берут кусочки ткани, используя канюлю из нержавеющей стали с внутренним диаметром 1,1 мм, согласно следующим координатам: А 1,5-2,0 мм для полосатого тела; Р 5,5-5,0 мм для SN, и включают наиболее желательные области. Образцы тканей сразу замораживают в жидком азоте и хранят при -70°С до экстракции. Экстракцию выполняют, оттаивая образцы и подвергая их ультразвуковому воздействию (80 ватт в течение 5 секунд при помощи Sonifier B-12; Branson, Danbury, CN) в 0,5 мл перхлоратного раствора (0,1М), содержащего ЭДТА/этанол (0,021%), на льду. Отбирают образец (100 мкл) для анализа белков, а остаток центрифугируют (2000×g, 10 мин, 4°С). Полученные супернатанты (экстракты тканей) фильтруют (0,45 мкм Acrodisk, Gelman; Ann. Arbor. M1) и хранят при -70°С до исследования ELISA с целью определения ILS или GDNF или ВЭЖХ-анализа с целью определения содержания 5-НТ и 5-HIAA.

Определение GDNF

Влияние циклических глицерофосфатов на выделение и производство GDNF из SVG-клеток и экстрактов ткани головного мозга определяют следующим образом. Клетки инкубируют в течение 12, 24 и 48 часов с циклическими фосфатами или без них. После центрифугирования берут супернатанты и анализируют на GDNF, используя набор ELISA (ENDOGEN, MA, USA и PROMEGA, Medison, USA, соответственно).

Выделение РНК

Общую РНК выделяют из культивированных клеток или экстрактов тканей, используя Tri Reagent™ (Boehringer Mannheim, Germany). Клетки лизируют в данном реагенте (10⁶ клеток/1 мл реагента). Замороженные кусочки тканей гомогенизируют с реагентом (50 мг ткани / 1 мл), используя тефлоновую палочку. Затем добавляют хлороформ и гомогенаты разделяют центрифугированием на три фазы. Осторожно удаляют водную фазу так, чтобы не перемешать межфазный слой или органическую фазу. Чтобы избежать загрязнения геномной ДНК, РНК осаждают из водной фазы, добавляя изопропанол, промывают этанолом и растворяют в воде, обработанной DEPC. РНК определяют спектрофотометрически при 260 нм и 280 нм и хранят до использования при -80°С.

Синтез кДНК первой нити проводят в реакционном объеме 20 мкл, содержащем 3 мкг общей РНК, 10 мМ праймера dT (Boehringer Mannheim, Germany) и 1 мМ dNTP mix (Boehringer Mannheim, Germany). После нагревания в течение 2 минут при 65°С и охлаждения обратно до 4°С начинают реакцию, добавляя 50 единиц обратной транскриптазы M-MuLV и 20 единиц ингибитора РНКазы (Boehringer Mannheim, Germany). Затем данную смесь доводят до 37°С в течение 60 минут. Полимеразную реакцию синтеза цепи (PCR) на кДНК проводят в реакционном объеме 50 мкл. кДНК первой нити (2 мкл) добавляют к PCR-смеси, содержащей следующие компоненты: 0,2 мМ dNTP mix (Boehringer Mannheim, Germany), 1 мМ каждого олигонуклеотидного праймера (праймеры обозначены согласно опубликованной последовательности кДНК GDNF 5’-TCACCAGATAAACAAATGGC-3’{5’} и 5’-TACATCCACACCTTTTAGCG-3’{3’}, соответствуя основаниям 81-101 и 460-480, соответственно) (Biosource, CA, USA) и 2,5Е Taq ДНК-полимеразы (Boehringer Mannheim). Реакционные смеси покрывают минеральным маслом и сначала денатурируют при 94°С в течение 2 минут. PCR проводят, используя прибор с циклическим температурным режимом MJ Research, запрограммированный на 40 циклов, включающих денатурацию при 94°С в течение 1 мин, затем отжиг праймера при 55°С в течение 1 мин и вставку праймера при 72°С в течение 1 мин. По завершении 40 циклов реакционную смесь хранят при 72°С в течение 10 мин. Продукт PCR анализируют посредством электрофореза на 2% агарозном геле, содержащем этидийбромид.

Иммуногистохимическое исследование выживания клеток в головном мозге

В конце эксперимента животным делают анестезию путем внутрибрюшинного введения кетамина и ксилазина и перфузируют посредством сердечной пункции PBS, а затем 4% параформальдегид. Потом удаляют головной мозг и вторично фиксируют в 4% параформальдегиде в течение 24 часов и переносят в 20% сахарозу на 48 часов. Получают срезы ткани размером 35 мкм, используя криостат и помещая их в PBS на 24-луночный планшет. Срезы инкубируют в течение ночи при 4°С с первичным поликлональным антителом кролика относительно тирозингидроксилазы (ТН) (Chemicon, CA, USA) или с первичным моноклональным антителом мыши относительно глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) (Chemicon, CA, USA). Затем срезы промывают PBS, инкубируют (1 час) с HRP-конъюгированным вторичным антителом (овцы против кролика или против мыши) (Chemicon, CA, USA) и промывают PBS. Далее срезы инкубируют с хромагенным диаминобензидином (DAB), контрастно окрашивают гематоксилином и сортируют при помощи светового микро