Антигенные менингококковые пептиды (варианты)

Антигенные менингококковые пептиды (варианты)

Реферат

Все цитируемые здесь документы включены в качестве ссылки во всей полноте. В частности, в данное описание включено в качестве ссылки содержимое международной заявки на патент W099/36544.

Область изобретения

Данное изобретение относится к антигенным пептидным последовательностям из бактерии Neisseria meningitidis.

На основе капсулярного полисахарида данного организма были идентифицированы 12 серологических групп N. meningitidis. Группа А является патогеном, наиболее часто причастным к эпидемическому заболеванию расположенной южнее Сахары части Африки. Серологические группы В и С являются ответственными за обширное большинство случаев в Соединенных Штатах и в большинстве развитых стран. Серологические группы W135 и Y являются ответственными за остальные случаи в Соединенных Штатах и развитых странах.

Менингококковая вакцина, используемая в настоящее время, является четырехвалентной полисахаридной вакциной, состоящей из серологических групп А, С, Y и W135. Однако менингококк В остается проблемой. Полисахаридный подход не может быть использован, так как капсулярный полисахарид menB является полимером α(2-8)-связанной N-ацетилнейраминовой кислоты, которая присутствует также в ткани млекопитающих. Один подход к вакцине menB использует смеси белков наружной мембраны (ОМР). Для преодоления разнообразия антигенных свойств были сконструированы поливалентные вакцины, содержащие до девяти различных поринов [например, Poolman JT (1992) Infect. Agents Dis. 4:13-28]. Дополнительными белками для применения в вакцинах наружной мембраны были белки ора и орс, но ни один из этих подходов не смог преодолеть разнообразие антигенных свойств [например, Ala'Aldeen and Borriello (1996) Vaccine 14(1):49-53].

Изобретение

Данное изобретение относится к фрагментам белков, описанным в международной патентной заявке WO99/36544, причем данные фрагменты содержат по меньшей мере одну антигенную детерминанту.

Таким образом, если длина любой конкретной последовательности белка, описанной в WO99/36544, равна х аминокислотам (см. таблицу II), то данное изобретение относится к фрагментам самое большее х-1 аминокислот данного белка. Фрагмент может быть более коротким, чем эта длина (например, х-2, х-3, х-4,...) и содержит предпочтительно 100 аминокислот или менее (например, 90 аминокислот, 80 аминокислот и т.д.). Данный фрагмент может быть таким коротким, как 3 аминокислоты, но предпочтительно является более длинным (например, до 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75 или 100 аминокислот).

Предпочтительные фрагменты содержат менингококковые пептидные последовательности, приведенные в таблице I, или их субпоследовательности. Данные фрагменты могут быть более длинными, чем фрагменты, представленные в таблице I, например, если фрагмент в таблице I простирается от аминокислотного остатка р до остатка q белка, то данное изобретение относится также к фрагментам от остатка (р-1), (р-2) или (р-3) до остатка (q+1), (q+2) или (q+3).

Данное изобретение также относится к полипептидам, которые являются гомологичными (т.е. имеют идентичность последовательности) данным фрагментам. В зависимости от конкретного фрагмента степень идентичности является предпочтительно более высокой, чем 50% (например, 60, 70, 80, 90, 95, 99% или более). Эти гомологичные полипептиды включают мутанты и аллельные варианты данных фрагментов. Идентичность между двумя последовательностями предпочтительно определяют при помощи алгоритма поиска гомологии Smith-Waterman, осуществленного в программе MPSRCH (Oxford Molecular), использующего поиск аффинного пропуска с параметрами штраф за открытие пропуска = 12 и штраф за удлинение пропуска = 1.

Данное изобретение также относится к белкам, содержащим один или более описанных выше фрагментов.

Данное изобретение подчиняется условию, что оно не включает в его объем белки, содержащие какую-либо из 45 белковых последовательностей, описанных в WO99/36544 (т.е. четных последовательностей SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10,..., 86, 88, 90 WO99/36544).

Белки данного изобретения могут быть, конечно, получены различными способами (например рекомбинантной экспрессией, очисткой из культуры клеток, химическим синтезом и т.д.) и в различных формах (например, нативные, С-концевые и/или N-концевые слитые белки и т.д.). Их предпочтительно получают по существу в чистом виде (т.е. по существу не содержащие других белков Neisseria или белков клетки-хозяина). Короткие белки предпочтительно получают с использованием химического пептидного синтеза.

