Конструкции антител и хемокинов и их применение при иммунологических нарушениях

Конструкции антител и хемокинов и их применение при иммунологических нарушениях

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Данное изобретение относится к применению конструкции антитела и/или хемокина, которая связывается с хемокиновым рецептором, для получения фармацевтической композиции, предназначенной для устранения клеток, которые латентно инфицированы вирусом иммунодефицита приматов. Кроме того, данное изобретение относится к применению конструкции антитела и/или хемокина, которая связывается с хемокиновым рецептором, для получения фармацевтической композиции, предназначенной для лечения, профилактики и/или облегчения воспалительных заболеваний почек, воспалительных заболеваний кишечника, множественного склероза, заболеваний кожи, диабета или отторжения трансплантата. Далее, данное изобретение относится к конструкциям антитела и/или хемокина, в частности к конструкциям, в которых упомянутая конструкция антитела включает сайт связывания с хемокиновым рецептором 5 и сайт связывания с CD3 и в которых упомянутая конструкция хемокина включает RANTES и токсин. Изобретение также описывает полинуклеотиды, кодирующие упомянутые конструкции антител и/или хемокинов, и векторы и хозяев, содержащих упомянутые нуклеиновокислотные молекулы. Дополнительно, данное изобретение относится к композициям, включающим упомянутые конструкции антител, конструкции хемокинов, полинуклеотиды, векторы и/или хозяев. Предпочтительно упомянутая композиция представляет собой фармацевтическую композицию. Также описано применение конструкций антител, конструкций хемокинов, полинуклеотидов, хозяев и/или векторов для получения фармацевтической композиции для лечения, профилактики и/или облегчения иммунологических нарушений или для устранения латентно инфицированных клеток, где упомянутые клетки инфицированы вирусом иммунодефицита приматов, таким как ВИЧ-1. Данное изобретение также относится к способу лечения, профилактики и/или облегчения иммунологических нарушений или устранения клеток, которые латентно инфицированы вирусом иммунодефицита приматов. Кроме того, изобретение относится к комплекту, содержащему соединения по изобретению.

В тексте данного описания цитируются некоторые документы. Таким образом, каждый из документов, цитируемых здесь (включая любые спецификации производителей, инструкции и т.д.), приводится здесь в виде ссылки.

Заболеваемость иммунологическими нарушениями/заболеваниями, такими как аутоиммунные заболевания, воспалительные заболевания, а также инфекционные заболевания, не только увеличивается, но представляет серьезную опасность для здоровья всего человечества.

Например, в Германии около 1 % населения страдает таким аутоиммунным заболеванием, как ревматоидный артрит. Кроме того, имеется ряд других ревматоидных заболеваний, также ведущих к артриту. В настоящее время для лечения воспалительных заболеваний суставов используются три группы лекарственных средств - нестероидные противоревматические средства, препараты кортизона и препараты второго ряда, а также TNFα-блокирующие агенты. До сегодняшнего дня лечение было сфокусировано на местных инъекциях препаратов кортизона в комбинации с системным применением противовоспалительных средств или препаратов второго ряда.

Нестероидные противоревматические средства, которые обладают мягким обезболивающим и противовоспалительным действием, имеют тем не менее множество побочных эффектов при регулярном применении (например, при язвах ЖКТ, нефрозах). Высокое дозы препаратов кортизона при высоких дозах дают сильный противозастойный и обезболивающий эффект, однако приводят к быстрому рецидиву после прекращения лечения. Более того, препараты кортизона не могут остановить деструктивный процесс при заболеваниях суставов. Длительная терапия кортизоном обычно влечет за собой серьезные побочные эффекты (инфекции, синдром Кушинга, остеопороз, пергаментная кожа, расстройства метаболизма и гормональные расстройства). Существенный недостаток местных инъекций кортизона заключается в том, что активность мигрировавших лейкоцитов только снижается. Поскольку инфильтрирующие клетки не разрушаются, после прекращения терапии наступает быстрый рецидив. Как упоминалось выше, то же относится и к системному применению. Иногда развивается воспаление вследствие раздражающего воздействия кристаллов кортизона, усиливающееся после инъекции кортизона. Длительность действия инъекции кортизона очень неравномерна и может варьироваться от полной неэффективности до получения длительного эффекта в течение нескольких недель.

Препараты второго ряда в ревматологии используются для достижения долговременного подавления воспаления и для сокращения использования препаратов кортизона. Из-за существенной токсичности (аллергии, инфекции, злокачественные заболевания, почечная недостаточность, кризы кровяного давления, легочные заболевания) необходимо очень внимательное наблюдение врачей за пациентами. После начала лечения терапевтический эффект может не проявляться в течение первых трех месяцев. В настоящее время применяются 4 или 5 таких препаратов второго ряда, которые используют сначала индивидуально или комбинируют, если лечение неэффективно. О механизме действия препаратов второго ряда почти ничего не известно. До сих пор полностью не ясно, может ли применение препаратов второго ряда замедлить разрушение суставов. В последние годы в лечении ревматоидного артрита начали применять новую группу веществ, действие которых основано на блокировании веществ клеточного сигнала (в частности, TNFα) посредством моноклональных антител или растворимых рецепторных конструкций.

