Быстрый способ для свч-опосредованного иммуносорбентного твердофазного анализа

Быстрый способ для свч-опосредованного иммуносорбентного твердофазного анализа

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к быстрому способу для осуществления СВЧ-опосредованного ELISA (MELISA). Более конкретно настоящее изобретение относится к быстрому и эффективному способу для СВЧ-опосредованного ELISA (MELISA), где все главные этапы ELISA могут быть осуществлены под воздействием микроволнового излучения через короткий период времени. Этот способ предназначен для использования в клинической диагностике, молекулярной биологии, сельском хозяйстве, пищевой промышленности, защиты в окружающей среды и тому подобное.

Способ ELISA согласно настоящему изобретению является простым, сберегающим время и исключает требующую большого времени трудоемкую процедуру. Этот способ имеет потенциальную возможность для автоматизации.

Этот способ имеет преимущество перед существующими способами для ELISA, которые требуют большого времени, как правило, находящегося в пределах от нескольких часов до 2 дней, в то время как способ согласно настоящему изобретению занимает менее чем 10 минут. Он является предпочтительным для использования при диагностике заболеваний, где требуются быстрые результаты.

Уровень техники

Иммуносорбентный твердофазный анализ (ELISA) представляет собой очень чувствительный способ, используемый для полуколичественного или количественного определения концентрации определенных антигенов и антител. Анализ (ELISA) стал полезным инструментом при диагностике заболеваний как у животных, так и у растений. Кроме этого, его другие применения включают в себя скрининг моноклональных антител в ходе их продуцирования (Douillard, J.Y. and Hoffman, T., 1983), детектирование остатков пестицидов в урожае зерновых (Van Emon, J.M. and Lopez-Avila, V., 1992) и в образцах, взятых из окружающей среды, подобных почве и воде (Linde, D.G. and Goh, K.S., 1995), детектирование апоптоза в культуре тканей и тому подобное (Salgame, P. et al, 1996). Для осуществления ELISA повсеместно используется полистироловый планшет для микротитрования, поскольку он является прозрачным, дешевым, легко доступным, может быть сформован в любой желаемой форме и обладает свойством связывания белков путем адсорбции. Обычные способы ELISA основываются на иммобилизации антигена или антитела на поверхности лунок полистиролового планшета для микротитрования путем адсорбции. Это приписывается нековалентному взаимодействию между биологической молекулой и полистирольной поверхностью.

Однако адсорбция обычно представляет собой слишком неэффективный процесс для получения хороших выходов и не всегда осуществляется в зависимости от дозы. Для преодоления неэффективности обычных способов многими осуществляется ковалентная иммобилизация биологических молекул на планшете для микротитрования (Satoh, A. et al, 1999). Также сообщалось о ковалентном связывании иммуногенов на привитых пластиковых поверхностях (Larsson, P.M. et al, 1987). Несмотря на это, обычный способ ELISA требует для завершения очень длительного периода времени, изменяющегося от нескольких часов до 2 дней. Это является главным недостатком различных способов ELISA, основанных либо на адсорбции, либо на ковалентном связывании. В случае необходимости оказания срочной медицинской помощи, теряется ценное время при осуществлении диагностики перед введением пациенту лекарственных средств. В сельском хозяйстве ELISA используется для детектирования остатков пестицидов в собранном урожае и в образцах, взятых из окружающей среды. Экспорт и маркетинг собранного урожая могут замедляться вследствие этой задержки при использовании способа ELISA, что приводит к потере валютных средств.

Авторы разработали новый и уникальный способ, при котором ELISA может осуществляться быстро, с помощью использования микроволнового (СВЧ) излучения. Микроволновое излучение известно как ускоряющее иммуногистохимию в течение примерно десятка лет (Boon. M.E and Kok, L.P., 1992; Boon, M.E. et al, 1989; Boon, M.E. et al, PCT заявка на патент WO 89703038; Chiu, K.Y. and Chan, K.W., 1987; Hjerpe, A. et al, 1988).

О ковалентной иммобилизации антигена или антитела на полистирольной поверхности под воздействием микроволнового излучения до сих пор не сообщалось. И в самом деле, осуществление всех главных этапов способа ELISA под воздействием микроволнового излучения, за короткое время, для детектирования малых количеств антигена или антитела, с помощью измерения оптической плотности не были известны из уровня техники.

