Способ и набор для синтеза нуклеиновой кислоты, имеющей нуклеотидную последовательность, где в одной цепи попеременно связаны комплементарные нуклеотидные последовательности

Способ и набор для синтеза нуклеиновой кислоты, имеющей нуклеотидную последовательность, где в одной цепи попеременно связаны комплементарные нуклеотидные последовательности

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Данное изобретение относится к способу синтеза нуклеиновой кислоты, состоящей из специфической последовательности нуклеотидов, который применим в качестве способа амплификации нуклеиновой кислоты.

Предпосылки изобретения

Способ анализа, основанный на комплементарности нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, может непосредственно анализировать генетические признаки. Таким образом, этот анализ является очень эффективным средством для идентификации генетических заболеваний, малигнизации, микроорганизмов и т.д. Далее, сам ген является объектом обнаружения, и, следовательно, отнимающие много времени и обременительные процедуры, например процедуры культивирования, могут быть в некоторых случаях опущены.

Тем не менее, обнаружение гена-мишени, присутствующего в очень небольшом количестве в образце, является обычно нелегким, так что является необходимой амплификация самого гена-мишени или его определяемого сигнала. В качестве способа амплификации гена-мишени известен способ ПЦР (полимеразной цепной реакции) (Science, 230, 1350-1354, 1985). В настоящее время способ ПЦР является наиболее популярным способом в качестве способа амплификации нуклеиновых кислот in vitro. Этот способ хорошо устоялся как превосходный способ определения, благодаря высокой эффективности на основе эффекта экспоненциальной амплификации. Кроме того, поскольку продукт амплификации может быть извлечен в виде ДНК, этот способ широко используется в качестве важного инструмента, обеспечивающего способы генетической инженерии, такие как клонирование и определения структуры генов. Однако в способе ПЦР имеются следующие известные проблемы: для его применения необходим специальный терморегулятор; экспоненциальное развитие реакции амплификации обусловливает проблему количественного определения, и образцы, и реакционные растворы легко загрязняются извне, что делает возможным ошибочное смешивание нуклеиновых кислот для функционирования в качестве матрицы.

По мере накопления информации о геноме привлекает внимание анализ полиморфизмов единственного нуклеотида (SNP). Детектирование SNP при помощи ПЦР является возможным вследствие конструирования праймера таким образом, что его нуклеотидная последовательность содержит SNP. То есть присутствует ли нуклеотидная последовательность, комплементарная этому праймеру, или не присутствует, может быть выяснено определением, присутствует или не присутствует продукт реакции. Однако, как только комплементарная цепь синтезируется случайно ошибочно в ПЦР, этот продукт функционирует в качестве матрицы в последующей реакции, давая ошибочный результат. На практике считается, что строгий контроль ПЦР является трудным при различии только одного основания, имеющегося на конце праймера. Таким образом, требуется улучшение специфичности для применения ПЦР с целью обнаружения SNP.

С другой стороны, на практике используют также способ синтеза нуклеиновой кислоты при помощи лигазы. Способ ЛЦР (лигазной цепной реакции, Laffler TG; Garrino JJ; Marshall RL; Ann. Biol. Clin. (Paris), 51:9, 821-6, 1993) основан на реакции, в которой два смежных зонда гибридизуются с последовательностью-мишенью и лигируются друг с другом лигазой. Эти два зонда не могут быть лигированы в отсутствие нуклеотидной последовательности-мишени, и, следовательно, присутствие лигированного продукта является указанием на наличие нуклеотидной последовательности-мишени. Поскольку способ ЛЦР также требует регуляции температуры для отделения комплементарной цепи от матрицы, возникает та же самая проблема, что и в способе ПЦР. Для ЛЦР имеется также сообщение о способе улучшения специфичности посредством добавления стадии обеспечения пропуска между соседними зондами и заполнения этого пропуска ДНК-полимеразой. Однако то, что может ожидаться в этом способе, это только специфичность, но все еще остается проблема, заключающаяся в том, что необходима регуляция температуры. Кроме того, применение дополнительного фермента приводит к увеличению в стоимости.