Согласно другому аспекту, данное изобретение относится к антителам, которые узнают фрагменты данного изобретения, при условии, что данное изобретение не включает в его объеме антитела, которые узнают одну из 45 полных белковых последовательностей в WO99/36544. Данные антитела могут быть поликлональными или, предпочтительно, моноклональными и могут быть получены любыми подходящими способами.

Данное изобретение также относится к белкам, содержащим пептидные последовательности, распознаваемые данными антителами. Данные пептидные последовательности будут, конечно, включать фрагменты менингококковых белков в WO99/36544, но будут также включать пептиды, которые имитируют антигенную структуру менингококковых пептидов при связывании с иммуноглобулином.

Согласно следующему аспекту, данное изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей фрагменты и белки данного изобретения, при условии, что данное изобретение не включает в его объеме нуклеиновую кислоту, кодирующую одну из 45 белковых последовательностей в WO99/36544.

Кроме того, данное изобретение относится к нуклеиновой кислоте, содержащей последовательности, гомологичные (т.е. имеющие идентичность последовательности) данным последовательностям. Далее, данное изобретение относится к нуклеиновой кислоте, которая может гибридизоваться с этими последовательностями, предпочтительно в условиях "высокой жесткости" (например, при 65°С в растворе 0,1xSSC, 0,5% ДСН).

Должно быть понятно, что данное изобретение относится к нуклеиновой кислоте, содержащей последовательности, комплементарные последовательностям, описанным выше (например, для целей получения антисмысловых последовательностей или зондирования).

Нуклеиновая кислота данного изобретения может быть, конечно, получена многочисленными путями (например, химическим синтезом, из библиотек геномных ДНК или кДНК, из самого организма и т.д.) и может иметь различные формы (например, одноцепочечную форму, двухцепочечную форму, форму векторов, зондов и т.д.). Кроме того, термин "нуклеиновая кислота" включает в себя ДНК и РНК, а также их аналоги, такие как аналоги, содержащие модифицированные каркасные структуры, а также пептиднуклеиновые кислоты (ПНК) и т.д.

Согласно следующему аспекту, данное изобретение относится к векторам, содержащим нуклеотидные последовательности данного изобретения (например, экспрессирующие векторы), и клетки-хозяева, трансформированные такими векторами.

Согласно следующему аспекту, данное изобретение относится к композициям, содержащим белок, антитело и/или нуклеиновую кислоту данного изобретения. Данные композиции могут быть применимы, например, в качестве вакцин, или в качестве диагностических реагентов, или в качестве иммуногенных композиций.

Данное изобретение также относится к нуклеиновой кислоте, белку или антителу в соответствии с данным изобретением для применения в качестве лекарственных средств (например, в качестве вакцин или в качестве иммуногенных композиций) или в качестве диагностических реагентов. Оно также относится к применению нуклеиновой кислоты, белка или антитела в соответствии с данным изобретением в приготовлении: (i) лекарственного средства для лечения или профилактики инфекции, вызываемой бактериями Neisseria; (ii) диагностического реагента для обнаружения присутствия бактерий Neisseria или антител, индуцированных против бактерий Neisseria; и/или (iii) реагента, который может индуцировать антитела против бактерий Neisseria. Указанные бактерии Neisseria могут относиться к любому виду или штамму (например, N. gonorrhoeae), но предпочтительно являются N. meningitidis, в частности штаммом А или штаммом В.

Данное изобретение также относится к способу лечения пациента, предусматривающему введение пациенту терапевтически эффективного количества нуклеиновой кислоты, белка и/или антитела в соответствии с данным изобретением.

Согласно следующим аспектам, данное изобретение относится к различным способам.

Относится к способу получения белков данного изобретения, предусматривающему стадию культивирования клетки-хозяина в соответствии с данным изобретением в условиях, обеспечивающих экспрессию белка.

Относится к способу получения белка или нуклеиновой кислоты данного изобретения, в котором белок или нуклеиновую кислоту синтезируют отчасти или полностью химическими средствами.

Относится к способу обнаружения полинуклеотидов данного изобретения, предусматривающему стадии: (а) контактирования зонда нуклеиновой кислоты данного изобретения с биологическим образцом в условиях гибридизации для образования дуплексов и (b) детектирования указанных дуплексов.

Относится к способу обнаружения белков данного изобретения, предусматривающему стадии: (а) контактирования антитела данного изобретения с биологическим образцом в условиях, подходящих для образования комплексов антитело-антиген; и (b) детектирования указанных комплексов.