Однако известны попытки осуществления одного из этапов ELISA под воздействием микроволнового излучения (Hjerpe, A. et al, 1988), где полистироловые планшеты для ELISA сначала покрывают антиканцероэмбрионным антигеном кролика, путем инкубирования в течение ночи, при температуре 4°C, с последующим инкубированием антигена (CEA). На следующем этапе, то есть после добавления связанных с ферментом антител, авторы изучали воздействие микроволнового излучения на реакции антиген-антитело.

В другом эксперименте тех же авторов планшеты для ELISA сначала покрывались сывороткой нормальных мышей, путем инкубирования в течение ночи, при температуре 4°C, с последующим инкубированием в течение ночи вместе с немеченным Ig кролика антимышь. на следующем этапе они добавляли комплексы PAP (пероксидаза-антипероксидаза) мыши и определяли воздействие микроволнового излучения на временные константы реакций на этом последнем этапе.

В третьем эксперименте Hjerpe, A. et.al сначала покрывали планшеты неспецифичной сывороткой мышей, с последующим инкубированием вместе с биотинилированным IgG лошади антимышь. Затем планшеты использовались для исследования воздействия микроволнового излучения при последующем связывании биотинавидиновых комплексов.

Во всех указанных выше экспериментах выходы реакций были меньшими у образцов, подвергавшихся воздействию микроволнового излучения, при сравнении с теми, которые обрабатывались без стимуляции с помощью микроволнового излучения. Эксперименты продемонстрировали, что микроволновое излучение вызывает главные потери реакционной способности, и общие выходы составляли приблизительно от 10 до 15%, если сравнивать с теми, которые обычно получались без использования микроволновой печи. Согласно авторам при микроволновой методике уменьшение значений может быть вызвано слишком высокими температурами в лунках, несмотря на тот факт, что в качестве меры компенсации использовались загрузка воды (пробирка с водой, чтобы поглощать избыток СВЧ-энергий) и охлаждаемый нижний планшет.

В дальнейшем эксперименте ELISA авторы (Koh и Boon, 1992) использовали оптоволоконный термометр для ограничения температуры в пределах ниже 40°C. Здесь также использовалась загрузка воды, составляющая 200 мл водопроводной воды. Наряду с этим жидкость в лунках перемешивалась путем медленной продувки воздуха через раствор с помощью тонких пластиковых наконечников, которые были вставлены в лунки. В эксперименте авторов осуществляются только два этапа, а именно этап связывания антитела и конъюгата под воздействием микроволнового излучения, в течение 6 минут, при 150 ватт, каждая.

В другом эксперименте этапы связывания антитела, антигена и конъюгата осуществляются за 15, 30 и 30 минут, соответственно, используя 45-50% микроволновой мощности на каждом этапе.

Оставшиеся этапы в обоих экспериментах осуществляются с помощью обычной процедуры.

Но в указанных выше экспериментах значения ELISA, как обнаружено, являются гораздо меньшими, чем при традиционном способе.

Согласно авторам более длительное время экспонирования дает более высокое значение экстинкции (показатель ELISA), но преимущество во времени выглядит непривлекательно. В действительности, такое преимущество отсутствует при использовании времени экспонирования 30 минут или более. Слишком короткие периоды времена экспонирования приводят к значениям экстинкции, которые являются скорее низкими и не могут быть использованы.

Способы ELISA с экспонированием для микроволнового излучения, о которых сообщалось, имеют несколько недостатков, таких как (1) результаты (значения ELISA) являются гораздо меньшими, чем при обычной процедуре, (2) преимущество по времени не является привлекательным. Может быть возможным получение сравнимых результатов (значений ELISA) путем осуществления ELISA вне микроволновой печи за то же самое время, (3) процедура требует загрузки воды, (4) требуется система охлаждения или охлаждаемый нижний планшет, (5) требуется система перемешивания в лунках планшета для микротитрования, (6) не все этапы осуществляются с помощью энергии микроволнового излучения, и процедура ELISA, о которой сообщается, имеет очень низкий потенциал для автоматизации, если вообще имеет какой-либо.

