Способ определения функциональной активности компонента c4 комплемента человека

Способ определения функциональной активности компонента c4 комплемента человека

Реферат

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах. Компонент С4 после его активации и активации компонента С2 образует прочный Mg-зависимый комплекс С4b2а, связанный с поверхностью, на которой происходит активация. Этот комплекс является ферментом - С3 конвертазой, которая активирует компонент С3, после чего последний необратимо связывается на той же поверхности в количествах, пропорциональных количеству активного С4 при избытке остальных компонентов комплемента (C1, C2 и С3). Имеющийся на сегодняшний день способ определения функциональной активности компонента С4 комплемента человека [1, 2] решает задачу определения активности С4 путем измерения количества связавшегося активированного С4 с помощью специфических антител против С4, ковалентно связанных с ферментом. Недостатком указанного способа являются трудности получения высококачественных антител к С4, и вследствие этого, их конъюгаты с ферментом в тест-системе имеют высокие фоновые значения. В результате приходится определять активность С4 в тестируемых образцах, используя несколько точек с двукратными прогрессивными разведениями образцов и измерением тангенсов угла наклона соответствующих графиков раститровок.

Задачей заявленного изобретения является разработка способа, позволяющего определять функциональную активность компонента С4 системы комплемента человека на основе иммуноферментного метода в одном разведении с использованием линейного калибровочного графика.

Поставленная задача достигается путем разработки способа определения, который предусматривает сорбцию в лунках микропланшета иммуноглобулина G, затем определяемого С4 из растворов, его содержащих, в присутствии реагента R4, т.е. сыворотки крови человека, лишенной активности С4. Количество ковалентно связавшегося компонента С3 зависит от концентрации функционально активного определяемого компонента С4. Количество ковалентно связавшегося в результате активации компонента С3 определяют по продукту ферментативной реакции с помощью антител к С3 - фракции иммуноглобулинов G, конъюгированных с ферментом. Моноспецифические поликлональные антитела к С3 легко приготовляются и коммерчески доступны. Способ основан на способности функционально активного комплекса С4b2а активировать С3 с образованием С3b, количество которого определяется по его количеству, связавшемуся в лунках. Тем самым достигается определение функциональной активности С4 иммуноферментным методом, пригодным для стандартизации.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка способа определения функциональной активности компонента С4 комплемента человека в одном разведении, обладающего хорошей воспроизводимостью результатов.

Пример. Определение функциональной активности препарата С4. Растворяют иммунохимически чистый IgG в 0,05 М натрий-карбонатном буфере, рН 9,5, в концентрациях белка 10-100 мкг/мл и вносят по 100 мкл раствора в каждую лунку плоскодонного полистиролового 96-луночного планшета. Закрывают крышкой и оставляют на ночь при 4°С. Два раза отмывают планшет вероналовым буферным раствором, рН 7,4, содержащим 0,15 М NaCl, 0,15 мМ Са²⁺ и 0,5 мМ Mg²⁺ (VBS⁺⁺), заливая по 150 мкл в каждую лунку, затем планшет осушают путем вытряхивания остатка жидкости. В лунки планшета вносят по 100 мкл раствора, содержащего тестируемый С4 в VBS⁺⁺ и 10 мкл сыворотки крови человека, лишенной активности С4 (реагент R4 - продажный препарат Кировского НИИ гематологии и переливания крови). После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°С, двукратной отмывки фосфатным буфером, рН 7,4, содержащим 0,15 М NaCl и 0,05% твин-20, и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл конъюгата пероксидазы с антителами против компонента С3 человека в том же буфере в подобранном разведении. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°С, двукратной отмывки тем же буфером и осушения микропанели в каждую лунку вносят по 100 мкл раствора 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (ТМБ) в субстратном буфере. После 30 мин инкубации в темноте реакцию останавливали внесением в каждую лунку 50 мкл 4% серной кислоты. Результаты реакции учитывали с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 450 нм. Функциональную активность препарата С4 рассчитывали по стандартной кривой. Результаты определения активности С4 приведены на чертеже.

Литература

1. Козлов Л.В., Скороходова Т.Г., Баталова Т.Н., Лахтин В.М., Матвеевская Н.С., Гузова В.А., Дьяков В.Л. Способ определения функциональной активности компонента С4 комплемента человека (варианты). Патент РФ 2149406. Бюл.№14. 20.05.2000.

2. Козлов Л.В., Лахтин В.М., Скороходова Т.Г., Баталова Т.Н., Шойбонов Б.Б., Дьяков В.Л., Гузова В.А., Матвеевская Н.С. Изотипирование компонента С4 комплемента человека с использованием различий в функциональной активности// Биоорган. химия. 2000. Т.26. №7. С.539-547.

Способ определения функциональной активности компонента С4 комплемента человека, характеризующийся тем, что в лунках микропанели сорбируют иммуноглобулин G, в лунки затем вносят анализируемую пробу, содержащую компонент С4 комплемента человека с неизвестной активностью, и реагент R4, т.е. сыворотку крови человека, лишенную активности С4, а также буферный раствор, содержащий ионы кальция и магния, проводят инкубацию и после отмывки и осушения планшета в лунки вносят конъюгат фермента с антителами против компонента С3 человека и субстрат этого фермента, после чего проводят расчет активности компонента С4 по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции.