Способ доставки биологически активного соединения на ассоциированную со слизистой оболочкой лимфоретикулярную ткань животного, способ получения композиции и композиция для доставки биологически активного соединения

Способ доставки биологически активного соединения на ассоциированную со слизистой оболочкой лимфоретикулярную ткань животного, способ получения композиции и композиция для доставки биологически активного соединения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Состояние проблемы

Изобретение относится к способу перорального введения и препарату биологически активного соединения, заключенного в индифферентную среду из одного или нескольких биосовместимых полимерных материалов, образующих микрокапсулы с активным веществом, которые благодаря своим размерам и физико-химическим свойствам обеспечивают доставку этого вещества и его включение в агрегированные лимфатические фолликулы (пейеровы бляшки) пищеварительных органов животных без потери активности при прохождении через желудочно-кишечный тракт. Аналогичные агрегаты имеются в дыхательных органах, мочеполовой системе, толстой кишке и других органах, имеющих слизистую оболочку. В ходе дальнейшего изложения эти образования обозначаются как ассоциированная со слизистой лимфатическая ткань.

Микрокапсулы широко применяются для предохранения биологически активных соединений от разложения. Обычно такие соединения заключают в один или несколько слоев защитного материала, как правило, полимерной природы. Активное соединение может быть окружено слоем полимерного материала в форме оболочки (микрокапсулы) или равномерно распределено в нем (микросферы). В дальнейшем термином "микрокапсулы" будут обозначаться обе формы препарата. Количество активного вещества в микрокапсулах можно варьировать в зависимости от назначения препарата, от очень небольших величин до 95% и более общего состава микрокапсулы. Размеры последней также могут изменяться от менее 1 мкм до 3 мл и более.

Пейеровы бляшки представляют собой агрегированные лимфатические узелки, локализованные в стенках толстых и тонких кишок и слепого отростка, и являются важным компонентом защитной системы организма против инфекционных организмов и другого чужеродного материала. Антигены - это вещества, индуцирующие образование антител и/или клеточные иммунные реакции вследствие наличия в их составе посторонних белков или тканей.

Реакции, индуцируемые взаимодействием антигенов с иммунной системой, могут быть положительными или отрицательными в смысле способности организма продуцировать антитела или отвечать опосредуемыми через клетки иммунными реакциями на повторное воздействие тем же антигеном. В понятие опосредуемого через клетки иммунитета включают способность вызывать гибель инородных клеток или тканей, "опосредуемую через клетки цитотоксичность" и аллергические реакции отложенного типа. Антитела относятся к классу белков, называемых иммуноглобулинами (Ig), которые образуются под воздействием антигенов и образуют с ними специфические комплексы. Такие комплексы обеспечивают выведение антигена из организма, их образование сопровождается гибелью "живых" антигенов (например, патогенных возбудителей, инородных или раковых клеток) и нейтрализацией активности токсинов или ферментов. Основным классом иммуноглобулинов в секрете, омывающем слизистые, являются иммуноглобулины A (sIgA). Секретирующие их антитела предотвращают прилипание патогенных организмов к слизистой или их проникновение в нее. Это же относится и к другим антигенам.

Многочисленные антигены проникают в организм через слизистые оболочки, однако наиболее распространенные способы иммунизации, например, внутримышечные или подкожные инъекции вакцин или антигенов, редко вызывают появление sIgA в продуктах секреции слизистой. Их продукция наиболее интенсивно индуцируется посредством прямой иммунизации ассоциированной со слизистой лимфатической ткани, основная часть которой присутствует в организме в форме пейеровых бляшек желудочно-кишечного тракта.