Авторы настоящего изобретения устраняют все указанные выше недостатки. На самом деле, подобно тепловой энергии, микроволновое излучение также может активировать или инактивировать биологическую молекулу. При отсутствии соответствующих условий микроволновое излучение может вызвать частичное или полное разрушение биологической молекулы, приводя к низкому или нежелательному значению ELISA. В способе согласно настоящему изобретению используются соответствующие условия, большинство из которых представляет собой противоположность способу, известному из уровня техники, или неизвестно в данной области. В способе согласно настоящему изобретению все этапы, исключая проявление окраски, осуществляются при стимуляции под воздействием микроволнового излучения. Этап блокирования не осуществлялся под воздействием микроволнового излучения в известном из уровня технике способе, поскольку он дает неспецифическое связывание, в то время как авторы изобрели способ, где этап блокирования осуществляется в течение короткого времени под воздействием микроволнового излучения. Более длительное время экспонирования для микроволнового излучения в способе, известном из уровня техники, приводит к более высокому значению ELISA, в то время как при осуществлении способа согласно настоящему изобретению он приводит к разрушению материала или к неспецифическому связыванию. Это может происходить из-за того, что загрузка воды или система охлаждения, используемая в способе, известном из литературы, поглощает большую часть энергии микроволнового излучения, давая минимальное воздействие микроволнового излучения и значительное воздействие времени, в обычном способе. В противоположность этому способ согласно настоящему изобретению не требует никакой загрузки воды, системы охлаждения или системы перемешивания. Более того, в способе согласно настоящему изобретению для ELISA требуется время, примерно в 200 раз меньшее (исключая этап проявления окраски) чем для традиционного способа (который занимает примерно 18 часов), со сравнимым или даже лучшим показателем ELISA. Кроме того, он также обладает хорошим потенциалом для автоматизации.

Известный из уровня техники ELISA осуществляется на планшете для микротитрования, который не связывает биологическую молекулу с помощью ковалентной связи. На самом деле, известно, что микроволновое излучение может легко воздействовать на целостность нековалентного вторичного связывания, такого как водородные связи, гидрофобные связи и ван-дер-Ваальсово взаимодействие.

Цели изобретения

Главной целью настоящего изобретения является создание быстрого и эффективного способа для иммуносорбентного твердофазного анализа, для спектрофотометрического детектирования малых количеств антигена или антитела с целью быстрой диагностики заболеваний.

Другой целью настоящего изобретения является создание способа, который является простым, воспроизводимым и не требует дополнительного опыта или дорогостоящего оборудования.

Другой целью настоящего изобретения является создание быстрой реализации способа, который имеет потенциал для автоматизации и который может свести к минимуму ошибку оператора, которая обычно изменяется от одного человека к другому.

Краткое описание изобретения

Имея в виду достижение целей и преодоление недостатков известного способа ELISA, предусматривается быстрый и эффективный способ для СВЧ-опосредованного ELISA (MELISA), который включает в себя этапы: (i) ковалентную иммобилизацию антигена или антитела на активированной твердой поверхности с помощью воздействия микроволнового излучения, (ii) блокировки свободной поверхности с помощью блокирующего агента путем краткого воздействия микроволнового излучения, (iii) связывания антитела или антигена с помощью контролируемого воздействия микроволнового излучения, (iv) связывания конъюгата с помощью контролируемого воздействия микроволнового излучения, (v) добавления красителя и субстрата в лунки и (vi) измерения значения коэффициента поглощения.

Процедура СВЧ-опосредованного ELISA (MELISA) осуществляется на активированной поверхности за очень короткое время (около 10 минут) и с такой же эффективностью, как и у обычного ELISA, производимого при 37°C, за 16-18 час.

Настоящее изобретение обеспечивает возможность автоматизации или полуавтоматизации способа ELISA.

Микроволновое излучение является известным как воздействующее на целостность нековалентного вторичного связывания, такого как водородные связи, гидрофобные взаимодействия и ван-дер-Ваальсово взаимодействие.

Для преодоления этой проблемы авторы активируют поверхность лунок планшетов для микротитрования перед использованием. Активированная поверхность иммобилизирует антиген с помощью ковалентной связи при кратком экспонировании для микроволнового излучения. Этот ковалентно иммобилизованный антиген является достаточно стабильным для того, чтобы выдерживать повторяющиеся, но краткие периоды экспонирования для микроволнового излучения, которые являются необходимыми для осуществления последующих этапов ELISA. Последующие этапы связывания биологической молекулы в процедуре ELISA осуществляются с помощью нековалентного связывания, которое является восприимчивым к энергии микроволнового излучения. Эти проблемы преодолеваются путем контроля времени и энергии микроволнового излучения, подводимого на каждом этапе.

