Гомологи (atr) полипептида rad3, полинуклеотиды и связанные с ними способы и материалы

Гомологи (atr) полипептида rad3, полинуклеотиды и связанные с ними способы и материалы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к классу генов точки контроля, которые контролируют прогресс на протяжении клеточного цикла в эукариотических клетках.

Предпосылки создания изобретения

Контроль клеточного цикла является фундаментальным для роста и поддержания эукариотических организмов, от дрожжей до млекопитающих. Эукариотические клетки имеют развитые контрольные пути, названные "точками контроля" ("checkpoints"), которые обеспечивают, чтобы индивидуальные стадии клеточного цикла завершались до того, как происходит следующая стадия. В ответ на повреждение ДНК, клеточное выживание возрастает как за счет непосредственных механизмов восстановления ДНК, так и за счет замедления прогресса на протяжении клеточного цикла в эукариотических клетках. В зависимости от положения клетки в пределах цикла во время облучения, повреждение ДНК в клетках млекопитающего может препятствовать (а) переходу из GI в S фазу, (b) прогрессу на протяжении S фазы или (с) переходу из G2 в митоз. Предполагается, что такие точки контроля должны предотвращать разрушительные события такие, как репликация поврежденной ДНК и сегрегация фрагментированных хромосом во время митоза (Hartwell and Kastan, 1994).

Rad3 ген Schizosaccharomyces pombe требуется для точек контроля, которые отвечают за повреждение ДНК и репликацию блоков. Rad3 является членом липид киназного подкласса киназ, который обладает областями, имеющими последовательность, гомологичную липид киназному доменому р110 субъединицы фосфатидилинозитол-3 киназы (PI-3). Этот подкласс также включает АТМ белок, поврежденный у пациентов с атаксия-телеангиэктазией. Клетки от пациентов с атаксия телеангиэктазией (AT клетки) утрачивают замедление в S фазе после облучения и, как оказывается, проявляют радиоустойчивость при синтезе ДНК (Painter and Young, 1989). AT клетки, облученные в S фазе, аккумулируются в G2 с летальным повреждением, вероятно, как следствие стремления реплицировать поврежденную ДНК. AT клетки, облученные во время G2, проявляют различный фенотип: они не прекращают митоз после повреждения ДНК и развиваются на протяжении митоза с поврежденной ДНК (Beamish and Lavin, 1994). Мутации в локусе, к которому АТМ ген картирован, приводит таким образом к разрушению нескольких точек контроля, которые требуются для соответствующего ответа на ионизирующее облучение. Эти элементы липид киназного подкласса включают:

Tellp (Greenwell et al., 1985), ген, вовлеченный в поддержание собственной теломерной длины в Saccharomyces cerevisiae: Esrip: Meclp и продукт Drozophila melanogaster mei-41 ген точки контроля (Hari et al., 1995).

Раскрытие изобретения

Мы проанализировали S. pombe rad3 ген и нашли, что он имеет аминокислотную последовательность из 2386 аминокислот полной длины, но не из 1070 аминокислот, описанных Seaton et al., 1992. Определено, что он является прямым гомологом S. cerevisiae Esrip, и что он имеет ту же самую общую структуру, что и АТМ ген. С-терминальная область rad3 белка содержит липид киназный домен, который требуется для функции Rad3. Было показано, что Rad3 способен к самоассоциации. Мы также определили протеин киназную активность, связанную с Rad3.

Кроме того, мы обнаружили человеческий гомолог к rad3. Этот ген, который мы назвали ATR (атаксия и rad родственный "ataxia and rad"), проявляет значительно более высокую гомологию к rad3, чем он проявляет ее к АТМ гену.

ATR кДНК последовательность человека представляют в Seq.ID No.1. Аминокислотную последовательность ORF из нуклеотидов 80 и 80II представляют в Seq.ID.No.2.

ДНК последовательность открытой рамки считывания (ORF) rad3 показывают как Seq.ID No.3. 2386 аминокислотная трансляция гена (нуклеотиды 585-7742 Seq.ID Nо.3.) показывают как Seq.ID Nо.4.

Соответственно, в первом аспекте, изобретение представляет собой ATR белок Seq.ID No.2 и его гомологи, его полипептидные фрагменты, а также антитела, способные к связыванию ATR белка или его полипептидных фрагментов. ATR белки, гомологи и его фрагменты рассматриваются ниже как полипептиды изобретения.