Кроме того, некоторые пациенты не реагируют на применяемые в настоящее время виды лечения. В других случаях традиционную терапию прекращают из-за непереносимых побочных эффектов.

Подобная ситуация, когда современные виды лечения имеют множество ограничений, наблюдается и для многих других воспалительных и аутоиммунных заболеваний, таких как почечные воспалительные заболевания, кишечные воспалительные заболевания, множественный склероз и отторжение трансплантата. Например, средства, используемые для лечения воспалительных и аутоиммунных заболеваний, включают противовоспалительные и иммунодепрессивные средства, такие как азатиоприн, циклофосфамид, глюкокортикоиды, например, преднизон и кортикостероиды; иммунодепрессанты, такие как циклоспорин А, такролимус (FK506), сиролимус (рапамицин); и протеиновые средства, такие как кальцинурин, β-интерферон, анти-ТМРα-моноклональные антитела (ремикад). Эти препараты показывают общие иммуномодулирующие эффекты, и поэтому их показатели эффективности и побочных эффектов могут накладывать серьезные ограничения на выбранные варианты лечения (Harrison’s Principles of Internal Medicine, eds. Fauci et al., 14^th edition, McGraw-Hill publisher).

Для лечения кишечных воспалительных заболеваний (примерами которых являются болезнь Крона, язвенный колит) обычно используют такие противовоспалительные средства, как сульфасалазин (азулфидин) и глюкокортикоиды, такие как преднизон и, в некоторых случаях, TNFα-блокирующими препараты. При язвенном колите традиционно применяют иммунодепрессивную терапию такими препаратами, как азатиоприн, а пациентам с тяжелыми формами болезни назначают мощное иммунодепрессивное средство циклоспорин (Harrison’s Principles of Internal Medicine, eds. Fauci et al., 14^th edition, McGraw-Hill publisher).

Во многих случаях при использовании имеющихся лекарственных средств достаточное снижение активности заболевания не достигается, так что иногда даже становится необходимым хирургическое вмешательство.

Почечные воспалительные заболевания (нефрит) обычно лечат, например, глюкокортикоидами, алкилирующими средствами и/или плазмаферезом. Подобные варианты лечения также применяются при системной красной волчанке (СКВ), синдроме Шегрена, полимиозите, дерматомиозите, смешанной болезни соединительных тканей, антифосфолипидном синдроме.

Для лечения некоторых из этих заболеваний на сегодняшний день существует лишь ограниченное количество терапевтических вариантов. Все эти болезни включают воспалительный компонент. Однако имеющимися в настоящее время препаратами воспалительный компонент не может быть подавлен в достаточной степени. Для некоторых препаратов, например алкилирующих средств, не должна превышаться максимальная для пациента пожизненная доза.

Отторжение трансплантата обычно лечат иммунодепрессивными средствами, включая азатиоприн, микофенолат мофетил, глюкокортикоиды, циклоспорин, такролимус (FK506), сиролимус (рапамицин). Комбинацию стероидов и низкой дозы мышиного моноклонального антитела ОКТЗ, связывающегося с Т-клетками, используют для того, чтобы вызвать анергию и истощение Т-клеток, а затем терапию продолжают с использованием иммунодепрессантов, например, циклоспорина. Человеческие антимышиные антитела I(HAMAs) имеют распространенные побочные эффекты и ограничивают использование ОКТЗ (Fauci et al. sic.2374-2381).

Способы лечения множественного склероза включают такие средства, которые воздействуют на иммунную систему в целом, например, противовоспалительные средства, такие как азатиоприн, циклофосфамид, преднизон, кортикостероиды, циклоспорин А, кальцинурин, рапамицин, β-интерферон (Fauci et al. sic.2415-2419; Wang (2000) J. Immunol 165, 548-57). Кроме того, применяется ряд неспецифических средств, которые могут улучшить качество жизни, включая физиотерапию и психофармацевтические средства. Ни один из вариантов лечения, упомянутых выше, не оказывает целительного действия. Даже самый многообещающий препарат, β-интерферон, лишь замедляет развитие болезни и при этом вызывает существенные побочные воздействия.

