Способы подавления глюкагона

Способы подавления глюкагона

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящая заявка заявляет приоритет предварительной патентной заявки США 60/116380, озаглавленной "Новые препараты агонистов экзендина и способы их введения", поданной 14 января 1999 года (и соответствующей заявки РСТ, поданной 14 января 2000 года, серийного номера [пока не присвоен]), предварительной патентной заявки США 60/132017, озаглавленной "Способы подавления глюкагона", поданной 30 апреля 1999 года, и предварительной патентной заявки США 60/[номер пока не присвоен], озаглавленной "Применение экзендинов и его агонистов для модуляции уровней триглицеридов и лечения дислипидемии", поданной 10 января 2000 года: их содержание в полном объеме включено здесь для сведения в виде библиографических ссылок.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение касается способов подавления и/или снижения уровня глюкагона у субъекта, включающих введение экэендина, агониста экзендина или модифицированного экэендина или агониста экзендина, у которых пептид экзендина или агониста экзендина соединен с одним или несколькими полимерами полиэтиленгликоля или другим соединением, используемыми для снижения почечного клиренса исходного пептида. Такие способы применимы, например, для лечения гиперглюкагонемии и других состояний, при которых приносит пользу снижение уровней глюкагона или подавление секреции глюкагона.

Предпосылки

Нижеследующее описание содержит информацию, которую можно использовать для понимания настоящего изобретения. Это не является признанием того, что любая из представляемой здесь информации является прототипом для заявляемого здесь изобретения, равно как и любая из публикаций, которая непосредственно или предположительно упоминается в данном тексте, является прототипом для изобретения.

Экзендины являются пептидами, которые обнаруживаются в слюнных выделениях жилатье (гильского ядозуба) и эскорпиона (мексиканского ядозуба) - ящериц, обитающих в Аризоне и на севере Мексики. Экзендин-3 [SEQ ID NO 1: His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser-NH₂] присутствует в слюнных выделениях Heloderma horridum (эскорпион, мексиканский ядозуб), а экзендин-4 [SEQ ID NO 2: His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe lle Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser-NH₂] присутствует в слюнных выделениях Heloderma suspectum (жилатье, гильский ядозуб) (J.Eng et al., 1990, J. Biol. Chem., 265, 20259-20262; J.Eng et al., 1992, J. Biol. Chem., 267, 7402-7405). Аминокислотная последовательность экзендина-3 показана на фигуре 1. Аминокислотная последовательность экзендина-4 показана на фигуре 2. Вначале считалось, что экзендин-4 является (потенциально токсичным) компонентом яда. Сейчас представляется, что экзендин-4 не связан с токсичностью, а на самом деле образуется в слюнных железах гильского ядозуба.

Экзендины проявляют определенную степень сходства с некоторыми членами семейства глюкагоно-подобных пептидов при наибольшем уровне гомологии - 53%- с пептидом GLP-1[7-36]NH₂ [SEQ ID NO 3] (Goke et al., 1993, J. Biol. Chem., 268, 19650-19655). GLP-1[7-36]HN₂, также иногда обозначаемый как проглюкагон [78-107] или просто как "GLP-1", что наиболее часто используется в данном тексте, обладает инсулинотропным действием, стимулирующим секрецию инсулина бета-клетками поджелудочной железы; GLP-1 так же, как было сообщено, подавляет секрецию глюкагона альфа-клетками поджелудочной железы (Orsov et al., 1993, Diabetes, 42, 658-661; D'Alessio et al., 1996, J. Clin. Invest., 97, 133-138). Как сообщалось, GLP-1 подавляет опорожнение желудка (B.Willms et al., 1996, К. Clin. Endocrinol. Metab., 81 (1), 327-332; A.Wettergren et al., 1993, Dig. Dis. Sci., 38 (4), 665-673) и секрецию желудочной кислоты (B.T.Schjoldager et al., 1989, Dig. Dis. Sci., 34 (5), 703-708; D.J.O'Halloran et al., 1990, J. Endocrinol., 126 (1), 169-173; A.Wettergren et al., 1993, Dig. Dis. Sci., 38 (4), 665-673). GLP-1[7-37], который включает дополнительный остаток глицина по своему С-концу, как сообщалось, стимулирует секрецию инсулина у человека (Orskov et al., 1993, Diabetes, 42, 658-661). Трансмембранный связанный с аденилатциклазой G-белковый рецептор, считающийся ответственным по крайней мере за часть инсулинотропного действия GLP-1, был клонирован из линии бета-клеток (Thorens, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 8641-8645). GLP-1 находился в фокусе интенсивных исследований в последние годы благодаря сообщению о его действии на интенсификацию простимулированной выработки инсулина (M.M.Byrne, B.Goke, "Lessons from human studies with glucagon-like peptide-1: Potential of the gut hormone for clinical use", In: H.C.Fehmann, B.Goke, "Insulinotropic Gut Hormone Glukagon-Like Peptide 1", Basel, Switzerland, Karger, 1997, pp. 219-233).

