Применение гепаринсвязывающих антагонистов в ингибировании высвобождения брадикинина

Применение гепаринсвязывающих антагонистов в ингибировании высвобождения брадикинина

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Описание

Область изобретения

Изобретение связано со способом лечения или предотвращения заболевания, происходящего в результате высвобождения брадикинина у млекопитающего, в частности у млекопитающего, которое продуцирует гепарин-связывающий белок, при котором указанный гепарин-связывающий белок связывается с антагонистом гепарин-связывающего белка, включающий в себя введение указанному млекопитающему антагониста гепарин-связывающего белка в количестве, эффективном для снижения уровня высвобождения брадикинина у млекопитающего. Более того, изобретение связано со способами и наборами для определения того, продуцирует ли млекопитающее гепарин-связывающий белок, который связывается с антагонистом гепарин-связывающего белка, и способом обнаружения антагониста гепарин-связывающего белка.

Предшествующий уровень техники

Воспаление

Острый воспалительный ответ связан с несколькими явлениями, включая изменения в размерах и тонусе сосудов, так же, как и в увеличении проницаемости сосудов, что приводит к образованию обогащенного белком экссудата (Lewis in Mediators of Inflammation, Wright, Bristol, U.K., 1986).

Поскольку нейтрофилы (ПМЯ) получают хемотаксические сигналы, они располагаются по периферии сосудов и прилипают к сосудистым эндотелиальным клеткам посредством специфических адгезивных молекул, синтезируемых как на поверхности эндотелиальных клеток, так и на поверхности нейтрофилов. После прикрепления нейтрофилов к эндотелиальным клеткам в эндотелии образуются зазоры, индуцирующие проницаемость сосудов и создающие возможность для миграции нейтрофилов в интерстициальную область ткани.

Фазово-контактная система охватывает три ферментативных фактора, фактор XI (F XI), фактор XII (F XII) и прокалликреин (пре-калликреин) плазмы (РК), а также неэнзиматический кофактор, Н-кининоген (НК), который образует эквимолярные комплексы с F XI и РК, соответственно. Контактная фаза присутствует на моноцитах, фибробластах и нейтрофилах. Специфические связывающие сайты, экспонируемые эндотелиальными клетками и неклеточными отрицательно заряженными поверхностями, такими как каолин, в целом называемыми здесь "контактной фазой", создают возможность локального скопления критических компонентов. Превращение зимогена F XII в активный фермент, F ХIIа, активирует как таковую фазово-контактную систему (Colman et al., 1986, Grit. Rev. Oncol. Hematol. 5: 57-85). Реципрокная активация связанного с поверхностью F XII и РК, заякоренного на поверхности посредством НК, способствует выработке F XIIа и Pka, амплифицируя тем самым сигнал инициации. Затем фактор XIIа может активировать фактор XI, и инициируется внутренний путь свертывания. Известно, что РК также гидролизует НК с образованием сильного нанопептида, брадикинина (Kaplan and Silverberg, 1987, Blood 70:1-15). Кинины считаются первичными медиаторами процесса воспаления, которое вызывает боль, расширение сосудов и увеличение проницаемости сосудов в результате прямого действия на эндотелиальные клетки, вызывая их сокращение и допуская одновременно и миграцию нейтрофилов, и образование транссудата содержимого плазмы (Oyvin et al., 1970, Experentia 26:843-844). Может быть вовлечен также процесс локального продуцирования простагландинов и окиси азота, NO (Hall, 1992, Pharmacol. Ther. 56:131-190). Следовательно, активация фазово-контактной системы может приводить к целому ряду повреждающих эффектов, например, к воспалению, септическому шоку, респираторному дистресс-синдрому взрослых, диссеминированному внутрисосудистому свертыванию, послеоперационному кровотечению при сердечно-сосудистой хирургии.

Фазово-контактная система может быть активирована, в частности, когда нейтрофилы связываются с эндотелиальными клетками, присутствием эндотоксинов и бактериальной инфекции (обзор Colman et al., 1997, Blood 90:3819-3843). Например, было обнаружено, что при сепсисе происходит активация фактора XII и прекалликреина, при которой они расщепляются и в результате превращаются в ферменты, которые быстро реагируют с С1-ингибитором с образованием комплексов фактор XIIa-C1-ингибитор и калликреин-C1-ингибитор. Значительное увеличение образования комплекса калликреин-С1-ингибитор наблюдается при стимулированном экстракорпоральном (искусственном) кровообращении.