Новизна настоящего изобретения заключается в том, что ELISA осуществляется на активированной поверхности, способной к формированию ковалентной связи с белковым лигандом.

СВЧ-опосредованная ковалентная иммобилизация биологической молекулы, более предпочтительно антигена или антитела, на активированной поверхности представляет собой другой новый существенный признак настоящего изобретения.

Контролируемое воздействие микроволнового излучения на каждом этапе процедуры ELISA представляет собой другой новый подход.

В способе согласно настоящему изобретению все этапы ELISA, такие как связывание антигена, блокировка, связывание антитела и конъюгата, осуществляются под воздействием микроволнового излучения, и только взаимодействие фермент-субстрат осуществляется вне микроволновой печи при комнатной температуре. Способ ELISA согласно настоящему изобретению является очень быстрой, со сравнимым или даже лучшим показателем ELISA, чем у традиционного способа.

Другим новым отличительным признаком настоящего изобретения является то, что способ ELISA согласно настоящему изобретению не требует никакой загрузки воды или системы перемешивания.

Другим новым отличительным признаком настоящего изобретения является то, что способ ELISA согласно настоящему изобретению может быть полностью или частично автоматизирован с использованием специально сконструированного устройства.

Другим новым отличительным признаком настоящего изобретения является то, что способ согласно настоящему изобретению может быть использован в других иммунологических анализах, таких как радиоиммуннологический анализ, радиологический иммуносорбентный анализ, радиологический аллергосорбентный анализ, иммунологический анализ с помощью биотин-авидина/стрептавидина, имммуноблоттинг, иммуноокрашивание и тому подобное, наряду с различными типами ELISA, такими как непосредственный ELISA, опосредованный ELISA, сэндвич-ELISA и тому подобное.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение предусматривает новый подход к методике иммуносорбентного твердофазного анализа на активированном планшете для микротитрования, модуле или лунке, путем экспонирования для микроволнового излучения. Активированная поверхность иммобилизует антиген путем ковалентного связывания под воздействием микроволнового излучения. Этот ковалентно иммобилизованный антиген является достаточно стабильным для того, чтобы выдержать повторяющееся, но краткое экспонирование для микроволнового излучения, которое необходимо для осуществления следующих далее этапов ELISA. ELISA представляет собой многоэтапный и деликатный процесс, где несоответствующие условия на любом этапе могут повредить результатам в целом.

В способе согласно настоящему изобретению инертная твердая поверхность, такая как полистирол, активируется с помощью фотохимической реакции в сухом состоянии, с использованием фотоактивируемого соединения. Активирование твердой подложки осуществляется путем экспонирования подложки, покрытой фотоактивируемым соединением, для УФ-излучения или яркого солнечного света. Эта активированная подложка используется для СВЧ-опосредованного ELISA (MELISA) и для контроля ELISA с целью детектирования антител, например, E.histolytica и Aspergillus fumigatus. При использовании необработанной подложки на ней не удается связать биологические молекулы под воздействием микроволнового излучения за такое короткое время.

Воздействие микроволнового излучения осуществляется внутри бытовой микроволновой печи (BPL-Sanyo, India), работающей на частоте примерно 2450 МГц.

Амёбный антиген получают из культуры E.histolytica согласно опубликованному способу (Sawhney, S., et al, 1980; Sharma, G.L. et al, 1984). Концентрация белков антигенов составляет 1,54 мг на мл, как определяется согласно способу Lowry et.al. (Lowry, O.H., et al, 1951). Антиген разбавляют перед осуществлением ELISA, и для нанесения на лунки используется концентрация 1,0 мкг на лунку.

Фосфатный солевой буфер (PBS), pH 7,2, 0,01 M используется в качестве буфера для покрытия.

Фосфатный солевой буфер (PBS), pH 7,2, 0,01 M, вместе с 0,1% Tween 20, используется в качестве буфера для промывки.

Блокирующий раствор изготавливается путем растворения 2% BSA в 0,01 M PBS, pH 7,2.