Другие сообщения касаются подавления опорожнения желудка. Укороченный GLP-1 (проглюкагон 78-107-амид) подавляет функции желудка и поджелудочной железы у человека (A.Wettergren et al. 1993, Dig. Dis. Sci., 38 (4), 665-673), подавляет секрецию глюкагона (W.O.C.Creutzfeldt et al., 1996, "Glucagonostatic actions and reduction of fasting hyperglycemia by exogenous glucagon-like peptide 1(7-36) amide in type I diabetic patients". Diabetes Care, 19 (6), 580-586) и предположительно участвует в контроле аппетита (M.D.Turton et al., 1996, "A role for glucagon-like peptide-1 in the central regulation of feeding". Nature, 379 (6560), 69-72).

Также было сообщено, что GLP-1 восстанавливает чувствительность островков Лангерганса к глюкозе у стареющих крыс с увеличением у них переносимости глюкозы до уровней, характерных для молодых крыс (J.M.Egan et al., 1997, "Glucagon-like peptide-1 restores acute-phase insulin release to aged rats", Diabetologia, 40 (suppl. 1), A130). Однако короткая продолжительность биологического действия GLP-1 in vivo является тем свойством пептида, которое затрудняет его использование в качестве лекарственного средства. Для увеличения времени полужизни GLP-1 или GLP-1(7-37) были испробованы различные способы, включая попытки изменить их аминокислотную последовательность и доставить их с использованием различных форм препаратов (см., например, европейскую патентную заявку, озаглавленную "Пролонгированная доставка пептидов", поданную Darley et al., номер публикации 0-619322-А2, касающуюся включения полиэтиленгликоля в состав препаратов, содержащих GLP-1(7-37)).

Фармакологические исследования на материале диспергированных ацинозных клеток поджелудочной железы морской свинки и париетальных клеток желудка привели к сообщениям о том, что экзендин-4 может действовать на рецепторы GLP-1 на некоторых инсулин-секретирующих клетках; также сообщалось о том, что пептид стимулирует секрецию соматостатина и подавляет секрецию гастрина в изолированных желудках (Goke et al., 1993, J. Biol. Chem., 268, 19650-19655; Schepp et al., 1994, Eur. J. Pharmacol., 69, 183-191; Eissele et al., 1994, Life Sci., 55, 629-634). Было обнаружено, что экзендин-3 и экзендин-4 стимулируют выработку цАМФ в ацинозных клетках поджелудочной железы и секрецию ими амилазы (R.Malhotra et al., 1992, Regulatory Peptides, 41, 149-156; Raufman et al., 1992, J. Biol. Chem., 267, 21432-21437; Singh et al., 1994, Regul. Pept., 53, 47-59). Кроме того, экзендин-4 обладает существенно более продолжительным действием по сравнению с GLP-1. Например, в одном эксперименте снижение уровня глюкозы действием экзендина-4 у мышей с диабетом, как сообщалось, продолжалось в течение нескольких часов, а в зависимости от дозы вплоть до 24 часов (J.Eng, 1996, "Prolonged effect of exendin-4 on hyperglycemia of db/db mice". Diabetes, 45 (suppl. 2), 152A (abstract 554)). С учетом их инсулинотропной активности предполагалось использование экзендина-3 и экзендина-4 для лечения сахарного диабета и профилактики гипергликемии (Eng, патент США 5424286).

Результаты изучения того, являются ли экзендины гомологами GLP-1 млекопитающих, опубликованы Chen & Drucker, которые клонировали ген экзендина гильского ядозуба (J. Biol. Chem., 272 (7), 4108-4115 (1997)). Обнаружение того, что у гильского ядозуба также имеются самостоятельные гены проглюкагонов (из которых образуется GLP-1), которые в большей степени сходны с проглюкагоном млекопитающих, чем экзендин, указывает на то, что экзендины не являются единственными гомологами GLP-1 у данных видов.