Обнаружено, что апротинин, ингибитор одновременно и плазмина, и калликреина плазмы, уменьшает кровопотери после сердечной хирургии и уменьшает повышенное послеоперационное время свертывания. В частности, было показано, что апротинин в модели стимулированного экстракорпорального кровообращения способствует снижению образования комплексов калликреин-C1-ингибитор и С1-С1-ингибитор (Wachtfogel et al., 1993, J. Thorac. Cardiovasc Surg. 106:1). При добавлении апротинина к искусственному кругу кровообращения, перфузируемому всем объемом крови, антикоагулируемой гепарином, апротинин фактически дополнял действие гепарина (Bannan et al., 1998, Brit. J. Haem. 101:455-461). Следовательно, апротинин оказывает дополнительное гемостатически благоприятное воздействие по сравнению с индивидуальным действием гепарина в указанной модели.

Апротинин также повышает жизнеспособность эндотелиальных клеток в условиях гипоксии при охлаждении, когда такие клетки хранят в растворах для сохранения органов, и повышает сохранность легких и миокарда в моделях, в которых используются органы целиком (Sunamori et al., 1991, Ann. Thor. Surg. 52:971-978 and Roberts et al., 1998, Ann. Thorac. Surg. 66:225-230). Более того, в то время как брадикинин, как было показано, способствует повышению сосудистой проницаемости, апротинин уменьшает эту проницаемость сосудов и количество нейтрофилов (O'Brien et al., 1997, Can. J. Physiol. Pharmacol. 75:741-749 and Dwenger et al., 1995, Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 34:207-214).

Гепарин-связывающий белок

В настоящее время обнаружена ковалентная структура двух тесно связанных белков, выделенных из нейтрофильных лейкоцитов периферической крови человека и свиньи (cf. H. Flodgaard et al., 1991, Eur. J. Biochem. 197: 535-547; J. Pohl et al., 1990, FEBS Lett. 272: 200 ff.). Оба белка обладают большим сходством с эластазой нейтрофилов, но в результате селективных мутаций активного серина 195 и гистидина 57 (нумерация по химотрипсину (B.S. Hartley, "Homologies in Serine Proteinases", Phil. Trans. Roy. Soc. Series 257,1970, p. 77 ff.)) эти белки лишены протеазной активности. Эти белки были названы гепарин-связывающим белком человека (hHBP) и гепарин-связывающим белком свиньи (рНВР), соответственно, благодаря их высокой аффинности к гепарину.

Schafer et al. (Schafer et al., 1984, Infec. Immun. 53:651) назвали этот белок катионным противомикробным белком (САР37) благодаря его противомикробной активности. НВР крепко связывается с липидным А-компонентом LPS и эндотоксином (K_ass=0,8×10⁹ М^-1). Было высказано предположение, что бактерицидный эффект НВР обусловлен связыванием с липидом A (Petersen et al., 1993, Eur. J. Biochem. B214: 271-279, Flodgaard et al., 1994, J. Cell. Biochem. Suppl. 18A: Abstr. E505; Pereira et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 4733-4737). Предполагаемый сайт связывания нативного НВР с липидом A/LPS локализован в виде незаряженного участка между основным и кислотным участками на НВР и содержит остатки 20-26 и 41-43. В сайте связывания липид A/LPS Phe25, Cys26, Cys42, и Phe43 образуют гидрофобный карман, пригодный для связывания либо цепей жирной кислоты, либо гликозаминильного сахарного кольца липида А. Рядом с этим карманом расположен ионный и гидрофильный карман (Asn20, Gln21, и Аrg23), который должен весьма хорошо подходить для связывания гликозаминил-связанной фосфатной группы липида A (Iversen et al., 1997, Nature Struct Biology 4: 265-268).

Более того, на животных моделях фекального перитонита было показано, что лечение НВР спасает мышей от летального повреждения (Mercer-Jones et al., 1996, In Surgical Forum, pp. 105-108 and Wickel et al., 1997, In 4^m International Congress on the Immune Consequences of Trauma, Shock and Sepsis, Munich, Germany, pp.413-416). В результате было выдвинуто предположение, что гепарин-связывающий белок или его LPS-связывающие фрагменты могут быть использованы для лечения септического шока (WO 95/28949, US Pat. Nos. 5458874, 5607916 and 5650392).

Первоначально НВР изучали в связи с тем, что он обладает антибиотическими и LPS-связывающими свойствами (Gabay et al. 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86:5610-5614 and Pereira et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 4733-7). Однако накопившиеся данные в настоящее время подтверждают концепцию, что НВР, кроме его бактерицидной роли, вовлечен в процесс развития воспаления благодаря его воздействию на рекрутмент и на активацию моноцитов (Pereira et al., 1990, J. Clin. Invest. 85:1468-1476 and Rasmussen et al., 1996, FEBS Lett. 390:109-112), рекрутинг Т-клеток (Chertov et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 2935-2940).

