Анализ аналитов с использованием частиц в качестве метки

Анализ аналитов с использованием частиц в качестве метки

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение относится к способу детектирования и измерения одного или более аналитов в образце. Способ основан на использовании некоторых частиц специфического состава, размера и формы и на детектировании и/или измерении одного или более свойств светорассеяния частицы. Детектирование и/или измерение свойств светорассеяния частиц коррелируется с присутствием и/или количеством, или с отсутствием одного или более аналитов в образце. Настоящее изобретение может применяться в той или другой форме для того, чтобы детектировать и измерять один или более аналитов в образце.

Предшествующий уровень техники

Ниже приводится описание существующих методов детектирования. Приводится также краткий обзор соответствующей области науки, благодаря которому читатель может иметь более четкое представление о заявленном изобретении. При этом не следует считать, что каждая из цитируемых предшествующих работ является прототипом данной заявки. Цитируемая литература вводится в настоящее описание посредством ссылки для того, чтобы не описывать вновь общие процедуры и методы, которые относятся к данной области техники и которые используются для осуществления настоящего изобретения. В частности, заявитель вводит те разделы цитируемых источников, которые относятся к общим методам, основанным на использовании "пары связывания", и к методам измерения рассеяния света, используемым в настоящей заявке.

Чувствительные анализы аналитов

Техника, основанная на использовании "пары связывания" (называемой также парой "лиганд-рецептор", связывающейся по принципу молекулярного распознавания, и т.п.), играет важную роль во многих применениях биомедицинских анализов, а также имеет большое значение в областях науки об окружающей среде, в ветеринарии, в фармацевтических исследованиях, в области контроля за качеством пищевых продуктов и воды и т.п. Для детекции аналитов, присутствующих в низких концентрациях (менее чем около 1 пикомоль на объем исследуемого образца), часто используют флюоресцентные, люминесцентные, хемилюминесцентные или электрохемилюминесцентные метки и методы их детекции.

Для детекции низких концентраций аналитов в целях диагностики хороший эффект дают широко используемые методы хемилюминесценции и электрохемилюминесценции. Эти методы хемилюминесценции и электрохемилюминесценции позволяют обнаруживать низкие концентрации аналитов путем амплификации ряда люминесцентных молекул или фотон-генерирующих многократных событий, что приводит затем к "усилению сигнала", позволяя обнаруживать аналиты низкой концентрации.

Кроме того, метод с использованием полимеразной цепной реакции (PCR) и другие подобные методы широко используются для амплификации ряда нуклеиновокислотных аналитов в образце. Путем добавления соответствующих ферментов и реагентов, а также использования методов термоциклизации ряд анализируемых молекул нуклеиновых кислот могут быть амплифицированы так, что этот аналит может быть обнаружен с применением наиболее известных детектирующих устройств. Высокий уровень экономической активности, направленной на разработку новых систем генерирования сигнала и детекции, а также на разработку новых типов тест-наборов и оборудования с использованием усиления сигнала и амплификации молекул аналита свидетельствует о важности и необходимости разработки чувствительных методов детекции.

Однако вышеуказанные методы усиления сигнала и амплификации молекул аналита связаны с некоторыми ограничениями, которые усложняют детекцию аналитов с применением этих методов, делают их трудоемкими для использования, требуют больших затрат времени и являются дорогостоящими. Проблемы, связанные с влиянием химических или ферментативных реакций, загрязнением окружающей среды, усложнением и многостадийностью процедур, ограниченной адаптируемостью до одной стадии "гомогенных" (без выделения) режимов, и требованием дорогостоящего и сверхточного оборудования относятся к тем областям деятельности, которые постоянно нуждаются в усовершенствовании.

Таким образом, имеется крайняя необходимость в разработке легких в применении, количественных, многоаналитных и недорогостоящих методов и устройств, которые могут быть использованы для детекции аналитов. Эти методы, тест-наборы и оборудование не должны иметь вышеуказанных недостатков и ограничений уже существующих методов усиления сигнала и амлификации молекул аналита и должны быть пригодными для использования в исследованиях, в отдельных случаях экстренной помощи {в кабинете врача, в кабинете неотложной помощи, в полевых условиях и т.п.) и в высокопроизводительных тестах.