Раствор субстрата приготавливают с помощью добавления 0,067% o-фенилендиамина и 0,043% H₂O₂ в 0,1 M фосфатцитратный буфер, pH 4,5.

Гипериммунные сыворотки для E.histolytica выращивают в кроликах Newzealand White согласно способам Sawhney et al (Sawhney et. al, 1980). Титры антитела в сыворотках проверяются путем исследования с помощью диффузии в геле.

Антитело (+ve сыворотки) разбавляют перед осуществлением ELISA и для экспериментов используется разбавление 1:300 в PBS.

У кроликов берут кровь через ушную вену перед введением иммунизирующей дозы антигена E.histolytica с целью получения сывороток для отрицательного контроля (сыворотки -ve). Используется по 100 мкл разбавленных (1:300) сывороток -ve на каждую лунку.

IgG Антикролик, конъюгированный с пероксидазой хрена, покупают у Sigma в виде лиофилизированного порошка.

После восстановления оптимальное разбавление, как обнаружено, составляет 1:4000, что определяется с помощью титрования в шахматном порядке, которое используется в экспериментах.

ELISA представляет собой способ из 5 этапов, а именно связывание антигена, блокировка, связывание антитела, связывание конъюгата и проявление окраски. Каждый этап MELISA оптимизируется путем осуществления следующих далее этапов, согласно обычному способу ELISA. Традиционный ELISA осуществляется путем выдерживания, в течение ночи, покрытых антигеном активированных лунок при 4°C, блокировки лунок через 2 час, при 37°C, с последующим связыванием антитела и конъюгата при 37°C, на 2 ч, каждое, и проявления окраски, то есть взаимодействия фермент-субстрат, при комнатной температуре, в течение 5 минут, с последующим измерением коэффициента поглощения.

В способе согласно настоящему изобретению первый этап ELISA осуществляется путем ковалентной иммобилизации амёбного антигена на активированном полистироловом планшете с микролунками, под воздействием микроволнового излучения при 700 ватт, с различной длительностью по времени. Связывание, детектируемое уже через 10 секунд, увеличивается с увеличением времени воздействия излучения (таблица 1). Через 90 секунд связывание антигена становится более или менее таким же, как через 70 секунд воздействия микроволнового излучения. Следовательно, оптимальное время для иммобилизации антигена принимается равным 70 секунд. В контрольных экспериментах, осуществляемых в течение такого же времени, то есть 70 секунд, при 37°C, никакого связывания антигена с активированной полистирольной поверхностью не наблюдается.

На втором этапе MELISA осуществляется блокировка с помощью 2% BSA через 10 секунд, в микроволновой печи, при мощности 700 ватт, для блокировки свободной поверхности активированной поверхности. Дальнейшее увеличение времени воздействия микроволнового излучения демонстрирует неспецифическое связывание (таблица 2).

На третьем этапе MELISA связывание антитела с иммобилизованным антигеном осуществляется при 155 ватт, в течение 100 секунд. Этот этап является критичным, где неправильные условия, такие как слишком большое время или повышенная выходная мощность, приводят к неспецифическому связыванию, как показано в таблице 3. При 155 ватт через 50 секунд и 100 секунд никакого неспецифического связывания не наблюдается. Хотя через 50 секунд наблюдаемое значение OD является очень низким, 100 секунд, как обнаружено, является превосходным временем, давая высокое отношение сывороток -ve к +ve. Увеличение времени до 150 секунд увеличивает неспецифическое связывание (таблица 4).

На четвертом этапе MELISA осуществляется связывание конъюгата с помощью воздействия микроволнового излучения, при 155 ватт, в течение различных периодов времени. Превосходный результат получается через 100 секунд (таблица 6). Неправильные условия, такие как слишком большое время или более высокая энергия, например 700 ватт, приводят к неспецифическому связыванию (таблица 5).

На каждом этапе осуществляется контрольный эксперимент путем проведения такого же эксперимента вне микроволновой печи, в течение такого же периода времени. Во всех этих экспериментах получают пренебрежимо малый или нежелательный показатель ELISA (неспецифическое связывание).

После оптимизации каждого этапа MELISA авторы осуществляют все этапы при оптимизированных условиях воздействия микроволнового излучения без повреждения биологических молекул. Для достижения указанной оптимизации авторы получают иммобилизованный антиген на активированной лунке через 70 секунд, блокировку через 10 секунд, связывание антитела через 100 секунд и связывание конъюгата через 100 секунд воздействия микроволнового излучения. Общее время, требуемое для всех этих этапов, составляет 280 секунд, только с помощью способа согласно настоящему изобретению, в то время как обычный ELISA осуществляется примерно через 18 часов.