Пейеровы бляшки имеют в своем составе клетки-предшественники, так называемые В клетки, которые локализуются в lamina propria желудочно-кишечного тракта и верхних отделов дыхательной системы и дифференцируются в зрелые клетки, синтезирующие IgA. Исследования Heremans и Bazin по формированию способности синтезировать IgA у мышей после перорального введения антигена показали, что существует определенная последовательность формирования антиген-специфичных клеток, продуцирующих IgA: сначала они появляются в брыжеечных лимфатических узлах, затем в селезенке и, наконец, в lamina propria желудочно-кишечного тракта (Bazin Н., Levi G. & Doria G. Predominant contribution of IgA antibody-forming cells to an immune response detected in extraintestinal lymphoid tissues of germ free mice exposed to antigen via the oral route / Ведущая роль клеток продуцирующих IgA-антитела в иммунных реакциях, выявляемых во внекишечных лимфоидных тканях безмикробных мышей после орального введения антигена /, I. Immunol. 105: 1049; 1970 и Crabbe P.A., Nash D.R., Bazin Н., Eyssen H. & Heremans J.F. Antibodies of the IgA type in intestinal plasma cells of germ-free mice after oral or parenteral immunization with ferritin / IgA - антитела в клетках кишечной плазмы безмикробных мышей после пероральной или парентеральной иммунизации ферритином /, J. Exp. Med.130: 723; 1969). Последующие исследования показали, что пероральное введение антигенов приводит к образованию sIgA антител в пищеварительных органах, а также их появлению в продуктах секреции таких удаленных от пищеварительного тракта органах, как бронхи, грудные железы (в молоке и молозиве), слюнные железы, и в слезах (Mestecky J., McGhee J.R., Arnold R.R., Michalek S.M., Prince S.J. & Babb J.L. Selective induction of an immune response in human external secretions by ingestion of bacterial antigen / Избирательная индукция иммунной реакции во внешних секретах человека после перорального введения бактериального антигена /, J. Clin Invest. 61: 731; 1978, Montgomery Р.С., Rosner B.R. & Cohen J. The secretory antibody response. Anti-DNP antibodies induced by dinitrophenylated Type III pneumococcus / Секреторная реакция антител. Антитела к ДНП, индуцированные динитрофенилированными пневмококками III типа /, Immunol. Commun. 3: 143; 1974; & Hanson L.A., Ahistedt S., Carlsson В., Kaijser В., Larsson P., Mattsby Baltzer A., Sohl Akerlund A., Svanborg Eden C. & Dvennerhoint A.M. Secretory IgA antibodies to enterobacterial virulence antigens: their induction & possible relevance / Секреция IgA антител к вирулентным антигенам энтеробактерий: Их индукция и возможная роль / Adv. Exp. Med. Biol. 1007; 165; 1978). Данные указанных авторов свидетельствуют о том, что пейеровы бляшки служат обильными источниками клеток-предшественников, трансформирующихся в IgA-продуцирующие клетки, которые после сенсибилизации антигеном поступают в циркуляцию и обусловливают экспрессию антител не только в месте исходного действия антигена, но и на удаленных от него участках слизистой. Такая система транспорта В клеток в различные участки слизистой после их сенсибилизации обеспечивает реакцию ее иммунной системы на проникающие в желудочно-кишечный тракт из окружающей среды антигены и потенциальные возбудители.

Особое значение с точки зрения предлагаемого изобретения имеет способность антигенов индуцировать образование защитных антител после перорального введения. Известно, что поступление антигенов в организм животных с кормом приводит к образованию специфических иммуноглобулинов А, которые могут быть обнаружены в смывах из бронхов или носовой полости. При исследованиях на добровольцах также показано, что введение антигриппозной вакцины (перорально) индуцирует секрецию соответствующих антител в носовую полость.

Многочисленные исследования продемонстрировали возможность оральной иммунизации для индуцирования активности иммунной системы слизистой. Одновременно было показано, однако, что для этого необходимы очень высокие дозы антигена. Поэтому, за редкими исключениями, такой способ не может иметь практической ценности. Очевидно, что любой препарат для перорального введения или способ последнего должны обеспечивать предохранение активного ингредиента от разрушения в желудочно-кишечном тракте в процессе транспорта к пейеровым бляшкам. Несоблюдение этого условия приведет к тому, что если этот ингредиент и достигнет бляшек, то его количество или активность будут недостаточны для проявления желаемого эффекта.

В связи с этим очевидна потребность в способе пероральной иммунизации, который бы обеспечивал эффективную стимуляцию иммунной системы слизистой и позволял решить проблему защиты антигена от разрушения при прохождении по желудочно-кишечному тракту к пейеровым бляшкам. Еще более актуальной задачей является разработка способа, обеспечивающего избирательный транспорт антигена в пейеровы бляшки и его освобождение в этих образованиях. Нерешенной остается и проблема иммунизации с использованием слизистой других органов, что позволило бы избежать разрушения антигена и обеспечило его поступление именно в ассоциированную со слизистой лимфатическую ткань. Кроме того, предстоит решить вопросы защиты антигена от разрушения после его поступления в слизистую, обеспечения и/или оптимизации дальнейшего транспорта антигена из ассоциированной со слизистой лимфатической ткани и освобождения биологически активного материала из фармакологического препарата после введения последнего в организм.