Было обнаружено, что НВР индуцирует сокращение эндотелиальных клеток и фибробластов (Ostergaard and Flodgaard, 1992, J. Leuk.Biol. 51: 316-323). В этой связи в WO 93/05396 описывается способ скрининга ингибиторов НВР путем инкубации НВР или клеток, продуцирующих НВР, в присутствии вещества, у которого предполагалось наличие свойств ингибитора НВР, и в присутствии ткани или клеток, которые способны взаимодействовать с НВР; ослабленное взаимодействие (например, сокращение эндотелиальных клеток) указывает на то, что это вещество является ингибитором НВР.

В заявке WO 99/26647 описано применение гепарин-связывающего белка в модулировании или профилактике апоптоза клеток млекопитающих. В этой заявке описано также, что НВР спасает клетки инсулиномы крысы от IL-1-индуцированного апоптоза.

Было также обнаружено, что гепарин-связывающий белок человека, в отличие от гепарин-связывающего белка свиньи, связывается с апротинином (BPTI) (Petersen et al., Eur. J. Biochem. 214:271-279). В частности, BPTI обладает способностью связывать НВР с K_d=0,1×10^-6 M (Petersen et al., 1993, Eur. J. Biochem. B214: 271-279). P1-специфичность НВР, как было показано, в первую очередь связана с Lys или Leu (Kiczak et al., 1999, Biol. Chem. 380: 101-105). Было выдвинуто предположение, что наиболее характерными остатками в структуре НВР, которые ответственны за связывание BPTI, являются Gly169, Gly175, Ser192, и Asp201, в соответствии с Asp189, Ser195, Gly216, и Asp226 в трипсине (Petersen et al., 1993, Eur. J. Biochem. B214: 271-279). Kiczak et al., 1999, Biol. Chem. 380:101-106, используя методы фагового распределения, сконструировали библиотеку мутантов боковой цепи Р1 апротинина. Этими исследователями обнаружено, что НВР обладает большой аффинностью в отношении Р1 Lys, так же, как и в отношении незаряженных аминокислот P1 - Leu, Thr, Met, Gin.

Краткое содержание изобретения

Случайно было обнаружено, что гепарин-связывающий белок (НВР) служит сигналирующим звеном в индуцированной нейтрофилами проницаемости сосудов и в активации фазово-контактной системы с одновременным образованием брадикинина и что это, в частности, влияет на опосредованное РК расщепление НК с получением брадикининовой последовательности. Кроме того, было показано, что антагонисты НВР уменьшают проницаемость эндотелиальных клеток. Как здесь показано, "антагонистом НВР" является вещество, которое связывается с гепарин-связывающим белком и ингибирует действие гепарин-связывающего белка.

Данное изобретение направлено на способ лечения или предотвращения заболеваний, происходящих в результате высвобождения брадикинина у млекопитающего, в частности, у больного человека, в частности, у млекопитающего, у которого продуцируется гепарин-связывающий белок, который связывается с антагонистом НВР, включающий в себя введение указанному млекопитающему, в случае необходимости, антагониста гепарин-связывающего белка в количестве, эффективном для модуляции или снижения уровня высвобождения брадикинина у указанного млекопитающего. Такие заболевания включают в себя, не ограничиваясь ими, синдром системной воспалительной реакции, ишемическую реперфузию, анафилаксию и отторжение аллотрансплантата. Такие заболевания могут также включать в себя респираторный дистресс-синдром взрослых как побочный эффект синдрома системной воспалительной реакции. Анафилаксия может возникать на фоне нежелательной активации ПМЯ в процессе искусственного кровообращения, легочной хирургии, травмы головы и общей травмы всего организма. Модуляция или снижение степени высвобождения брадикинина происходит в результате предотвращения контакта НВР с эндотелиальными клетками и/или с фазово-контактной системой. В особом аспекте антагонист НВР модулирует или снижает опосредованное калликреином расщепление Н-кининогена с получением брадикининовой последовательности. Далее, изобретение направлено на применение антагониста НВР для изготовления лекарственного средства, применимого для лечения синдрома системной воспалительной реакции, ишемической реперфузии, анафилаксии и отторжения аллотрансплантата у больного, имеющего НВР, который связывается с антагонистом НВР. Антагонисты НВР могут, кроме того, быть использованы для лечения или изготовления лекарственного средства, применимого для лечения осложнения синдрома системной воспалительной реакции, респираторного дистресс-синдрома взрослых.