Краткое изложение стандартных способов и процедур, которые могут быть использованы для осуществления данного изобретения (например, для использования описанных последовательностей для вакцинации или диагностических целей), следует далее. Это краткое изложение не является ограничением данного изобретения, а скорее дает примеры, которые могут быть использованы, но не являются обязательными.

Общая часть

Практика данного изобретения будет предусматривать, если нет иных указаний, общепринятые способы молекулярной биологии, микробиологии, рекомбинантных ДНК и иммунологии, которые находятся в пределах квалификации в данной области. Такие способы полностью объяснены в литературе, например, Sambrook Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition (1989); DNA Cloning. Volumes I and ii (D.N Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed, 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D.Hames & S.J.Higgins eds. 1984); Transcription and Translation (B.D.Hames & S.J.Higgins eds. 1984); Animal Cell Culture (R.I.Freshney ed. 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); В. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); the Methods in Enzymology series (Academic Press, Inc.), especially volumes 154 & 155; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H.Miller and M.P.Calos eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Mayer and Walker, eds. (1987), Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); Scopes, (1987) Protein Purification; Principles and Practice, Second Edition (Springer-Verlag, N.Y.), and Handbook of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D.M.Weir and C.C.Blackwell eds 1986).

В данном описании используются стандартные аббревиатуры для нуклеотидов и аминокислот.

Все публикации, патенты и заявки на выдачу патента, цитируемые здесь, включены в данное описание во всей полноте в качестве ссылки.

Определения

Композиция, содержащая X, является "по существу не содержащей" Y, когда по меньшей мере 85% по весу общей суммы Х+Y в данной композиции составляет X. Предпочтительно, Х составляет по меньшей мере приблизительно 90% по весу общего Х+Y в данной композиции, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 95% или даже 99% по весу.

Термин “содержащий” обозначает “включающий в себя”, а также “составляющий”, например, композиция, “содержащая” Х может состоять исключительно из Х или может включать что-либо дополнительно к X, например, X+Y.

Термин “антигенная детерминанта” включает в себя В-клеточные и Т-клеточные эпитопы.

Термин “гетерологичные” относится к двум биологическим компонентам, которые не обнаруживаются вместе в природе. Данные компоненты могут быть клетками-хозяевами, генами или регуляторными областями, такими как промоторы. Хотя гетерологичные компоненты не обнаруживаются вместе в природе, они могут функционировать вместе, например, когда промотор, гетерологичный гену, функционально связан с данным геном. Другим примером является случай, когда менингококковая последовательность является гетерологичной мышиной клетке-хозяина. Следующим примером могли бы быть два эпитопа из одного и того же или из различных белков, которые были собраны в единый белок в расположении, неприродного происхождения.

“Сайт инициации репликации” является полинуклеотидной последовательностью, которая инициирует и регулирует репликацию полинуклеотидов, таких как экспрессирующий вектор. Сайт инициации репликации ведет себя как автономная единица репликации полинуклеотидов в клетке, способная к репликации под ее собственным контролем. Сайт инициации репликации может нуждаться в векторе для репликации в конкретной клетке-хозяине. В случае некоторых сайтов инициации репликации экспрессирующий вектор может высокопродуктивно воспроизводиться в присутствии подходящих белков в клетке. Примерами сайтов инициации репликации являются автономно реплицирующие последовательности, эффективные в дрожжах, и вирусный Т-антиген, эффективный в клетках COS-7.

Экспрессирующие системы

Менингококковые нуклеотидные последовательности могут экспрессироваться во многих различных экспрессирующих системах; например в системах, используемых с клетками млекопитающих, бакуловирусами, растениями, бактериями и дрожжами.

i. Системы млекопитающих

Экспрессирующие системы млекопитающих известны в данной области. Промотором млекопитающих является любая последовательность ДНК, способная связывать РНК-полимеразу млекопитающих и инициировать транскрипцию в направлении 3' кодирующей последовательности (например, структурного гена) в мРНК. Промотор будет иметь область инициации транскрипции, которая обычно помещена проксимально к 5'-концу кодирующей последовательности, и ТАТА-бокс, обычно расположенный на 25-30 пар оснований (п.н.) левее от сайта инициации транскрипции. Считают, что ТАТА-бокс управляет РНК-полимеразой II для начала синтеза РНК в правильном сайте. Промотор млекопитающих будет содержать также левый элемент промотора, обычно расположенный на 100-200 п.н. левее от ТАТА-бокса. Левый элемент промотора определяет скорость, с которой инициируется транскрипция, и может действовать в любой ориентации [Sambrook et al. (1989) "Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells". In Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd ed.].