Краткое содержание изобретения

Изобретение относится к способу введения и препарату для направленного переноса и последующего освобождения биологически активного соединения в организме животных после контакта со слизистыми оболочками, особенно к способу перорального и внутрилегочного введения. Биологически активное соединение заключают в микрокапсулу из биологически совместимого полимера или сополимера, который может проходить через желудочно-кишечный тракт и сохраняться на поверхности слизистой, не подвергаясь разрушению или подвергаясь ему в незначительной степени, что обеспечивает поступление биологически активного соединения в пейеровы бляшки или другие ассоциированные со слизистой лимфатические ткани и проникновение в них в исходных эффективных количествах. Термином биологически сопоставимый полимерный материал обозначается полимер, не обладающий токсичностью, канцерогенным или воспалительным действием в организме. Желательно, чтобы индифферентный полимерный материал микрокапсул подвергался биодеградации, т.е. разрушался в ходе физиологических процессов до продуктов, не накапливающихся в тканях и выводящихся из организма. Микрокапсулы должны иметь такие размеры и физико-химические свойства, которые обеспечивали бы их эффективное избирательное поступление в пейеровы бляшки. В изобретении решены проблемы направленного переноса биологически активного соединения в пейеровы бляшки и другие ассоциированные со слизистой ткани и включения в них.

Цель изобретения состоит в разработке способа перорального введения антигена животным, при котором он достигает пейеровых бляшек и включается в них, стимулируя таким образом иммунную систему слизистой, без потери иммуногенной активности в процессе транспорта по желудочно-кишечному тракту.

Другая задача изобретения заключается в разработке способа перорального введения животным антигена, при котором он достигает пейеровых бляшек и включается в них без потери активности в процессе транспорта по желудочно-кишечному тракту, стимулируя таким образом системный иммунитет.

Еще одна цель изобретения - разработка способа введения антигена животным, при котором он достигает ассоциированных со слизистой лимфатических тканей, стимулируя таким образом иммунную систему слизистой, без потери активности вследствие разрушения на поверхности последней.

Следующая цель изобретения - разработка способа введения антигена животным, при котором он достигает ассоциированных со слизистой лимфатических тканей и включается в них, стимулируя таким образом системный иммунитет, без потери активности вследствие деградации на поверхности слизистой.

Цель изобретения состоит также в разработке способа перорального введения биологически активного соединения животным, обеспечивающего его транспорт и включение в пейеровы бляшки, для создания локальной или системной концентрации препарата.

Цель изобретения состоит также в разработке метода введения животным биологически активного соединения, обеспечивающего его поступление и включение в ассоциированную со слизистой лимфатическую ткань для создания локальной или системной концентрации препарата.

Цель изобретения - разработка фармакологической формы, содержащей биологически активный ингредиент и заключающий его полимерный или сополимерный индифферентный материал, предпочтительно поддающийся биодеградации, которая пригодна для переноса в слизистые оболочки описанными выше способами.

Еще одна цель изобретения состоит в создании улучшенной системы вакцинации, позволяющей избежать использования стимуляторов иммуногенеза.

Следующая цель изобретения - создание усовершенствованной системы вакцинации для индукции иммунитета в процессе пульсирующего освобождения антигена после однократного введения его в составе микрокапсулы.

Цель изобретения состоит также в создании усовершенствованной системы для вакцинации, которая позволяет избежать использования стимуляторов иммуногенеза и позволяет индуцировать иммунную реакцию посредством пульсирующего освобождения антигена исключительно из микрокапсулы после однократного введения препарата.

Цель изобретения состоит также в разработке композиции, обеспечивающей достижение вышеуказанных целей.

Подробное описание изобретения

Ниже приведены примеры реализации изобретения. Они иллюстрируют способы направленного и программированного переноса антигенов (тринитрофенил гемоцианина морского блюдечка и токсоидной вакцины стафилококкового энтеротоксина В) и лекарственного препарата (этретината) в ассоциированную со слизистой лимфатическую ткань мышей в составе микрокапсул из полимера DL-лактид-гликолида (50:50).

Следует отметить, что для этой цели можно использовать и другие полимерные материалы, например полигликолид, поли(DL-лактид-когликолид), кополиоксалаты, поликапролактон, поли(лактид-кокапролактон), поли(эстерамиды), полиортоэфиры и поли-8-оксимаслянную кислоту, а также полиангидриды и другие полимерные соединения.

Кроме того, можно использовать другие, помимо указанных выше, биологически активные ингредиенты. К их числу относятся антигены противовирусных вакцин, вакцин против бактериальных протозойных и грибковых заболеваний (грипп, парагрипп, другие респираторные заболевания, (Hemophilus influenza, Bordetella pertussis, Neisseria gonorrhoeae, Streptococcus pneumoniae & Plasmodium falciparum), а также вакцин против других болезней, вызываемых патогенными микроорганизмами; заболеваний, обусловленных патогенными микрогельминтами; и противоаллергических вакцин. Дополнительно в качестве биологически активных ингредиентов используют иммуномодуляторы, питательные вещества, лекарственные средства, пептиды, лимфокины, цитокины и другие соединения.