В основу настоящего изобретения поставлена задача разработки новых средств для более легкой детекции одного или нескольких аналитов в образце, присутствующих в более низких концентрациях, чем это было возможно ранее. С помощью настоящего изобретения могут быть обнаружены низкие концентрации аналитов без необходимого ранее усиления сигнала или амплификации молекулы аналита.

Настоящее изобретение относится к сигнальной и детектирующей системе для обнаружения аналитов, при которой могут быть упрощены процедуры и уменьшено количество и типы стадий и реагентов. Настоящее изобретение относится к количественной детекции одного или множества аналитов в образце. Настоящее изобретение также относится к значительному снижению числа различных тестов и количества анализируемого материала образца. Такое снижение числа отдельных тестов приводит к снижению материальных затрат и отходов производства, особенно тех отходов медицинской промышленности, которые нуждаются в утилизации.

Методы детекции, основанные на рассеянии света, и свойства частиц, рассеивающих свет

Имеется большое количество данных, касающихся явления рассеяния света частицами; использования меток, состоящих из частиц, для диагностических анализов; и использования методов, основанных на рассеянии света, в диагностических анализах, которые обсуждаются в нижеследующем описании, ни один из которых не рассматривался ранее до подачи настоящей заявки. Указанный предшествующий уровень техники свидетельствует о новизне и ценности заявленного изобретения.

Общее исследование рассеяния света относится к очень обширной области науки. Примерно за последние сто лет или около того явлению рассеяния света были посвящены интенсивные исследования, и применение имеющейся информации о рассеянии света к различным аспектам человеческой деятельности получило широкое распространение и менялось со временем.

Классическая теория рассеяния света небольшими гомогенными и не поглощающими свет сферическими частицами, размеры которых составляют около 1/20 или менее от длины волны падающего излучения, была впервые разработана Релеем. Позже Ми разработал более общую феноменологическую теорию рассеяния света гомогенными сферическими частицами любого размера и состава. Теорию Ми применяют как к поглощающим свет, так и не поглощающим свет частицам. Исходя из теории Ми было также показано, что уравнения Рэлея могут быть легко обобщены так, что они могут быть применены для частиц, которые поглощают свет, при условии, что эти частицы являются значительно меньше, чем длина волны падающего света. Для частиц такого небольшого диаметра теория Ми и обобщенная теория Рэлея дают одинаковые результаты. Рассеяние света (упругое) может быть рассмотрено с классической или квантомеханической точки зрения. Прекрасное количественное описание может быть получено с точки зрения классической теории.

Исторические предпосылки, а также описание фундаментальной теории рассеянного света и другого электромагнитного излучения приводится в нижеследующих работах: Absorbtion and Scattering of Light By Small Particles (1983), C.F.Bohren, D.R.Huffman, John Wiley and Sons; The Scattering of Light and Other Electromagnetic Radiation (1969), M. Kerker, Academic Press.

Дополнительная известная информация, касающаяся явления рассеяния света, может быть найдена в нижеследующих публикациях.

В работе Zsigmondy, Colloids and the Ultramicroscope - A Manual of Colloid Chemistry and Ultramicroscopy 1914, John Wiley & Sons, Inc. описаны различные светорассеивающие свойства частиц золота и частиц других типов.

В работе Hunter, Foundation of Colloid Science, Vol.1, 105, 1991 описано использование оптических микроскопов, ультрамикроскопов и электронных микроскопов для наблюдения частиц.

В работе Shaw et al., Introduction to Colloid and Surface Chemistry 2nd ed., 41, 1970 описаны оптические свойства коллоидов и использование электронной микроскопии и микросколии по методу затемненного поля, например ультрамикроскопа.

В работе Stolz, SpringerTracts, Vol.130 описана методика анализа рассеяния света.

В работе Klein and Metz, 5 Photographic Science and Engineering 5-11, 1961 описан цвет коллоидных частиц серебра в желатине.

В работе Eversole and Broida, 15 Physical Review 1644-1654, 1977 описано влияние размера и формы на рассеяние света частицами различных металлов, такими как серебро, золото, и медь.

В работе Kreibig and Zacharias, 231 Z. Physik 128-143, 1970 описан поверхностно-плазменный резонанс в небольших сферических частицах серебра и частицах золота.