Далее, вирусом иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1), который является наиболее распространенной причиной СПИДа, уже инфицированы более 50 млн человек (включая умерших), и темпы нового инфицирования оцениваются приблизительно в 6 млн человек в год (эпидемические данные по СПИДу за декабрь 1999 (UNAIDS, Geneva, 1999), www. unaids.org). Тревожит также неопределенность относительно возможности эпидемии. Хотя глобальным эпицентром является центральная Африка, скорость инфицирования в последнее время увеличилась в странах бывшего СССР и в части южной и юговосточной Азии, включая Индию и Китай, где буквально сотни миллионов человек находятся в потенциальной опасности. В Соединенных Штатах новая волна инфекции выявлена у женщин, сексуальных меньшинств и младших поколений мужчин-гомосексуалистов. Комбинационная антиретровирусная терапия приносит клиническое облегчение многим пациентам, однако обладает высокой стоимостью и токсичностью, и СПИД остается смертельным заболеванием. Кроме того, подавляющему большинству инфицированных людей в мире эти лекарства недоступны. Таким образом, хотя демография (и в некоторых случаях естественный ход развития) СПИДа изменилась, эпидемия отнюдь не предотвращена; наоборот, болезнь развивается, расширяется и представляет еще большую опасность.

Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) не может войти в человеческую клетку, не связавшись сначала с двумя ключевыми молекулами на клеточной поверхности, CD4 и корецептором. Корецептор, который узнается в первую очередь, это CCR5, а позднее в жизненном цикле вируса другой хемокиновый рецептор, CXCR4, становится корецептором для ВИЧ-1 (D’SouZa, Nature Med. 2, 1293 (1996); Premack, Nature Med. 2, 1174; Fauci, Nature 384, 529 (1996)). Штаммы ВИЧ-1, которые в основном передаются половым путем, называются М-тропными вирусами. Эти штаммы ВИЧ-1 (также известные как NSI-первичные вирусы) могут реплицироваться в первичных CD4+ Т-клетках и макрофагах и используют хемокиновый рецептор CCR5 (реже - CCR3) в качестве корецептора. Т-тропные вирусы (иногда называемые Sl-первичными) также могут реплицироваться в первичных CD4+ Т-клетках, но кроме этого, могут заражать установившиеся линии CD4+ Т-клеток in vitro, что осуществляется посредством хемокинового рецептора CXCR4 (фузина). Многие из этих Т-тропных штаммов могут использовать CCR5 в дополнение к CXCR4, а некоторые посредством CCR5 могут входить в макрофаги, по крайней мере, в определенных in vitro условиях (D’SouZa, Nature Med. 2, 1293 (1996); Premack, Nature Med. 2, 1174; Fauci, Nature 384, 529 (1996)). Участвуют ли другие корецепторы в патогенезе ВИЧ-1, не выяснено, но из in vitro исследований может быть сделан вывод о существовании другого корецептора для некоторых Т-тропных штаммов. Поскольку М-тропные штаммы примерно на 90 % связаны с передачей ВИЧ половым путем, CCR5 является доминирующим корецептором для вируса у пациентов; передача (или системное закрепление) СХСR4-использующих (Т-тропных) штаммов происходит редко (D’SouZa, Nature Med. 2, 1293 (1996); Premack, Nature Med. 2, 1174; Fauci, Nature 384, 529 (1996), Paxton, Nature Med. 2, 412 (1996); Liu, Cell 86, 367 (1996); Samson, Nature 382, 722 (1996); Dean, Science 273, 1856 (1996); Huang, Nature Med. 2, 1240 (1996)). Однако когда SI-вирусы развиваются in vivo (или произошла передача), они особенно вирулентны и вызывают ускоренное прогрессирование болезни (D’SouZa, Nature Med. 2, 1293 (1996); Premack, Nature Med. 2, 1174; Fauci, Nature 384, 529 (1996), Schuitemaker, J. Virol. 66, 1354 (1992); Connor, J. Virol. 67, 1772 (1993); Richman, J. Infect. Dis. 169, 968 (1994); R.I. Connor et al., J. Exp. Med. 185, 621 (1997); Trkola, Nature 384, 184 (1996)).

Количество и природа корецепторных молекул на целевых клетках, а также предполагаемая способность штаммов ВИЧ-1 входить в клетки посредством различных корецепторов представляются факторами, которые определяют прогрессирование болезни. Эти факторы оказывают огромное влияние на механизмы ВИЧ-1-инфицирования как со стороны хозяина, так и со стороны вируса. Например, гомозиготный дефект (дельта 32) в CCR5 строго коррелирует с устойчивостью к ВИЧ-1-инфекции in vivo и in vitro. Индивидуумы, являющиеся гетерозиготными к дефектной аллели CCR5, в лучшем случае слабо защищены от инфекции и показывают лишь умеренно замедленное прогрессирование заболевания (Paxton, Nature Med. 2, 412 (1996); Liu, Cell 86, 367 (1996); Samson, Nature 382, 722 (1996); Dean, Science 273, 1856 (1996); Huang, Nature Med. 2, 1240 (1996)). Однако на уровень экспрессии CCR5 на активированных CD4+ Т-клетках могут влиять другие факторы, что, в свою очередь, влияет на эффективность ВИЧ-1 - инфекции in vitro (Trkola, Nature 384, 184 (1996); BleuI, Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 94, 1925 (1997)). По причинам, которые пока не ясны, величина экспрессии CCR5 на клеточной поверхности (измеренная по МIР-1-связыванию) CD4+ Т-клеток от индивидуумов с двумя аллелями CCR5 дикого типа изменяется в 20 раз (Trkola, Nature 384, 184 (1996)) (см. фиг). Окрашивание CCRS-специфическим моноклональным антителом показывает столь же сильную изменчивость (Wu, J. Ехр. Med. 186:1373-81 (1997)). Такое изменение может быть намного сильнее эффекта от одной дефектной аллели CCR5. Причины такого изменения должны быть тщательно изучены, поскольку они открывают путь к контролируемым факторам, которые могут повысить устойчивость к заболеванию.