I. Микрокапсулирование

А. Изготовление микрокапсул с красителями

Для того чтобы проследить проникновение микрокапсул в пейеровы бляшки, изготавливают светящиеся капсулы из неподдающегося биодеградации полимера полистирола, содержащие растворимый в воде флюоресцирующий краситель кумарин. Процедура изготовления состоит в следующем:

Сначала готовят раствор полимера, разводя 4,95 г полистирола (Type 685D, Dow Chemical Company, Midland, MI) в 29,5 г метилен хлорида (Reagent Grade, Eastman Kodak Rochester, NY). Затем в полимерный раствор добавляют примерно 0,05 г кумарина (Polysciences Inc., Warrington, PA) и помещают смесь на магнитную мешалку.

В отдельной емкости готовят 10%-ный водный раствор поливинилового спирта (ПВС), используемого в качестве рабочей среды. Для этого 40 г ПВС (Vinol 2050, Air Products & Chemical, Allentown) разводят в 360 г деионизированной воды.

Готовый раствор насыщают 6 г метиленхлорида. Затем его переливают в мешалку из синтетической смолы (Асе Glass, Inc., Vineland, NY) с турбинной крыльчаткой (2,5 дюйма) и моторчиком Фишера и перемешивают при скорости вращения 380 оборотов/мин. Вместимость мешалки 1 л.

Полученную таким образом смесь кумарина с полистиролом переносят в емкость с раствором ПВС, используя для этого воронку диаметром 7 мм с длинной ножкой. При этом образуется устойчивая водно-масляная эмульсия, которую дополнительно перемешивают в течение 30 мин при атмосферном давлении до получения микрокапель масла желаемого размера. Затем емкость закрывают и постепенно понижают давление до 520 мм рт.ст., используя водяной насос, подсоединенный к манометру, и выпускной клапан. Содержимое емкости перемешивают при пониженном давлении в течение 24 часов до полного испарения метиленхлорида. После этого центрифугированием собирают отвердевшие микрокапсулы и подсушивают их в течение 72 часов в вакуумной камере при комнатной температуре.

Б. Изготовление микрокапсул с антигеном

Растворимый в воде антиген ТНФ - ГМЦ заключают в капсулу из поли(DL-лактид-когликолида) - биологически совместимого, поддающегося биодеградации полиэфира. При этом используют следующую процедуру.

Сначала готовят раствор полимера, растворяя 0,5 г поли(DL-лактид-когликолида) в соотношении 50:50 в 4,0 г метиленхлорида. Затем 300 мкл антигена ТНФ-ГМЦ (46 мг антигена/мл после диализа) равномерно распределяют в растворе поли(DL-лактид-коглинолида), используя смеситель Vortex-Genie 2 (Scientific Industries Inc., Bohemia, NY).

В отдельной емкости готовят 8%-ный водный раствор ПВС, разводя 4,8 г ПВС в 55,2 г деинизированной воды. После растворения ПВС раствор переливают в смеситель из синтетической смолы с турбинной крыльчаткой из тефлона диаметром 1,5 дюйма на вращающемся валу (Kontes Glass Inc., Vineland, NY). Затем через воронку длиной 7 мм с длинной ножкой доливают полимерный раствор, одновременно перемешивая раствор ПВС при скорости вращения вала около 650 оборотов/мин. Полученную таким образом водно-масляную эмульсию перемешивают в течение еще 10 мин, содержимое емкости переносят в 3,5 л деионизированной воды в сосуде на 4 л и перемешивают примерно при 800 оборотах/мин с помощью крыльчатки из нержавеющей стали (2 дюйма). Образовавшиеся при этом микрокапсулы в течение 30 мин промывают деионизированной водой, собирают посредством центрофугирования, дважды промывают деионизированной водой для удаления остатков ПВС и снова собирают в условиях лиофильной сушки. Полученные таким образом микрокапсулы представляют собой сферические частицы диаметром от 1 до 10 мкм. Аналогичным способом получают другие микрокапсулы, например, для включения стафилококкового энтеротоксина В.