К настоящему времени средства, которые служат для задержки опорожнения желудка, в целом находят свое место в медицине в качестве диагностических средств при рентгенологических исследованиях желудочно-кишечного тракта. Например, глюкагон является полипептидным гормоном, который вырабатывается альфа-клетками островков Лангерганса поджелудочной железы. Он является гипергликемическим агентом, который мобилизует глюкозу за счет активации гликогенолиза в печени. Он способен в меньшей степени стимулировать секрецию панкреатического инсулина. Глюкагон используют в лечении вызванной инсулином гипогликемии, например, тогда, когда внутривенное введение глюкозы невозможно. Однако, поскольку глюкагон ослабляет перистальтику желудочно-кишечного тракта, его также используют в качестве диагностического средства при проведении рентгенологических исследований желудочно-кишечного тракта. Также глюкагон был использован в нескольких исследованиях по лечению различных заболеваний желудочно-кишечного тракта, характеризующихся сильной болью, вызванной спазмами. Сообщалось (Daniel et al., 1974, Br. Med. J., 3, 720) о более быстром ослаблении симптомов острого дивертикулита у больных, в лечении которых использовали глюкагон, по сравнению с больными, которых лечили с помощью аналгетиков или спазмолитических средств. В обзоре (Glauser et al., 1979, J. Am. Coll. Emergency Physicians, 8, 228) описывалось ослабление острой пищевой закупорки пищевода после лечения глюкагоном. В другом исследовании глюкагон в значительной степени ослаблял боль и болезненность у 21 больного с болезнью желчного протока по сравнению с 22 больными, которым давали плацебо (M.J.Stower et al., 1982, Br. J. Surg., 69, 591-592).

Способы регуляции перистальтики желудочно-кишечного тракта с использованием агонистов амилина описаны в принадлежащей тем же заявителям международной патентной заявке № PCT/US 94/10225, опубликованной 16 марта 1995 г.

Способы регуляции перистальтики желудочно-кишечного тракта с использованием агонистов экзендина описаны в принадлежащей тем же заявителям патентной заявке США серийного №08/908867, поданной 8 августа 1997 г., озаглавленной "Способы регуляции перистальтики желудочно-кишечного тракта", причем заявка является частично продолжающей патентную заявку США серийного №08/694954, поданную 8 августа 1996 г.

Способы снижения потребления пищи с использованием агонистов экзендина описаны в принадлежащей тем же заявителям патентной заявке США серийного №09/003869, поданной 7 января 1998 г., озаглавленной "Применение экзендина и его агонистов для снижения потребления пищи", которая заявляет приоритет предварительных патентных заявок США №№60/034905, поданной 7 января 1997г., 60/055404, поданной 7 августа 1997 г., 60/065442, поданной 14 ноября 1997 г., и 60/066029, поданной 14 ноября 1997 г.

Новые соединения-агонисты экзендина описаны в принадлежащей тем же заявителям заявке РСТ серийного №PCT/US 98/16387, поданной 6 августа 1998 г., озаглавленной "Новые соединения-агонисты экзендина", которая заявляет приоритет патентной заявки США серийного №60/055404, поданной 8 августа 1997 г.

Другие новые агонисты экзендина описаны в принадлежащей тем же заявителям заявке РСТ серийного №PCT/US 98/24210, поданной 13 ноября 1998 г., озаглавленной "Новые соединения-агонисты экзендина", которая заявляет приоритет предварительной патентной заявки США №60/065442, поданной 14 ноября 1997 г.

Следующие новые агонисты экэендина описаны в принадлежащей тем же заявителям заявке РСТ серийного №PCT/US 98/24273, поданной 13 ноября 1998 г., озаглавленной "Новые соединения-агонисты экзендина", которая заявляет приоритет предварительной патентной заявки США №60/066029, поданной 14 ноября 1997 г.

Другие недавние достижения в технологии, основывающейся на использовании экзендина, описаны в предварительной патентной заявке США серийного №60/075122, поданной 13 февраля 1998 г., озаглавленной "Инотропное и мочегонное действие экзендина и GLP-1", и в предварительной патентной заявке США серийного №60/116380, поданной 14 января 1998 г., озаглавленной "Новые препараты агонистов экзендина и способы их введения".

Модифицирование терапевтических пептидов и белков полиэтиленгликолем (ПЭГ) может приводить и к преимуществам, и к недостаткам. В то время как ПЭГ-модификация может приводить к улучшению времени циркуляции, снижению антигенности и иммуногенности, улучшенной растворимости, устойчивости к протеолитическому расщеплению, повышенной биологической доступности, сниженной токсичности, улучшенной стабильности и более простому приготовлению препаратов таких пептидов (см. Francis et al., 1998, International Journal of Hematology, 68, 1-18), в большинстве случаев проблемой, сопровождающей "ПЭГирование", является существенное снижение биологической активности (цит. там же). Кроме того, в большинстве способов используют линкеры, которые характеризуются различными типами неблагоприятных побочных эффектов, включая иммуногенность, нестабильность, токсичность и реактивность (цит. там же).