В работе Bloemer et al., 37 Physical Review 8015-8021, 1988 описаны оптические свойства серебряных игл субмикрометрового размера и использование этих игл, как указано в патенте США (Bloemer) 5151956, где описан поверхностно-плазменный резонанс небольших металлических частиц, используемый для поляризации света, распространяющегося в волноводе.

В работе Wiegel., 136 Zeitschrift fur Physik, Bd., 642-653, 1954 описан цвет коллоидного серебра и его использование в электронной микроскопии.

Использование частиц, рассеяния света и других методов для детекции аналитов

За последние примерно тридцать пять лет частицы металла, включая золото и серебро, использовались в качестве агентов для усиления контраста или в качестве светопоглощающих меток во многих аналитических и/или диагностических методах различного типа. Подавляющее большинство этих методов подпадает под категорию цитоиммунохимических исследований, в которых частицы золота или частицы, усиленные серебром частицы золота, используются в качестве маркеров для исследования структурных аспектов клеточной, субклеточной или тканевой организации. В этих исследованиях частицы металлов и их локализация обычно детектируются методами электронной микроскопии, включая сканирование, передачу сигнала и BEI (визуализацию посредством обратнорассеянных электронов). Эти методы имеют то преимущество, что в них для облегчения детекции частиц золота используются металлы с большой электронной плотностью или металлы с высоким атомным номером благодаря большому числу вторичных и обратнорассеянных электронов, генерируемых этими плотными металлами {см. Hayat, Immunogold-silver staining reference Page 1, and Chepters 1, 6, 15; и Hayat, Colloid Gold reference Chapters 1, 5, 7 и другие).

Имеется несколько работ, посвященных использованию золотых и усиленных серебром золотых частиц в микроскопических исследованиях света. Так, например, в 1978 золотые частицы были использованы в качестве иммунного золотого красителя для детекции с помощью оптической микроскопии. В обзоре использования золотых частиц в оптической микроскопии (см. Hayat, Immunogold-silver staining reference Page 3), опубликованном в 1995, обсуждается эта работа 1978 и представлен следующий анализ: "Geoghehan и др. (1978) были первыми, кто использовали красный или розовый цвет золей коллоидального золота в иммунологическом методе окрашивания золотом с использованием парафиновых срезов. В полимерных полутонких срезах красная окраска света, рассеянного золотыми частицами, имеющими размер до 14 нм, наблюдалась с помощью оптического микроскопа в клеточных органеллах, содержащих высокие концентрации меченых антигенов (Lucocq & Roth, 1984). Поскольку чувствительность иммунологического метода окрашивания золотом гораздо ниже по сравнению с другими иммуноцитохимическими методами, то этот метод не получил широкого применения; при этом визуализировать розоватую окраску золотого покрытия довольно трудно."

В этом параграфе имеется указание на существующую информацию о светорассеивающих свойствах золота и других металлических частиц для диагностических и аналитических исследований. В этом параграфе конкретно указывается: "В полимерных полутонких срезах красная окраска света, рассеянного золотыми частицами, имеющими размер до 14 нм, наблюдалась под оптическим микроскопом в клеточных органеллах, содержащих высокие концентрации меченых антигенов."

Однако при освещении белым светом свет, рассеиваемый золотыми частицами размером 14 нм, имеет, в основном, зеленую окраску. Поскольку под оптическом микроскопом частицы кажутся красными, то это свидетельствует о том, что наблюдаются некоторые взаимодействия, которые являются следствием не только чистого рассеяния света. Вероятно, что красный цвет, наблюдаемый при помощи оптического микроскопа, является преимущественно пропущенным, а не рассеянным светом. В случае когда золотые частицы аккумулируются в достаточном количестве в сайте-мишени в клетках, в тканевых срезах или на некоторых других поверхностях, то благодаря пропущенному свету будет наблюдаться красный цвет (см. также J.Roth (1983) Immunocytochemistry 2 стр.217; and Dewaele et al (1983) in Techniques in Immunochemstry Vol 2 p1, Eds. Bullock and Petrusz, Academic Press).