Гены вирусов млекопитающих часто высокопродуктивно экспрессируются и имеют широкий круг хозяев; таким образом, последовательности, кодирующие гены вирусов млекопитающих, обеспечивают особенно применимые промоторные последовательности. Примеры включают ранний промотор SV40, LTR-промотор вируса опухоли молочной железы мышей, большой поздний промотор аденовируса (AdMLP) и промотор вируса простого герпеса. Кроме того, последовательности, полученные не из вирусных генов, такие как мышиный ген металлотионеина, также обеспечивают применимые промоторные последовательности. Экспрессия может быть либо конститутивной, либо регулируемой (индуцибельной) в зависимости от промотора, который может индуцироваться глюкокортикоидом в гормон-чувствительных клетках.

Присутствие энхансерного элемента (энхансера), объединенного с описанными выше промоторными элементами, будет обычно увеличивать уровни экспрессии. Энхансер представляет собой регуляторную последовательность ДНК, которая может стимулировать транскрипцию до 1000-кратного уровня при связывании с гомологичными или гетерологичными промоторами, причем синтез начинается в нормальном инициирующем сайте РНК. Энхансеры являются также активными, когда они помещены левее или правее от сайта инициации транскрипции, в нормальной или обратной ориентации, или на расстоянии более 1000 нуклеотидов от промотора [Maniatis et al. (1987) Science 236:1237; Alberts et al. (1989) Molecular Biology of the Cell, 2^nd ed.]. Энхансерные элементы, происходящие из вирусов, могут быть особенно применимы, так как они обычно имеют более широкий круг хозяев. Примеры включают энхансер раннего гена SV40 [Dijkema et al (1985 EMBO J. 4:761] и энхансер/промоторы, полученные из длинного концевого повтора (LTR) вируса саркомы Рауса [Gorman et al.(1989b) Proc. Natl. Acad. Sci. 79:6777] и из цитомегаловируса человека [Boshart et al. (1985) Cell 41:521]. Кроме того, некоторые энхансеры являются регулируемыми и становятся активными только в присутствии индуктора, такого как гормон или ион металла [Sassone-Corsi and Borelli (1986) Trends Genet. 2:215; Maniatis et al. (1987) Science 236:1237].

Молекула ДНК может экспрессироваться внутриклеточно в клетках млекопитающих. Промоторная последовательность может быть связана непосредственно с данной молекулой ДНК, и в этом случае первой аминокислотой на N-конце рекомбинантного белка всегда будет метионин, который кодируется стартовым кодоном ATG. Если желательно, N-конец может быть отщеплен от данного белка инкубированием in vitro с цианогенбромидом.

Альтернативно, чужеродные промоторы могут также секретироваться из клетки в среду для выращивания посредством образования химерных молекул ДНК, которые кодируют слитый (гибридный) белок, состоящий из фрагмента лидерной последовательности, которая относится к секреции чужеродного белка в клетках млекопитающих. Предпочтительно, имеются сайты процессинга, кодируемые между лидерным фрагментом и чужеродным геном, которые могут расщепляться in vivo или in vitro. Фрагмент лидерной последовательности обычно кодирует сигнальный пептид, состоящий из гидрофобных аминокислот, которые управляют секрецией данного белка из клетки. Состоящий из трех частей лидер аденовируса является примером лидерной последовательности, которая относится к секреции чужеродного белка в клетках млекопитающих.

Обычно последовательности терминации транскрипции и полиаденилирования, распознаваемые клетками млекопитающих, являются регуляторными областями, расположенными 3' относительно стоп-кодона трансляции, и, следовательно, вместе с промоторными элементами фланкируют кодирующую последовательность. 3'-конец зрелой молекулы мРНК образуется сайт-специфическим посттранскриционным расщеплением и полиаденилированием [Birnstiel et al. (1985) Cell 41:349; Proudfoot and Whitelaw (1988) "Termination and 3' end processing of eukariotic RNA. In Transcription and splicing (ed. B.D.Hames and D.M.Glover); Proudfoot (1989) Trends Biochem. Sci. 14:105]. Такие последовательности управляют транскрипцией мРНК, которая может транслироваться в полипептид, кодируемый данной ДНК. Примеры сигналов терминации транскрипции/полиаденилирования включают сигналы, полученные из SV40 [Sambrook et al. (1989) "Expression of cloned genes in cultured mammalian cells." In Molecular Cloning: A Laboratory Manual].