Глюкагонома (опухоль клеток, секретирующих глюкагон) в дополнение к непереносимости глюкозы обусловливает специфическое состояние кожи - некролитическую мигрирующую эритему. Это проявляется в появлении слущиваемой красной сыпи, иногда образовании волдырей и, возможно, струпьев, расположенных на лице, животе, конечностях и в промежности. Также она может быть связана с воспалением языка и рта, поражении ногтей и истончении волос. Сообщалось, что данное состояние реагирует на октреотид - аналог глюкагоностатического гормона. Соединения, описанные в данном тексте, также применимы в качестве глюкагоностатических средств и, соответственно, в лечении данного заболевания, которое впервые было описано в 1966 году (L.K.Kaplan, "Endocrine Tumors of the Gastrointestinal Tract and Pancreas", Ch. 262, p.1392, In "Harrison's Principles of Internal Medicine", 12th edition, McGraw-Hill Inc., New York, 1991). Соединения, описанные здесь как применимые для снижения уровней глюкагона и/или подавления секреции глюкагона, включают экзендин, агонисты экзендина и модифицированные экзендины и агонисты экзендина, а также родственные препараты и дозированные препараты.

Содержание упоминавшихся выше статей, патентов и патентных заявок и всех других документов, упоминаемых или цитируемых в данном тексте, в полном их объеме включено здесь для сведения в виде библиографических ссылок. Заявители сохраняют право на физическое включение в данную заявку любого и в полном объеме материала и информации из любых таких статей, патентов, патентных заявок или других документов, упоминающихся или цитируемых в данном тексте.

Краткое содержание изобретения

Настоящее изобретение касается способов снижения уровней глюкагона и/или подавления секреции глюкагона у субъекта. Также оно касается лечения гиперглюкагонемии и состояний, при которых пользу приносит введение глюкагоностатических средств, включая, но тем самым не ограничиваясь, некролитическую мигрирующую эритему.

Таким образом, в одном аспекте изобретение касается применения экзендина, агониста экзендина или модифицированного экзендина или агониста экзендина, в котором экзендин или агонист экзендина соединен с одним или несколькими полимерами полиэтиленгликоля или другими молекулами, повышающими молекулярную массу, с целью снижения уровней глюкагона у субъекта.

В другом аспекте изобретение касается применения экзендина, агониста экзендина или модифицированного экзендина или агониста экзендина, в котором экзендин или агонист экзендина соединен с одним или несколькими полимерами полиэтиленгликоля или другими соединениями, применяемыми для снижения почечного клиренса исходного пептида, с целью подавления секреции глюкагона у субъекта.

Еще в одном аспекте изобретение касается применения экзендина, агониста экзендина или модифицированного экзендина или агониста экзендина, в котором экзендин или агонист экзендина соединен с одним или несколькими полимерами полиэтиленгликоля или другими молекулами, повышающими молекулярную массу, для лечения состояний, связанных с гиперглюкагонемией.

В следующем аспекте изобретение касается применения экзендина, агониста экзендина или модифицированного экзендина или агониста экзендина, в котором экзендин или агонист экзендина соединен с одним или несколькими полимерами полиэтиленгликоля или другими молекулами, повышающими молекулярную массу, для лечения субъекта с глюкагономой или некролитической мигрирующей эритемой.

В предпочтительных вариантах экзендином является экзендин-4. В других предпочтительных вариантах модифицированный экзендин или агонист экзендина имеет молекулярную массу, которая больше молекулярной массы экзендина или агониста экзендина (предпочтительно больше на 10%, 50% или 90%), модифицированный экзендин или агонист экзендина имеет отрицательный заряд, который больше отрицательного заряда экзендина или агониста экзендина (предпочтительно больше на 10%, 50% или 90%), модифицированный экзендин или агонист экзендина характеризуется меньшим почечным клиренсом по сравнению с почечным клиренсом экзендина или агониста экзендина (предпочтительно меньше на 10%, 50% или 90%), время полужизни модифицированного экзендина или агониста экзендина больше времени полужизни экзендина или агониста экзендина (предпочтительно больше на 10%, 50% или 90%), иммуногенность/антигенность модифицированного экзендина или агониста экзендина меньше, чем иммуногенность/антигенность экзендина или агониста экзендина, растворимость модифицированного экзендина или агониста экзендина больше растворимости экзендина или агониста экзендина (предпочтительно больше на 10%, 50% или 90%), скорость протеолитического расщепления модифицированного экзендина или агониста экзендина меньше скорости протеолиза экзендина или агониста экзендина (предпочтительно меньше на 10%, 50% или 90%), токсичность модифицированного экзендина или агониста экзендина меньше токсичности экзендина или агониста экзендина, стабильность модифицированного экзендина или агониста экзендина выше стабильности экзендина или агониста экзендина и проницаемость/биологическая функциональность модифицированного экзендина или агониста экэендина больше или меньше, чем проницаемость/биологическая функциональность экзендина или агониста экзендина (предпочтительно больше или меньше на 10%, 50% или 90%).