Как упоминалось в вышеприведенной цитате, очевидно, что чувствительность иммунологического метода скрашивания золотом в оптической микроскопии является более низкой, чем чувствительность других методов, и использование золотых частиц в качестве маркеров для детекции с использованием оптического микроскопа не получило широкого применения. В обзорной монографии, вышедшей в 1995, в Главе 12, стр.198 (Gao & Gao) имеется следующее описание, относящееся к настоящему обсуждению:

"Коллоидное золото благодаря своей электронно-плотной природе и свойствам вторичной электронной эмиссии первоначально использовалось только в качестве маркера для электронной микроскопии (ЭМ) (Horisberger, 1979). Прямая визуализация коллоидного золота в оптической микроскопии (ОМ) была ограничена. Размер частичек коллоидного золота слишком мал для того, чтобы он мог быть обнаружен оптическим микроскопом, хотя при использовании клеток, подвергнутых иммунологическому мечению золотыми частицами в высокой концентрации, эти клетки могут иметь красную окраску благодаря этому реагенту (Geoghehan et al., 1978; Roth, 1982; Holgate et al., 1983)".

Как было упомянуто в вышеуказанных работах, очевидно что чувствительность обнаружения коллоидного золота оптическим микроскопом достаточна низка. Для устранения этого явного недостатка был разработан метод серебряного усиления золотых частиц. В вышеупомянутом обзоре 1995 г. приводится следующее:

"Реальным крупным достижением в иммунологической технике скрашивания золотом, применяемой в оптической микроскопии, явилось использование серебряного усиления коллоидных золотых частиц (20 нм), связанных с иммуноглобулином в парафиновых срезах, толщиной 5 микрон (Holgate et al., 1983). Этот метод способствовал значительному повышению чувствительности, эффективности и точности детекции антигена при помощи оптического микроскопа. С использованием IGSS золотые частицы такого малого диаметра, как 1 нм, могут быть визуализированы в оптическом микроскопе. Тонкий срез, подвергаемый IGSS, также может наблюдаться в оптическом микроскопе, особенно с использованием фазово-контрастного или эпиполяризованного освещения (Stierhof et al., 1992)."

Метод серебряного усиления золотых частиц широко используется. Этот метод усиления позволяет преобразовывать маркерную золотую частицу в более крупную металлическую частицу или даже в более крупную структуру, размер которой составляет несколько микронов или более. Эти структуры состоят, в основном, из серебра, и такие укрупненные частицы могут быть более легко обнаружены визуально в светопольном оптическом микроскопе.

Отдельные увеличенные частицы были визуализированы с помощью конфокальной и эпиполяризоционной оптической микроскопии с использованием высокоразрешающего лазера. См. там же на стр.26 и 203.

Однако специалисты утверждают, что даже с использованием техники серебряного усиления, этот метод не позволяет достичь чувствительности и специфичности, присущих другим методам. Так, например, в публикации Vener, T.I. et al., Analytical Biochemistry 198, p.308-311 (1991) авторы обсуждают новый метод чувствительной детекции аналита, называемый "Анализом на латексную гибридизацию (LHA)". В этом методе используются крупные полимерные частицы диаметром 1,8 микрон, наполненные в высокой степени флюоресцентными молекулами красителя, которые служат в качестве метки для аналита и благодаря которым связанные аналиты могут быть обнаружены посредством флюоресцентного сигнала. Ниже приводится цитата из этой публикации:

"Для оценки метода LHA мы провели сравнение нашего метода с двумя другими непрямыми методами, в которых не используются радиоактивные метки и которые описаны в литературе. Наиболее подходящим методом для сравнения является метод серебряного усиления гибридизационного сигнала с использованием коллоидного золота, связанного со стрептавидином, поскольку этот метод относится к технике конкурентного связывания частиц. Однако этот метод не слишком чувствителен даже с использованием дополнительной стадии серебряного усиления, то есть этот метод позволяет обнаруживать лишь 8 пг ДНК λ -фага, тогда как метод LHA позволял обнаруживать 0,6 пг или 2× 10⁴ молекул ДНК λ -фага на найлоновой мембране.