Содержание антигена ТНФ-ГМЦ в микрокапсулах, точнее их сердцевине, определяют взвешиванием 10 мг содержащих его капсул в центрифужной пробирке на 12 мл. Для этого в пробирку наливают 3,0 мл метиленхлорида и перемешивают до растворения поли(DL-лактид-когликолида). Затем в пробирку добавляют 3,0 мл деионизированной воды и энергично перемешивают в течение еще 1 мин. Полученную смесь центрифугируют для разделения водной и органической фаз. Водный слой переносят в мерную колбу объемом 10 мл. Повторяют экстракцию, объединив водные фазы в мерной колбе и долив в нее деионизированную воду до конечного объема. Методом белковой пробы проводят количественное определение антигена ТНФ-ГМЦ в мерной колбе и рассчитывают его содержание в микрокапсулах. Последние должны содержать антиген в количестве 0,2% общего веса. Аналогичным образом определяют содержание стафилококкового энтеротоксина В в заключающих его микрокапсулах.

II. Проникновение микрокапсул с красителем в пейеровы бляшки после перорального введения

Пейеровы бляшки образуют основную массу ткани, в которой происходит индуцированное образование IgA антител. Эти изолированные островки лимфоретикулярной ткани расположены по всей длине тонкого кишечника и слепого отростка. Направленное поступление в них интактного антигена, сопровождающееся его локальным накоплением, согласно современным представлениям служит наиболее эффективным способом индукции диффузной иммунной реакции слизистой. Подверженные биодеградации капсулы являются оптимальными носителями для такой направленной вакцинации.

Пример 1. Микрокапсулы из полистирола

Включение микрокапсул в лимфоретикулярную ткань пищеварительной системы и его ограничение размерами микрокапсул изучали в экспериментах по пероральному введению мышам полистироловых капсул, содержащих флюоресцирующий краситель кумарин. Мышам линии BALB/C натощак и без анестезии вводили 0,5 мл суспензии, содержащей 100 мг/мл флюоресцирующих микрокапсул разного размера (от менее 5 до 8-50 мкм в диаметре). Суспензию готовили на водопроводной воде и вводили в желудок с помощью зонда. В разные сроки после введения (0,5; 1 и 2 часа) мышей забивали и извлекали тонкий кишечник. Отрезки кишки длиной 1 см с изолированными пейеровыми бляшками отмывали от содержимого, выворачивали внутренней стороной наружу и быстро замораживали. Замороженные отрезки исследовали под флюоресцентным микроскопом, определяя число, локализацию и размеры микрокапсул, включающихся в пейеровы бляшки из просвета кишечника.

Отдельные микрокапсулы после промывки оставались между ворсинками, однако их включение в иные ткани, кроме пейеровых бляшек отсутствовало. Через 30 мин после перорального введения микрокапсулы обнаруживали в пейеровых бляшках проксимального, но не дистального отделов тонкого кишечника. С течением времени они переносились благодаря перистальтическим сокращениям в другие отделы пищеварительной системы и спустя 2 часа их обнаруживали на всем протяжении желудочно-кишечного тракта, включая пейеровы бляшки подвздошной кишки. Подвергавшиеся эндоцитозу микрокапсулы характеризовались преимущественно периферической локализацией, на удаленных от апикальной части участках бляшек, в связи с чем складывается впечатление, что физический захват микрокапсул между телом бляшки и прилегающими ворсинками при перистальтике способствует их включению. Сопоставление эффективности включения микрокапсул размером менее 5 мкм по сравнению с более крупными капсулами (8-50 мкм) свидетельствует о том, что пейеровы бляшки быстро и избирательно включают микрокапсулы размером 1-10 мкм, тогда как включение микрокапсул диаметром более 10 мкм отсутствует. Это позволяет считать микрокапсулы, изготовленные из подвергающегося биодеградации материала, эффективным средством направленного переноса антигенов в лимфоретикулярную ткань с целью индукции иммунной реакции на поверхности слизистой.

Пример 2. Микрокапсулы из поли(DL-лактид-когликолида) в соотношении 85:15

1. Включение биологически совместимых и подверженных биодеградации микрокапсул в пейеровы бляшки

Разным группам мышей через желудочный зонд вводили суспендированные в воде микрокапсулы из подверженного биодеградации материала, содержащие флюоресцирующий краситель кумарин-6. Материалом микрокапсул служил поли(DL-лактид-когликолид) в соотношении 85:15, обладающий способностью противостоять биодеградации на протяжении 6 недель. Спустя 1-35 дней после введения отбирали три репрезентативные пейеровы бляшки, пробы ткани крупных брыжеечных лимфатических узлов и селезенки и после соответствующей обработки готовили замороженные срезы.

При исследовании под флюоресцентным микроскопом с использованием необходимых фильтров и источников возбуждения по локализации темно-зеленого флюоресцирующего красителя определяли распределение микрокапсул диаметром значительно меньше 1 мкм. С целью выявления общего количества микрокапсул в отдельных органах или тканях микроскопированию подвергали все имеющиеся срезы. С помощью окулярного калибровочного микрометра определяли размер каждой микрокапсулы и регистрировали ее локализацию в органе или ткани.