Экзендин или агонист экзендина может быть соединен с одним, двумя или тремя полимерами полиэтиленгликоля. Полимеры полиэтиленгликоля предпочтительно могут иметь молекулярную массу в диапазоне 500-20000. В предпочтительном варианте модифицированным экзендином или агонистом экзендина является одно из соединений 201-217, более предпочтительно одно из соединений 209, 210 и 213 или одно из соединений 201 и 202, или одно из соединений 216 и 217 (см. пример 4 ниже).

Полимеры полиэтиленгликоля предпочтительно присоединяют к аминогруппе, карбоксильной группе или тиогруппе и могут быть присоединены по N- или С-концу к боковым цепям лизина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты или цистеина, или, как альтернатива, полимеры полиэтиленгликоля могут быть присоединены с помощью диаминовых и дикарбоксильных групп. Предпочтительно экзендин или агонист экзендина соединяют с полимерами полиэтиленгликоля через -аминогруппу аминокислоты лизина в составе экзендина или агониста экзендина.

Под "агонистом экзендина" понимается соединение, которое имитирует действие экзендинов, например, на перистальтику кишечника и опорожнение желудка (а именно соединение, которое эффективно связывается с рецептором, в отношении которого проявляют свою активность собственно экзендины, влияя на перистальтику кишечника и опорожнение желудка, предпочтительно производное или аналог экзендина) или соединение, которое, например, имитирует действие экзендина по снижению потребления пищи за счет связывания с рецептором или рецепторами, через которые экзендин опосредует свое действие. Предпочтительными соединениями-агонистами экзендина являются те соединения, которые описаны в патентной заявке США серийного №90/003869, озаглавленной "Применение экзендина и его агонистов для снижения потребления пищи", поданной 7 января 1998 г. (и в приоритетных для нее заявках), права собственности, на которую принадлежат заявителям настоящей заявки и которая включена в настоящую заявку в полном объеме в качестве библиографической ссылки. Эффекты экзендинов и агонистов экзендинов могут быть выявлены, оценены или подвергнуты скринингу с использованием описанных здесь способов или других способов, известных в данной области техники в связи с установлением эффектов экзендина.

В другом аспекте терапевтически эффективное количество агониста амилина также вводят субъекту. В предпочтительном аспекте агонистом амилина является аналог амилина или аналог агониста амилина, такой как ^25,28,29проамилин человека (также известный как "прамлинтид", а ранее обозначавшийся как "АС-137" и описанный в патенте США №5686511 "Пептиды-агонисты амилина и их использование", выданном 11 ноября 1997 г.) или кальцитонин лосося.

Предпочтительно субъектом является позвоночное животное, более предпочтительно - млекопитающее и наиболее предпочтительно - человек. В предпочтительных аспектах экзендин, агонист экзендина или модифицированный экзендин или агонист экзендина по настоящему изобретению вводят парентерально, более предпочтительно - с помощью инъекции. В наиболее предпочтительном аспекте инъекцией является периферическая инъекция. Предпочтительно в день вводят от примерно 1-30 мкг до примерно 5 мг модифицированного экзендина или агониста экзендина по настоящему изобретению. Более предпочтительно в день вводят от примерно 1-30 мкг до примерно 2 мг или от примерно 1-30 мкг до примерно 1 мг модифицированного экзендина или агониста экзендина по настоящему изобретению. Наиболее предпочтительно в день вводят от примерно 3 мкг до примерно 500 мкг модифицированного экзендина или агониста экзендина по настоящему изобретению.

Предпочтительными экзендинами или агонистами экзендина для модифицирования и использования являются:

экзендин-4 (1-30) [SEQ ID NO 4: His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly];

экзендин-4 (1-30)-амид [SEQ ID NO 5: His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe He Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly-NH₂];

экзендин-4 (1-28)-амид [SEQ ID NO 6: His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn-NH₂];

¹⁴Leu,²⁵Phe-экзендин-4-амид [SEQ ID NO 7: His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Leu Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe lle Glu Phe Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser-NH₂];

¹⁴Leu,²⁵Phe-экзендин-4-(l-28)-амид, [SEQ ID NO 8: His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Leu Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe lle Glu Phe Leu Lys Asn-NH₂]; и

¹⁴Leu, ²²Ala, ²⁵Phe-экзендин-4-(1-28)-амид [SEQ ID NO 9: His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Leu Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Ala Ile Glu Phe Leu Lys Asn-NH₂].

Определения

В соответствии с настоящим изобретением и по использованию в данном тексте следующие термины определяются как имеющие далее указанные значения, если это специально не оговаривается дополнительно.