В работе Stimpson et al., 92, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 6379-6383, July 1995 описан метод детекции ДНК-гибридизации в реальном масштабе времени. Авторы описывают использование корпускулярной метки на ДНК-мишени, которая действует как "светорассеивающий источник при освещении затухающей волной волновода, и лишь метка, связанная с поверхностью, генерирует сигнал... Затухающая волна, генерируемая волноводом, используется для рассеяния света корпускулярной меткой, абсорбированной на множественных "зонах захвата ДНК", находящихся на поверхности волновода. Поскольку незатухающая волна распространяется лишь на несколько сот нанометров от поверхности волновода, то несвязанная/диссоциированная метка не рассеивает свет и стадия промывки не требуется. Интенсивность сигнала является достаточной для измерения связывания с поверхностью, а десорбция светорассеивающей метки может быть исследована в реальном масштабе времени; то есть скорость ее детекции не ограничена. Характер гибридизации на данном элементе может быть оценен визуально или количественно проанализирован с использованием стандартной ПЗС-камеры с 8-битной видеосхемой ввода и регистрации кадра изображения за 1/30 долю секунды."

Эксперименты были осуществлены с использованием золотых частиц диаметром 70 нанометров и селеновых частиц диаметром 200 нанометров. Более интенсивные сигналы были получены с использованием селеновых частиц. При этом авторы указывают, что:

"Был генерирован сигнал волновода, достаточный для того, чтобы можно было различить одно основание ДНК размером 4-40 нм, а поэтому этот сигнал был сравним с системой флюоресцентного сигнала."

В этом методе были использованы волноводы и излучение света типа затухающей волны. Кроме того, этот метод является почти таким же чувствительным, как современные системы детекции, основанные на флюоресценции. При этом предпочтительными являются частицы диаметром 70 нм или более.

В патенте США 501709 (Schutt et al.) описана система иммуноанализа для детекции лигандов или партнеров, связывающихся с этими лигандами, в гетерогенном формате. Эта система основана на детекции "обратнорассеянного света затухающей волны, возникающей благодаря присутствию метки из частиц коллоидного золота, доставляемой к поверхности посредством иммунологической реакции... Расположение детектора под обратным углом выше критического угла обеспечивает более высокое отношение "сигнал-шум".

Авторы поясняют, что в описанной системе иммуноанализа используется диффузное полное внутреннее отражение, то есть распространение затухающих волн. Это указывает на то, что присутствие коллоидного золота прерывает распространение затухающей волны и приводит к получению рассеянного света, который может быть обнаружен фотоумножителем или другими световыми приемниками с получением чувствительного сигнала. Это свидетельствует о том, что важным аспектом настоящего изобретения является локализация детектора.

"Детектор является идеально расположенным в том случае, если угол, под которым он расположен, превышает критический угол, и при такой локализации обнаруживается только свет, рассеянный в обратном направлении по отношению к детектируемому источнику. Поэтому такое расположение позволяет идеально избежать детекции сверхрассеянного света в объемной жидкой среде."

Полное внутреннее отражение падающего луча используется для создания моды затухающей волны излучения, и его детекцию осуществляют на оптически прозрачной поверхности. При этом предпочтительно использовать специальное оборудование.

В патенте США 4313734 (Leuvering) описан метод детекции специфически связывающихся белков путем использования меченых компонентов, полученных путем присоединения частиц "водной дисперсии металлов, металлических соединений или полимерных сфер, покрытых металлом или металлическим соединением и имеющих диаметр, по крайней мере, 5 нм". Указывается, что этот способ является особенно подходящим для оценки иммунохимических компонентов, таких как гаптен, антигены и антитела. Указывается также, что металлические частицы были уже использованы как метки, усиливающие контрастность в электронной микроскопии, но об их использовании в иммуноанализе, по-видимому, "нигде не сообщается, и возможность его использования является неожиданной".

Иммунохимические методы с использованием золей из металлических частиц, разработанные в соответствии с настоящим изобретением, могут быть не только более чувствительными, чем известные иммунологические методы, предусматривающие использование радиоактивных и ферментных меток, но можно также продемонстрировать, что благодаря использованию частиц золя различного химического состава в качестве меток эти методы способны обеспечить определение более одного иммунологического компонента в одной и той же тест-среде одновременно".

Примерами металлов являются платина, золото, серебро и медь или их соли.

