Способ диагностики стадий вич-инфекции

Способ диагностики стадий вич-инфекции

Реферат

Изобретение относится к области медицины, преимущественно клинической иммунологии, а именно к иммунодиагностике инфекции, вызванной вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), и может найти применение при определении стадий ВИЧ-инфекции.

ВИЧ-инфекция продолжает оставаться одной из самых актуальных проблем современной медицины. С 1990 года регистрируется пандемия, что означает распространение этой болезни по всей планете, при этом в России за последние 3 года зарегистрировано свыше 200 тысяч инфицированных ВИЧ. Распространяясь на “новые” территории, болезнь не уходит из захваченных ранее. Кроме того, биология ВИЧ-инфекции такова, что отсутствуют естественные механизмы противостояния, и только социальные факторы способны противодействовать дальнейшей прогрессии пандемии (P.M.Хаитов, Г.А.Игнатьева, И.Г.Сидорович. Иммунология - М.: Медицина, 2000. - С.291-295).

К реально эффективным средствам борьбы с распространением ВИЧ следует отнести своевременную и качественную диагностику, значимость которой прослеживается с двух позиций. Во-первых, выявление факта инфицирования позволяет использовать действенные способы профилактики дальнейшего распространения инфекции. Во-вторых, ранняя диагностика при инфицировании ВИЧ способствует своевременному назначению достаточно эффективных терапевтических мероприятий, которые пролонгируют начальные стадии ВИЧ-инфекции и таким образом существенно влияют на ее прогрессию. В этой связи весьма актуальной продолжает оставаться проблема выбора надежных критериев, позволяющих быстро, достоверно, своевременно и с наименьшими материальными затратами определить стадии инфекционного процесса, вызванного ВИЧ (Л.П.Сизякина, В.Н.Чернышев - ВИЧ-инфекция у детей. - Ростов-на-Дону, - 2001. - С.81).

В настоящее время ВОЗ принята классификация стадий инфекционного процесса, опосредованного ВИЧ, основанная на клинических проявлениях, в соответствии с которыми определяют начальную или стадию А - генерализованной лимфаденопатии (ГЛАП), для которой характерно не только отсутствие патогномоничных признаков, но и клинически стабильное состояние пациента. Стадия В (пре-СПИД) характеризуется нарастанием разнообразной клинически значимой симптоматики - бациллярный ангиоматоз, орофарингиальный кандидоз, цервикальная карцинома, общеинфекционные синдромы, такие как лихорадка или диарея более месяца, лейкоплакия языка, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, периферическая нейропатия. Для стадии С - СПИД (терминальной) характерными клиническими признаками являются легочный туберкулез, рецидивирующая пневмония, опухоли разнообразной локализации (CDC MMWR, 1992, v.41, N RR - 17, р.22). Определение стадий инфекционного процесса необходимо для обоснования варианта своевременной адекватной терапии, позволяющей удлинить средние сроки жизни инфицированных ВИЧ и для профилактики распространения инфекции. Проведенный анализ патентной и научно-медицинской литературы выявил ряд способов диагностики стадий ВИЧ-инфекции.

В частности, тестом, используемым при определении стадий ВИЧ-инфекции и служащим основанием для назначения противовирусной терапии является оценка вирусной нагрузки периферической крови посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) (Кравченко А.В., Серебровская Л.В., Голохвостова Е.Л. и др. Тимазид в сочетании с хивидом и инвиразой в комплесной терапии больных с ВИЧ-ифекцией. - Эпидемиология и инфекционные болезни. - 1998. - №5 - с.51-52). Сущность метода заключается в количественном определении копий РНК вируса в плазме. Однако следует отметить отсутствие четкой корреляции между прогрессией инфекционного процесса и вирусной нагрузкой плазмы. В частности, стадии А ВИЧ-инфекции соответствует высокий уровень содержания вируса в плазме. Следующая стадия - В (пре-СПИД) характеризуется существенным снижением числа копий РНК вируса, несмотря на клиническую прогрессию инфекции. В терминальной стадии С (СПИД) вновь регистрируется неограниченная прогрессия уровня РНК ВИЧ в крови (В.В.Шкарин, С.Н.Соринсон. ВИЧ/СПИД - инфекция. Двадцать лет спустя после начала пандемии. - Н.-Новгород: Изд-во НГМА, 1999. - С.43). Таким образом, данный тест недостаточно информативен для характеристики уровня развивающегося иммунодефицита. К недостаткам метода следует отнести также его высокие технологическую сложность и стоимость, а именно: необходимость строгого соблюдения особых условий - стерильности и температурного режима при заборе крови, ее транспортировке и проведении теста. При этом помимо сертифицированных диагностических наборов необходимы не только весьма дорогостоящие приборы, но и комплекс лабораторных комнат, в том числе стерильных боксов. Непосредственная методика определения генома вируса достаточно трудоемка и длительна, занимает не менее 5 часов.

Способ лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции (патент №2123187 опубликован в БИ №34) предусматривает ионнообменную хромотографию сыворотки с последующим ИФА определением уровня “скрытых” антител. Данный метод, имеющий значение в прогнозе течения ВИЧ-инфекции, не ориентирован на определение ее стадий.

Способ определения антител к вирусу иммунодефицита человека (пат. №2032907 опубликован в БИ №10) может быть использован при установлении факта инфицирования ВИЧ, но не связан с определением стадии инфекции.

Способ твердофазного иммуноферментного определения антител к вирусу иммунодефицита человека (пат. 4653296/30-13, БИ №45) имеет целью повышение чувствительности способа определения антител к ВИЧ, но также не может быть использован для диагностики стадии инфекционного процесса.

Известен способ оценки стадий ВИЧ-инфекции (Клиническая иммунология и аллергология под ред. Г.Лолора-младшего. - М., Практика, 2000. – С. 585-587), заключающийся в определении уровня сывороточного β2-микроглобулина. Увеличение концентрации этого белка, определяемого с помощью диагностических наборов иммуноферментного анализа, соответствует прогрессии ВИЧ-инфекции. Между тем, данные изменения неспецифичны, поскольку подобная динамика β2-микроглобулина возможна не только при ВИЧ-инфекции, но и при опухолевых процессах, циррозе печени, лимфопролиферативных заболеваниях. Таким образом, этот метод недостаточно информативен для оценки стадий ВИЧ-инфекции ввиду своей неспецифичности (А.Ройт, Дж. Бристофф Иммунология. - М.: Мир, 2000. - с.411).

Наиболее близким техническим решением, принятым нами за прототип, является способ диагностики стадий ВИЧ-инфекции (В.В.Покровский с соавт. “Клиническая диагностика и лечение ВИЧ-инфекции”. - М.: ГОУ ВУНМЦ РФ, 2001. - С.11), заключающийся в определении абсолютного количества CD4+ лимфоцитов периферической крови. Данная методика состоит из ряда последовательных этапов: выделения популяции лимфоцитов посредством наслоения 2 миллилитров крови на заранее приготовленный раствор фиколла и верографина с градиентом плотности 1,077 г/см³, центрифугирования полученной смеси на центрифуге ОПН-3 при скорости 1 тыс. оборотов в минуту в течение 35 минут, удаления в отдельную пробирку образовавшегося “лимфоцитарного кольца” с последующей трехкратной “отмывкой” от смеси фиколл - верографин центрифугированием в культуральной среде 199 при 1,5 тыс. оборотов в минуту в течение 5 минут. Далее к отмытой взвеси лимфоцитов добавляют моноклональные антитела к CD4 поверхностному антигену, меченные флюорохромом, полученную взвесь инкубируют в течение 40 минут при 4°С, после чего вновь отмывают на центрифуге ОПН-3 в среде 199 в течение 5 минут при 1,5 тысячах оборотов в минуту. После этого проводят определение относительного количества CD4 позитивных лимфоцитов на проточном цитофлюориметре. Именно этот прибор дает возможность наиболее адекватной оценки уровня CD4+ клеток. В тот же день определяют формулу крови пациента, после чего рассчитывают абсолютное количество CD4+лифoцитoв по формуле: число лейкоцитов ×10⁹л×% лимфоцитов×%CD4+лимфoцитoв:10000. При этом, если абсолютное число CD4+ Т-клеток более 0,5×10⁹/л, диагностируют стадию А; при абсолютном количестве CD4+лифoцитoв в пределах 0,2-0,499×10⁹ /л - стадию В; при абсолютном числе CD4+ лимфоцитов менее 0,2 клеток ×10⁹/л диагностируют стадию С - (CDC MMWR, 1992, v.41, N RR - 17, р.22). Недостаток способа - сложность его реализации. В частности, результаты данного теста могут быть объективными лишь при использовании высокоспецифичных сертифицированных реактивов (моноклональных антител) и крайне дорогостоящего прибора - проточного цитофлюориметра, требующего вспомогательного обслуживающего персонала - инженеров, программистов. Эти диагностические приборы находятся лишь в специализированных центрах регионального масштаба, что значительно усложняет возможность оценки стадий ВИЧ-инфекции. В первую очередь из-за того, что анализ основан на характеристике рецепторов жизнеспособных клеток крови, поэтому исследование ограничено временными рамками - интервал между забором крови и ее тестированием не должен превышать 3-4 часов. Методику усложняют и дополнительные анализы - определение формулы крови и общего числа лейкоцитов с целью подсчета основного критерия - абсолютного числа CD4+ лимфоцитов периферической крови. Для прототипа характерна недостаточная информативность из-за лабильности показателей, не связанной непосредственно с фактом инфицирования ВИЧ. Изменения числа CD4+ лимфоцитов весьма неспецифичны и могут наблюдаться при других заболеваниях. В этой связи диагностическая значимость теста может быть важна лишь в контексте с другими критериями ВИЧ-инфекции.