Включение микрокапсул, независимо от размера, отмечали уже через 24 часа после введения; они сохранялись в пейеровых бляшках во все сроки 35-дневного периода наблюдений (таблица 1). Не отмечено ни одного случая проникновения микрокапсул в кишечную ткань за пределами пейеровых бляшек. Общее число микрокапсул в этих образованиях увеличивалось в течение первых 4 дней после введения и уменьшалось на протяжении последующих 31 дня до 15% максимальной величины.

Это наблюдение согласуется с данными о том, что свободные микрокапсулы присутствуют на поверхности кишечных ворсинок в 1, 2 и 4-й день после введения. Интересно, что примерно через 10 часов после перорального введения микрокапсул в форме суспензии содержавший кумарин материал обнаруживался в экскрементах. Эти наблюдения проводились с использованием источника ультрафиолетового излучения, и уже через сутки основная часть флюоресцирующего материала выводилась из кишечника. Таким образом, непрерывное включение микрокапсул в пейеровы бляшки в течение 2-4 дней после введения может объясняться захватом небольшого их количества слизистой кишечной стенки в промежутках между ворсинками. Кроме того, интенсивность включения захваченных микрокапсул, по-видимому, на несколько порядков выше, чем микрокапсул, присутствующих в просвете кишечника над поверхностью слизистой. Это наблюдение имеет важное значение с медицинской точки зрения, поскольку масса лимфатической ткани пейеровых бляшек у человека по сравнению с мышами неизмеримо больше, а продолжительность прохождения микрокапсул через тонкий кишечник человека дольше, что может значительно повышать эффективность их включения в пейеровы бляшки.

Во все сроки наблюдений, как показано в таблице 1, в пейеровых бляшках присутствовали микрокапсулы любого размера. Через 1, 2 и 4 дня после их введения относительная доля микрокапсул диаметром менее 2 мкм (45-47%), от 2 до 5 мкм (31-35%) и более 5 мкм (18-23%) оставалась довольно постоянной. Спустя 7 дней и особенно в более поздние сроки характер распределения микрокапсул разного размера изменялся, и число наиболее крупных из них (более 5 мкм в диаметре) начинало преобладать над числом более мелких (менее 2 мкм и от 2 до 5 мкм). Этот сдвиг совпадал по времени со снижением общего числа микрокапсул в пейеровых бляшках, начинавшимся с 7 дня. Эти наблюдения свидетельствуют об избирательной миграции микрокапсул малого и среднего размера из пейеровых бляшек и задержке в них преимущественно крупных микрокапсул.

Эти данные подтверждаются наблюдениями за локализацией микрокапсул в морфологических структурах пейеровых бляшек. Они, как правило, обнаруживались в эпителии непосредственно в местах проникновения в бляшки (в пределах 200 мкм от них) или в глубине лимфоидной ткани, на расстоянии 200 мкм и более от ближайшего слоя эпителия (таблица 1). Микрокапсулы, характеризовавшиеся последним типом локализации, были обычно представлены мелко- и среднеразмерными формами. В первый день после введения 92% микрокапсул локализовались в эпителии вблизи куполообразной поверхности бляшек. Относительное число микрокапсул, проникавших на более значительную глубину, возрастало до 24% их общего количества на 4-й день, после чего постепенно уменьшалось до 2% на 14-й и последующие дни. Таким образом, мелкие и среднего размера микрокапсулы мигрируют через пейеровы бляшки и выводятся из них, тогда как крупные, диаметром более 5 мкм, на протяжении длительного времени остаются в пределах купола.

2. Миграция микрокапсул в брыжеечные лимфатические узлы и селезенку

Небольшое количество микрокапсул обнаруживали в лимфатических узлах брыжейки в день введения, после чего их количество прогрессивно возрастало вплоть до 7 дня (таблица 2). Затем оно уменьшалось, однако часть микрокапсул сохранялась в этих узлах на протяжении, по крайней мере, 35 дней. Анализ распределения микрокапсул по размерам выявил относительно более высокое содержание мелких микрокапсул (менее 2 мкм в диаметре) по сравнению с микрокапсулами среднего размера (2-5 мкм) в лимфатических узлах в ранние сроки после введения и отсутствие в них крупных микрокапсул диаметром более 5 мкм, что свидетельствует о более интенсивной миграции в них мелкоразмерных частиц. Кроме того, в первое время после введения большинства микрокапсул локализовалось непосредственно под оболочкой узла или в его подкапсульном синусе. Позднее микрокапсулы перемещались в более глубокие структуры узла и к 14 дню 90% всех микрокапсул локализовалось в пределах коркового слоя медуллярного вещества. Первоначальная локализация микрокапсул в субкапсульном синусе или вблизи его свидетельствует о том, что они проникают в узлы через лимфатические сосуды, дренирующие пейеровы бляшки. Прогрессивное увеличение количества мелких микрокапсул в глубине лимфатических узлов к 4 дню после их перорального введения и постепенное снижение их общего количества на протяжении последующих 14 дней и в более поздние сроки свидетельствует о том, что микрокапсулы мигрируют через узловую ткань и выводятся из нее через эфферентные лимфатические протоки.