В другом аспекте, настоящее изобретение представляет собой полинуклеотид в существенно изолированной форме, способный гибридизироваться селективно с Seq.ID No.1 или с его комплементом (т.е. противоположной цепью). Обеспечиваются также полинуклеотиды, кодирующие полипептиды изобретения. Такие полинуклеотиды будут рассматриваться как полинуклеотид изобретения. Полинуклеотиды изобретения включают ДНК Seq.ID Nos 1 и фрагменты их, способные селективно гибридизироваться с этим геном.

В следующем аспекте, изобретение представляет собой рекомбинантные векторы, несущие полинуклеотид изобретения, включая экспрессионные векторы, и способы роста таких векторов в подходящей клетке хозяине, например, при условиях, при которых происходит экспрессия белка или полипептида, кодируемого последовательностью изобретения.

В дополнительном аспекте, изобретение представляет собой наборы, включающие полинуклеотиды, полипептиды или антитела изобретения, и способы использования таких наборов в диагностике наличия или отсутствия ATR и его гомологов, или его вариантов, включая вредные ATR мутанты.

Изобретение, кроме того, представляет собой способы анализа для скринирования веществ кандидатов для применения в качестве соединений для ингибирования или активирования ATR акивности, или активности мутированных форм ATR, которые являются дефицитными в активности точки контроля. Изобретение также представляет собой способы анализа для скринирования веществ кандидатов для применения в качестве соединений для ингибирования взаимодействий между ATR и другими сединениями, которые взаимодействуют с ATR, включая и сам ATR.

В близком аспекте, изобретение представляет собой полинуклеотидную последовательнось Seq.ID Nо.3 в существенно выделенной форме, и белок Seq.ID No.4 в существенно выделенной форме, и их новые варианты и фрагменты.

Детальное описание изобретения

А. Полинуклеотиды

Полинуклеотиды изобретения могут включать ДНК или РНК. Они могут быть также полинуклеотидами, которые имеют в своем составе синтетические или модифицированные нуклеотиды. В данной области известен ряд различных типов модификаций до олигонуклеотидов. Они включают метилфосфонатную и фосфоротиоатную основные цепи, дополнительно акридиновую или полилизиновые цепи при 3’ и/или 5’ концах молекулы. Для целей настоящего изобретения должно быть понятно, что Полинуклеотиды, описанные здесь, могут быть модифицированы любым способом, который доступен в данной области. Такие модификации могут проводиться для того, чтобы повысить активность in vivo или продолжительность жизни полинуклеотидов изобретения.

Полинуклеотиды изобретения, способные селективно гибридизироваться с ДНК Seq.ID No.1, будут составлять, по крайней мере, 70%, предпочтительно, по крайней мере, 80 или 90%, и более предпочтительно, по крайней мере, 95% гомологичных к соответствующей ДНК Seq.ID No.1 в пределах области, по крайней мере, 20, предпочтительно, по крайней мере, 25 или 30, например, по крайней мере, 40, 60 или 100 или более, соседних нуклеотидов.

Должно быть понятно, что специалисты в этой области могут, используя известные технические приемы, осуществить нуклеотидные замещения, которые не затрагивают полипептидную последовательность, кодированную полинуклеотидами изобретения для отражения использования кодона любого конкретного организма хозяина, в котором полипептиды изобретения должны экспрессироваться.

Может быть использована любая комбинация вышеупомянутых степеней гомологии и минимальных размеров для определения полинуклеотидов изобретения, с более строгими комбинациями (т.е. более высокая гомология в пределах больших длин), являющихся предпочтительными. Так, например, полинуклеотид, который является, по крайней мере, на 80% гомологичным в пределах 25 нуклеотидов, предпочтительно 30 нуклеотидов, представляет один аспект изобретения, так же как и полинуклеотид, который является на 95% гомологичным в пределах 40 нуклеотидов.

Полинуклеотиды изобретения могут применяться для продуцирования праймера, например, PCR праймера, праймера для альтернативной реакции амплификации, пробы, например, меченной меткой, обнаруживаемой стандартными средствами с использованием радиоактивных или нерадиоактивных меток, или полинуклеотиды могут быть клонироваными в векторах. Такие праймеры, пробы и другие фрагменты будут представлять, по крайней мере, 15, предпочтительно, по крайней мере, 20, например, по крайней мере, 25, 30 или 40 нуклеотидов в длину, и охватываются также названными нуклеотидами изобретения, как они использованы здесь.