Способ, названный способом SDA (амплификацией с вытеснением (замещением) цепи) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 392-396, 1992] [Nucleic Acid. Res., 20, 1691-1696, 1992], известен также как способ амплификации ДНК, имеющей последовательность, комплементарную последовательности-мишени, в качестве матрицы. В способе SDA используют особую ДНК-полимеразу для синтеза комплементарной цепи, начинающейся от праймера, комплементарного 3'-стороне определенной нуклеотидной последовательности, с вытеснением (замещением) двухцепочечной цепи, если она имеется, на 5'-стороне этой последовательности. В данном описании простое выражение “5'-сторона” или “3'-сторона” относится к стороне цепи, служащей в качестве матрицы. Поскольку двухцепочечная цепь на 5'-стороне вытесняется вновь синтезированной комплементарной цепью, этот способ назван способом SDA. Стадия изменения температуры, необходимая в способе ПЦР, может быть исключена в этом способе SDA предварительным встраиванием последовательности узнавания рестрикционного фермента (рестриктазы) в гибридизуемую последовательность в виде праймера. То есть ник (одноцепочечный разрыв), генерируемый рестрикционным ферментом, дает 3'-ОН-группу, действующую в качестве затравки синтеза комплементарной цепи, а ранее синтезированная комплементарная цепь высвобождается в виде однонитевой цепи посредством синтеза с замещением цепи и затем снова используется в качестве матрицы для последующего синтеза комплементарной цепи. Таким образом, сложная регуляция температуры, необходимая в способе ПЦР, не требуется в способе SDA.

Однако в способе SDA должен быть использован рестрикционный фермент, генерирующий ник, кроме ДНК-полимеразы вытесняющего цепь типа. Это требование дополнительного фермента является главной причиной более высокой стоимости. Далее, поскольку рестриктаза должна использоваться не для расщепления обеих цепей двухцепочечной нуклеиновой кислоты, а для введения ника (т.е. расщепления только одной из этих цепей), производное dNTP, такое как α-тио-dNTP, должно быть использовано в качестве субстрата для синтеза, чтобы сделать другую цепь устойчивой к расщеплению этим ферментом. Таким образом, продукт амплификации по способу SDA имеет структуру, отличающуюся от структуры природной нуклеиновой кислоты, и, следовательно, ограничивает расщепление рестрикционными ферментами или использование амплифицированного продукта для клонирования генов. Также и в этом отношении присутствует веская причина для более высоких расходов. Кроме того, при применении способа SDA для неизвестной последовательности существует возможность, что та же самая нуклеотидная последовательность, что и последовательность узнавания рестриктазы, используемая для введения ника, может присутствовать в области, подлежащей синтезу. В этом случае, возможно, что полная комплементарная цепь не сможет быть синтезирована.

NASBA (амплификация на основе последовательности нуклеиновой кислоты, также называемая опосредованным ТМА/транскрипцией способом амплификации) известна также в качестве способа амплификации нуклеиновой кислоты, в котором сложная регуляция температуры не является необходимой. NASBA является системой реакций, где ДНК синтезируется ДНК-полимеразой в присутствии РНК-мишени в качестве матрицы с зондом, имеющим добавленный к нему промотор Т7, и этот продукт образует со вторым зондом двухнитевую цепь, с последующей транскрипцией РНК-полимеразой Т7 с образованной двухнитевой цепью в качестве матрицы для амплификации большого количества РНК (Nature, 350, 91-92, 1991). NASBA требует некоторых стадий денатурации нагреванием, пока не завершается синтез двухцепочечной ДНК, но последующая реакция транскрипции РНК-полимеразой Т7 протекает при изотермических условиях. Однако необходимо комбинирование многочисленных ферментов, таких как обратная транскриптаза, РНКаза Н, ДНК-полимераза и РНК-полимераза Т7, что неблагоприятно сказывается на стоимости, аналогично SDA. Далее, поскольку сложно устанавливать условия для реакции многочисленных ферментов, этот способ едва ли является широко распространенным в качестве общего аналитического способа. В известных реакциях амплификации нуклеиновой кислоты остаются проблемы, такие как сложная регуляция температуры и необходимость применения множественных ферментов, как описано выше.