"Измерение физических свойств и/или концентрации металлов и/или образованных металлсодержащих агломератов в определенной фазе реакционной смеси может быть осуществлено с использованием различных методов, которые известны по существу. Примерами таких методов являются колориметрическое определение, где предусматривается использование интенсивной окраски некоторых дисперсий, которые, кроме того, меняют свой цвет в соответствии с физикохимическими изменениями; визуальный метод, который часто применяется для качественной оценки, исходя из вышеуказанного факта, что металлические золи являются окрашенными; использование пламенной эмиссионной спектрофотометрии или другого метода плазменно-эмиссионной спектрофотометрии, который позволяет осуществлять одновременное детектирование; и высокочувствительный метод беспламенной атомно-абсорбционной спектрофотометрии."

Два или несколько аналитов, присутствующих в образце, могут быть предпочтительно обнаружены с использованием пламенной эмиссионной спектрофотометрии или другим методом плазменно-эмиссионной спектрофотометрии. Предпочтительным методом с более чувствительной детекцией является беспламенная атомно-абсорбционная спектрофотометрия.

В патенте США 5350697 (Swope et al.) описано устройство для измерения рассеянного света с использованием источника света, расположенного так, чтобы луч света, направленный на образец, падал под углом, меньшим, чем критический угол. Детектор был расположен так, что он обнаруживал рассеянный свет с внешней стороны огибающей критического угла.

В патенте США 4480042 (Craig et al.) описано использование реагентов, состоящих из частиц с высоким показателем преломления, в иммуноанализе, основанном на рассеянии света. Предпочтительные частицы состоят из полимерных материалов. Концентрацию соединений, представляющих биологический интерес, определяли путем измерения изменения степени помутнения, вызванной частичной агглютинацией, или ингибированием агглютинации. Предпочтительные частицы имеют диаметр менее 0,03 микрон. "Более короткие длины волн, такие как 340 нм, дают большую разность сигналов, чем более длинные длины волн, такие как 400 нм."

В патенте США 4851329 (Cohen et al.) и в патенте США 5286452 (Hansen) описаны методы детекции агглютинированных частиц путем анализа размера частиц, дающих оптические импульсы, или путем использования анализатора частиц светового потока. Указывается, что эти системы могут быть использованы для определения концентраций антигена или антител. Эти методы предусматривают использование сверхточной аппаратуры и специальных устройств для обработки сигнала. Предпочтительные частицы имеют диаметр от около 0,1 до 1 микрон для метода Cohen и от около 0,5 до около 7,0 микрон для метода Hansen.

В работе Okano et al., 202 Analitieal Biochemistry 120, 1992 описан гетерогенный "сандвич"-иммуноанализ с использованием микрочастиц, которые могут быть подсчитаны с помощью инвертированного оптического микроскопа. Микрочастицы имели диаметр 0,76 микрон и представляли собой карбоксилированные микрочастицы, изготовленные из акрилата.

Другие методы детектирования частиц описаны в патенте США 3975084 (Block), в патенте 3975084 (Kuroda), в патенте США 5274431 (Ford, Jr.), в патенте США 5305073 (Furuya), в патенте США 5257087 и в патенте США 5311275 (Taniguichi et al.).

В работе Geoghagan et al., 7 Immunological Communication 1-12, 1978 описано применение коллоидного золота для мечения кроличьего антитела против козьих иммуноглобулинов IgG, используемого для непрямого обнаружения других антител. Для детекции меченых частиц использовался оптический и электронный микроскоп. Золотые частицы имели средний размер 18-20 нанометров, и для их обнаружения использовалась светлопольная оптическая микроскопия. Для электронной микроскопии использовались тонкие срезы, окрашенные серебром-золотом по методу Araldite. "Аналогичные процентные соотношения поверхностно меченных клеток были определены с помощью иммунофлюоресценции и окрашивания коллоидным золотом по методу светлого поля". С помощью электронного микроскопа может быть детектировано 1-5 частиц на клетку, но авторы указывают, что:

"Такие небольшие количества метки не могут быть детектированы с помощью флюоресценции или с помощью светлопольной микроскопии и могут представлять собой неспецифически связанные или связанные посредством Fc-рецептора молекулы GAD и GAM с низким уровнем поверхностного иммуноглобулина (S.lg) на GAD- и GAM-обработанных клетках."