MELISA и ELISA для детектирования антител E.histolytica повторяют при сходных экспериментальных условиях несколько раз, и результаты, как обнаружено, являются в высшей степени воспроизводимыми, как показано в таблице 7.

Способ MELISA дополнительно проверяется путем детектирования антитела Aspergillus fumigatus из сывороток пациентов. Антиген A.fumigatus получают из статической культуры согласно опубликованному способу (Banerjee, B., et al, 1990).

Концентрация белков антигена, как обнаружено, составляет 12,5 мг на мл, как определено с помощью способа Lowry et al. (Lowry et al, 1951). Иммуннореакционная способность антигена проверяется путем использования гипериммунной сыворотки, выращенной в кроликах Newzealand White.

Образцы сывороток получают от 10 пациентов с аллергическим бронхопульмонарным аспергиллозом (ABPA). Все эти пациенты удовлетворяют клиническим критериям ABPA, как описано ранее (Rosenberg, M., et al, 1997).

Образцы сывороток для отрицательного контроля берут от 10 добровольцев, которые, очевидно, являются здоровыми и не имеют никакого респираторного или иного заболевания.

Собранные положительные и отрицательные сыворотки берутся в качестве контролей для ELISA, которые, как обнаружено, сравнимы как для MELISA, так и для обычного ELISA.

Пероксидазу хрена, коъюгированную с IgG анти-человек, покупают у Sigma в виде лиофилизированного порошка. После восстановления оптимальное разбавление конъюгата, как обнаружено, составляет 1:4000, как определяется с помощью титрования в шахматном порядке.

Антитело A.fumigatus(присутствующее в сыворотках пациента), детектируемое с помощью способа по настоящему изобретению, совпадает с результатами обычной процедуры ELISA (таблица 8).

Результатам, полученным в различных экспериментах, присваиваются сравнительные оценки:

Превосходно

Очень хорошо

Хорошо

Плохо

Нежелательные результаты или их отсутствие-

Общее время, требуемое для MELISA, составляет менее чем 10 минут. Однако время, требуемое для каждого этапа, может изменяться в зависимости от вида биологических молекул, при этом превосходные результаты могут быть получены с помощью небольшой модификации условий реакции, то есть небольшого изменения в длительности и энергии воздействующего микроволнового излучения.

Соответственно, настоящее изобретение предусматривает быстрый способ СВЧ-опосредованного иммуносорбентного твердофазного анализа, характеризующийся использованием активированной твердой подложки, где указанный способ включает в себя:

(a) создание активированной твердой подложки,

(b) загрузку биологической молекулы, выбранной из антигена или антитела, путем растворения указанной биологической молекулы в буфере, наносимом в активированную лунку указанной твердой подложки, и помещения указанной лунки внутри микроволновой печи, с последующим воздействием на указанную лунку микроволновым излучением с частотой, находящейся в пределах между 2300 и 2500 МГц, с выходной мощностью, находящейся в пределах между 600 и 900 ватт, в течение периода времени, находящегося в пределах от 50 до 100 секунд, с последующей тщательной промывкой лунки с помощью соответствующего буфера для промывки,

(c) блокирование свободных центров связывания лунки с иммобилизованными биологическими молекулами, как она получена после этапа (b), выше, путем загрузки блокирующего раствора в указанную лунку и воздействия на нее, внутри микроволновой печи, микроволновым излучением с частотой от 2300 до 2500 МГц, с выходной мощностью, находящейся в пределах между 600 и 800 ватт, в течение периода времени, находящегося в пределах от 5 до 20 секунд, и промывки указанной лунки соответствующим буфером для промывки,

(d) загрузку соответствующего антитела или антигена, растворенного в буфере, в лунку с иммобилизованным антигеном или антителом, как она получена после этапа (c), выше, с последующим воздействием на указанную лунку, внутри микроволновой печи, микроволновым излучением с частотой от 2300 до 2500 МГц, с выходной мощностью, находящейся в пределах от 50 до 200 ватт, в течение периода времени, находящегося в пределах от 90 до 200 секунд, с последующей промывкой с помощью буфера для промывки,