Полинуклеотиды, такие, как ДНК полинуклеотиды и праймеры согласно изобретению, могут продуцироваться рекомбинантно, синтетически, или любыми другими средствами, доступными специалистам в данной области. Они могут также клонироваться стандартными техническими приемами.

В основном, праймеры могут продуцироваться синтетическим способом, включая ступенчатое производство одного нуклеотида желаемой последовательности нуклеиновой кислоты за один раз. Технические приемы для выполнения этого способа, использующие автоматизированные способы, являются легко доступными в данной области.

Более длинные полинуклеотиды будут, в основном, продуцироваться с использованием рекомбинантных способов, например, использующих PCR (полимеразная цепная реакция) способы клонирования. Способ клонирования будет включать изготовление пары праймеров (например, около 15-30 нуклеотидов) с областью ATR гена, которая является желательной для клонирования, приведение праймеров в контакт с мРНК или кДНК, полученными из клетки человека (например, делением клетки такой, как периферический лейкоцит крови), выполнение реакции полимеразной цепи при условиях, которые возникают при амплификации желаемой области, выделение амплифицированного фрагмента (т.е. очисткой реакционной смеси на агарозном геле) и выделение амплифицированной ДНК. Праймеры могут конструироваться так, чтобы они содержали подходящие сайты узнавания фермента рестрикции, с тем чтобы амплифицированная ДНК могла клонироваться в пригодном клонирующем векторе.

Для получения всей или части ATR последовательности, могут использоваться технические приемы, описанные здесь. Могут быть также получены аналогичным способом геномные клоны, содержащие ATR ген и его интроны и промоторные области, начиная с геномной ДНК клетки человека, например, клетки печени.

Хотя, в основном, технические приемы, упомянутые здесь, хорошо известны в науке, ссылка может быть сделана, в частности, на Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989).

Полинуклеотиды, которые не являются на 100% гомологичными последовательностям настоящего изобретения, но попадают в объем изобретения, можно получать рядом приемов.

Другие аллельные варианты человека ATR последовательности, описанные здесь, могут быть получены, например, опробованием геномных ДНК библиотек, созданных из ряда представителей, например, представителей из различных популяций.

Кроме того, могут быть получены гомологи ATR других животных, особенно млекопитающих (например, мышей, крыс или кроликов), более конкретно приматов, и такие гомологи и их фрагменты, в основном, могут быть способны селективно гибридизироваться с Seq.ID No.1. Такие последовательности могут быть получены опробированием кДНК библиотек, созданных из разделенных клеток или тканей или геномных ДНК библиотек от других животных видов, и опробированием таких библиотек пробами, включающими всю или часть Seq.ID 1 в условиях среды с высокой строгостью (например, 0.03 М хлорида натрия и 0.03 М цитрата натрия при температуре от около 50°С до около 60°С).

Аллельные варианты и видовые гомологи могут быть также получены с использованием дегенеративной PCR, которая будет использовать праймеры, сконструированные для нацеливания последовательностей внутри вариантов и гомологов, кодирующих сохраненные аминокислотные последовательности. Сохраненные последовательноси могут быть предсказаны сравнением ATR аинокислотной последовательности с последовательностью rad3. Праймеры будут содержать одну или больше дегенеративных позиций и будут использоваться в строгих условиях более низких, чем те, которые применяются для клонирования последовательностей с единичной последовательностью праймеров по отношению к известным последовательностям.

Альтернативно, такие полинуклеотиды могут быть получены посредством сайт направленного мутагенеза ATR последовательностей или их аллельных вариантов. Это может применяться там, где, например, требуются изменения молчащего кодона для последовательностей, чтобы оптимизировать преимущества кодона для конкретной клетки хозяина, в которой экспрессируется полинуклеотидная последовательность. Могут быть желательны изменения других последовательностей для того, чтобы ввести узнаваемые сайты фермента рестрикции, или изменить свойство или функцию полипептидов, кодированных полинуклеотидами, Могут быть желательными дальнейшие изменения для того, чтобы представить особые кодирующие изменения, найденные в ATR, которые дают увеличение мутантных ATR генов, которые утратили функции точки контроля. Пробы, базирующиеся на таких изменениях, могут использоваться как диагностические пробы для обнаружения таких ATR мутантов.