В особом аспекте изобретение направлено на способ предотвращения заболеваний, происходящих в результате высвобождения брадикинина у млекопитающего, в частности, у больного человека, в частности, у млекопитающего, у которого продуцируется гепарин-связывающий белок, который связывается с антагонистом НВР, включающий в себя введение указанному млекопитающему, в случае необходимости, домена ингибитора сериновой протеиназы наподобие сериновой протеиназы Кунитца или его аналога или производного, которое связывается с НВР, в количестве, эффективном для модуляции или снижения высвобождения брадикинина у указанного млекопитающего.

В другом, особом, аспекте данное изобретение направлено на способ предотвращения заболеваний, происходящих в результате высвобождения брадикинина у млекопитающего, в частности, у больного человека, в частности, у млекопитающего, у которого продуцируется гепарин-связывающий белок, который связывается с моноклональным антителом, которое связывается по меньшей мере с одним эпитопом на НВР, причем указанный эпитоп связывается с прекалликреин-Н-кининогеновым комплексом и активирует высвобождение брадикинина, включающий в себя введение указанному млекопитающему, в случае необходимости, моноклонального антитела, которое связывается по меньшей мере с одним эпитопом на НВР, причем указанный эпитоп связывается с прекалликреин-Н-кининогеновым комплексом и активирует высвобождение брадикинина, в количестве, эффективном для модуляции или снижения высвобождения брадикинина у указанного млекопитающего.

Данное изобретение, далее, направлено на обнаружение антагониста НВР. В одном из аспектов указанный способ включает в себя (а) культивирование эндотелиальных клеток в присутствии НВР и в присутствии и в отсутствие вещества, которое предположительно является указанным антагонистом, и (b) обнаружение любого действия указанного вещества на проницаемость эндотелиальных клеток, причем сниженная проницаемость указанных эндотелиальных клеток по сравнению с проницаемостью указанных клеток, когда их инкубируют в присутствии НВР, но в отсутствие указанного вещества, указывает на то, что указанное вещество является антагонистом. В другом аспекте указанный способ включает в себя (а) инкубирование НВР в присутствии первого вещества, которое взаимодействует с НВР, и второго вещества, которое по предположению является антагонистом НВР, и (b) обнаружение любого действия указанного второго вещества, которое по предположению является антагонистом НВР, на взаимодействие НВР с указаным первым веществом.

В особом аспекте данное изобретение направлено на способы идентификации моноклонального антитела, которое связывается по меньшей мере с одним эпитопом на НВР, в частности, НВР человека, причем указанный эпитоп связывается с прекалликреин-Н-кининогеновым комплексом и активирует высвобождение брадикинина. В одном из аспектов указанный способ включает в себя (а) культивирование эндотелиальных клеток в присутствии НВР и в присутствии и в отсутствие моноклонального антитела, которое предположительно связывается по меньшей мере с одним эпитопом НВР, в частности, НВР человека, причем указанный эпитоп связывается с прекалликреин-Н-кининогеновым комплексом и активирует высвобождение брадикинина, и (b) обнаружение любого действия указанного вещества на проницаемость эндотелиальных клеток, причем сниженная проницаемость указанных эндотелиальных клеток по сравнению с проницаемостью указанных клеток, когда их инкубируют в присутствии НВР, но в отсутствие указанного антитела, указывает на то, что указанное антитело является моноклональным антителом, которое связывается, по меньшей мере, с одним эпитопом НВР, причем указанный эпитоп связывается с прекалликреин-Н-кининогеновым комплексом и активирует высвобождение брадикинина. В другом аспекте указанный способ включает в себя (а) инкубирование прекалликреин-Н-кининогенового комплекса в присутствии НВР и в присутствии и в отсутствие моноклонального антитела, которое предположительно связывается, по меньшей мере, с одним эпитопом на НВР, в частности, НВР человека, причем указанный эпитоп связывается с прекалликреин-Н-кининогеновым комплексом и активирует высвобождение брадикинина, и (b) обнаружение любого действия указанного антитела на высвобождение брадикинина, причем сниженное высвобождение брадикинина указывает на то, что указанное антитело связывается, по меньшей мере, с указанным эпитопом на НВР.