Термин "аминокислота" обозначает природные аминокислоты, ненативные аминокислоты и аналоги аминокислот и все их D- и L-стереоизомеры, если их структура позволяет существовать таким стереоизомерным формам. Природными аминокислотами являются аланин (Ala), аргинин (Arg), аспарагин (Asn), аспарагиновая кислота (Asp), цистеин (Cys), глутамин (Gln), глутаминовая кислота (Glu), глицин (Gly), гистидин (His), изолейцин (Ile), лейцин (Leu), лизин (Lys), метионин (Met), фенилаланин (Phe), пролин (Pro), серин (Ser), треонин (Thr), триптофан (Trp), тирозин (Tyr) и валин (Val). Ненативными аминокислотами являются, тем самым не ограничиваясь, азетидинкарбоновая кислота, 2-аминоадипиновая кислота, 3-аминоадипиновая кислота, -аланин, аминопропионовая кислота, 2-аминомасляная кислота, 4-аминомасляная кислота, 6-аминокапроновая кислота, 2-аминогептановая кислота, 2-аминоизомасляная кислота, 3-аминоизомасляная кислота, 2-аминопимелиновая кислота, трет-бутилглицин, 2,4-диаминоизомасляная кислота, десмозин, 2,2'-диаминопимелиновая кислота, 2,3-диаминопропионовая кислота, N-этилглицин, N-этиласпарагин, гомопролин, гидроксилизин, аллогидроксилизин, 3-гидроксипролин, 4-гидроксипролин, изодесмозин, аллоизолейцин, N-метилаланин, N-метилглицин, N-метилизолейцин, N-метилпентилглицин, N-метилвалин, нафтилаланин, норвалин, норлейцин, орнитин, пентилглицин, пипеколиновая кислота и тиопролин. Аналогами аминокислот являются природные и ненативные аминокислоты, которые химически, обратимо или необратимо, заблокированы или модифицированы по их N-концевой аминогруппе или по группам их боковых цепей, как, например, метионинсульфоксид, метионинсульфон, S-(карбоксиметил)-цистеин, S-(карбоксиметил)-цистеинсульфоксид и S-(карбоксиметил) -цистеинсульфон.

Термин "аналог аминокислоты" обозначает аминокислоту, у которой С-концевая карбоксильная группа, N-концевая аминогруппа или функциональная группа боковой цепи была химическим путем модифицирована в другую функциональную группу. Например, -метиловый сложный эфир аспарагиновой кислоты является аминокислотным аналогом аспарагиновой кислоты; N-этилглицин является аналогом аминокислоты глицина или аланинкарбоксамид является аналогом аминокислоты аланина.

Термин "аминокислотный остаток" обозначает радикалы, имеющие структуру: (1)-С(O)-R-NH-, где R обычно представляет -CH(R^')-, где R' является боковой цепью аминокислоты, обычно Н или содержащим углерод заместителем; или (2)

где р равно 1, 2 или 3, что представляет остатки азетидинкарбоновой кислоты, пролина или пипеколиновой кислоты соответственно.

Термин "низший", используемый в данном тексте в отношении органических радикалов, таких как алкильные группы, определяет такие группы, которые включают до и включительно 6 атомов углерода, предпочтительно до и включительно 4 и преимущественно 1 или два атома углерода. Такими группами могут быть прямая цепь или разветвленная цепь.

"Фармацевтически приемлемая соль" охватывает соли соединений по настоящему изобретению, производные от сочетания таких соединений с органической или неорганической кислотой. На практике использование солевой формы равнозначно использованию формы основания. Соединения по настоящему изобретению применимы и в форме основания, и в форме соли, при том что обе такие формы рассматриваются как входящие в объем настоящего изобретения.

Кроме того, указанные сокращения обозначают следующее:

"ACN" или "CH₃CN" обозначает ацетонитрил.

"Boc", "tBoc" или "Tboc" обозначает трет-бутоксикарбонил.

"DCC" обозначает N,N'-дициклогексилкарбодиимид.

"Fmoc" обозначает флуоренилметоксикарбонил.

"HBTU" обозначает 2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилуронийгексафторфосфат.

"HOBt" обозначает 1-гидроксибензотриазолмоногидрат.

"homoP" или "hPro" обозначает гомопролин.

"MeAla" или "Nme" обозначает N-метилаланин.

"naph" обозначает нафтилаланин.

"pG" или "pGly" обозначает пентилглицин.

"tBuG" обозначает трет-бутилглицин.

"ThioP" или "tPro" обозначает тиопролин.

"3Нур" обозначает 3-гидроксипролин.

"4Нур" обозначает 4-гидроксипролин.

"NAG" обозначает N-алкилглицин.

"NAPG" обозначает N-алкилпентилглицин.

"Norval" обозначает норвалин.

"Norleu" обозначает норлейцин.

Другие свойства и преимущества изобретения будут ясны из нижеследующего описания его предпочтительных вариантов, а также из формулы изобретения.