В патенте США 5079172 (Hari et al.) описано использование золотых частиц в реакциях антител и обнаружение этих частиц с использованием электронного микроскопа. Размер частиц составлял 15 нанометров. В предпочтительном методе используется электронная микроскопия.

В патенте США 4420558 (DeMey et al.) описано использование светлопольной оптической микроскопии для подсчета клеток, меченных антителами, которые, в свою очередь, были помечены золотом. В этом методе используется оптический микроскоп в светлопольном устройстве с увеличением 500 х или более, где для подсчета негативных по пероксидазе и меченных золотом клеток используются масляно-иммерсионные линзы. Визуализация меченых поверхностей основана на агрегирующих свойствах золотых частиц, которые при определенных условиях подвергаются экстенсивному скоплению, и эти очаги скопления ("пэтчи") на клеточной поверхности могут быть выявлены с использованием описанного метода. Было установлено, что оптимальные результаты могут быть получены с использованием золотых частиц размером 40 нанометров.

В патенте США 4446238 (De Mey et al.) описан аналогичный иммуноцитохимический метод с использованием светлопольной оптической микроскопии для определения локализации в гистологических срезах меченных коллоидным золотом иммуноглобулинов в виде маркера красного цвета. Этот метод иммунологического окрашивания золотом (IGS) авторы описывают следующим образом:

"В обеих процедурах конечным продуктом является аккумуляция большого числа золотых гранул на антигенсодержащих участках, в результате чего продуцируется типичная рыжеватая окраска золей коллоидного золота."

В патенте США 4752567 {DeBrabander et al.) описан метод обнаружения отдельных металлических частиц, имеющих диаметр менее чем 200 нм, с использованием светлопольной или эпиполяризационной микроскопии и контрастного усиления с помощью видеокамеры. Авторы изобретения сообщают:

"Обычно в вышеупомянутых процедурах используемые металлические частицы имеют диаметр от около 10 до около 100 нм. Это значительно ниже предела разрешения светопольной микроскопии, которое обычно составляет около 200 нм. Поэтому совершенно очевидно, что все до сих пор известные визуальные методы с использованием оптического микроскопа ограничены в своем применении детекции иммобилизованных агрегатов металлических частиц. Отдельные частицы могут наблюдаться лишь с помощью ультрамикроскопической техники, а в частности, с помощью электронной микроскопии.

Неожиданно было обнаружено, что отдельные металлические частицы диаметром менее чем 200 нм могут быть сделаны отчетливо видимыми с помощью оптической микроскопии по методу светлого поля или эпиполяризационной микроскопии в видимой части спектра при условии, что полученное изображение может быть подвергнуто электронному контрастному усилению."

В последующих главах авторы сообщают:

"По сравнению с существующими диагностическими методами, основанными на иммуноанализах с использованием зольных частиц, настоящий метод имеет большую чувствительность. Действительно, существующие методы основаны, главным образом, на поглощении или рассеянии света массой абсорбированных или суспендированных металлических частиц. Очевидно, что для наблюдения окраски, например, на среде для блоттинга, необходимо присутствие огромного числа частиц. В противоположность этому настоящий метод позволяет наблюдать и подсчитывать отдельные частицы. Поэтому рассматриваемый метод будет способствовать значительному облегчению проявления диагностических блотов в тех случаях, где, например, существующие визуальные или колориметрические методы являются слишком низкочувствительными, например для диагностики гепатита."

В работе Schafer et al., 352 Nature, 444-448, 1991 описано использование частиц золота размером в несколько нанометров, которые могут наблюдаться с использованием дифференциальной интерференционной контрастной микроскопии с видеоусилением. Были использованы частицы размером 40 нанометров.

В работе DeBrabander et al., 6 Cell Motolity and the Cytoskeleton, 1050113, 1986 (и в патенте США 4752567) описано использование субмикроскопических золотых частиц и светопольного контрастного видеоусиления. В частности, клетки наблюдались с помощью светлопольной контрастной микроскопии с видеоусилением и с использованием золотых частиц диаметров 5-40 нанометров. Авторы также сообщают:

"отдельные золотые частицы, имеющие размер менее чем ±100 нанометров и абсорбированные на стекле или клетках или введенные путем микроинъекции в клетки, не обнаруживаются оптическим микроскопом. Однако они легко визуализируются с использованием видеокамеры для электронного контрастного усиления."