Обычно описанные выше компоненты, содержащие промотор, сигнал полиаденилирования и последовательность терминации транскрипции, помещают вместе в экспрессирующие конструкции. Энхансеры, интроны с функциональными донорным и акцепторным свитами сплайсинга и лидерные последовательности могут быть также включены в экспрессирующую конструкцию, если желательно. Экспрессирующие конструкции часто сохраняются в репликоне, таком как в нехромосомный элемент (например, плазмиды), способном к стабильному сохранению в хозяине, таком как клетки млекопитающих или бактерии. Реплицирующие системы млекопитающих включают системы, произведенные из вирусов животных, которые требуют транс-действующих факторов для репликации. Например, плазммды, содержащие реплицирующие системы паповавирусов, таких как SV40 [Gluzman (1981) Cell 23:175], или полиомавирусов, реплицируются чрезвычайно высокопродуктивно в присутствии подходящего вирусного Т-антигена. Дополнительные примеры репликонов млекопитающих включают репликоны, полученные из папилломавируса крупнорогатого скота и вируса Эпштейна-Барр. Кроме того, репликон может иметь две системы репликации, что позволяет ему сохраняться, например, в клетках млекопитающих для экспрессии и в прокариотическом хозяине для клонирования и амплификации. Примеры таких челночных векторов млекопитающих-бактерий включают pMT2 [Kaufman et al. (1989) Mol. Cell. Biol. 9:946] и рНЕВО [Shimizu et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:1074].

Используемая процедура трансформации зависит от трансформируемого хозяина. Способы введения гетерологичных полинуклеотидов в клетки млекопитающих известны в данной области и включают опосредованную декстраном трансфекцию, осаждение фосфатом кальция, опосредованную полибреном трансфекцию, слияние протопластов, электропорацию, инкапсулирование полинуклеотида (полинуклеотидов) в липосомах и прямую микроинъекцию ДНК в ядра.

Клеточные линии млекопитающих, доступные для экспрессии, известны в данной области и включают многие иммортализованные клеточные линии, доступные из Американской Коллекции Типовых Культур (АТСС), включая, но не ограничиваясь ими, клетки яичника Китайского хомячка (СНО), клетки HeLa, клетки почек детеныша хомячка (ВНК), клетки почек обезьяны (COS), клетки печеночно-клеточной карциномы человека (например, Нер G2), и ряд других клеточных линий.

ii. Бакуловирусные системы

Полинуклеотид, кодирующий белок, может быть также встроен в подходящий экспрессирующий вектор насекомых и функционально связан с регуляторными элементами в данном векторе. Конструирование вектора использует способы, которые известны в данной области. Обычно компоненты данной экспрессирующей системы включают вектор-переносчик, обычно бактериальную плазмиду, которая содержит как фрагмент генома бакуловируса, так и подходящий сайт рестрикции для инсерции гетерологичного гена или генов, которые должны экспрессироваться; бакуловирус дикого типа с последовательностью, гомологичной бакуловирус-специфическому фрагменту в векторе-переносчике (это делает возможной гомологичную рекомбинацию гетерологичного гена в геном бакуловируса); и подходящие клетки-хозяева насекомых и среду для выращивания.

После встраивания последовательности ДНК, кодирующей данный белок, в вектор-переносчик, данный вектор и вирусный геном дикого типа трансфицируют в клетку-хозяин насекомого, где данному вектору и вирусному геному дают рекомбинироваться. Экспрессируется упакованный рекомбинантный вирус и рекомбинантные стерильные пятна идентифицируют и очищают. Материалы и способы для экспрессирующих систем бакуловирус/клетка насекомого являются коммерчески доступными в форме наборов из, inter alia, Invitrogen, San Diego CA ("MaxBac" kit). Эти способы обычно известны специалистам в данной области и во всей полноте описаны у Summers and Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987) (далее называемой "Summers and Smith").

Перед встраиванием последовательности ДНК, кодирующей данный белок, в геном бакуловируса, описанные выше компоненты, включающие в себя промотор, лидер (если желательно), представляющую интерес кодирующую последовательность и последовательность терминации транскрипции, обычно помещают в промежуточную перемещающую конструкцию (вектор-переносчик, трансдуцирующий вектор). Такая конструкция может содержать единственный ген и функционально связанные регуляторные элементы; множественные гены, каждый с его собственным набором функционально связанных регуляторных элементов; или множественные гены, регулируемые одним и тем же набором регуляторных элементов. Промежуточные перемещающие конструкции часто сохраняются в репликоне (автономной единице репликации), таком как внехромосомный элемент (например, плазмиды), способном стабильно сохраняться в хозяине, таком как бактерия. Репликон будет иметь систему репликации, что позволяет ему сохраняться в подходящем хозяине для клонирования и амплификации.