Данное изобретение направлено также на способы и наборы для определения того, продуцируют ли млекопитающие НВР, который связывается с антагонистом НВР. Метод включает в себя следующие стадии: (а) выделение НВР или клеток или тканей, продуцирующих НВР, из млекопитающего, в частности больного человека; (b) инкубирование указанного НВР или клеток или тканей, продуцирующих НВР, с веществом, тканью, клетками или их компонентами, которые взаимодействуют с НВР и указанным антагонистом НВР, и (с) обнаружение воздействия указанного гепарин-связывающего антагониста на взаимодействие НВР с указанным веществом, тканью, клетками или их компонентами, причем сниженное взаимодействие указывает на то, что указанное НВР связывается с указанным антагонистом НВР. Набор для тестов включает (а) антагонист НВР; (b) нативный НВР и (с) вещество, ткань, клетки или их компонент, которые взаимодействуют с НВР.

В особом аспекте данное изобретение направлено также на способы и наборы для определения того, продуцирует ли млекопитающее, в частности больной человек, НВР, который связывается с моноклональным антителом, которое связывается по меньшей мере с одним эпитопом на нативном НВР, в частности, НВР человека, причем указанный эпитоп связывается с прекалликреин-Н-кининогеновым комплексом и активирует высвобождение брадикинина, включающие в себя (а) выделение НВР или клеток или тканей, продуцирующих НВР, из указанного млекопитающего; (b) культивирование указанного НВР или клеток или тканей, продуцирующих НВР, с эндотелиальными клетками в присутствии или в отсутствие указанного антитела, и (с) обнаружение любого воздействия указанного антитела на проницаемость эндотелиальных клеток, причем сниженная проницаемость указывает на то, что НВР связывается с указанным антителом. В другом аспекте способ включает в себя (а) выделение НВР или клеток или тканей, продуцирующих НВР, из указанного млекопитающего; (b) инкубирование указанного НВР или клеток или тканей, продуцирующих НВР, с прекалликреин-Н-кининогеновым комплексом в присутствии или в отсутствие указанного антитела, и (с) обнаружение любого воздействия указанного НВР на высвобождение брадикинина из прекалликреин-Н-кининогенового комплекса, причем сниженное высвобождение брадикинина указывает на то, что указанный НВР связывается с указанным антителом. Набор согласно изобретению включает в себя (а) моноклональное антитело, которое связывается по меньшей мере с одним эпитопом на нативном НВР, в частности, с НВР человека, причем указанный эпитоп связывается с прекалликреин-Н-кининогеновым комплексом и активирует высвобождение брадикинина, (b) нативный НВР человека, и (с) прекалликреин-Н-кининогеновый комплекс, прикрепленный к твердому носителю.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 показан эффект перекрестного связывания CD 18 со вторичным козьим антителом против мышиного F{аb}₂.

На фиг.2 показан зависимый от дозы эффект НВР (25-75 мкг/мл) на проницаемость монослоев эндотелиальных клеток.

На фиг.3 показано ингибирование НВР-индуцированного увеличения проницаемости эндотелиальных клеток (ЭК) поликлональной антисывороткой против НВР.

На фиг.4 показано, как влияют антитела против НВР на функцию эндотелиального барьера под действием продуктов секреции полиморфно-ядерных лейкоцитов (ПМЯ).

На фиг.5 показано ингибирование вызванного брадикинином и НВР увеличения проницаемости ЭК под действием моноклонального антитела МВК3 против брадикинина. Брадикинин (100 нМ; фиг. 5а) или НВР (75 мкг/мл; фиг.5b) вводили во время, соответствующее нулю, в боковую пластинку монослоев эндотелиальных клеток, проинкубированных в присутствии mAb МВК3 (40 мкг/мл).

На фиг.6 показано ингибирование вызванного НВР увеличения проницаемости ЭК под действием моноклонального антитела РКН4 против калликреина плазмы. НВР (75 мкг/мл; заполненные кружочки) или брадикинин (100 нМ; полые кружочки).

На фиг.7 показано ингибирование вызванного НВР увеличения проницаемости ЭК под действием обработки пептидом НКН20.

На фиг.8 показано ингибирование вызванного НВР увеличения проницаемости ЭК при обработке пептидом SDD31.

На фиг.9 показано ингибирование вызванного НВР увеличения проницаемости ЭК при обработке апротинином.

Фиг.10: высвобождение Il-6 из моноцитов человека. Моноциты культивировались в 1 мл бессывороточной среды в течение 24 часов в присутствии LPS и/или нативного НВР /[R23S, F25E]HBP/ [G175Q] HBP в количествах, указанных на фигуре.

Фиг.11: Насыщение нативного НВР, [R23S,F25E]HBP и [G175Q]HBP (A) ³H-LPS и (В) конкуренцией за связывание ¹²⁵I-BPTI фиксированными, увеличивающимися концентрациями немеченого BPTI. (С) Концентрации ¹²⁵I-BPTI показаны при 0 нМ % немеченого BPTI. Кажущееся различие в связывании между НВР и [R23S,F25E]HBP обсуждается в разделе "Результаты". Стрелками показаны стандартные отклонения.