В отношении этих известных реакций синтеза нуклеиновой кислоты имеются несколько сообщений о попытке дополнительного улучшения эффективности синтеза нуклеиновой кислоты без ухудшения специфичности или расходов. Например, в способе, называемом RCA (амплификация катящегося кольца), было показано, что одноцепочечная ДНК, имеющая ряд нуклеотидных последовательностей, комплементарных подобному “висячему замку” зонду, может синтезироваться непрерывно в присутствии нуклеотидной последовательности-мишени (Paul M. Lizardi et al., Nature Genetics, 19, 225-232, July, 1998). В RCA используется подобный “висячему замку” зонд, имеющий особую структуру, в которой каждый из 5'- и 3'-концов единственного олигонуклеотида составляют смежный зонд в LCR. Затем, непрерывная реакция синтеза комплементарной цепи с зондом типа “висячего замка” в качестве матрицы, который был лигирован и циклизован в присутствии нуклеотидной последовательности-мишени, запускается объединением с полимеразой, катализирующей реакцию по типу вытеснения (замещения) цепи синтеза комплементарной цепи. Таким образом, образуется одноцепочечная нуклеиновая кислота, имеющая структуру из ряда районов, каждый из которых состоит из одной и той же последовательности нуклеотидов. Затем праймер дополнительно гибридизуют с этой одноцепочечной нуклеиновой кислотой для синтеза ее комплементарной цепи, и, следовательно, осуществляется высокая степень амплификации. Однако все еще остается проблема необходимости множества ферментов. Далее, запуск синтеза комплементарной цепи зависит от реакции лигирования двух смежных районов, и ее специфичность является в основном такой же, что и в LCR.

Для цели обеспечения З'-ОН существует известный способ, в котором нуклеотидную последовательность обеспечивают на 3'-конце последовательностью, комплементарной ей, и на этом конце образуется петля в виде шпильки (Gene, 71, 29-40, 1988). Синтез комплементарной цепи с самой последовательностью-мишенью в качестве матрицы начинается при петле-шпильке с образованием одноцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из комплементарной нуклеотидной последовательности. Например, структура, в которой гибридизация происходит в той же самой цепи на конце, к которому была присоединена комплементарная нуклеотидная последовательность, получена в PCT/FR95/00891. Однако в этом способе необходимой является стадия, в которой этот конец отменяет спаривание оснований с комплементарной цепью, и спаривание оснований происходит опять в той же самой цепи. По оценкам, эта стадия протекает в зависимости от тонкого состояния равновесия на этом конце взаимно комплементарных нуклеотидных последовательностей, в том числе спаривания оснований. То есть используется равновесное состояние, поддерживаемое между спариванием оснований с комплементарной цепью и спариванием оснований в той же самой цепи, и только одна цепь, гибридизующаяся с нуклеотидной последовательностью в одной и той же цепи, служит в качестве затравки синтеза комплементарной цепи. Таким образом, считается, что для получения высокой эффективности реакции должны быть установлены строгие условия реакции. Кроме того, в этом существующем ранее способе сам праймер образует структуру петли. Таким образом, как только образуется димер праймера, реакция амплификации автоматически инициируется независимо от того, присутствует нуклеотидная последовательность-мишень или нет, и таким путем образуется неспецифический синтетический продукт. Это может быть серьезной проблемой. Далее, образование димера праймера и последующее использование этого праймера не специфической синтетической реакцией приводит к снижению эффективности амплификации желаемой реакции.

Кроме того, сообщают, что область, не служащую в качестве матрицы для ДНК-полимеразы, использовали для реализации гибридизации 3'-концевой структуры с той же самой цепью (ЕР713922). Это сообщение означает ту же самую проблему, что и в PCT/FR95/00891 выше в отношении использования динамического равновесия при этом конце или возможности неспецифической синтетической реакции вследствие образования димерного праймера. Кроме того, особая область, не служащая в качестве матрицы для ДНК-полимеразы, должна быть приготовлен в качестве праймера.

Далее, в различных сигнальных реакциях амплификации, для которых используют принцип описанной здесь NASBA, часто используют олигонуклеотид, имеющий структуру шпильки на его конце для обеспечения двухцепочечного района промотора (патент Японии JP-A5-211873). Однако эти способы не являются способами, позволяющими последовательное обеспечение 3'-ОН для синтеза комплементарной цепи. Кроме того, структура петли-шпильки, имеющая 3'-конец, гибридизованный гибридизацией в той же самой цепи, используется с целью получения ДНК-матрицы, транскрибируемой РНК-полимеразой, в патенте Японии JP-A 10-510161 (WO96/17079). В этом способе матрицу амплифицируют с использованием транскрипции в РНК и обратной транскрипции из РНК в ДНК. Однако в этом способе реакционная система не может быть составлена без комбинирования множества ферментов.