В настоящее время наиболее часто используемым вектором-переносчиком для введения чужеродных генов в AcNPV является рАс373. Были также сконструированы многие другие векторы, известные специалистам в данной области. Они включают, например, pVL985 (который изменяет стартовый кодон полиэдрина с ATG на АТТ и который вводит клонирующий сайт BamHI 32 п.н. правее от АТТ; см. Luckow and Summers, Virology (1989) 17:31.

Данная плазмида обычно также содержит сигнал полиаденилирования полиэдрина (Miller et al. (1988) Ann. Rev. Microbiol., 42:177) и прокариотический ген устойчивости к ампициллину (аmр) и сайт инициации репликации для отбора и размножения в Е. coii.

Бакуловирусные векторы-переносчики обычно содержат промотор бакуловируса. Промотором бакуловируса является любая ДНК-последовательность, способная связывать бакуловирусную РНК-полимеразу и инициировать транскрипцию в направлении 5'→3' кодирующей последовательности (например, структурного гена) в мРНК. Промотор будет иметь область инициации транскрипции, которая обычно находится проксимально к 5'-концу кодирующей последовательности. Обычно эта область инициации транскрипции включает в себя сайт связывания РНК-полимеразы и сайт инициации транскрипции. Бакуловирусный вектор-переносчик может также иметь второй домен, называемый энхансером, который в случае его присутствия обычно расположен дистально относительно структурного гена. Экспрессия может быть регулируемой или конститутивной.

Структурные гены, обильно транскрибируемые в последние периоды вирусного инфекционного цикла, обеспечивают особенно подходящие промоторные последовательности. Примеры включают последовательности, полученные из гена, кодирующего вирусный белок полиэдрин, Friesin et al. (1986) "The Regulation of Baculovirus Gene Expression, " в: The Molecular Biology of Baculoviruses (ed. Walter Doerfler); EPO Publ. Nos. 127839 and 155476; и ген, кодирующий белок р10, Vlak et al. (1988), J.Gen. Virol. 69:765.

ДНК, кодирующие подходящие сигнальные последовательности, могут быть получены из генов для секретируемых белков насекомых или бакуловируса, таких как бакуловирусный ген полиэдрина (Carbonell et al. (1988) Gene 73:409). Альтернативно, поскольку сигналы для посттрансляционных модификаций клеток млекопитающих (такие как сигнал расщепления пептидов, протеолитического расщепления и фосфорилирования), по-видимому, узнаются клетками насекомых, и сигналы, требующиеся для секреции и ядерного накопления, также, по-видимому, сохраняются между клетками беспозвоночных и клетками позвоночных, лидерные последовательности (лидеры), не происходящие из насекомых, такие как лидеры, происходящие из генов, кодирующих α-интерферон человека, Maeda et al. (1985), Nature 315:592; гастрин-высвобождающий пептид человека, Labaeq-Verheyden et al., (1988), Molec. Cell. Biol. 8:3129; IL-2 человека. Smith et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:8404; мышиный IL-3, Miyajima et al., (1987) Gene 58:273; и глюкоцереброзидазу человека, Martin et al. (1988) DNA, 7:99, могут быть также использованы для обеспечения секреции в насекомых.

Рекомбинантный полипептид или полипротеин может экспрессироваться внутриклеточно или, если он экспрессируется с правильными регуляторными последовательностями, он может секретироваться. Хорошая внутриклеточная экспрессия неслитых чужеродных белков обычно требует гетерологичных генов, которые в идеале имеют короткую лидерную последовательность, содержащую подходящие сигналы инициации трансляции, предшествующие стартовому сигналу ATG. Если желательно, метионин на N-конце может быть отщеплен от зрелого белка инкубированием in vitro с цианогенбромидом.

Альтернативно, рекомбинантные полипротеины или белки, которые природно не секретируются, могут секретироваться из клетки насекомого посредством создания химерных молекул ДНК, которые кодируют слитый белок, состоящий из фрагмента лидерной последовательности, которая относится к секреции чужеродного белка в насекомых. Данный фрагмент лидерной последовательности обычно кодирует сигнальный пептид, состоящий из гидрофобных аминокислот, которые управляют транслокацией данного белка в эндоплазматический ретикулум.