Изобретение далее представляет двухцепочные полинуклеотиды, включающие полинуклеотид изобретения и его комплемент.

Полинуклеотиды или праймеры изобретения могут нести обнаруживаемую метку. Подходящие метки включают радиоизотопы, такие, как ³²P или ³⁵S, ферментные метки, или другие белковые метки, такие, как биотин. Такие метки могут добавляться к полинуклеотидам или праймерам изобретения и могут обнаруживаться с использованием технических средств, известных по существу.

Полинуклеотиды или праймеры изобретения или их фрагменты, меченные или немеченные, могут применяться специалистами в данной области в опытах на основе нуклеиновой кислоты для обнаружения или секвенирования ATR в теле человека или животного.

Такие опыты по обнаружению обычно включают приведение образца тела человека или животного, содержащего ДНК или РНК, в контакт с пробой, включающей полинуклеотид или праймер изобретения, при условиях гибридизации, и обнаружение любого дуплекса, образованного между пробой и нуклеиновой кислотой в образце. Такое обнаружение может быть достигнуто применением технических приемов, таких как PCR, или путем иммобилизации пробы на твердую подложку с удалением нуклеиновой кислоты, которая не гибридизируется с пробой, и затем определяя нуклеиновую кислоту, которая гибридизировалась с пробой. Альтернативно, образец нуклеиновой кислоты можно иммобилизовать на твердую подложку, и количество пробы, связанное с такой подложкой, можно определить. Подходящие методы анализа этого и любых других форматов можно найти, например, в WO 89/03891 и WO 90/13667.

Опыты по секвенированию ATR включали приведение образца тела человека или животного, содержащего мишень ДНК или РНК, в контакт с пробой, включающей полинуклеотид или праймер изобретения, в условиях гибридизации и определение последовательности посредством, например, способа терминации Ganger дидеокси цепи (см. Sambrook et al.).

Такой способ обычно включает удлинение в присутствии пригодных реагентов, праймера путем синтеза цепи комплементарной к ДНК мишени или РНК мишени и селективно терминирующий реакцию удлинения при одном или большем количестве А, С, Q или T/U остатка; обеспечение возможности для осуществления удлинения цепи и реакции терминации; разделение согласно размеру удлиненных продуктов для определения последовательности нуклеотидов, при которых произошла селективная терминация. Подходящие реагенты включают фермент ДНК полимеразы, деоксинуклеотиды dATP, dCTP, dGTP и dTTP, буфер и АТР. Дидеоксинуклеотиды используются для селективной терминации.

Опыты для обнаружения или секвенирования ATR в теле человека или животного могут использоваться для определения ATR последовательностей внутри клеток у отдельных представителей, которые имеют, или предполагают, что имеют, измененную последовательность ATR гена, например, в раковых клетках, включая клетки лейкемии и твердые опухоли такие, как опухоли молочной железы, яичника, легкого, толстой кишки, поджелудочной железы, яичка, печени, мозга, мышечных и костных опухолей.

Кроме того, открытие ATR будет выявлять роль этого гена в наследственных заболеваниях, которые будут исследоваться, способом, аналогичным способу АТМ гена. В основном это будет включать установление статуса ATR (например, использованием анализа PCR последовательности) в клетках, выделенных из пациентов с заболеваниями, которые могут быть связаны с повреждением до реплицирования клеток, например, наследственная предрасположенность к раку, хромосомный разрыв или нестабильный фенотип или восстановимо-поврежденный чувствительный фенотип.

Пробы изобретения могут традиционно упаковываться в форме опытного набора в соответствующем контейнере. В таких наборах проба может связываться с твердой подложкой, где формат анализа, для которого конструируется набор, требует такого связывания. Набор также может содержать пригодный реагент для обработки образца, который будет опробоваться, гибридизируя пробу с нуклеиновой кислотой в образце, контрольные реагенты, инструкции, и тому подобное.

Настоящее изобретение также представляет полинуклеотиды, кодирующие полипептиды изобретения, описанные ниже. Из-за того, что такие полинуклеотиды будут пригодны как последовательности для рекомбинантного образования полипептидов изобретения, для них не является необходимым быть селективно гибридизируемыми с последовательностью Seq.ID No.1, хотя это будет обычно желательным. Иначе говоря, такие полипетиды могут метиться, использоваться и готовиться, как описано выше, если это желательно. Полипептиды изобретения описываются ниже.

Особенно предпочтительными полинуклеотидами изобретения являются те, которые получаются из домена липид киназы ATR, его аллельных вариантов и видовых гомологов. Домен липид киназы представляется нуклеотидами от 7054 до 8011 Seq.ID No.1. Полинуклеотиды изобретения, которые включают этот домен, являются особенно предпочтительными. Термин "липид киназный домен" относится к домену, который является гомологичным с другими известными липид киназами, в частности р110 субъединицей PI-3 киназы, как определено рядами последовательности.

Другими предпочтительными полинуклеотидами изобретения являются те, которые включают нуклеотиды, кодирующие аминокислоты от 181 до 302 Seq.ID No 2 (нуклеотиды от 620 до 985 Seq.ID No.1), которые, как предполагается, являются областью лейциновой "молнии", предполагаемым сайтом белок-белкового взаимодействия, и аминокислот от 1358 до 1366 (нуклеотиды от 4151 до 4177), которые также сохраняются.

В дополнительном аспекте, полинуклеотиды изобретения включают те Seq.ID No 3 и их фрагменты, которые способны селективно гибридизироваться с этой последовательностью другой, чем фрагмент, состоящий из нуклеотидов от 2482 до 6599, в котором проведены следующие изменения: делеция остатков 2499, 2501, 2507 и 2509; инсерция С между 5918/5919.

Особенно предпочтительные фрагменты включают те, которые содержат остаток от 6826 до 7334 (домен липид киназы) и области лейциновой "молнии" от 1476 до 1625 и от 2310 до 2357. Кроме того, является предпочтительным фрагмент, включающий сохраненную область от 3891 до 3917. Такие полипептиды и фрагменты могут быть приготовлены и использованы, как описано выше.

В. Полипептиды

Полипептиды изобретения включают полипептиды по существу в выделенной форме, которые включают последовательность, представленную в виде Seq ID No.2.

Полипептиды, кроме того, включают варианты таких последовательностей, включая естественно возникшие алельные варианты и синтетические варианты, которые являются существенно гомологичными указанным полипептидам. В этом контексте, существенная гомология рассматривается как последовательность, которая имеет, по крайней мере, 70%, например, 80% или 90% аминокислотной гомологии (идентичности) в пределах 30 аминокислот с последовательностью Seq ID No.2, за исключением липид киназного домена и С-терминальной части (остатки от 2326 до 2644), где существенная гомология рассматривается как, по крайней мере, 80% гомология, предпочтительно 90% гомология (идентичность) в пределах 50 аминокислот.

Полипептиды также включают другие полипептиды, которые кодируют ATR гомологи от других видов, включая животных таких, как млекопитающие (например, мыши, крысы или кролики), особенно приматов, и варианты их, как указано выше.

Полипептиды изобретения также включают фрагменты вышеупомянутых полипептидов полной длины и их варианты, включая фрагменты последовательности, представленной в виде Seq ID No.2.

Предпочтительные фрагменты включают те, которые включают эпитоп, особенно эпитоп. Пригодные фрагменты будут составлять, по крайней мере, около 5, например, 10, 12, 15 или 20 аминокислот по размеру. Полипептидные фрагменты ATR белка и его аллельные и видовые варианты могут содержать одно или большее количество (например, 2, 3, 5, или 10) замещений, делеций, или инсертов, включая сохраненные замещения.

Сохраненные замещения могут готовиться в соответствии со следующей таблицей, которая показывает сохраняемые замещения, где аминокислоты одного и того же блока во второй колонке и предпочтительно на одной и той же строке в третьей колонке могут замещаться друг на друга:

АЛИФАТИЧЕСКИЕ	Неполярные	GAP
		ILV
	Полярные	CSTM

	незаряженные	NQ
Полярные	DE
заряженные	KR
АРОМАТИЧЕСКИЕ		HFWY
ДРУГИЕ		NQDE

Варианты полипептидов изобретения могут также включать полипептиды, где одна или больше специфических (т.е. естественно кодированнных) аминокислот делецируется или замещается, или где добавляются одна или больше неспецифических аминокислот: (1) без потери активности киназы, специфичной к полипептидам изобретения; или (2) при отсутствии акивности киназы, специфичной к полипептидам изобретения; (3) при отсутствии способности к взаимодействию с участниками или регуляторами пути точки контроля клеточного цикла.

Эпитопы могут определяться любым техническим средством, таким, как средство пептидного сканирования, как описано Geysen et al. Mol. lmmunol., 23; 709-715 (1986).

Полипептиды изобретения могут находиться по существу в выделенной форме. Должно быть понятно, что полипептиды могут смешиваться с носителями или разбавителями, которые не будут влиять на предполагаемое назначение полипептида, и все же могут рассматриваться как существенно выделенные. Полипептид изобретения может также быть в существенно очищенной форме, в том случае, когда полипептид будет содержаться в препарате более чем на 90%, например, 95%, 98% или 99% полипептида в препарате, он является полипептидом изобретения. Полипептиды изобретения могут быть модифицированы, например, добавлением остатков гистидина, для облегчения их очистки, или добавлением сигнальной последовательности, чтобы способствовать их выделению из клетки.

Полипептиды изобретения могут метиться обнаруживаемой меткой. Обнаруживаемая метка может быть любой пригодной меткой, которая позволяет обнаруживать полипептид. Пригодные метки включают радиоизотопы, например ¹²⁵I, ферменты, антитела, полинуклеотиды и линкеры, такие, как биотин. Меченные полипептиды изобретения могут использоваться в диагностических процедурах, таких, как иммуноанализы, для того, чтобы определять количество полипептида в образце. Полипептиды или меченные полипептиды изобретения могут также использоваться в серологических или связанных с клеткой иммуных анализах для определения иммунной реактивности к указанным полипептидам в организмах животных и людей при использовании стандартных протоколов.

Полипептиды или меченные полипептиды изобретения или фрагменты их могут также фиксироваться на твердой фазе, например, на поверхности чашек для иммуного анализа или измерительного стержня.

Такие меченные или иммобилизованные полипептиды могут упаковываться в наборы в подходящем контейнере, вместе с подходящими реагентами, контрольными составами, инструкциями и тому подобным.

Такие полипептиды и наборы могут использоваться в методах обнаружения антител к ATR белку или его аллельных или видовых вариантов с помощью иммуных анализов.

Способы иммуного анализа хорошо известны в данной области и будут обычно включать:

(a) обеспечение полипептида, содержащего эпитоп, способный к связыванию с помощью антитела по отношению к указанному белку;

(b) инкубирование биологического образца с указанным полипептидом при условиях, которые позволяют образование антитело-антигенного комплекса;

и

(c) определение, образовался ли антитело-антигенный комплекс, содержащий указанный полипептид.

Полипептиды изобретения могут быть образованы либо синтетическими средствами (например, как описано Geysen et al.), либо рекомбинантно, как описано ниже.

Особено предпочтительные полипептиды изобретения включают те, которые протягиваются или внутри домена липид киназы, а именно от аминокислот 2326 до 2644 Seq.ID.2, или последовательностей, существенно гомологичных ему. Фрагменты, как определено выше, из этой области являются особенно предпочтительными. Полипептиды и фрагменты их могут содержать аминокислотные сдвиги, как описано выше, включая замещения при одной или больше позиций 2475, 2480 и 2494, которые соответствуют позициям rad3 заместителей, описанных в примерах ниже. Предпочтительные замещения включают D2475A, N2480K и D2494E.

Полипептиды изобретения могут использоваться in vitro или in vivo в системах клеточной культуры для изучения роли ATR в качестве гена точки контроля. Например, усеченные или модифицированные (например, модифицированные в домене липид киназы) ATR-ы могут быть введены в клетку для разрушения нормальных функций точки контроля, которые происходят в клетке.

Полипепиды изобретения могут вводиться в клетку посредством in situ эспрессии полипептида из рекомбинантного экспрессионного вектора (см. ниже). Экспрессионный вектор необязательно несет индуцибельный промотор для контроля экспресии полипептида.

Применение клеток хозяев млекопитающего, как ожидается, обеспечит такие пост-трансляционные модификации (например, миристолирование, гликозилирование, усечение, лапидацию и тирозин, серин или треонин фосфорелирование), которые могут оказаться нужными, чтобы придать оптимальную биологическую активность продуктам рекомбинантной экспрессии изобретения.

Системы такой клеточной культуры, в которых экспрессируется полипептид изобретения, могут использоваться в системах анализа для идентификации веществ кандидатов, которые мешают или усиливают функции точки контроля в клетке (см. ниже).