Описание изобретения

Целью данного изобретения является обеспечение способа синтеза нуклеиновой кислоты на основе нового принципа. Более конкретной целью является обеспечение способа, способного осуществлять синтез нуклеиновой кислоты в зависимости от последовательности эффективно при низких расходах. То есть целью данного изобретения является обеспечение способа, способного осуществлять синтез и амплификацию нуклеиновой кислоты с использованием единственного фермента даже при изотермических условиях реакции. Другой целью данного изобретения является обеспечение способа синтеза нуклеиновой кислоты, который может давать высокую специфичность, трудно достигаемую в случае известных принципов реакций синтеза нуклеиновых кислот, а также способа амплификации нуклеиновых кислот с использованием указанного синтетического способа.

Авторы данного изобретения сконцентрировали внимание на том факте, что использование полимеразы, катализирующей синтез комплементарной цепи по типу вытеснения (замещения) цепи, применимо для синтеза нуклеиновых кислот, не зависящего от сложной регуляции температуры. Такая ДНК-полимераза является ферментом, используемым в SDA и RCA. Однако даже при использовании такого фермента реакция другого фермента всегда требуется для обеспечения 3'-ОН в качестве затравки синтеза в хорошо известном способе на основе праймеров, таком как SDA.

В этих условиях авторы данного изобретения исследовали обеспечение 3'-ОН с совершенно иной точки зрения в сравнении с известным подходом. В результате авторы данного изобретения нашли, что с использованием олигонуклеотида, имеющего особую структуру, 3'-ОН может обеспечиваться без дополнительной ферментативной реакции, посредством чего была достигнута цель данного изобретения. То есть данное изобретение относится к способу синтеза нуклеиновой кислоты, способу амплификации нуклеиновой кислоты с применением указанного способа синтеза нуклеиновой кислоты и новому олигонуклеотиду, делающему возможными указанные способы, следующим образом:

1. Способ синтеза нуклеиновой кислоты, имеющей комплементарные нуклеотидные последовательности, связанные попеременно в однонитевой цепи, предусматривающий:

a) стадию обеспечения нуклеиновой кислоты, которая обеспечена на ее 3'-конце областью F1, способной гибридизоваться с частью F1c в той же самой цепи, и которая при гибридизации области F1 с F1c способна образовывать петлю, содержащую область F2c, способную к спариванию оснований,

b) стадию выполнения синтеза комплементарной цепи, где 3'-конец F1, присоединенный гибридизацией к F1c, служит в качестве затравки синтеза,

c) стадию гибридизации с областью F2c олигонуклеотида, обеспеченного его 3'-концом, с F2, состоящим из последовательности, комплементарной области F2c, с последующим синтезом, с указанным олигонуклеотидом в качестве затравки синтеза, комплементарной цепи полимеразой, катализирующей реакцию вытеснения (замещения) цепи синтеза комплементарной цепи, для вытеснения комплементарной цепи, синтезированной в стадии b), и

d) стадию гибридизации, с комплементарной цепью, вытесненной в стадии с), для подготовки для спаривания оснований, полинуклеотида, обеспеченного на его 3'-конце последовательностью, комплементарной произвольной области в указанной цепи, синтезированной в стадии с), с последующим синтезом, с указанным 3'-концом в качестве затравки синтеза, комплементарной цепи полимеразой, катализирующей реакцию вытеснения цепи синтеза комплементарной цепи, для вытеснения комплементарной цепи, синтезированной в стадии с).

2. Способ по п.1, где в стадии d) затравка синтеза представляет собой область R1, присутствующую на 3'-конце в той же самой цепи и способную гибридизоваться с областью R1c, а петля, содержащая область R2c, способную к спариванию оснований, образуется гибридизацией R1 с R1c.

3. Олигонуклеотид, состоящий по меньшей мере из двух областей Х2 и Х1с ниже, и Х1с связана с 5'-стороной Х2,

Х2: область, имеющая нуклеотидную последовательность, комплементарную произвольной области Х2с в нуклеиновой кислоте, имеющей специфическую нуклеотидную последовательность, и

X1c: область, имеющая по существу ту же самую нуклеотидную последовательность, что и в области X1c, расположенной на 5'-стороне области Х2с в нуклеиновой кислоте, имеющей специфическую нуклеотидную последовательность.