Клинические изоляты вирусов иммунодефицита приматов главным образом используют для вхождения хемокиновый рецептор CCR5 (Feng, Science 272, 872 (1996); Choe, Cell 85, 1135 (1996); Deng, Nature 381, 661 (1996); Dragic et al., Nature 381, р. 667; Doranz, Cell 85, 1149 (1996); Alkhatib, Science 272, 1955 (1996)). Для большинства изолятов ВИЧ-1, которые закрепились после передачи и доминируют в течение первых лет инфицирования, CCR5 является обязательным корецептором, и редкие индивидуумы, являющиеся генетически дефицитными в экспрессии CCR5, относительно устойчивы к инфекции ВИЧ-1 (Connor, J. Ехр. Med. 185, 621 (1997); Zhang, Nature 383, 768 (1996); Björndal, J. Virol. 71, 7478 (1997); Dean, Science 273,1856 (1996); Liu, Cell 86, 367 (1996); Paxton, Nature Med. 2, 412 (1996); Samson, Nature 382, 722 (1996)). Изоляты ВИЧ-1, появляющиеся позднее в ходе инфекции, в дополнение к CCR5 часто используют другие хемокиновые рецепторы, чаще всего CXCR4. Изучение химерных оболочечных гликопротеинов показало, что третья переменная (V3) петля gp120 является главным детерминантом использования хемокинового рецептора (см. ссылки, приведенные выше, а также Cocchi, Nature Med. 2, 1244 (1996); Bieniasz, EMBO J. 16, 2599 (1997); Speck, J. Virol. 71, 7136 (1997)). V3-делетированные версии gp120 не связываются с CCR5, хотя и происходит связывание с CD-4 на уровнях дикого типа. Антитела к петле V3 препятствуют gp-120-ССR5-связыванию (Trkola, Nature 384, 184 (1996); Wu, Nature 384, 179 (1996); Lapham, Science 274, 602 (1996); Bandres, J. Virol. 72, 2500 (1998); Hill, Science 71, 6296 (1997)). Эти результаты показывают участие петли V3 в связывании хемокиновых рецепторов.

Латентное состояние ВИЧ устанавливается на самых ранних стадиях инфекции, когда доминируют М-тропные штаммы. Заражение М-тропными штаммами зависит от присутствия CCR5 на целевой клетке. Важность CCR5 как незаменимого корецептора для М-тропного ВИЧ-1 подтверждается тем фактом, что индивидуумы с отсутствием CCR5 из-за гомозиготной делеции 32 пар оснований (дельта 32) являются высокоустойчивыми к ВИЧ-1-инфекции. В отличие от других маркеров, таких как CD4, CD25 или CD45RO, CCR5 присутствует только в определенной подгруппе лимфоцитов и других клеток, подверженных ВИЧ-инфекции (Rottmann (1997) Am J Pathol 151, 1341-1351; Naif (1998) J Virol 72, 830-836; Lee (1999) Proc. Natl. Acad Sci. 96, 5315-5220).

Некоторые подходы к лечению основаны на удалении латентно инфицированных клеток. Одна из стратегий состоит в доведении латентно инфицированных клеток до продуцирования вируса и последующей гибели клеток. В этом контексте одним из способов является введение IL-2 (TNFα, IL-6) в присутствии HAART, пока не исчерпается вирусный источник (Chun (1999) Nat. Med. 5, 651-655; Stellbrink (1999) Abstracts of the 6^th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections (Foundations for Retrovirology and Human Health, Alexandria, VA), abstr. 358, p. 135). Предполагается, что эти клетки умирают после активации. Вопрос, может ли быть полностью уничтожен весь пул латентно инфицированных клеток, остается открытым.

Другая стратегия состояла в попытке специфического убивания латентно инфицированных клеток на основе экспрессии gp120 на клеточной поверхности. Были предложены иммунотоксины, узнающие gp120, но они оказались неудачными по двум причинам. Одна конструкция, протестированная на людях, представляла собой протеин, состоящий из растворимых CD4, сцепленных с экзотоксином А Pseudomonas aeroginosa (РЕ). Клинические результаты оказались неутешительными из-за дозоограничивающей гепатотоксичности при отсутствии каких-либо признаков эффективности, и программа была закрыта (Ashorn (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 8889-8893; Berger (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. 95, 11511-11513). Вторая причина неудачи состояла в том, что латентно инфицированные клетки не экспрессируют вирусные поверхностные гликопротеины, т.е. gр-120 и gр-41. Таким образом, способы, основанные на узнавании gр-120 или gр-41 для устранения латентно инфицированных клеток, являются неэффективными.

Другие способы устранения латентно инфицированных клеток основаны на устранении целого отдела CD4+ Т-клеток (Berger (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. 95, 11511-11513), или СD25-положительного отдела (Bell (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90, 1411-1415), отдела Т-лимфоцитов CD45RO (McCoig (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. 96, 11482-11485). Однако эти маркеры не включают в достаточной мере все потенциально инфицированные клетки. Такие клетки включают, кроме CD4-положительных клеток, или Т-лимфоцитов, также макрофаги и негематопоэтические клетки.

В WO 98/18826 описано антитело, направленное против хемокинового рецептора 5 млекопитающих (например, человека), при этом упомянутое антитело предложено в способе ингибирования взаимодействия клетки, несущей CCR5, с потенциальным лигандом, таким как ВИЧ. Упомянутый способ предложен как ингибирующий ВИЧ-инфекцию. Кроме того, предложены варианты лечения воспалительных заболеваний, аутоиммунных заболеваний и отторжения трансплантата. Все эти варианты лечения основаны на допущении, что специфические антитела, такие как иммуноглобулиновые молекулы или их функциональные части, препятствуют взаимодействиям рецептор-лиганд. Однако способны ли эти антитела уничтожать соответствующие клетки, не выяснено. Кроме того, в WO 98/18826 только сделано предположение, что взаимодействие ВИЧ и рецептора CCR5 будет предотвращено и, следовательно, предотвращена ВИЧ-инфекция.

Лейкоциты, в частности Т-клетки, предположительно являются ключевыми регуляторами иммунного ответа на инфицирующие факторы и являются главными компонентами для инициирования и поддержания воспалительных процессов, таких как кишечные воспалительные заболевания и почечные воспалительные заболевания, воспалительные заболевания суставов, аутоиммунных нарушений, таких как множественный склероз и артрит, заболеваний кожи, таких как псориаз, диабета и отторжения трансплантата.

Поэтому техническая задача изобретения состоит в создании новых средств и способов, которые могут привести к подавлению активированных лейкоцитов, участвующих в иммунологических патологиях, таких как аутоиммунные заболевания, воспалительные процессы и/или вирусные инфекции иммунных клеток.

Соответственно данное изобретение относится к применению конструкции антитела и/или хемокина, которая связывается с хемокиновым рецептором, для получения фармацевтической композиции для устранения клеток, которые латентно инфицированы вирусом иммунодефицита приматов, предпочтительно вирусом иммунодефицита человека, наиболее предпочтительно ВИЧ-1.

В контексте данного изобретения связывание упомянутой конструкции антитела и/или хемокина, которая связывается с хемокиновым рецептором, приводит к уничтожению и/или деструкции целевой клетки, а именно клетки, латентно инфицированной упомянутым вирусом иммунодефицита приматов.

Данное изобретение выявило тот неожиданный факт, что высокоспецифические антитела, направленные против хемокинового рецептора, оказались неспособными разрушать, вызывать лизис и/или истощать клетки, которые экспрессируют упомянутый хемокиновый рецептор. Однако конструкции антител или хемокинов, описанные в данном изобретении, оказались способными специфически взаимодействовать с упомянутыми хемокиновый рецептор-положительными клетками и способными уничтожать упомянутые клетки. Упомянутое уничтожение/деструкция может быть достигнуто, например, за счет привлечения специфических эффекторных клеток, таких как моноциты, макрофаги, Т-клетки (особенно предпочтительными являются цитотоксические Т-клетки) или дендритических клеток. Хотя моноклональные антитела оказались успешными в деструкции/уничтожении злокачественных клеток (см., например, Maloney (1999), Sem. Oncol. 26, 76-78), они не показывают эффективности против определенных подтипов лейкоцитов (включая лимфоциты, полиядерные лейкоциты и моноциты), особенно ССR5-положительных моноцитов, Т-клеток и дендритических клеток, что подтверждается в данном описании и в прилагаемых примерах.

В данном изобретении выражение "конструкция антитела и/или хемокина" (т.е. конструкция антитела и/или конструкция хемокина) включает не только молекулы и многофункциональные конструкции и соединения, описанные здесь, но и их функциональные фрагменты. Функциональные фрагменты упомянутых конструкций представляют собой фрагменты, которые способны связываться или взаимодействовать с хемокиновым рецептором на целевой клетке и обеспечивать средства уничтожения, лизиса и/или разрушения упомянутой целевой клетки.

Специфические хемокиновые рецепторы по данному изобретению включают, но не ограничены, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, XCR1, CCR10 и CX3CR1. Хемокины и/или хемокиновые лиганды, связывающиеся с упомянутыми хемокиновыми рецепторами, хорошо известны в данной области и показаны, среди прочего, в Табл.4. Кроме того, хемокины и соответствующие рецепторы описаны у Murphy (2000), Pharm. Reviews 52, 145-176. Хемокины, хемокиновые лиганды и/или рецепторы приматов являются предпочтительными, наиболее предпочтительными - человеческие хемокины/лиганды/рецепторы.

Данное изобретение также относится к применению конструкции антитела и/или хемокина, которая связывается с хемокиновым рецептором, для получения фармацевтической композиции для лечения, профилактики и/или облегчения воспалительных заболеваний почек, воспалительных заболеваний кишечника, множественного склероза, заболеваний кожи, аллергических реакций, диабета или отторжения трансплантата.

Упомянутые заболевания кожи включают, среди прочих, псориатические нарушения, атопический дерматит или хроническое воспаление кожи. В PBMCs, полученных от пациентов с псориазом, экспрессия CCR6 апрегулирована. В дополнение к этому лиганд CCR6 (CCL20=MIP3 альфа) и CCR6 апрегулированы в псориатической коже. Кроме того, CCL20-экспрессирующие кератиноциты совместно локализуются с инфильтрирующими кожу Т-клетками (Homey (2000) J. Immunol. 164, 6621-6632). Кроме того, CCR10 был обнаружен на меланоцитах, дермальных фибробластах, дермальных эндотелиальных клетках, Т-клетках и кожных клетках Лангерханса, но не кератиноцитах. Лиганд CCR10 (CCL27) имеет кожно-ассоциированный характер экспрессии (Homey (2000) J. Immunol. 164, 3465-3470; Cnarbonnier (1999) J. Exp. Med. 190, 1755-1768). Далее, CCR4 и его лиганд (TARC, MDC) апрегулированы в хронически воспаленной коже. Кроме того, CCR4 является хоуминг-рецептором для Т-клеток, входящих в кожу. CCR4+ Т-клетки представляют собой лишь небольшую субпопуляцию всех Т-клеток, и поэтому уничтожение CCR4+ Т-клеток показано для различных воспалительных заболеваний кожи (Campbell (1999) Nature 400, 776-780). Экспрессия CCR3 и эндотоксина усилена при атопическом дерматите и может участвовать в инициировании и поддержании воспаления (Yawalkar (1999) J. Invest. Dermatol. 113, 43-48).

Фактически все Т-клетки в тканях ревматоидного артрита, синовиальной жидкости и в различных воспаленных тканях, например при язвенном колите, хроническом вагините и саркоидозе, экспрессируют CXCR3, в то время как в нормальных лимфоузлах меньшее количество Т-клеток являются CXCR3-положительными.

Для множественного склероза было показано, что CCR5 и CXCR3 экспрессируются в большом количестве на Т-клетках, инфильтрирующих демиелинирующие поражения мозга, а также в периферической крови пораженных болезнью пациентов. Соответствующие лиганды М1Р-1α и IP-10 также были обнаружены в тромбоцитах (Balashov (1999) Proc. Natl. Acad Sci. 96, 6873-6878). Удаление Т-клеток заблокировало бы Т-клеточный активатор этого аутоиммунного заболевания.

Иммунохимический анализ экспрессии бета-хемокиновых рецепторов в посмертных тканях ЦНС пациентов с множественным склерозом (МС) показал, что в хронически пораженных МС участках экспрессия CCR2, CCR3 и CCR5 была ассоциирована с пенистыми макрофагами и активированной микроглией, в то время как в контрольной ткани ЦНС микроглиальными клетками экспрессировались низкие уровни этих хемокиновых рецепторов. CCR2 и CCR5 также присутствовали на больших количествах инфильтрирующих лимфоцитов, а в 5 из 14 случаев МС CCR3 и CCR5 также экспрессировались на астроцитах. Повышенная экспрессия CCR2, CCR3 и CCR5 в ЦНС при МС говорит о том, что эти бета-хемокиновые рецепторы и их лиганды играют определенную роль в патогенезе МС (Simpson, J. Neuroimmunol., 2000, 108, 192-200).

Высокая экспрессия CCR3 и CCR5 также была отмечена в лимфоузлах от пациентов с болезнью Ходжкина. В то время как CCR3 был в равной степени распределен в клетках CD4+ и CD8+, CCR5 был главным образом связан с клетками CD4+. Эти данные показывают, что хемокины участвуют в образовании ненеопластических лейкоцитных инфильтратов при болезни Ходжкина (Buri, Blood, 2001,97, 1543-8).

Периодонтальное заболевание представляет собой периферическую инфекцию с участием грам-отрицательных микроорганизмов. У пациентов с умеренным и прогрессирующим заболеванием в воспалительных инфильтратах были обнаружены клетки, экспрессирующие хемокиновый рецептор CCR5 (Gamonal, J. Periopdontal. Res., 2001, 36, 194-203 and Taubman, Crit. Rev. Oral. Biol. Med. 2001, 12, 125-35).