Подробное описание изобретения

Гепарин-связывающий белок

В данном контексте термин "гепарин-связывающий белок" ("НВР") означает белок, который (i) протеолитически неактивен; (ii) содержался в азурофильных гранулах полиморфно-ядерных лейкоцитов; и (iii) является хемоаттрактантом для моноцитов и/или активирует моноциты. НВР может, соответственно, являться белком млекопитающего, в частности человека. В частности, НВР представляет собой зрелый НВР человека, имеющий по меньшей мере примерно 80% идентичность с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:1, более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 90%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 95%, и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, примерно 97% (далее в описании "гомологичные полипептиды"), которые качественно сохраняют активность НВР.

SEQ ID NO:1:

Аминокислотные последовательности гомологичных полипептидов отличаются от аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:1, включением или делецией одного или более аминокислотных остатков и/или заменой одного или более аминокислотных остатков различными аминокислотными остатками. Предпочтительно, чтобы изменения аминокислот имели второстепенную природу, т.е. чтобы имели место такие консервативные аминокислотные замены, которые не оказывают существенного влияния на пространственную упаковку и/или активность протеина; малые делеции, обычно порядка 30 аминокислот; малые амино- или карбокси-концевые привески, такие как амино-концевой метиониновый остаток; малый линкерный пептид, состоящий примерно из 20-25 остатков; или малый привесок, который облегчает очистку путем изменения нейтрального заряда или выполняющий другую функцию, такой как полигистидиновый тракт, антигенный эпитоп или связывающий домен.

Примеры консервативных замен заключены в пределах группы основных аминокислот (таких как аргинин, лизин и гистидин), кислых аминокислот (таких как глутаминовая кислота и аспарагиновая кислота), полярных аминокислот (таких как глутамин и аспарагин), гидрофобных аминокислот (таких как лейцин, изолейцин и валин), ароматических аминокислот (таких как фенилаланин, триптофан и тирозин) и малых аминокислот (таких как глицин, аланин, серин, треонин и метионин). Аминокислотные замены, которые обычно не изменяют специфическую активность, известны в данной области и описаны, например, у Н. Neurath and R.L. Hill, 1979, в The Proteins, Academic Press, New York. Наиболее часто происходят следующие замены: Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly, и наоборот.

Этот термин специально введен для того, чтобы включить пептидные фрагменты НВР, в частности, фрагменты, имеющие хемотаксический эффект, сходный с таковым самого НВР. Более того, НВР, используемые в способах согласно настоящему изобретению, связываются с антагонистами НВР, такими как апротинин и/или моноклональное антитело, вырабатываемое против нативного НВР человека. Нативный НВР человека в его зрелой форме имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:1, и кроме того, является (i) протеолитически неактивным; (ii) содержащимся в азурофильных гранулах полиморфно ядерных лейкоцитов; и (iii) является хемоаттрактантом для моноцитов и/или активирует моноциты.

НВР может быть выделен из тромбоцитов крови, полученных из крови человека с применением способов, описанных в патенте США №5814602. Более конкретно, белок получен путем фракционирования экстракта тромбоцитов крови. Для этой цели применяется колоночная хроматография с использованием гепарин-сефарозы. Такой метод хроматографии, включающий в себя элюирование с колонки в градиенте NaCI от 0,5 М вплоть до 3 М, через которую сначала был пропущен экстракт тромбоцитов крови, дает в результате такой элюции два пика. Первый пик в области 1,2 М NaCI можно было зарегистрировать при 280 нм в виде широкого протеинового пика, который представляет собой известный сам по себе тромбоцитарный фактор (PF<). В области 1,8 М NaCI количество протеина ниже предела регистрации для используемой системы, но фракции в этой области обладают ангиогенной активностью. Активные фракции дополнительно очищали, используя микропробу, с помощью ВЭЖХ с обратимой фазой на колонке С₄, и при 214 нм регистрировали полностью очищенный протеиновый пик; этот протеин оказался идентичным присутствующим НВР, будь то НВР свиного или человеческого типов, в зависимости от типа используемых тромбоцитов.

Если НВР используется для обнаружения антагонистов НВР, предпочтительно, чтобы он был получен методом рекомбинантной ДНК, как указано ниже. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая НВР, может быть получена искусственным путем с помощью установленных стандартных методов, например, фосфоамидитного метода, описанного S.L Beaucage and M.H. Caruthers, 1981, Tetrahedron Letters 22:1859-1869, или метода, описанного Matthes et al., 1984, EMBO Journal 3: 801-805. Согласно фосфоамидитному методу, олигонуклеотиды были синтезированы, например, в автоматическом ДНК-синтезаторе, очищены, гибридизованы, лигированы и клонированы в соответствующие векторы.