Аналогичные исследования в селезенке выявили отсутствие в ней микрокапсул до 4 дня после введения. Максимальное количество их регистрировалось не ранее 14 дня. Как и в случае брыжеечных лимфатических узлов, в селезенке отсутствовали микрокапсулы размером более 5 мкм. Во все сроки наблюдений микрокапсулы локализовались в глубине коркового слоя ткани. Следует отметить, что максимальное число микрокапсул в селезенке обнаруживали во время, когда их содержание в брыжеечных лимфатических узлах уменьшалось, а сохранявшиеся в них микрокапсулы локализовались в самых глубинных частях узлов. Это наблюдение согласуется с известной последовательностью перемещения лимфы из пейеровых бляшек в брыжеечные лимфатические узлы, а оттуда - в кровяное русло, через грудной проток. Таким образом, прежде чем поступить в селезенку микрокапсулы проходят через пейеровы бляшки и лимфатические узлы брыжейки, а затем переносятся кровью.

В дополнительных экспериментах с помощью гистохимических и иммуногистохимических методов исследовали срезы пейеровых бляшек, брыжеечных лимфатических узлов и селезенки, содержавшие абсорбированные микрокапсулы из полилактида-когликолида в соотношений 85:15. Помимо прочего, в этих исследованиях установлено, что абсорбированные пейеровыми бляшками микрокапсулы локализуются внутри макрофагоподобных клеток, в которых с помощью окраски реактивом Шиффа с периодной кислотой (ПКШ) выявляли углеводы, преимущественно гликоген, и антигены класса II главного комплекса гистосовместимости (ГКГ). Кроме того, присутствующие в брыжеечных лимфатических узлах и селезенке микрокапсулы обычно переносятся туда в указанных ПКШ и ГКГ положительных клетках. Таким образом, микрокапсулы, содержащие антиген, включают в антиген-трансформирующие придаточные клетки (АТПК) пейеровых бляшек и разносятся ими в другие лимфатические ткани.

Приведенные данные показывают, что характер иммунной реакции, индуцируемой посредством перорального введения заключенной в микрокапсулы вакцины, можно регулировать подбором микрокапсул определенного размера. Микрокапсулы размером менее 5 мкм выводятся из пейеровых бляшек в составе АТПК и высвобождают антиген в лимфатическую ткань, служащую местом индукции системной иммунной реакции. В противоположность этому, микрокапсулы диаметром 5-10 мкм задерживаются в пейеровых бляшках и в АТПК на протяжении длительного времени и высвобождают антиген непосредственно в бляшках, индуцируя продукцию sIgA антител.

Пример 3. Сопоставление включения в пейеровы бляшки микрокапсул из 10 различных материалов

С целью выявления индифферентных материалов, наиболее пригодных для создания систем контролируемой доставки биологически активных соединений к тканям - мишеням, проводили эксперименты с микрокапсулами из разных материалов, одновременно оценивая физико-химические свойства последних, обеспечивающие направленную абсорбцию микрокапсул ассоциированной со слизистой лимфатической тканью. Что касается последней задачи, то предыдущие исследования показали более интенсивный фагозитоз гидрофобных частиц клетками ретикулоэндотелиальной системы по сравнению с гидрофильными. В связи с этим была изучена абсорбция пейеровыми бляшками микрокапсул размером от 1 до 10 мкм, изготовленных из 10 различных полимерных материалов, отличающихся разной степенью гидрофобности. В их число входили: полистирол, поли(L-лактид), поли(DL-лактид), 50:50 поли(DL-лактид-когликолид), 85:15 поли(DL-лактид-когликолид), поли(оксимасляная кислота), поли(метил-метакрилат), этилцеллюлоза, ацетилцеллюлоза - фталат водорода и триацетилцеллюлоза. Установлена абсорбция микрокапсул из 7 использованных материалов и их преимущественная локализация в теле пейеровых бляшек спустя 48 часов после введения в форме суспензии, содержащей 20 мг микрокапсул, перорально (таблица 3). Случаи проникновения микрокапсул в кишечную стенку за пределами пейеровых бляшек не зарегистрированы. За единственным исключением (этилцеллюлоза), эффективность абсорбции коррелировала с относительной гидрофобностью индифферентного материала капсул. При введении наиболее гидрофобных материалов: полистирола, полиметил метакрилата и полиоксимасляной кислоты, в трех репрезентативных пейеровых бляшках мышей насчитывалось до 1500 микрокапсул. При использовании капсул из менее гидрофобных материалов: поли(L-лактида), поли(DL-лактида), 85:15 поли(DL-лактид-когликолида) или 50:50 поли(DL-лактид-когликолида), их количество в аналогичных пробах составляло 200-1000 штук. Целлюлозные микрокапсулы не абсорбировались.