В дополнительном аспекте, полипептиды изобретения включают белок Seq.ID No.4 и фрагменты его из области другой, чем фрагмент, содержащий аминокислоты от 713 до 1778. Особенно предпочтительные фрагменты включают те, которые содержат остатки от 2082 до 2386 (домен липид киназы) и области лейциновой "молнии" от 298 до 347 и от 576 до 591. Кроме того, фрагмент, включающий сохраненную область от 1103 до 1111, является предпочтительным. Такие полипептиды и фрагменты могут готовиться и использоваться, как описано выше.

Изобретение также представляет полипептиды, существенно гомологичные белку Seq.ID No.4 и фрагментам его. В этом контексте, существенная гомология рассматривается как последовательность, которая имеет, по крайней мере, 70%, например, 80% или 90% аминокислотной гомологии (идентичности) в пределах 30 аминокислот с последовательностью Seq.ID No.4, за исключением липид киназного домена и С-терминальной части (остатки от 2082 до 2386), где существенная гомология рассматривается как, по крайней мере, 80%, предпочтительно, по крайней мере, 90% гомологии (идентичности) в пределах 50 аминокислот.

С. Векторы

Полинуклеотиды изобретения можно вводить в рекомбинантный способный к репликации вектор. Вектор можно использовать для репликации нуклеиновой кислоты в совместимой клетке хозяине. Таким образом, в следующем варианте, изобретение представляет собой способ приготовления полинуклеотидов изобретения введением полинуклеотида изобретения в способный к репликации вектор, введением вектора в совместимую клетку хозяин и выращиванием клетки хозяина при условиях, которые приводят к репликации вектора. Вектор может выделяться из клетки хозяина. Пригодные клетки хозяева описаны ниже в связи с экспрессионными векторами.

Р. Экспрессионные векторы

Предпочтительно, полинуклеотиды изобретения в векторе являются способными к связыванию с контрольной последовательностью, которая является способной обеспечить экспрессию кодирующей последовательности клеткой хозяином, т.е. вектор является экспрессионным вектором.

Термин "способный к связыванию" ("operably linked") относится к наложению прямой мутации и супрессора (juxtaposition), где описанные компоненты находятся во взаимосвязи, позволяющей им функционировать предназначенным им способом. Контрольная последовательность, "способная к связыванию" с кодирующей последовательностью, лигируется таким образом, что экспрессия кодирующей последовательности достигается при условиях, совместимых с контрольными последовательностями.

Такие векторы можно трансформировать в пригодной клетке хозяине, как описано выше, для обеспечения экспрессии полипептида изобретения. Таким образом, в следующем аспекте изобретение представляет собой процесс приготовления полипептидов согласно изобретению, который включает культивирование клетки хозяина, трансформированной или трансфекцированной экспрессионным вектором, как описанно выше, при условиях, которые обеспечивают экспрессию вектором кодирующей последовательности, которая кодирует полипептиды, и выделение экспрессированных полипептидов.

Векторы могут быть, например, плазмидой, вирусом или фаговым вектором, снабженным изначально репликацией, необязательно промотором для экспрессии указанного полинуклеотида и необязательно регулятором промотора. Векторы могут содержать один или больше селектируемых генов маркеров, например, ген, устойчивый к ампицилину в случае бактериальной плазмиды, или ген, устойчивый к неомицину для вектора млекопитающего. Векторы могут применяться in vitro, например, для приготовления РНК или применяться для трансфекции или трансформации клетки хозяина. Векторы можно приспосабливать также для применения in vivo, например, в способе генной терапии.

Следующий вариант изобретения представляет клетки хозяев, трансформированные или трансфекцированные векторами для репликации и экспрессии полинуклеотидов изобретения. Клетки будут отбираться так, чтобы они были совместимыми с указанным вектором, и могут быть бактериальными, дрожжевыми, клетками насекомого или млекопитающего.

Полинуклеотиды, согласно изобретению, можно также инсерцировать в векторы, описанные выше, в антисмысловой ориентации, для того, чтобы обеспечить приготовление антисмысловой РНК. Антисмысловая РНК или другие антисмысловые полинуклеотиды могут также продуцироваться синтетическими способами. Такие антисмысловые полинуклеотиды могут использоваться в способе контролирования уровней ATR или его вариантов или видовых гомологов.