Методы, используемые для выделения или клонирования последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей гепарин-связывающий белок, используемый в способе согласно настоящему изобретению, хорошо известны в данной области и включают в себя выделение из геномной ДНК, получение из кДНК или их комбинацию. Клонирование последовательностей нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению из таких геномных ДНК может быть реализовано, например, с использованием хорошо известной полимеразно-цепьевой реакции (PCR) или скрининга библиотек экспрессии антител для регистрации клонированных фрагментов ДНК с частичными структурными свойствами (см., например, Innis et al., 1990, A Guide to Methods and Application, Academic Press, New York). Можно использовать и другие способы амплификации нуклеиновой кислоты, такие как лигазно-цепьевая реакция (LCR), лигированная активированная транскрипция (LAT) и амплификация на основе последовательности нуклеиновой кислоты (NASBA).

Затем последовательность нуклеиновой кислоты включается в рекомбинантный вектор экспрессии, который может представлять собой любой вектор, который будет удобен для проведения методов рекомбинантной ДНК. Выбор вектора часто зависит от клетки-хозяина, в которую он будет включен. Так, вектор может быть автономно реплицирующимся вектором, т.е. вектором, который существует в виде внехромосомного вещества, и репликация которого не зависит от хромосомной репликации, например, плазмида. Альтернативно, в качестве вектора может быть выбран такой вектор, который при введении его в клетку-хозяина интегрируется в хозяйский геном и реплицируется вместе с хромосомой(ами), в которую он интегрировался.

Последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:2, кодирующая последовательность SEQ ID NO:1, может быть оперативно связана с нуклеиновой кислотой, кодирующей гетерологичную про- и/или сигнальную последовательность. Альтернативно, нуклеиновая кислота, кодирующая SEQ ID NOS: 4 (сигнальная последовательность + зрелый HBF) и 6 (сигнальная последовательность + про-последовательность + зрелый НВР), SEQ ID NOS: 3 и 5, соответственно, могут быть включены в рекомбинантный вектор.

Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая НВР, может быть также оперативно связана с соответствующим терминатором, таким как терминатор гормона роста человека (Palmiter et al., op. cit.) Вектор может дополнительно содержать другие элементы. Последние включают в себя сигналы полиаденилирования (например, из SV 40 или из области 5 Elb аденовируса), транскрипционные энхансерные последовательности (например, энхансер SV 40) и трансляционные энхансерные последовательности (например, последовательности, кодирующие РНК аденовируса VA). Рекомбинантный экспрессирующий вектор может также содержать последовательность ДНК, позволяющую вектору реплицироваться в клетке соответствующего хозяина. Вектор может также включать в себя селективный маркер, например ген, продукт которого восполняет дефект в клетке-хозяине, такой как ген, кодирующий дигидрофолатредуктазу (DHFR), или же такой ген, который придает резистентность к лекарству, например, неомицину, генетицину, ампициллину или гигромицину.

В особом аспекте НВР может продуцироваться культивируемыми хозяйскими клетками, содержащими последовательность ДНК, кодирующую зрелый НВР, которому предшествует N-концевая добавка в соответствующей культуральной среде в условиях, допускащих экспрессию НВР, в таком случае НВР получают из культуральной среды в виде НВР, содержащего дополнительный вставочный материал на N-конце.

N-концевая добавка может представлять собой последовательность примерно от 5 до 25 аминокислотных остатков, в частности примерно от 8 до 15 аминокислотных остатков. Природа аминокислотных остатков в N-концевой последовательности не считается критической.

Для того чтобы облегчить получение зрелого НВР, обычно считается предпочтительным, чтобы последовательность ДНК, кодирующая N-концевую добавку, включала в себя последовательность ДНК, кодирующую сайт, подверженный протеолитическому расщеплению, локализованный между последовательностью ДНК, кодирующей N-концевую добавку, и последовательностью ДНК, кодирующей зрелый НВР. Примерами соответствующих сайтов протеолитического расщепления являются сайт расщепления энтерокиназой с аминокислотной последовательностью, сайт расщепления фактором Ха с аминокислотной последовательностью.

Альтернативно, хозяйские клетки, содержащие ДНК, кодирующую зрелый НВР, предваряемый сигнальной последовательностью, могут быть культивированы в соответствующей культуральной среде в условиях, допускающих экспрессию НВР, и результирующий НВР получают из культуральной среды в виде зрелого НВР.