4. Способ по п.1, где нуклеиновая кислота в стадии а) является второй нуклеиновой кислотой, обеспеченной следующими стадиями:

i) стадией гибридизации с областью F2c в нуклеиновой кислоте, служащей в качестве матрицы, области F2 в олигонуклеотиде, описанном в п.3, где область Х2 является областью F2, а область X1c является областью F1c,

ii) стадией синтеза первой нуклеиновой кислоты, имеющей нуклеотидную последовательность, комплементарную матрице, причем F2 в этом олигонуклеотиде служит в качестве затравки синтеза,

iii) стадией превращения произвольной области в первой нуклеиновой кислоте, синтезированной в стадии ii), в область, готовую для спаривания оснований, и

iv) стадией гибридизации олигонуклеотида, имеющего нуклеотидную последовательность, комплементарную области, превращенной в область, готовую для спаривания оснований, в первой нуклеиновой кислоте в стадии iii), с последующим синтезом второй нуклеиновой кислоты с указанным олигонуклеотидом в качестве затравки синтеза и превращения F1 на ее 3'-конце в область, готовую для спаривания оснований.

5. Способ по п.4, где область, способная к спариванию оснований, в стадии iii) представляет собой R2c, a олигонуклеотид в стадии iv) представляет собой олигонуклеотид, описанный в п.3, где область Х2с является областью R2c, a область Х1с является областью R1c.

6. Способ по п.4 или 5, где стадию придания способности спаривания оснований в стадиях iii) и iv) проводят синтезом с вытеснением цепи комплементарной цепи полимеразой, катализирующей реакцию вытеснения цепи синтеза комплементарной цепи, где внешний праймер, гибридизующийся с 3'-стороной F2c в матрице, и внешний праймер, гибридизующийся с 3'-стороной области, используемой в качестве затравки синтеза в стадии iv) для первой нуклеиновой кислоты, служат в качестве затравки синтеза.

7. Способ по п.6, где температура плавления каждого олигонуклеотида и его комплементарной области в матрице, используемой в этой реакции, находится в следующем соотношении при одной и той же жесткости:

(внешний праймер/область на 3'-стороне в матрице)≤(F2c/F2 и R2c/R2)≤(F1c/F1 и R1c/R1).

8. Способ по любому из пунктов 4-7, где нуклеиновая кислота, служащая в качестве матрицы, является РНК, и синтез комплементарной цепи в стадии ii) проводят ферментом, имеющим обратную транскриптазную активность.

9. Способ амплификации нуклеиновой кислоты, имеющей комплементарные нуклеотидные последовательности, связанные попеременно в однонитевой цепи, с использованием повторяемого проведения следующих стадий:

A) стадии обеспечения матрицы, которая обеспечивается на ее 3'- и 5'-концах областью, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной каждой концевой области в той же самой цепи, и которая при гибридизации этих взаимно комплементарных нуклеотидных последовательностей образует петлю, способную к спариванию оснований между ними,

B) стадии выполнения синтеза комплементарной цепи, где 3'-конец указанной матрицы, гибридизующийся с той же самой цепью, служит в качестве затравки синтеза,

C) стадии гибридизации, с петлевой частью, олигонуклеотида, обеспеченного на его 3'-конце комплементарной нуклеотидной последовательностью, с петлей, которая среди указанных петель расположена на 3'-концевом сайте, с последующим синтезом, с олигонуклеотидом в качестве затравки синтеза, комплементарной цепи полимеразой, катализирующей реакцию вытеснения цепи синтеза комплементарной цепи, для вытеснения комплементарной цепи, синтезированной в стадии В), с получением ее 3'-конца, готового для спаривания оснований, и

D) стадии, в которой цепь с 3'-концом, сделанным готовым к спариванию оснований в стадии С), служит в качестве новой матрицы.

10. Способ по п.9, где олигонуклеотид в стадии С) обеспечивается на его 5'-конце нуклеотидной последовательностью, комплементарной 3'-концу, служащему в качестве затравки синтеза в стадии В).

11. Способ по п.10, дополнительно предусматривающий стадию, в которой комплементарную цепь, синтезированную с олигонуклеотидом в стадии С) в качестве затравки синтеза, используют в качестве матрицы в стадии А).

12. Способ по п.9, где матрица в стадии А) синтезируется по способу, описанному в п.5.

13. Способ по п.1 или 9, где реакцию вытеснения цепи синтеза комплементарной цепи проводят в присутствии регулятора температуры плавления.