(e) загрузку соответствующего конъюгата фермента, растворенного в соответствующем буфере, в указанную выше лунку, полученную после этапа (d), и воздействие на указанную лунку, внутри микроволновой печи, микроволновым излучением с частотой от 2300 до 2500 МГц, с выходной мощностью, находящейся в пределах от 100 до 300 ватт, в течение периода времени, находящегося в пределах от 50 до 150 секунд, с последующей промывкой с помощью буфера для промывки,

(f) добавление субстрата-красителя буфера в указанную выше лунку, как она получена после этапа (e), выше, и выдерживание ее в течение периода времени, находящегося пределах от 4 до 10 минут, в темноте, с последующим добавлением стоп-раствора и измерением оптической плотности раствора с помощью спектрофотометра, на соответствующей длине волны.

В одном из вариантов реализации согласно настоящему изобретению используемая твердая подложка выбирается из группы, состоящей из таких материалов, как полистирол, полипропилен, полиэтилен, стекло, целлюлоза, нитроцеллюлоза, силикагель, поливинилхлорид, полианилин и тому подобное.

В одном из вариантов реализации согласно настоящему изобретению предпочтительная используемая твердая подложка представляет собой полистирол.

Еще в одном варианте реализации, твердая подложка выбирается из любой конфигурации, формы и размера, такой как листы, пластины, из тест-частиц, таких как шарики и микросферы, пробирок, тест-палочки, тест-полоски, лунка, планшет ELISA, микролуночный планшет или модуль.

В одном из вариантов реализации согласно настоящему изобретению твердая подложка, используемая для иммобилизации биологических молекул, выбирается из любых подложек, имеющих, по меньшей мере, одну активную функциональную группу, способную к связыванию молекул-лигандов посредством ковалентной связи.

Еще в одном варианте реализации согласно настоящему изобретению функциональная группа выбирается из галогенида, альдегида, ацетила, эпоксида, сукцинамида, изотиоцианата, ацилазида и тому подобное.

Еще в одном варианте реализации согласно настоящему изобретению функциональная группа может присутствовать в самой подложке или может быть введена с помощью обычных химических, или фотохимических, или иных способов, известных в данной области.

Еще в одном варианте реализации согласно настоящему изобретению функциональная группа вводится на твердую подложку с помощью фотохимической реакции в сухих условиях с использованием фотоактивируемого соединения, которое выбирается из 4-фтор-3-нитроазидобензола, N-гидроксисульфосукцинимидил 4-азидобензоата, N-гидроксисульфосукцинимидил 4-азидосалициловой кислоты и тому подобное.

Еще в одном варианте реализации согласно настоящему изобретению полистирольная поверхность активируется путем нанесения 1-фтор-2-нитро-азидобензола и экспонирования покрытой подложки в сухих условиях для УФ-излучения на 365 нм.

Еще в одном варианте реализации согласно настоящему изобретению источник света для фотохимической реакции выбирается из УФ-лампы, лазерного луча, яркого солнечного света или чего-либо подобного.

Еще в одном варианте реализации согласно настоящему изобретению время для фотохимического взаимодействия с целью активирования твердой подложки выбирается от 10 секунд до 10 час.

Еще в одном варианте реализации микроволновое излучение формируется в микроволновом устройстве, выбранном из бытовой микроволновой печи, специально сконструированной микроволновой печи или любого устройства или камеры, в котором генерируется микроволновое излучение, и тому подобное.

Еще в одном предпочтительном варианте реализации согласно настоящему изобретению первый этап ELISA осуществляется с помощью ковалентного связывания антигена или антитела на активированном планшете под воздействием микроволнового излучения с частотой от 2300 до 2500 МГц, с выходной мощностью, находящейся в пределах между 600-900 ватт, в течение короткого периода времени, находящегося в пределах от 50 до 100 секунд.

Еще в одном предпочтительном варианте реализации согласно настоящему изобретению второй этап ELISA, то есть этап блокировки осуществляется с помощью воздействия микроволнового излучения, с частотой от 2300 до 2500 МГц, с выходной мощностью, находящейся в пределах между 600-800 ватт, в течение короткого периода времени, находящегося в пределах от 5 до 20 секунд.