Процедура, используемая для лигирования последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих НВР или НВР с N-концевой добавкой, Дпро-НВР (сигнал + зрелый НВР), промотора и терминатора, соответственно, и для включения их в соответствующие векторы, содержащие информацию, необходимую для репликации, хорошо известны специалистам в данной области (ср., например, Sambrook et al., цитир).

Хозяйская клетка(и), в которую вводится вектор экспрессии, может быть любой клеткой(ами), которая способна продуцировать НВР и предпочтительно является эукариотической клеткой(ами), такой как клетка(и) беспозвоночных (насекомых) или клетка(и) позвоночных, например, клетка(и) млекопитающих, в частности, клетка(и) насекомых и клетка(и) млекопитающих. В предпочтительном аспекте, клетка млекопитающего представляет собой клетку, которую можно культивировать в анаэробных условиях после трансфекции нуклеиновой кислотой, кодирующей НВР млекопитающего. В более предпочтительном аспекте, клетка млекопитающего представляет собой трансформированную аденовирусом клетку(и) или клетку(и), полученную из эмбриона. В данном контексте, клетка, полученная из эмбриональной клетки, представляет собой клетку(и), полученную из первичной культуры эмбриональных клеток, или клетку(и), полученную из клеточной линии, первоначально пересеянную из первичной культуры эмбриональных клеток. Примером такой трансформированной аденовирусом клетки или клетки, полученной из эмбриона, является клетка(и) эмбриональной почки человека (НЕК), в частности, клетка НЕК 293. Среди клеток насекомого такими клетками могут быть, например, клетки Lepidoptera или Drosophila.

Методы трансфекции клеток млекопитающих и экспрессии последовательностей ДНК, введенных в эти клетки, описаны, например, у Kaufman and Sharp, 1982, J. Mol. Biol. 159:601-621; Southern and Berg, 1982, J. Mol. Appl. Genet. 1:327-341; Loyter et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:422-426; Wigler et al., 1978, Cell 14:725; Corsaro and Pearson, 1981, Somatic Cell Genetics 7:603, Graham and van der Eb, 1973, Virology 52:456; Fraley et al., 1980, JBC 225:10431; Capecchi, 1980, Cell 22:479; Wiberg et al., 1983, NAR 11:7287; and Neumann et al., 1982, EMBO J. 1:841-845. Клетки насекомого могут быть соответствующим образом трансфицированы бакуловирусным вектором, как описано в патенте США №4745051.

Используемая для культивирования клеток среда может быть любой из обычно используемых сред, подходящих для роста клеток млекопитающих, таких как среда с содержанием сыворотки или бессывороточная среда, содержащая соответствующие добавки, или среда, подходящая для роста клеток млекопитающих. Необходимые среды можно приобрести в торговых фирмах или же приготовить самим в соответствии с опубликованными прописями (например, в каталогах Американской Коллекции Типовых Культур). Затем клетки подвергаются скринингу на резистентность к антибиотикам. После этого отобранные клоны подвергают анализу на определение активности НВР с использованием известных в данной области методов, таких как определение хемотаксической активности и анализ высвобождения цитокинов из моноцитов (см., например, Rasmussen et al., 1996, FEBS Lett. 390:109-112).

Продуцируемый клетками НВР может затем быть получен из культуральной среды с помощью обычных методов, включая отделение хозяйских клеток от среды путем центрифугирования или фильтрации, осаждение белковых компонентов супернатанта или фильтрата с помощью соли, например, сульфата аммония, очистку различными хроматографическими методами, например, методом ионообменной хроматографии, аффинной хроматографии и т.п.

Если НВР имеет N-концевую добавку, после его получения из культуральной среды N-концевая добавка НВР может быть успешно отщеплена под действием подходящей для этого протеиназы; и в результате получается зрелый (и активный) НВР. Примеры соответствующих ферментов включают в себя, не ограничиваясь ими, энтерокиназу и фактор Ха.

АНТАГОНИСТЫ НВР

Антагонисты НВР могут быть либо поликлональными антителами против НВР, либо моноклональными антителами против НВР. Для получения поликлональных антител против НВР могут быть использованы следующие процедуры. Для получения антител можно иммунизировать животных разных типов, используя их в качестве хозяина, путем инъецирования им НВР, предпочтительно НВР человека, включая, но не ограничиваясь ими, кроликов, мышей, крыс, овец, коз и т.д. В одном из аспектов, НВР может быть конъюгирован с иммуногенным носителем, например, бычьим сывороточным альбумином (BSA) или гемоцианином моллюска keyhole limpet (KLH). Для