Промоторы и другие экспрессионные регулирующие сигналы могут выбираться так, чтобы они были совместимыми с клеткой хозяином, для которой конструируется экспрессионный вектор. Например, дрожжевые промоторы включают S.cerevisiae GAL4 и ADH промоторы, S.pombe nmtl и adh промотор. Промоторы млекопитающего включают металлотионеиновый промотор, который может быть введен в ответ на тяжелые металлы, такие, как кадмий. Могут также использоваться вирусные промоторы, такие, как SV40 большой Т антигеновый промотор или аденовирусные промоторы. Все эти промоторы являются легко доступными в этой области.

Е. Антитела

Изобретение также представляет моноклональные или поликлональные антитела к полипептидам изобретения или их фрагментам. Изобретение далее представляет собой процесс получения моноклональных или поликлональных антител к полипептидам изобретения. Моноклональные антитела могут быть приготовлены с помощью традиционной гибридомной технологии, использующей полипептиды изобретения или их пептидные фрагменты в качестве иммуногенов. Поликлональные антитела могут также готовиться традиционными средствами, которые включают инокулирование животного хозяина, например, крысы или кролика, полипептидом изобретения или его пептидным фрагментом и выделение иммуной сыворотки.

Для того чтобы готовить такие антитела, изобретение должно обеспечить полипептиды изобретения или их фрагменты, гаптенизированные с другим полипептидом для использования в качестве иммуногенов в организмах животных или людей.

Предпочтительные антитела изобретения будут способны к селективному связыванию ATR белка человека, который обладает сродством, по крайней мере, 10-кратным, предпочтительно, по крайней мере, 100-кратным сродству rad3 белка. Такие антитела могут получаться известными приемами, например, отбором областей ATR белка с последовательностями, отличными от соответствующих областей rad3, приготовлением пептидов, содержащих такие последовательности, и использование таких пептидов в качестве иммуногенов. Вслед за получением антител, может быть определено связывание указанных антител. Предпочтительные антитела изобретения включают те, которые являются способными селективно связывать домена липид киназы (как определено выше) ATR белка человека. Кроме того, антитела, которые являются способными к связыванию липид киназных доменов человека и дрожжей (S.pombe) аналогичным сродством, но не к доменам АТМ семейства белков, образуют следующий аспект изобретения. Такие антитела могут выращиваться в противоположность пептидам из липид киназных доменов, которые соответствуют областям, найденным как идентичные, или существенно идентичные, в генах дрожжей и человека.

Для целей этого изобретения, термин "антитело", если не оговорено особо, включает фрагменты всего антитела, которое сохраняет свою связывающую активность для антигена мишени опухоли. Такие фрагменты включают Fv, F(ab) и F(ab’)2 фрагменты, так же как одноцепочные антитела. Кроме того, антитела и их фрагменты могут быть очеловеченными антителами, например, как описано в ЕР-А-239400.

Антитела могут применяться в способе обнаружения полипептидов изобретения, представленных в биологических образцах способом, который включает:

(a) обеспечение антитела изобретения;

(b) инкубирование биологического образца указанным антителом при условиях, которые позволяют образование антитело-антигенового комплекса; и

(c) определение, образовался ли антитело-антигеновый комплекс, включающий указанное антитело.

Пригодные образцы включают экстракты из разделенных клеток, например, лейкоцитов или раковых клеток, включающих клетки лейкемии, и твердых опухолей таких, как опухоли молочной железы, яичника, легкого, толстой кишки, поджелудочной железы, яичка, печени, мозга, мышечных и костных опухолей.

Антитела изобретения могут быть связаны с твердой подложкой и/или упакованы в наборы в соответствующем контейнере вместе с подходящими реагентами, контрольными составами, инструкциями и им подобными.

F. Анализы

Ликвидация точек контроля клеточного цикла является потенциальной стратегией для развития или конструирования лекарств для противораковой терапии, как нового лечения, так частично и объединенной терапии для усиления специфической токсичности существующих химиотерапевтических агентов. Например, алкилирующие агенты, такие, как азотсодержащий горчичный газ, используются как терапевтические агенты, которые повреждают ДНК в отношении быстрого деления клеток, приводя к смерти клетки. Токсичность таких агентов может быть уменьшена за счет восстановления ДНК и механизмов точки контроля. Ликвидация таких механизмов будет таким образом усиливать эффективность терапевтических соединений, сконструированных для повреждения ДНК. Ликвидация ATR точки контроля будет особенно полезна там, где опухолевые клетки утратили другую