Еще в одном предпочтительном варианте реализации согласно настоящему изобретению третий этап ELISA, то есть связывание соответствующего антитела или антигена, осуществляется путем воздействия микроволнового излучения с частотой от 2300 до 2500 МГц, с выходной мощностью от 50 до 200 ватт, в течение периода времени, находящегося в пределах от 90 до 200 секунд.

Еще в одном предпочтительном варианте реализации согласно настоящему изобретению четвертый этап ELISA, то есть связывание фермент-конъюгат, осуществляется с помощью воздействия микроволнового излучения, с частотой от 2300 до 2500 МГц, с выходной мощностью от 100 до 300 ватт, в течение периода времени, находящегося в пределах от 50 до 150 секунд.

Еще в одном предпочтительном варианте реализации согласно настоящему изобретению общее время для связывания антигена, блокировки, связывания антитела и связывания конъюгата находится в пределах от 195 до 470 секунд, при этом общее время для обычного способа, как правило, находится в пределах от 10 час до 24 час.

Еще в одном варианте реализации согласно настоящему изобретению антиген может быть растворен в буфере для нанесения соответствующей композиции, имеющем pH, в пределах от 6,5 до 11, с молярностью, находящейся в пределах от 0,005 M до 0,1 M, совместимым с антигеном, таком как карбонатный буфер, фосфатный буфер и тому подобное.

Еще в одном предпочтительном варианте реализации согласно настоящему изобретению используемый буфер для промывки представляет собой смесь фосфатного буфера, имеющего pH, находящийся в пределах от 6,5 до 11, с молярностью, находящейся в пределах от 0,005 M до 0,1 M, и Tween 20, в пределах между 0,05 и 3%.

Еще в одном предпочтительном варианте реализации согласно настоящему изобретению блокирующий реагент выбирается из бычьего сывороточного альбумина, порошкообразного снятого молока, желатина и тому подобное.

Еще в одном варианте реализации согласно настоящему изобретению биологическая молекула выбирается из антигена или антитела. Антиген может быть любой биологической молекулой, микроорганизмом, веществом и тому подобное, которое вызывает или может, в принципе, вызывать иммунную реакцию.

Еще в одном предпочтительном варианте реализации согласно настоящему изобретению антитело выбирается из любой биологической молекулы, которая продуцируется хозяином в ответ на инокуляцию конкретным антигеном и имеет способность к специфическому связыванию антигена.

Еще в одном предпочтительном варианте реализации согласно настоящему изобретению конъюгат представляет собой конкретную биологическую молекулу, содержащую антитело или антиген, конъюгированный с ферментом, выбранным из пероксидазы или щелочной фосфатазы.

Еще в одном предпочтительном варианте реализации согласно настоящему изобретению фермент может быть заменен меткой, выбранной из хромофора, флуорофора, и тому подобное, которая облегчает его анализ.

Еще в одном предпочтительном варианте реализации согласно настоящему изобретению способ согласно настоящему изобретению может быть использован для других иммунологических анализов, таких как радиоиммунологический анализ, радиологический иммуносорбентный анализ, радиологический аллергосорбентный анализ, иммунологический анализ с помощью биотин-авидина/стрептавидина, иммуноблоттинг, иммуноокрашивание и тому подобное, наряду с различными типами ELISA, такими как непосредственный ELISA, опосредованный ELISA, сэндвич-ELISA и тому подобное.

Настоящее изобретение, кроме того, предусматривает устройство для СВЧ-опосредованного иммуносорбентного твердофазного анализа (MELISA), содержащее (а) загрузочную камеру, для автоматической загрузки образцов или реагентов из указанной емкости, из тонкой трубки, с помощью соответствующего насоса, на активированный полистироловый планшет/модуль; (b) реакционную камеру, состоящую из магнетрона, вытяжного вентилятора, и тому подобное, для осуществления всех этапов, таких как связывание антигена, блокировка, связывание антитела и связывание конъюгата антитело-фермент, под воздействием микроволнового излучения, и взаимодействия фермента и субстрата без СВЧ-стимуляции, при температуре окружающей среды, в течение предварительно заданного времени; (с) камеру для промывки и сушки, предназначенную для автоматической промывки и сушки указанного планшета или модуля ELISA, по запрограммированной команде, после каждого этапа способа MELISA; (d) камеру для детектирования, предназначенную для колориметр