Целью настоящего изобретения является упрощение способа диагностики стадий ВИЧ-инфекции.

Эта цель достигается путем исследования сыворотки крови пациента, которую делят на 2 порции. На основе иммуноферментного анализа определяют оптическую плотность (ОП) исходного образца сыворотки, отражающую уровень специфических анти-ВИЧ антител у пациента и ОП второй порции, инкубированной в течение 10 мин со 100 мкл 3,5 М раствора изотиоционата натрия и характеризующей уровень анти-ВИЧ-иммуноглобулинов, не разрушивших связь с антигенами ИФА-планшета в условиях инкубации с NaSCN. На основании полученных результатов по % снижения значений ОП исходной сыворотки определяют стадию ВИЧ-инфекции: при снижении ОП на 40% и менее диагностируют стадию А - генерализованной лимфаденопатии, при снижении оптической плотности в открытом интервале 40-60% диагностируют стадию В - пре-СПИД, а при снижении ОП на 60% и более диагностируют стадию С - СПИД.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом: у пациента проводят забор венозной крови в количестве 2-3 миллилитров, после чего ее центрифугируют при 3 тыс. оборотов в минуту в течение 10 минут на центрифуге ОПН-3, отделяют сыворотку крови, делят ее на 2 порции. Образец сыворотки добавляют в лунку диагностической ИФА тест-системы с сорбированными антигенами ВИЧ (в соответствии с приказом МЗ и МП РФ №170 от 16.08.94). Затем отмывают раствор с целью удаления компонентов сыворотки, не связавшихся с ВИЧ-антигенами. Далее в лунку добавляют антитела к иммуноглобулинам человека, конъюгированные с ферментом, меняющим окраску последовательно добавленного химического реагента - субстрата. При этом в случае наличия в тестируемой сыворотке анти-ВИЧ-антител содержимое лунки изменяет цвет. С использованием специального прибора - иммуноферментного автоматического анализатора определяют оптическую плотность содержимого лунки, отражающую уровень специфических антител к ВИЧ в исследуемом образце.

Одновременно во вторую лунку диагностического планшета помимо тестируемой сыворотки добавляют 100 мкл 3,5 М раствора изотиоционата натрия (NaSCN ), полученный раствор инкубируют в течение 10 мин. Далее соблюдается последовательность этапов, описанная выше: отмывают раствор с целью удаления компонентов сыворотки, не связавшихся с ВИЧ-антигенами, в лунку добавляют антитела к иммуноглобулинам человека, конъюгированные с ферментом, меняющим окраску последовательно добавленного химического реагента - субстрата, при наличии в тестируемой сыворотке анти-ВИЧ-антител содержимое лунки меняет цвет. С использованием иммуноферментного автоматического анализатора определяют оптическую плотность содержимого лунки, отражающую уровень специфических антител к ВИЧ после обработки 3,5 М раствором изотиоционата натрия (NaSCN).

Далее вычисляют% изменения ОП по отношению к исходному образцу сыворотки и при снижении значений ОП на 40% и менее диагностируют стадию А - генерализованной лимфаденопатии, при снижении ОП в открытом интервале 40-60% диагностируют стадию В - пре-СПИД, а при снижении ОП на 60% и более диагностируют стадию С - СПИД.

Реализуемость способа подтверждается следующими клиническими примерами.

Пример 1. Пациент С., история болезни №122/198. При проведении эпидемиологического расследования был выявлен как контактный с инфицированным ВИЧ. При клиническом осмотре признаков патологии не выявлено. Жалоб не было, состояние удовлетворительное. Пациенту, согласно предлагаемому способу было проведено исследование сыворотки крови, в результате которого получены следующие результаты: ОП исх=1500, ОП инк=1200. В связи со снижением ОП на 20% диагностирована стадия А ВИЧ-инфекции.