14. Способ по п.13, где регулятором температуры плавления является бетаин.

15. Способ по п.14, где 0,2-3,0 М бетаин может присутствовать в реакционном растворе.

16. Способ обнаружения нуклеотидной последовательности-мишени в образце, предусматривающий выполнение способа амплификации, описанного в любом из пунктов 9-15, и наблюдение, генерируется или не генерируется продукт реакции амплификации.

17. Способ по п.16, где зонд, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную петле, добавляют к продукту реакции амплификации и наблюдают гибридизацию между ними.

18. Способ по п.17, где этот зонд является меченным на частицах, и наблюдают реакцию агрегации, имеющую место при гибридизации.

19. Способ по п.16, где способ амплификации, описанный в любом из пунктов 9-15, проводят в присутствии детектора для нуклеиновой кислоты, и определение, генерируется или не генерируется продукт реакции амплификации, наблюдают на основании изменения в сигнале детектора.

20. Способ обнаружения мутации в нуклеотидной последовательности-мишени по способу определения, описанному в п.16, где мутация в нуклеотидной последовательности в качестве объекта амплификации предотвращает синтез любой из комплементарных цепей, участвующих в способе амплификации.

21. Набор для синтеза нуклеиновой кислоты, имеющей комплементарные цепи, попеременно связанные с однонитевой цепью, содержащий следующие элементы:

i) олигонуклеотид, описанный в п.3, где область F2c в нуклеиновой кислоте в качестве матрицы является Х2с, a F1с, расположенная на 5'-стороне F2c, является Х1с;

ii) олигонуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную произвольной области в комплементарной цепи, синтезированной с олигонуклеотидом в (i), в качестве праймера;

iii) олигонуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, комплементарную области F3c, расположенной на 3'-стороне области F2c, в нуклеиновой кислоте, служащей в качестве матрицы;

iv) ДНК-полимеразу, катализирующую реакцию типа вытеснения цепи синтеза комплементарной цепи; и

v) нуклеотид, служащий в качестве субстрата для элемента iv).

22. Набор по п.21, где олигонуклеотид в ii) является олигонуклеотидом, описанным в п.3, где произвольная область R2c в комплементарной цепи, синтезированной с олигонуклеотидом в 1) в качестве затравки синтеза, является Х2с, a R1c, расположенная при 5' R2c, является Х1с.

23. Набор по п.22, дополнительно содержащий: vi) олигонуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, комплементарную области R3c, расположенную на 3'-стороне произвольной R2c в комплементарной цепи, синтезированной с олигонуклеотидом в i) в качестве затравки синтеза.

24. Набор для обнаружения нуклеотидной последовательности-мишени, содержащий детектор для определения продукта синтетической реакции нуклеиновой кислоты дополнительно в наборе, описанном в любом из пунктов 21-23.

Нуклеиновая кислота, имеющая комплементарные нуклеотидные последовательности, связанные попеременно в однонитевой цепи, в качестве объекта синтеза в данном изобретении, означает нуклеиновую кислоту, имеющую взаимно комплементарные нуклеотидные последовательности, непосредственно связанные в однонитевой цепи. Кроме того, в данном изобретении она должна содержать нуклеотидную последовательность для образования петли между этими комплементарными цепями. В данном изобретении эта последовательность называется петлеобразующей последовательностью. Нуклеиновая кислота, синтезированная по данному изобретению, состоит по существу из взаимно комплементарных цепей, связанных через петлеобразующую последовательность. Обычно цепь, не разделяющуюся на 2 или более молекулы при диссоциации спаривания оснований, называют однонитевой цепью, независимо от того, включает она в себя спаривание оснований или нет. Комплементарная нуклеотидная последовательность может образовывать спаривание оснований в той же самой цепи. Внутримолекулярный продукт со спаренными основаниями, который может быть получен при разрешении нуклеиновой кислоте иметь комплементарные нуклеотидные последовательности, связанные попеременно в однонитевой цепи в соответствии с данным изобретением, чтобы иметь спаренные основания в той же самой цепи, дает область, состоящую из, очевидно, двухнитевой цепи и петли, не имеющей спаривания оснований.