Краткое описание чертежей

На фигуре 1 приведена аминокислотная последовательность экзендина-3 [SEQ ID NO 1].

На фигуре 2 приведена аминокислотная последовательность экзендина-4 [SEQ ID NO 2].

На фигуре 3 приведены аминокислотные последовательности некоторых соединений-агонистов экзендина, применимых в настоящем изобретении [SEQ ID NO 10-40].

На фигуре 4 приведены аминокислотные последовательности некоторых соединений по настоящему изобретению - соединения 1-174.

На фигуре 5 изображен график, показывающий влияние функциональной нефрэктомии на клиренс экзендина-4.

На фигуре 6 приведен график, отображающий конечный распад плазматических уровней экзендина-4 у нефрэктомизованных и симуляционных субъектов.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение касается способов подавления и/или снижения уровня глюкагона у субъекта, включающих введение экзендина, агониста экзендина или модифицированного экзендина или агониста экзендина, в которых пептид экзендина или агониста экзендина соединен с одним или несколькими полимерами полиэтиленгликоля или другими соединениями, используемыми для повышения молекулярной массы. Такие способы применимы, например, для лечения гиперглюкагонемии и других состояний, при которых пользу принесет снижение уровней глюкагона или подавление секреции глюкагона. Такими состояниями являются, тем самым не ограничиваясь, глюкагонома и некролитическая мигрирующая эритема.

Модифицированные экзендины и агонисты экзендинов

Модифицированные экзендины и агонисты экзендинов по настоящему изобретению включают, например, один или большее число ПЭГ-полимеров, присоединенных к экзендину или агонисту экзендина, такому как встречающийся в естественных условиях экзендин, синтетический экзендин или агонист экзендина.

Экзендин-4

Экзендин-4 является встречающимся в естественных условиях пептидом, выделенным из слюнных выделений гильского ядозуба. Анализ влияния экзендина-4 на животных показал, что его способность снижать уровень глюкозы в крови сохраняется в течение нескольких часов. Экзендин-4, являющийся полипептидом, состоящим из 39 аминокислот, синтезирован с использованием твердофазного синтеза в соответствии с описанным здесь и, как было показано, такой синтетический материал идентичен нативному экзендину-4.

Как описано в данном тексте, была изучена неклиническая фармакология экзендина-4. В головном мозге экзендин-4 направленно связывается в областях area postrema и nucleus tractus solitarius заднего мозга и подсводовой области переднего мозга. Связывание экзендина-4 было выявлено в головном мозге и почках крыс и мышей. Структуры, с которыми экзендин-4 связывается в почках, не установлены.

В различных экспериментах проводили сравнение биологической активности экзендина-4 и GLP-1, и они показывают наличие более предпочтительного спектра свойств у экзендина-4. Однократное подкожное введение экзендина-4 снижало уровень глюкозы в плазме у мышей db/db (с диабетом) и ob/ob (с диабетом и ожирением) на 40%. У крыс с диабетом и ожирением Diabetic Fatty Zucker (ZDF) введение в течение 5 недель экзендина-4 приводило к снижению уровня HbA_1c (мера гликозилированного гемоглобина, использованная для оценки уровней плазматической глюкозы) на 41%. Восприимчивость к инсулину также улучшалась на 76% после 5-недельного лечения крыс ZDF с ожирением. У приматов с непереносимостью глюкозы также было выявлено зависимое от дозы снижение уровня глюкозы в плазме.

Инсулинотропное действие экзендина-4 также было выявлено у грызунов с улучшением инсулинового ответа на глюкозу более чем на 100% у неголодающих крыс линии Harlan Sprague Dawley (HSD) и вплоть до примерно 10 раз у неголодающих мышей db/db. Более высокие уровни глюкозы до обработки были связаны с более выраженными эффектами по снижению уровня глюкозы. Таким образом, выявленный эффект по снижению уровня глюкозы у экзендина-4, по-видимому, является зависимым от глюкозы и минимально выражен, если животное уже характеризуется эугликемией.

Экзендин-4 в дозозависимом режиме замедлял опорожнение желудка у крыс HSD и был примерно в 90 раз более сильным по такому действию по сравнению с GLP-1. Также было показано, что экзендин-4 снижает потребление пищи у мышей линии NIH/Sw (Swiss) после периферического введения и оказывается по крайней мере в 1000 раз более сильным в этом отношении, чем GLP-1. Экзендин-4 снижал концентрации плазматического глюкагона приблизительно на 40% у крыс ZDF под наркозом при состоянии гиперинсулиновой/гипергликемической фиксации, но не влиял на концентрации плазматического глюкагона при эугликемическом состоянии у нормальных крыс. Как было показано, экзендин-4 в дозозависимом режиме снижает массу тела у крыс ZDF с ожирением, в то время как у крыс ZDF без ожирения выявленное снижение массы тела, по-видимому, носит временный характер.