После инсерции ДНК-последовательности и/или гена, кодирующего продукт экспрессии, являющийся предшественником данного белка, клетку-хозяин насекомого котрансформируют гетерологичной ДНК вектора-переносчика и геномной ДНК бакуловируса дикого типа - обычно котрансфекцией. Промотор и последовательность терминации транскрипции данной конструкции обычно будут содержать участок 2-5 т.п.н. генома бакуловируса. Способы введения гетерологичной ДНК в желаемый сайт в бакуловирусном вирусе являются известными в данной области (См. Summers and Smith supra; Ju et al. (1987); Smith et al., Mol. Cell. Biol. (1983) 3:2156; и Luckow and Summers (1989)). Например, встраивание может происходить в ген, например, ген полиэдрина, гомологичной рекомбинацией с двойным кроссинговером; встраивание может происходить также в сайт рестрикционного фермента, сконструированного в желательном бакуловирусном гене. Miller et al., (1989), Bioessays 4:91. ДНК-последовательность при клонировании вместо гена полиэдрина в данном экспрессирующем векторе фланкирована как 5', так и 3'полиэдрин-специфическими последовательностями и расположена правее от промотора полиэдрина.

Новообразованный бакуловирусный экспрессирующий вектор упаковывают затем в инфекционный рекомбинантный бакуловирус. Гомологичная рекомбинация происходит при низкой частоте (между приблизительно 1% и приблизительно 5%); таким образом, большая часть данного вируса, продуцируемого после котрансфекции, все еще является вирусом дикого типа. Таким образом, требуется способ для идентификации рекомбинантных вирусов. Преимуществом данной экспрессирующей системы является визуальный скрининг, позволяющий отличать рекомбинантные вирусы. Белок полиэдрин, который продуцируется нативным вирусом, продуцируется чрезвычайно высокопродуктивно в ядрах инфицированных клеток в поздние периоды после вирусной инфекции. Накопленный белок полиэдрин образует внутриклеточные тельца включения, которые содержат заключенные в них частицы. Тельца включения размером до 15 мкм сильно преломляют свет, что придает им яркий блестящий вид, который легко визуализировать под световом микроскопом. Клетки, инфицированные рекомбинантным вирусом, не содержат телец включения. Чтобы отличить рекомбинантный вирус от вируса дикого типа, супернатант после трансфекции помещают для образования бляшек на монослой клеток насекомых способами, известными специалистам в данной области. А именно, бляшки подвергают скринингу под световым микроскопом на присутствие телец включения (являющееся признаком вируса дикого типа) или отсутствие телец включения (являющееся признаком рекомбинантного вируса). "Current Protocols in Microbiology" Vol.2 (Ausubel et al. eds) d 16.8 (Supp. 10, 1990); Summers and Smith, supra; Miller et al. (1989).

Были разработаны рекомбинантные бакуловирусные экспрессирующие векторы для инфицирования нескольких клеточных линий насекомых. Например, были сконструированы рекомбинантные бакуловирусы для, inter alia: Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda и Trichoplusia ni (WO 89/046699; Carbonell et al., (1985) J. Virol. 56:153; Wright (1986) Nature 321:718; Smith et al., (1983) Mol. Cell. Biol. 3:2156 и см. в общем, Fraser, et al. (1989) In Vitro Cell. Dev. Biol. 25:225).

Клетки и среды для культивирования клеток являются комимерчески доступными как для прямой, так и для слитой экспрессии гетерологичных полипептидов в бакуловирусной системе экспрессии; технология культуры клеток обычно известна среднему специалисту в данной области. См., например. Summers and Smith supra.

Затем модифицированные клетки насекомых могут быть выращены в подходящей питательной среде, которая делает возможной стабильное сохранение плазмиды (плазмид), присутствующих в модифицированном насекомом-хозяине. Если ген продукта экспрессии находится под индуцируемым контролем, хозяин может быть выращен до высокой плотности и экспрессия может быть индуцирована. Альтернативно, если экспрессия является конститутивной, продукт будет непрерывно экспрессироваться в среду и питательная среда должна непрерывно циркулировать при удалении представляющего интерес продукта и увеличении истощаемых питательных веществ. Данный продукт может быть очищен такими способами, как хроматография, например ВЭЖХ, аффинная хроматография, ионообменная хроматография и т.д.; электрофорез; центрифугирование в градиенте плотности; экстракция растворителями или т.п. Соответствующим образом продукт может быть дополнительно очищен, если требуется, для удаления по существу любых белков насекомых, которые также секретируются в среду или возникают вследствие лизиса клеток насекомых, чтобы обеспечить продукт, который является по меньшей мере по существу не содержащим дебриса хозяина, например белков, липидов и полисахаридов.