То есть нуклеиновая кислота, имеющая комплементарные нуклеотидные последовательности, связанные попеременно в однонитевой цепи согласно данному изобретению, содержит комплементарные нуклеотидные последовательности, способные гибридизоваться в той же самой цепи, а ее гибридизованный продукт может быть определен в виде одноцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из петли, не содержащей спаривания оснований в изогнутой, шарнирной части. Олигонуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, комплементарную этой части, может гибридизоваться с этой петлей, не имеющей спаривания оснований. Петлеобразующая последовательность может быть произвольной нуклеотидной последовательностью. Петлеобразующая последовательность способна к спариванию оснований таким образом, чтобы инициировать синтез комплементарной молекулы для вытеснения, и обеспечена предпочтительно последовательностью, отличающейся от нуклеотидной последовательности, расположенной в другой области для получения специфической гибридизации. Например, в предпочтительном варианте, петлеобразующая последовательность содержит ту же самую нуклеотидную последовательность, что и область F2c (или R2c), расположенную на 3'-стороне области (т.е. F1с или R1c), происходящую из нуклеиновой кислоты в качестве матрицы, и отожженной (гибридизованной) в той же самой цепи.

В данном изобретении по существу та же самая нуклеотидная последовательность определяется следующим образом. А именно, когда комплементарная цепь, синтезированная с определенной последовательностью в качестве матрицы, гибридизуется с нуклеотидной последовательностью-мишенью с образованием затравки синтеза комплементарной цепи, эта определенная последовательность является, по существу, той же самой, что и нуклеотидная последовательность-мишень. Например, термин “по существу, такая же последовательность, что и F2”, включает в себя не только абсолютно ту же самую нуклеотидную последовательность, что и F2, но также нуклеотидную последовательность, способную функционировать в качестве матрицы, дающей нуклеотидную последовательность, способную гибридизоваться с F2 и действовать в качестве затравки синтеза комплементарной цепи. Термин “гибридизоваться” в данном изобретении означает образование двухцепочечной структуры нуклеиновой кислоты через спаривание оснований на основе закона Уотсона-Крика. Таким образом, даже если цепь нуклеиновой кислоты, имеющая спаривание оснований, является однонитевой цепью, гибридизация имеет место, если внутримолекулярные комплементарные нуклеотидные последовательности являются последовательностями со спаренными основаниями. В данном изобретении отжиг и гибридизация имеют одно и то же значение, заключающееся в том, что нуклеиновая кислота образует двухцепочечную структуру посредством спаривания оснований.

Число пар комплементарных нуклеотидных последовательностей, составляющих нуклеиновую кислоту в соответствии с данным изобретением, равно по меньшей мере 1. Согласно желаемому варианту осуществления данного изобретения оно может быть равно 2 или более. В этом случае теоретически не существует верхнего предела числа пар комплементарных нуклеотидных последовательностей, составляющих эту нуклеиновую кислоту. Когда эта нуклеиновая кислота в качестве синтетического продукта данного изобретения составлена из множественных наборов комплементарных нуклеотидных последовательностей, эта нуклеиновая кислота состоит из повторяемых нуклеотидных последовательностей.

Нуклеиновая кислота, имеющая комплементарные нуклеотидные последовательности, связанные попеременно в однонитевой цепи, синтезированная данным изобретением, может не иметь такой же структуры, какую имеет природно встречающаяся нуклеиновая кислота. Известно, что, если производное нуклеотида используют в качестве субстрата, когда синтезируется нуклеиновая кислота под действием ДНК-полимеразы, может быть синтезировано производное нуклеиновой кислоты. Используемое производное нуклеиновой кислоты включает в себя нуклеотиды, меченные радиоактивным изотопом или производными нуклеотидов, меченными связывающим лигандом, например, биотином или дигоксином. Эти нуклеотидные производные могут быть использованы для мечения производных нуклеиновых кислот в качестве продукта. Альтернативно, если в качестве субстрата используют флуоресцентные нуклеотиды, нуклеиновая кислота в качестве продукта может быть флуоресцентным производным. Далее, этот продукт может быть либо ДНК, либо РНК. Какой продукт из них образуется, определяется комбинацией структуры праймера, типа субстрата для полимеризации и реагентов полимеризации для проведения полимеризации нуклеиновой кислоты.