Принимая во внимание эффекты по снижению уровня глюкагона и подавлению секреции глюкагона, экзендины, агонисты экзендинов и модифицированные экзендины или агонисты экзендинов на основе экзендина-4 найдут применение, например, для людей, для которых будет полезным снижение уровня глюкагона, например больных с глюкагономой и некролитической мигрирующей эритемой, а также больных с диабетом, независимо от того, сохранилась у них или не сохранилась способность секретировать инсулин: см. пример 5.

Токсикология экзендина-4 была исследована при однократном введении мышам, крысам и обезьянам, при повторных введениях (вплоть до 28 последовательных суточных доз) крысам и обезьянам и в тестах in vitro на мутагенность и хромосомные аберрации. К настоящему времени не было выявлено случаев гибели и не было обнаружено связанных с введением изменений в гематологии, клинической химии и крупных или микроскопических изменений в тканях. Было показано, что экзендин-4 не является мутагеном и не индуцирует хромосомные аберрации при исследованных концентрациях (вплоть до 5000 мкг/мл).

Для поддержки исследований неклинической фармакокинетики и метаболизма экзендина-4 был разработан ряд иммунологических тестов. Радиоиммунологический тест с ограниченной чувствительностью (примерно 100 пкМ) использовали в исходных фармакокинетических исследованиях. После этого двухсайтовый тест IRMA для экзендина-4 был отработан с меньшим пределом количественного выявления - 15 пкМ. По данным радиоиммуннологического анализа биологическая доступность вводимого подкожно экзендина-4 была определена на уровне приблизительно 50-80%. Это сходно с тем, что было установлено при внутрибрюшинном введении (48-60%). Пиковые концентрации в плазме (С_max) наблюдались между 30-й и 43-й минутами (Т_max). Величины и С_max, и AUC прямо зависели от дозы. Наблюдаемое конечное время полужизни для вводимого подкожно экзендина-4 составило примерно 90-110 минут. Это существенно больше, чем те 14-41 минуты, которые выявляются после внутривенного введения. Сходные результаты были получены с применением теста IRMA. Анализ разрушения экзендина-4 по сравнению с GLP-1 показывает, что экзендин-4 относительно устойчив к разрушению.

Агонисты экзендина

Взаимосвязь структуры и активности (SAR-анализ) экзендина изучали в связи со структурами, которые могут быть связаны с антидиабетической активностью экзендина, с его устойчивостью к метаболическим процессам и с улучшением его физических параметров, особенно в связи с пептидной стабильностью и доступностью для альтернативных систем доставки, в результате чего были изобретены различные соединения пептидов-агонистов экзендина. Агонисты экзендина включают пептидные аналоги экзендина, в составе которых одна или большее число нативных аминокислот удалены или заменены на другую(ие) аминокислоту(ы). Предпочтительными агонистами экзендина являются аналоги агонистов экзендина-4. Конкретно предпочтительными агонистами экзендина являются те, которые описаны в принадлежащей тем же заявителям заявке РСТ серийного PCT/US 98/16387, поданной 6 августа 1998 г., озаглавленной "Новые соединения-агонисты экзендина", которая заявляет приоритет патентной заявки США серийного №60/055404, поданной 8 августа 1997 г.; принадлежащей тем же заявителям заявки РСТ серийного №PCT/US 98/24210, поданной 13 ноября 1998 г., озаглавленной "Новые соединения-агонисты экзендина", которая заявляет приоритет предварительной патентной заявки США №60/065442, поданной 14 ноября 1997 г.; и принадлежащей тем же заявителям заявке РСТ серийного №PCT/US 98/24273, поданной 13 ноября 1998 г., озаглавленной "Новые соединения-агонисты экзендина", которая заявляет приоритет предварительной патентной заявки США №60/066029, поданной 14 ноября 1997 г., все они в полном своем объеме, включая любые чертежи, включены здесь для сведения в виде библиографических ссылок.

Активность агонистов экзендина может быть определена, например, по активности в тестах, описанных здесь далее. Влияние экзендинов или агонистов экзендина на перистальтику желудка и опорожнение желудка может быть выявлено, оценено или подвергнуто скринингу с использованием способов, описанных в данной заявке, или других известных в данной области техники или эквивалентных способов определения перистальтики желудка. Негативно-рецепторные тесты или системы скрининга для соединений-агонистов экзендина или предполагаемых соединений-агонистов экзендина, такие как скрининг-тест с рецептором амилина с использованием препарата рецептора амилина в соответствии с описанным в патенте США №5264372, выданном 23 ноября 1993 г., содержание которого включено здесь для сведения в виде библиографической ссылки, скрининг-тесты с одним или несколькими рецепторами кальцитонина с использование