Диабет типа I считается Т-клеточно-опосредованным аутоиммунным заболеванием. Экспрессию рецептора CCR5 в поджелудочной железе связывали с прогрессированием диабета типа I в соответствующих животных моделях (Cameron (2000) J. Immunol. 165, 1102-1110). В частности, экспрессию CCR5 связывали с развитием инсулинита и спонтанного диабета типа I.

В соответствующих животных моделях диабета типа I с миграцией Т-клеток связаны специфические хемокины: RANTES, MCP-1, MCP-5, IP-10. Эти хемокины приводят к иммунному ответу th1 (Bradley (1999) J. Immunol. 162:2511-2520).

Упомянутое выше кишечное воспалительное заболевание может включать болезнь Крона и язвенный колит.

CCR9 экспрессируется на Т-клетках, мигрирующих в кишечник, и может участвовать в болезни Крона и язвенном колите. Все кишечные лимфоциты собственной пластинки (lamina propria) и интраэпителиальные лимфоциты экспрессируют CCR9 (Zabel (1999) J. Exp. Med. 190, 1241-1256).

Кроме того, конструкция антитела и/или хемокина, описанная в данном изобретении, также полезна для предотвращения осложнений во время и/или после трансплантаций, т.е. предотвращения отторжения трансплантата и заболевания "трансплантат против хозяина".

CCR7 экспрессируется на наивных Т-клетках и дендритических клетках и опосредует клеточную миграцию в лимфатические органы. Поэтому устранение CCR7+ клеток будет предотвращать иммунный ответ на новые антигены, например, после трансплантации. Такое лечение будет не иммунодепрессивным в целом, а избирательным для новых антигенов и будет ограничено временем приема лекарственных средств по изобретению, истощающих CCR7+ клетки (Forster (1999) Cell 99, 23-33). CXCR5 экспрессируется на наивных В-клетках в периферической крови и миндалинах, а также в Т-лимфоцитах. Устранение CXCR5+ В-клеток будет предотвращать формирование гуморального ответа. Кроме того, устранение Т-лимфоцитов будет снижать клеточный компонент иммунного ответа (Murphy (2000), Pharmacological Reviews 52, 145-176).

Для создания фармацевтических композиций для лечения аллергий и/или аллергических реакций могут быть использованы конструкции антител и/или хемокинов, описанные здесь. Было показано, что CCR3, который связывается с эндотоксином и RANTES, экспрессируется на эозинофилах, клетках Тh2, мачтовых клетках, базофилах, которые участвуют в аллергических реакциях (Romangnani (1999) Am. J. Pathol. 155, 1195-1204).

Для вышеупомянутых почечных заболеваний было показано, что CCR5-положительные Т-клетки могут играть определенную роль в интерстициальных процессах, ведущих к фиброзу. ССR5-положительные клетки были идентифицированы в интерстициальном инфильтрате различных гломерулярных и интерстициальных заболеваний, а также отторжения трансплантата. Упомянутые заболевания включают острый и хронический нефрит, IgA нефропатию и др. (Segerer (1999), Kidney Int. 56, 52-64).

В модели транзиторного иммунного комплексного гломерулонефрита (IC-GN) CCR1, CCR2 и CCR5 экспрессировались на ранней стадии и уже были даунрегулированы в момент пика протеинурии и инфильтрации лейкоцитов. Экспрессия CCR5 была локализована в гломерулах путем гибридизации in situ и количественной обратной транскрипционной (ОТ) ПЦР изолированных гломерул (Anders, J. Am. Soc. Nephrol., 2001, 12, 919-31). В почках 38 пациентов с несколькими почечными заболеваниями CCR1- и ССR5-положительные макрофаги и Т-клетки были обнаружены как в гломерулах, так и в интерстиции, что было показано иммуногистохимическим анализом. Количество почечных ССR5-положительных клеток резко снизилось во время выздоровления, обусловленного глюкокортикоидами (Furuichi, Am. J. Nephrol., 2000, 20, 291-9).

В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к применению конструкции антитела и/или хемокина, которая связывается с хемокиновым рецептором, для получения фармацевтической композиции, описанной выше, в которой упомянутый хемокиновый рецептор представляет собой хемокиновый рецептор 5 (CCR5). Предпочтительно, чтобы упомянутый CCR5 представлял собой человеческий CCR5.

Хемокиновый рецептор CCR5 является членом большого семейства G-протеин-сцепленных рецепторов с семью трансмембранными доменами, которые связываются с провоспалительными хемокинами RANTES, МIР1-α, МIР1-β и МСР-2. Хемокины действуют согласованно с адгезионными молекулами, индуцируя выброс лейкоцитов и направляя их миграцию к участкам повреждения ткани.

CCR5 экспрессируется на незначительной части Т-клеток и моноцитов и является основным корецептором для М-тропных штаммов ВИЧ-1, которые преобладают на ранней стадии ВИЧ-инфекции.