Синтез нуклеиновой кислоты, имеющей структуру, описанную выше, может быть инициирован применением ДНК-полимеразы, имеющей активность вытеснения цепи, и нуклеиновой кислотой, которая обеспечена на ее 3'-конце областью F1, способной гибридизоваться с частью F1с в той же самой цепи, и которая при гибридизации области F1 с F1с способна образовывать петлю, содержащую область F2c, способную к спариванию оснований. Имеются многочисленные сообщения о реакции синтеза комплементарной цепи, в которой образуется петля в виде шпильки, и сама последовательность образца используется в качестве матрицы, тогда как в данном изобретении часть петли в виде шпильки обеспечена областью, способной к спариванию оснований, и, следовательно, имеется новый признак, заключающийся в использовании этой области в синтезе комплементарной цепи. Посредством использования этой области в качестве затравки синтеза комплементарная цепь, синтезированная ранее с самой последовательностью образца в виде матрицы, вытесняется. Затем область R1c (произвольная область), расположенная на 3'-конце вытесняемой цепи, находится в состоянии, готовом для спаривания оснований. Область, имеющая комплементарную последовательность к этому R1c, гибридизуется с ним, приводя к образованию нуклеиновой кислоты (2 молекул), имеющей нуклеотидную последовательность, простирающуюся от F1 до R1c, и ее комплементарную цепь, связанную попеременно через образующую петлю последовательность. В данном изобретении произвольная область, такая как R1c, описанная выше, может быть выбрана произвольно, при условии, что она может быть гибридизована с полинуклеотидом, имеющим нуклеотидную последовательность, комплементарную этой области, и что комплементарная цепь, синтезируемая с этим полинуклеотидом в качестве затравки синтеза, имеет необходимые функции для данного изобретения.

В данном изобретении используется термин “нуклеиновая кислота”. Нуклеиновая кислота в данном изобретении обычно включает в себя как ДНК, так и РНК. Однако нуклеиновая кислота, нуклеотид которой замещен искусственным производным или модифицированной нуклеиновой кислотой, произведенной из природной ДНК или РНК, также включена в термин нуклеиновой кислоты данного изобретения, пока он функционирует в качестве матрицы для синтеза комплементарной цепи. Нуклеиновая кислота данного изобретения обычно содержится в биологическом образце. Биологический образец включает в себя животные, растительные или микробные ткани, клетки, культуры и экскреции или экстракты из них. Биологический образец данного изобретения включает в себя геномную ДНК или РНК внутриклеточных паразитов, таких как вирус или микоплазма. Нуклеиновая кислота данного изобретения может происходить из нуклеиновой кислоты, содержащейся в указанном биологическом образце. Например, кДНК, синтезированная из мРНК, или нуклеиновая кислота, амплифицированная на основе нуклеиновой кислоты, происходящей из биологического образца, является типичным примером нуклеиновой кислоты данного изобретения.

Нуклеиновая кислота, характерная для данного изобретения, которая обеспечена на ее 3'-конце области F1, способной гибридизоваться с частью F1с в той же самой цепи, и которая при гибридизации области F1 с F1с способна образовывать петлю, содержащую область F2c, способную к спариванию оснований, может быть получена различными способами. В наиболее предпочтительном варианте реакция синтеза комплементарной цепи с использованием олигонуклеотида, имеющего следующую структуру, может быть использована для получения данной структуры.

То есть олигонуклеотид, применимый в данном изобретении, состоит по меньшей мере из двух областей Х2 и Х1с, описанных ниже, где Х1с лигирован с 5'-стороной Х2.

Х2: область, имеющая нуклеотидную последовательность, комплементарную области Х2с в нуклеиновой кислоте, имеющей специфическую нуклеотидную последовательность.

Х1с: область, имеющая по существу такую же нуклеотидную последовательность, что и область Х1с, расположенная на 5'-стороне области Х2с в нуклеиновой кислоте, имеющей специфическую нуклеотидную последовательность.

Здесь нуклеиновой кислотой, имеющей специфическую нуклеотидную последовательность, которой определяется структура олигонуклеотида данного изобретения, называют нуклеиновую кислоту, служащую в качестве матрицы при использовании олигонуклеотида данного изобретения в качестве праймера. В случае обнаружения нуклеиновой кислоты на основе синтетического способа данного изобретения нуклеиновая кислота, имеющая специфическую нуклеотидную последовательность, является мишенью определения или нуклеиновой кислотой, происходящей из этой мишени определения. Нуклеиновой кислотой, имеющей специфическую нуклеотидную последовательность, называют нуклеиновую кислоту, в которой по меньшей мере часть нуклеотидной последовательности является обнаруживаемой или предсказуемой. Частью обнаруживаемой нуклеотидной последовательности я