Авторы описывают использование эпи-освещения поляризованным светом или использование "более легкого и явно более чувствительного метода" с применением пропускаемого светлопольного освещения монохроматическим светом и с использованием простой камеры. Авторы указывают, что золотые частицы могут быть легко детектированы с помощью фазово-контрастной микроскопии.

"В отличие от методов, которые могут быть осуществлены с использованием более крупных золотых частиц (обычно 20-40 нм), даже плотные скопления 5-нанометровых золотых частиц, например на таких структурах, как микротрубочки, не видны под оптическим микроскопом. Они не продуцируют детектируемой красной окраски. Недавно эта проблема была решена путем физического увеличения с использованием солей серебра, которые увеличивают размер частиц с продуцированием легко заметной черной окраски.

Нами был описан способ определения локализации лигандов почти на молекулярном уровне. Этот способ является новым, поскольку он впервые позволяет достичь указанной цели с помощью оптического микроскопа и с использованием отдельных дискретных маркеров, которые явно отличаются от фоновых структур. Поскольку этот способ может быть применен даже к живым клеткам, то он может быть использован для прослеживания динамического поведения отдельных белков. Это обусловлено тем, что указанный способ объединяет два хорошо разработанных метода: мечение золотом и видеомикроскопию. Большинство из этих применений может быть осуществлено с использованием недорогостоящей видеоаппаратуры, стоимость которой меньше, чем стоимость хороших масляно-иммерсионных 100 х-объективов. Кроме того, объединение этих современных цифровых преобразований изображения дает много дополнительных возможностей. Некоторые из дополнительных преимуществ заслуживают внимания. Поскольку метка состоит из отдельных дискретных маркеров, то их подсчет как вручную, так и автоматически (с помощью компьютера) является легким и надежным. Небольшой размер маркера минимизирует проблемы, связанные с пенетрацией и диффузией. Возможность изменять заряд маркера почти по желанию способствует снижению неспецифического связывания при любом конкретном применении."

Этот способ определяется авторами как "нанокорпускулярная видеоультрамикроскопия или коротковолновая нановидеоультрамикроскопия." Аналогичная технология описана Geerts et al., 151, Nature, 765-766, 1991.

Предыдущие дискуссии, касающиеся методов, основанных на рассеянии света и использовании рассеивающих свет частиц, и методов диагностики явно показали пределы современных методов детекции аналитов, а также новизну и важное значение настоящего изобретения. Целью настоящего изобретения является не только устранение имеющихся в настоящее время ограничений и недостатков диагностических анализов, основанных на рассеянии света, но также и устранение ограничений и недостатков других методов, не использующих световое рассеяние, таких как метод усиления сигнала и амплификации молекул аналита. Описанное здесь настоящее изобретение является более простым в применении, имеет большую чувствительность детекции и позволяет измерять аналиты, имеющие концентрации в более широком диапазоне, чем это было возможно ранее. Настоящее изобретение может быть широко применено к большинству типов образцов и схем анализа в качестве системы генерирования сигнала и системы для детекции аналита.

Изобретение представляет способ для детектирования одного или более аналитов в образце посредством связывания этих аналитов по меньшей мере с одной детектируемой светорассеивающей частицей с размером меньшим, чем длина волны света от осветителя. Эта частица освещается световым лучом при условиях, когда луч света, рассеянный частицей, может быть обнаружен человеческим глазом с увеличением менее 500 крат. Свет, который рассеян от частицы, затем детектируется при этих условиях в качестве меры присутствия одного или более аналитов.

Заявитель с удивлением определил, что просто гарантируя соответствующее освещение и гарантируя максимальное детектирование специфического рассеянного света, можно получить в результате чрезвычайно чувствительный способ. Способ светового освещения и детектирования назван заявителем как "DLASLPD" (прямое освещение, направленное под таким углом, чтобы детектировался только свет, рассеянный частицами).

Способ и связанное с ним устройство предназначены для максимального детектирования только рассеянного света от частиц, и, таким образом, он во много раз более чувствительный, чем использование флюорофоров или использование таких частиц в других описанных выше способах. Такие частицы могут детектироваться с использованием микроскопа с низким увеличением (с увеличением в диапазоне 2-500 раз, н