Таким образом, фармацевтическая композиция, описанная выше, особенно полезна для уничтожения CCR5⁺ лейкоцитов и могла бы быть полезной для удаления клеток, латентно инфицированных ВИЧ-1. Поэтому уничтожение CCR5⁺ клеток должно снижать количество клеток, латентно инфицированных ВИЧ, и должно быть особенно полезно для в комбинации с активной антивирусной, предпочтительно антиретровирусной терапией.

В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения упомянутая конструкция антитела, которая связывается с хемокиновым рецептором, предпочтительно CCR5, в качестве первого антигена, и с антигеном CD3 эффекторной клетки в качестве второго антигена. Предпочтительно, упомянутый антиген CD3 находится на поверхности Т-клетки, предпочтительно цитотоксической Т-клетки. Поэтому упомянутый CD3 обозначает антиген, который экспрессируется на вышеупомянутых клетках и может быть частью многомолекулярного (Т-)клеточного рецепторного комплекса.

Биспецифические антитела могут быть сконструированы путем гибрид-гибридомных технологий, путем ковалентного связывания специфических антител или другими способами, например, на основе диатела (Kipriyanow, Int. J. Cancer 77 (1998), 763-773).

Предпочтительно, упомянутое биспецифическое антитело представляет собой конструкцию одноцепочечного антитела.

Хорошо известно, что Fv, минимальный фрагмент антитела, который содержит полный сайт узнавания и связывания антигена, состоит из димера из одного вариабельного домена тяжелой цепи и одного вариабельного домена легкой цепи (V_H и V_L) в нековалентной связи. В этой конфигурации, которая соответствует конфигурации, обнаруживаемой в нативных антителах, три определяющих комплементарность области (CDRs) каждого вариабельного домена взаимодействуют друг с другом, определяя сайт связывания антигена на поверхности V_H-V_L-димера. Эти шесть CDRs вместе придают антителу специфичность связывания с антигеном. Каркасные области (FRs), фланкирующие CDRs, имеют третичную структуру, которая по существу законсервирована в нативных иммуноглобулинах таких отличающихся видов, как человек и мышь. Эти FRs служат для поддержания CDRs в свойственной им ориентации. Константные домены не требуются для функции связывания, но могут способствовать стабилизации взаимодействия V_H-V_L. Даже один вариабельный домен (или половина Fv, содержащая только три CDRs, специфические к антигену), обладает способностью узнавать и связывать антиген, хотя обычно с более низкой аффинностью, чем целый сайт связывания (Painter, Biochem. 11 (1972), 1327-1337). Таким образом, упомянутым доменом сайта связывания конструкции антитела, определенной и описанной в данном изобретении, может быть пара доменов V_H-V_L, V_H-V_H, или V_L-V_L. различных иммуноглобулинов. Порядок доменов V_H и V_L внутри полипептидной цепи не имеет решающего значения в данном изобретении, и порядок доменов, приведенный выше, обычно может быть изменен без потери функции. Однако важно, чтобы домены V_H и V_L были расположены таким образом, чтобы сайт связывания антигена мог изгибаться нужным образом.

Различные части антител/иммуноглобулинов могут быть соединены посредством обычных способов или сконструированы в виде смежных протеинов посредством рекомбинантных ДНК-технологий, например таким образом, чтобы экспрессировалась молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая цепь химерного или гуманизированного антитела, чтобы сконструировать смежный протеин (ср., например, Mack et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.92, pp.7021-7025).

Предпочтительным является одноцепочечное антитело со следующими фрагментами Fv: фрагмент sc-Fv моноклонального антитела против хемокинового рецептора, предпочтительно против CCR5, и фрагмент sc-Fv моноклонального антитела против CD3. В этом случае оба фрагмента Fv направлены против хемокинового рецептора, и фрагмент Fv против CD3 может быть расположен в N-концевом положении. Порядок доменов антитела V_L и V_H может быть переменным в обеих конструкциях, предпочтителен порядок фрагмента Fv против CCR5 V_L-V_H, а порядок фрагмента Fv против CD3 - V_H-V_L. Линкеры между вариабельными доменами, а также между двумя фрагментами Fv могут состоять из пептидных линкеров, предпочтительно из гидрофильного гибкого глицин- и серин-содержащего линкера, содержащего 1-25 аминокислот. Дополнительная гистидиновая цепь, например, из 6 × His, в С- или N-концевом положении, может использоваться для упрощения очистки и обнаружения конструкции.

По сравнению с обычными биспецифическими антителами биспецифические одноцепочечные антитела имеют то преимущество, что они состоят только из одной протеиновой цепи и, таким образом, их состав является точно определенным. Они имеют низкий молекулярный вес, обычно <60 кДа, и могут легко вырабатываться в промышленном масштабе в подходящих клеточных линиях, например, в СНО-клетках, с использова