Для получения экспрессии белка рекомбинантные клетки-хозяева, полученные из трансформантов, инкубируют в условиях, которые делают возможной экспрессию кодирующей последовательности рекомбинантного белка. Условия будут варьироваться в зависимости от выбранной клетки-хозяина. Однако данные условия могут быть легко определены средним специалистом в данной области на основе того, что известно в данной области.

iii. Растительные системы

Существуют многочисленные системы экспрессии генов, использующие культуры растительных клеток и целые растения. Примеры систем экспрессии генов растительными клетками включают системы, описанные в таких патентах, как патент США 5693506; патент США 5659122 и патент США 5608143. Дополнительные примеры экспрессии генов в культуре клеток растений были описаны Zenk, Phytochemistry 30:3861-3863 (1991). Описания сигнальных пептидов белков растений могут быть найдены, кроме описанных выше ссылок, у Vaulcombe et al., Mol. Gen. Genet. 209:33-40 (1987); Chandler et al.. Plant Molecular Biology 3:407-418 (1984); Rogers, J. Biol. Chem. 260:3731-3738 (1985); Rothstein et al.. Gene 55:353-356 (1087); Whittier et al., Nucleic Acids Research 15:2515-2535 (1987); Wirsel et al., Molecular Microbiology 3:3-14 (1989); Yu et al., Gene 122:247-253 (1992). Описание регуляции экспрессии генов растений фитогормоном, гибберелловой кислотой и секретируемыми ферментами, индуцируемыми гибберелловой кислотой, может быть найдено у R.L.Jones and J.MacMiilin, Gibberellins: в: Advanced Plant Physiology, Malcolm B.Wilkins, ed., 1984 Pitman Publishing Limited, London, pp. 21-52. Ссылки, которые описывают другие метаболически регулируемые гены: Sheen, Plant Cell, 2:1027-1038 (1990); Maas et al., EMBO J. 9:3447-3452 (1990); Benkel and Hickey, Proc. Natl. Acad. Sci. 84:1337-1339 (1987).

Обычно с использованием способов, известных в данной области, желаемую полинуклеотидную последовательность встраивают в экспрессируюшую кассету, содержащую генетические регуляторные элементы, сконструированные для функционирования в растениях. Данную экспрессирующую кассету встраивают в желательный экспрессирующий вектор с сопутствующими последовательностями левее и правее от экспрессирующей кассеты, подходящими для экспрессии в растении-хозяине. Сопутствующие последовательности имеют плазмидное или вирусное происхождение и обеспечивают необходимые свойства для вектора, чтобы данные векторы перемещали ДНК из первоначального клонирующего хозяина, такого как бактерии, в желательного хозяина-растение. Конструкция исходного бактериального/растительного вектора предпочтительно будет предусматривать прокариотический сайт инициации репликации широкого круга хозяев; прокариотический селектируемый маркер и для трансформации с использованием Agrobacterium Т-ДНК-последовательности для опосредованного Agrobacterium переноса в хромосомы растений. Если гетерологичный ген не поддается простому определению, данная конструкция будет предпочтительно содержать также ген селектируемого маркера, подходящий для установления трансформации клетки растения. Общий обзор подходящих маркеров, например, для видов семейства злаковых, может быть найден у Wilmink and Dons, 1993, Plant Mol. Biol. Reptr, 11(2):165-185.

Также рекомендуются последовательности, полезные для обеспечения интеграции гетерологичной последовательности в геном растений. Они могут включать транспозонные последовательности и тому подобные последовательности для гомологичной рекомбинации, а также Ti-последовательности, которые делают возможной случайное встраивание гетерологичной экспрессирующей кассеты в геном растения. Подходящие прокариотические селектируемые маркеры включают гены устойчивости к антибиотикам, таким как ампициллин и тетрациклин. Другие последовательности ДНК, кодирующие дополнительные функции, могут также присутствовать в данном векторе, как известно в данной области.

Молекулы нуклеиновых кислот данного изобретения могут быть включены в экспрессирующую кассету для экспрессии представляющего интерес белка (белков). Обычно это будет только одна экспрессирующая кассета, хотя возможны и две или большее количество экспрессирующих кассет. Рекомбинантная экспрессирующая кассета будет содержать кроме кодирующей последовательности гетерологичного белка следующие элементы: промоторную область, 5'-нетранслируемые последовательности растений, инициирующий кодон при наличии такового в данном структурном гене и последовательность терминации транскрипции и трансляции. Уникальные сайты ферментативной рестрикции на 5'- и 3'-концах данной кассеты делают возможным легкое встраивание в исходный вектор.

Гетерологичная последовательно