Установлено, что зависимость избирательной абсорбции микрокапсул от физико-химических свойств составляющего их материала опосредуется через поверхностные процессы на границе раздела между пейеровыми бляшками и полостью кишечника. Поэтому изменение поверхностных характеристик микрокапсул посредством химической модификации полимера или свойств оболочки модно использовать в качестве средства регуляции эффективности захвата микрокапсул и доставки биологически активных соединений в ассоциированные со слизистой лимфатические ткани или АТПК. В качестве неограничивающих примеров материалов для таких оболочек можно привести химические реактивы, полимеры, антитела, биоадгезивные соединения, белки, пептиды, углеводы, пектины и подобные им материалы как природного, так и искусственного происхождения.

III. Продукция антител, индуцируемая вакцинами в составе микрокапсул

Материалы и методы:

Мыши: мыши линии BALB/C в возрасте от 8 до 12 недель (во всех экспериментах).

Тринитрофенил гемоцианин: Гемоцианин, получаемый из морского блюдечка (Megathura crenulate), производства компании Calbiochem (Сан Диего, США), коньюгировали с нитрофенильным гаптеном (ТНФ-ГМЦ) с использованием 2,4,6-тринитробензол-сульфоновой кислоты, как описано Rittenburg и Amkraut (Immunogenecity of trinitrophenyl-hemocyanin: Production of primary and secondary anti-hapten precipitins / Иммуногенные свойства тринитрофенил-гемоцианина: Получение первичных и вторичных антигаптеновых преципитинов / J. Inununol., 97, 421, 1966). Степень замещения по данным спектрофотометрического определения равнялось ТНФ₈₆₁ - ГМЦ (при коэффициенте молярной экстинкции 15400 и длине волны 350 нм с 30%-ной поправкой на поглощение ГМЦ в этих условиях).

Вакцина со стафилококковым энтеротоксином В:

Формалиновую вакцину стафилококкового энтеротоксина В (СЭВ) готовили по методу Warren J.R., Spero L., & Metzger J.F. (Anfcigenicity of formalin-inactivated staphylococcal enterotoxin В / Антигенные свойства инактивированного формалином стафилококкового энтеротоксина В / J. Immunol., 111, 885, 1973). Вкратце, 1 г энтеротоксина разводили в 0,1 м натрий - фосфатном буфере рН 7,5 до конечной концентрации 2 мг/мл. В полученный раствор добавляли формалин до получения молярного соотношения формалин:энтеротоксин 4300:1. Раствор помещали в инкубатор при 37°C и медленном встряхивании, поддерживая величину рН на уровне 7,5+0,1 ежедневно. Спустя 30 дней токсин концентрировали, отмывали боратным буфером (ББ) в фильтрационной камере (Амикон) под давлением и стерилизовали методом фильтрации. Превращение энтеротоксина в энтеротоксоид подтверждали по отсутствию снижения веса кроликов с массой тела 3,0-3,5 кг после внутримышечного введения им 1 мг токсоидного материала.

Иммунизация: Антиген в микрокапсулах и без них суспендировали при определенной концентрации в растворе, состоявшем из 8 частей стерилизованной ультрафильтрацией водопроводной воды и 2 частей 7,5%-ного раствора бикарбоната натрия. 0,5 мл суспензии с помощью желудочного зонда вводили мышам - реципиентам натощак, как описано Babb J.L., Kiyono Н., Michalek S.M., & Me Ghee J.R. (LPS regulation of the immune responce: Suppression of immune response to orally-administered T-dependent antigen/Регуляция ЛФР иммунной реакции: Подавление иммунной реакции на пероральное введение Т-зависимого антигена /, J. Immunol 127, 1052, 1981).

Получение биологических жидкостей:

1. Плазма крови: Кровь отбирали калиброванными капиллярными пипетками после прокола ре