Пример 2. Пациент Д., история болезни 68/103. При плановом диспансерном обследовании была выявлена генерализованная лимфаденопатия, гепатосплеиомегалия. Пациенту в соответствии с заявляемым способом было проведено исследование сыворотки крови. Значение ОП исх=1627, ОП инк=897, снижение значения ОП=45%, в связи с чем больному поставлен диагноз: ВИЧ-инфекция, стадия В - пре-СПИД, назначена адекватная терапия.

Пример 3. Пациент Е., история болезни 1203/109. Находился в инфекционном стационаре с клиническими проявлениями пневмоцистной пневмонии и нефропатии. Больному в соответствии с заявляемым способом было проведено исследование сыворотки крови. ОП исх=1020, ОП инк=340, снижение оптической плотности = 67%. Больному в соответствии с заявляемым способом был поставлен диагноз “СПИД”, назначена адекватная терапия.

Пример 4. Пациент С., история болезни 101/04. В течение года состоял на диспансерном учете в областном центре по профилактике и борьбе со СПИДом, жалоб не предъявлял. В соответствии с заявляемым способом было проведено исследование сыворотки крови. Значение ОП исх=1920, ОП инк=1152, снижение ОП=40%, в связи с чем поставлен диагноз: ВИЧ-инфекция, стадия А - генерализованная лимфаденопатия.

Пример 5. Пациент Ш., история болезни 88/98. Выявлен как контактный с инфикцированными ВИЧ внутривенными наркоманами. При клиническом осмотре была выявлена пневмония, установлен факт снижения массы тела на 16 кг в течение полугода. Пациенту в соответствии с заявляемым способом было проведено исследование сыворотки крови. Значение ОП исх=1950, ОП инк=780, снижение значения ОП=60%. Больному был поставлен диагноз - ВИЧ-инфекция, стадия С - “СПИД”, назначена адекватная терапия.

В соответствии с предлагаемым способом оценки стадий ВИЧ-инфекции нами на базе НУПК “Клиническая иммунология” РостГМУ были протестированы 86 образцов сывороток инфицированных пациентов. Из них 44 поставлен диагноз: ВИЧ-инфекция в стадии А, так как снижение значений ОП составило 40 и менее %, 32 пациентам - диагноз: ВИЧ-инфекция в стадии В - пре-СПИД (ОП снижалась более, чем на 40, но менее, чем на 60%), а у 10 человек диагностирована стадия С (СПИД), при этом % снижения ОП был 60 и более.

Нами был проведен анализ 42 историй болезни лиц, находящихся на стационарном лечении в специализированном отделении ВИЧ-инфекции ГБ-1 г. Ростова-на-Дону, Из них у 20 человек был диагноз “ВИЧ-инфекция в стадии А (ГЛАП)”, у 16 - “ВИЧ-инфекция в стадии В (пре-СПИД)”, а у 6 - “СПИД”. Этим пациентам нами были проведены исследования согласно заявляемому способу. Полученные результаты показали, что у 3 человек из 20 диагноз “ВИЧ-инфекция в стадии А” был поставлен ошибочно, нами у данных пациентов была диагностирована стадия В - пре-СПИД (ОП снижалась более, чем на 40, но менее, чем на 60%), что в последствии подтвердилось клиническими признаками, 4 пациентам из 16 с диагнозом стадия В (пре-СПИД) нами на основе заявляемого способа диагностики стадий ВИЧ-инфекции был определен диагноз “СПИД”, так как % снижения ОП=60 и более. Это позволило своевременно откорректировать проводимую терапию. В 100% случаев терминальной стадии ВИЧ-инфекции С (СПИД) диагнозы совпадали (у всех пациентов снижение ОП было равным или превышало 60%). При этом для диагностики стадий ВИЧ-инфекции в соответствии с заявляемым способом не требовалось использования дополнительных трудозатрат, диагностических наборов и дорогостоящего оборудования.

Таким образом, предлагаемый способ по сравнению с прототипом более прост.

Способ диагностики стадий ВИЧ-инфекции путем исследования крови, отличающийся тем, что тестируют сыворотку крови методом иммуноферментного анализа, определяют оптическую плотность - ОП исходного образца сыворотки и оптическую плотность исходного образца сыворотки, инкубированного в течение 10 мин со 100 мкл 3,5 М раствора изотиоционата натрия - NaSCN и при снижении ОП на 40% и менее диагностируют стадию А - генерализованной лимфаденопатии, при снижении ОП в интервале 40-60% диагностируют стадию В - пре-СПИД, а при снижении ОП на 60% и более диагностируют стадию С - СПИД.